專利名稱：胰激肽原酶的制備及其親和層析純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種胰激肽原酶的制備和親和層析純化方法，屬一種生物藥品的制備方法。
胰激肽原酶(即血管舒緩素)能從激肽原(Kininogen)中釋放激肽(Kinin)，激肽具有擴(kuò)張周圍血管，降低血壓的功能，因此該酶被廣泛地應(yīng)用于高血壓及動(dòng)脈硬化等癥的預(yù)防和治療。
眾所周知，胰激肽原酶是從哺乳動(dòng)物的胰臟中提取純化而得，提取途徑為從胰臟本身，胰酶粉及胰激肽原酶粗品(中間體)中提取，并通過(guò)純化而制得的一種循環(huán)系統(tǒng)的酶。
在純化和制備方法上，已知類型的純化方法，是使用多糖非樹脂物料，其中包括一種方法是使這種粗的激肽原酶吸附到一種弱堿性陰離子交換纖維素上并分離而得。(見日本專利發(fā)行No.11697/62)；一種方法是加入一種鋁鹽或者鋅鹽于含有激肽原酶的水溶液中，將產(chǎn)生的激肽原酶的沉淀吸附到弱堿性的陰離子交換纖維素上或交聯(lián)葡取糖(Sephadex)上，并分離之(見日本公開專利發(fā)行No.56886/73)；另一種已知類型的純化方法是使用離子交換樹脂，包括一種方法是加入一種蛋白質(zhì)沉淀劑到胰臟提取液中，產(chǎn)生的激肽原酶吸附到大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂上，并分離之(見日本公開專利No.103715/73)利用多糖型非樹脂物料作為吸附的方法缺點(diǎn)是離子交換物料的物理強(qiáng)度不夠和微生物易于發(fā)生污染，因此這些方面不能進(jìn)行大規(guī)模制備，另一方面，離子交換樹脂法優(yōu)點(diǎn)在于避免上述的麻煩，但仍不能使產(chǎn)品在洗脫時(shí)除去不需要的雜質(zhì)。
本發(fā)明對(duì)純化激肽釋放酶提供一種新方法，該法使含有激肽原酶的提取液，利用胰激肽原酶與胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶對(duì)酶抑制劑的親和性的差別，使抑制劑與水不溶性載體的結(jié)合，而將激肽原酶與其他酶分解，制得高純度的產(chǎn)品。本發(fā)明公開了從動(dòng)物胰臟中提取的激肽釋放酶單位效價(jià)可在250-380u/mg，比活可達(dá)800-1000iu/mg.p。產(chǎn)品收率為85％，本工藝順序簡(jiǎn)單，操作方便，適宜于工業(yè)化制備。
一、豬胰自溶物中提取胰激肽原酶的工藝流程 二、豬胰丙酮粉中提取胰激肽原酶的工藝流程胰臟—→加入5-10倍量0.5M，PH4.5-8.5醋酸溶液—→靜置15℃1小時(shí)，經(jīng)過(guò)板框壓濾的清液(加入樹脂吸附彈性酶后母液)，經(jīng)過(guò)中空纖維超濾器(P10O10)超濾濃縮后加入原體積PH5.0，0.001M，PBS緩沖液(第二次超濾)濃縮后加入原體積PH6.5，0.001M，PBS緩沖液(進(jìn)行第三次超濾) 三、胰酶中提取胰激肽原酶的工藝流程 PH6.5，加入0.8倍量DEAE纖維素?cái)嚢栉?小時(shí)—→清水洗滌 凍干燥—→成品我們發(fā)現(xiàn)按照本文的方法利用親和凝膠柱的動(dòng)態(tài)吸附后在上樣流出液中，大部分不需要的(而在一般離交樹脂上同樣會(huì)被吸附的)雜質(zhì)酶不會(huì)被吸附上親和凝膠柱上，在洗滌步驟中，我們又可洗去凝膠表面的不純的激肽原酶。這樣已吸附的激肽原酶能夠以好的純度和效率加以洗脫和回收。
我們發(fā)現(xiàn)用親和層析法制得的產(chǎn)品，單位效價(jià)比一般專利文獻(xiàn)報(bào)道60-150u/mg提高到了250-380u/mg，純度從200-300u/mg.p提高到了800-1000u/mg.p，產(chǎn)品的收率從40-60％提高到了85％以上。
我們又發(fā)現(xiàn)，用大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂時(shí)，洗脫吸附了的激肽原酶，需要消耗大量溶劑和長(zhǎng)時(shí)期周期，而且，雜質(zhì)傾向于伴隨所分離的激肽原酶，但我們用親和層析技術(shù)，不但縮短了生產(chǎn)工藝，而且很容易地把雜質(zhì)與激肽原酶分離。
根據(jù)本文推薦的純化方法，含激肽原酶的水提取液，經(jīng)過(guò)親和層析膠體柱，保證水提液與親和膠體的充分接觸，使純的激肽原酶全部親和吸附在膠體中，吸附操作的PH最好在PH4以上，PH8.5以下盡可能在PH5.5-7.5之間，最好的PH為6.5±0.5，PH超出規(guī)定范圍時(shí)激肽原酶就會(huì)失活，PH超過(guò)8.0不吸附的激肽原酶量就會(huì)增加，酶的收率和純度降低。
已吸附到凝膠上的激肽原酶，用一種弱酸的鈉鹽水溶液在PH4.5-6.0條件下進(jìn)行洗脫。吸附、洗脫的溫度必須在5℃-10℃冷房?jī)?nèi)進(jìn)行。洗脫溶液盡可能在低鹽條件下洗脫，一般控制在0.05M-0.001M之間，最終產(chǎn)物可在P2O5的真空干燥箱內(nèi)加以干燥，也可用冷凍干燥方法。
我們所使用的親和層析膠體是以胰蛋白酶抑制劑為配基與瓊脂糖4B結(jié)合的層析膠體，瓊脂糖凝膠為Sigma公司產(chǎn)品。
為了證實(shí)親和層析在純化激肽釋放酶的結(jié)果，以下實(shí)驗(yàn)是用含激肽原酶的水提液與日本專利文獻(xiàn)中使用WA-30(見特許公報(bào)昭55-44726)DEAE纖維素及美國(guó)的大孔樹脂Amberite IRA-938進(jìn)行對(duì)照[見公開特許昭53-62592]。
以上實(shí)驗(yàn)我們是取相同量的含激肽原酶的粗品，按照文獻(xiàn)及資料中陳述的工藝進(jìn)行操作。在操作中，我們注意在各種吸附劑吸附后的母液中檢查280nm波長(zhǎng)的透光值(E為消光系數(shù))，表示吸附劑中吸上蛋白總量。同時(shí)，測(cè)試母液中含胰激肽原酶量。
激肽原酶的省略測(cè)定及純度計(jì)算都按照衛(wèi)生部98版部頒標(biāo)準(zhǔn)中胰激肽原酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)試。
下面用實(shí)施例和說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明作具體說(shuō)明附

圖1為胰激肽原酶生產(chǎn)工藝路線方框圖。
附圖2為豬胰自溶物中提取胰激肽原酶的工藝流程圖。
附圖3為豬胰丙酮粉中提取胰激肽原酶的工藝流程圖。
附圖4為胰酶中提取胰激肽原酶的工藝流程圖。
實(shí)施例11000克胰酶的丙酮粉，用其重量20倍的水混合均勻，調(diào)PH至5.0-6.0，加入醋酸銨200克，攪拌3小時(shí)，置5℃-10℃冷室過(guò)夜，過(guò)濾出清液(渣棄除)，加2.5倍量丙酮復(fù)沉淀，P2O5干燥后得粗制胰激肽原酶300克，測(cè)含量為7.5u/mg，總效價(jià)為225萬(wàn)u。
粗制胰激肽原酶，用其20倍量0.001M，PH5.5-8.5磷酸緩沖液溶解后，過(guò)濾清后再上親和層析柱，流速每分鐘20ml，親和柱高80cm，直徑15cm，床體積51。上樣完畢用同樣緩沖液洗滌親和層析柱10床體積后，用PH4.0-5.0，0.001M醋酸緩沖液洗脫親和層析柱，以紫外線監(jiān)測(cè)收集峰值部分，調(diào)PH5.5-7.5后，加入3倍量丙酮沉淀，次日沉淀物脫水后P2O5干燥，再進(jìn)行去熱原后得成品8.6克，測(cè)效價(jià)為230.8u/mg，純度(比活)為825u/mg.p，總活力單位為198.48萬(wàn)u，收率為88.21％。
實(shí)施例2取購(gòu)買進(jìn)胰激肽原酶粗品，測(cè)每毫克20.22u/mg，150克加入其重量20倍的0.001M PH5.5-8.5緩沖液在5℃±3冷房中攪拌溶解3小時(shí)后用除菌助濾板過(guò)濾清液后即上樣流速為20ml/分鐘，親和柱高80cm，直徑15cm，床體積51，上樣完畢用同樣緩沖液洗親和層析柱，10床體積后，用PH4.0-5.0，0.001M醋酸緩沖液洗親和層析柱，紫外監(jiān)測(cè)收集峰值部分，調(diào)PH5.5-9后，加入3倍量丙酮沉淀，次日沉淀物脫水后P2O5干燥，再進(jìn)行去熱原后得成品7.8克，測(cè)單位效價(jià)為339u/mg，純度(比活)為825u/mg.p，總活力單位為264.42萬(wàn)u，收率為87.19％。
實(shí)施例3將豬胰臟10公斤，切碎，放到0.05M醋酸溶液50升中，在15℃下攪拌提取5小時(shí)，加入1％-5％十二脂腸切碎液，同時(shí)使其自溶，然后將胰臟小塊和脂肪小塊濾除，將濾液調(diào)整PH6.5后，加入2倍量丙酮沉淀，得粗制胰酶丙酮粉1020克，1020克丙酮粉按實(shí)施列(1)方法在進(jìn)行粗制激肽原酶的提取，得粗制激肽原酶325克，測(cè)含量為6.9u/mg，總活力為224.3萬(wàn)iu粗制激肽原酶用PH5.5-8.5，0.001M磷酸緩沖液重量的20倍量溶解后用除菌澄清濾板過(guò)濾清后，上親和層析柱，流速20ml/分鐘，親和柱高80cm，直徑15cm，床體積51，上樣完畢用同樣緩沖液洗滌親和層析柱，以紫外監(jiān)測(cè)收集峰值部分，調(diào)PH5.5-9后，超濾濃縮后，進(jìn)行冷凍干燥，即得胰激肽原酶精品5.3克，測(cè)單位效價(jià)為368u/mg，純度為882u/mg.p，總活力195.04萬(wàn)u，收率為86.95％。
實(shí)施例4將豬胰臟10千克，切碎，加入5-10倍量0.05MPH4.5-6.5醋酸溶液中，攪拌自溶5小時(shí)，靜置在15℃容器內(nèi)10小時(shí)后板框壓濾，清液調(diào)至PH5.5-7.5加入吸附彈性酶的大孔樹脂吸附提取1小時(shí)后，將濾出樹脂的母液，用中空纖維超濾膜H10P10進(jìn)行循環(huán)超濾濃縮，后同樣方法進(jìn)行第二次、第三次超濾，用除菌板濾過(guò)清液后即上樣，流速為20ml/分鐘。親和柱高80cm，直徑15cm，床體積51，上樣完畢用同樣緩沖液洗脫，紫外監(jiān)測(cè)收集峰值部分，調(diào)PH5.5-9后，加入3倍量丙酮沉淀，次日沉淀物脫水后P2O5干燥，再進(jìn)行去熱原后，得成品8.9克，測(cè)單位效價(jià)為219.5u/mg，純度(比活)為965u/mg.p，總活力單位為195.36萬(wàn)u，收率為83.89％。
實(shí)施例5取購(gòu)進(jìn)含激須原酶的胰酶粉6千克，加入10倍量PH4.5，0.001M醋酸鈉緩沖液攪拌提取2小時(shí)后板框壓濾，棄渣，清液用6N NaOH調(diào)至PH6.5后加入0.8倍量預(yù)先平衡好DEAE-23攪拌吸附1小時(shí)后棄除母液，過(guò)濾出纖維素，水漂洗后，用0.1M氯化鈉洗滌1-2次，加入0.6N甲酸銨洗脫，過(guò)濾收集清液；2.5V丙酮沉淀五氧化二磷干燥得成品105克，測(cè)效價(jià)為26.5u/mg，總單位為278.25萬(wàn)單位，收率46.38萬(wàn)u/kg，用以上中間體，按實(shí)施例2上親和層析柱，洗脫液凍干后得干品7.25克，單位效價(jià)為308.5u/mg，純度(比活)為863u/mg.p，收率為79.08％。
本發(fā)明能夠在工業(yè)化生產(chǎn)中率先使用親和層析分離技術(shù)，純化胰激肽原酶。不僅使產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)，純度；收率都達(dá)到了國(guó)際先進(jìn)水平，也為國(guó)內(nèi)更廣泛應(yīng)用此藥打下基礎(chǔ)。親和層析分離純化技術(shù)對(duì)生物制品特別對(duì)酶的純化，是目前生物制品分離純化技術(shù)中最為先進(jìn)純化手段之一，本方法利用胰激肽原酶與胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶等對(duì)酶抑制劑的親和性的差別，使抑制劑與水不溶性載體結(jié)合，以此將激肽原酶與其他酶分離，制得高純度激肽原酶產(chǎn)品。本發(fā)明簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的生產(chǎn)技術(shù)，提高了工業(yè)化生產(chǎn)能力，使產(chǎn)品工業(yè)化應(yīng)用前景看好。
權(quán)利要求
1.一種胰激肽原酶的制備及其親和層析純化方法，胰激肽原酶多數(shù)是從豬胰自溶物或豬胰丙酮粉中提取，也可以從胰酶中提取，其特征在于提取純化的方法采用親和層析純化技術(shù)，利用胰激肽原酶與胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對(duì)抑制劑的親和性的差別，使抑制劑與水不溶性載體結(jié)合，以此將胰激肽原酶與其他酶分離，親和層析純化工藝流程為(1)豬胰自溶物中提取胰激肽原酶的工藝流程胰臟在10℃條件下切碎生成胰酶粉，然后在PH2-7.5醋酸緩沖液溫度2℃-25℃條件下激活激肽原酶，通過(guò)水解析提取，壓濾除渣，得到清液用丙酮沉淀，制成激肽酶粗品，然后在濃度0.001M磷酸緩沖液PH5.2-8.5對(duì)粗品再溶解及除菌過(guò)濾，進(jìn)入親和層析上樣，在流速為16-25ml/分鐘，PH5.2-8.5進(jìn)行，親和層析上樣后進(jìn)行親和洗滌，用PH5.2-8.5磷酸緩沖液，流速成20-30ml/分鐘，洗滌親和層析柱10-20床體積后，用PH4.5-8.5醋酸緩沖液洗脫親和層析柱，再進(jìn)行去熱原加入丙酮沉淀，沉淀物脫水后P2O5干燥或冷凍干燥，最后得成品。(2)豬胰丙酮粉中提取胰激肽原酶的工藝流程胰臟經(jīng)加入5-10倍量0.5M，PH4.5-8.5醋酸溶液，在溫度15℃條件靜置10小時(shí)，經(jīng)過(guò)板框壓濾的清液，(加入樹脂吸附彈性酶后母液)，經(jīng)過(guò)中空纖維超濾器(H10P10)超濾濃縮后加入原體積PH6.5，0.001M.PBS緩沖液(第二次超濾)濃縮后加入原體積PH6.5，0.001M.PBS緩沖液(進(jìn)行第三次超濾)，經(jīng)除菌過(guò)濾后進(jìn)入親和層析上樣，親和層析上樣及以后的流程同流程(1)；(3)胰酶中提取工藝流程胰酶粉(含胰激肽原酶)用10倍量PH4.5，0.01M.NQAC(醋酸鈉)進(jìn)行溶解，在溫度5℃條件攪拌2-5小時(shí)，用板柜壓濾棄除濾渣，所得清液調(diào)PH6.5，加入0.8倍量DEAE纖維素?cái)嚢栉?小時(shí)后，棄除吸附后母液過(guò)濾出纖維素，先用清水漂洗，再用0.1M氯化鈉洗滌1-2次，用0.6N甲酸銨洗脫，過(guò)濾收集清液；2.5V丙酮沉淀，沉淀物脫水后，P2O5干燥得中間體，再按流程(1)中親和層析上樣及以后的工藝流程操作得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰激肽原酶的親和層純化方法，其特征在于所述的激肽原酶的水提取液經(jīng)過(guò)親和層析膠體柱，保證水提液與親和膠體的充分接觸，使純的激肽原酶全部親和吸附膠體中，吸附操作的PH盡可能在PH5.5-7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰激肽原酶的親和層析純化方法，其特征在于所述的吸附洗脫的溫度必須在5℃-10℃冷房?jī)?nèi)進(jìn)行，洗脫溶液盡可能在低鹽條件下洗脫，一般控制在0.05M-0.001M之間，最終產(chǎn)物可在P2O5真空干燥或者冷凍干燥箱內(nèi)干燥而得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胰激肽原酶的親和層析純化方法，其特征在于所述的親和層析膠體是以胰蛋白酶抑制劑為配基與瓊脂糖結(jié)合的層析膠體。
5.一種權(quán)利要求1所獲得胰激肽原酶產(chǎn)品，其特征在于激肽釋放酶單位效價(jià)≥50iu/mg，可在250-380iu/mg；比活≥300iu/mg.p，可達(dá)800-1000iu/mg.p。
全文摘要
一種胰激肽原酶的制備及其親和層析純化方法,胰激肽原酶多數(shù)是從豬胰自溶物或豬胰丙酮粉中提取,也可以從胰酶中提取,其特征在于提取純化的方法采用親和層析純化技術(shù),利用胰激肽原酶與胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶對(duì)酶抑制劑的親和性的差別,使抑制劑與水不溶性載體結(jié)合,以此將胰激肽原酶與其他酶分離,本發(fā)明的親和層析分離技術(shù),能夠工業(yè)化生產(chǎn),純化胰激肽原酶的質(zhì)量純度高,達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平,也為國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用此藥打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K1/22GK1336434SQ00119540
公開日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月1日
發(fā)明者沙龍華, 金武 申請(qǐng)人:上?；莺Ｉ破窂S