專利名稱：一種人肝癌細胞衍生生長因子編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種人肝癌細胞衍生生長因子(HDGF3)的cDNA序列，該蛋白是小鼠HRP-2的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用以及所述多核苷酸和所述多肽的制備方法。
研究已表明，細胞生長的調(diào)節(jié)是通過各種細胞因子與其特異的膜表面受體作用后引發(fā)的一系列級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)的。在腫瘤細胞中，某些級聯(lián)反應(yīng)的失控致使細胞持續(xù)增殖。在肝癌細胞中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些自分泌和旁分泌細胞因子(Proc．Natl． Acad．Sci．832448-2452，1986；Proc．Natl．Acad．Sci．867432-7436，1989；Cell 611137-1146，1990)。肝癌細胞衍生生長因子(HDGF)是在無血清培養(yǎng)的人肝癌細胞株系HuH-7中找到的一個細胞因子，它具有肝素結(jié)合能力并能刺激Swiss 3T3細胞的DNA合成(J．Biol．Chem．269(40)25143-25149，1994)。
1989年Nakamura等人首次從HuH-7細胞中部分純化并鑒定了HDGF(Clin．Chim．Acta．183273-284，1989)，1994年該實驗組又完整克隆了HDGF的cDNA序列(J．Biol．Chem．269(40)25143-25149，1994)，1997年該實驗組在小鼠中找到了HDGF的同系物并發(fā)現(xiàn)了該基因家族的另兩個成員HRP-1、HRP-2，它們都具有一個相當保守的98個氨基酸長的氨基端序列(Biochem．Biophys．Res．Commun．23826-32，1997)，1999年該實驗組又在人和小鼠中克隆到了HDGF基因家族的另一個成員HRP-3(Biochem．Biophys．Res．Commun．266(1)81-87，1999)。在本發(fā)明被公布之前，尚沒有任何人公開過本申請中涉及的人HDGF3。
本發(fā)明的目的在于提供一種新的人肝癌細胞衍生生長因子多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼小鼠HRP-2蛋白的同源蛋白，該多核苷酸序列被命名為人HDGF3。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人肝癌細胞衍生生長因子的蛋白，該蛋白被命名為人HDGF3。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人HDGF3蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種人HDGF3基因序列和蛋白的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No．6所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的HDGF3蛋白多肽，它包括具有SEQ ID No．6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID No．6序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有HDGF3蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成HDGF3蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成HDGF3蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HDGF3蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HDGF3蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為2118個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO．5，其中開放讀框位于6-2033位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HDGF3蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No．5中6-2033位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID No．5序列的編碼框6-2033位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID No．5中6-2033位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID No．6所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴謹條件下，更佳地，在高度嚴謹條件下與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與人HDGF3相同功能的蛋白的SEQ ID No．5中開放讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的20％，較佳地50％，更佳地80％，最佳地90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HDGF3蛋白多肽”指具有HDGF3蛋白活性的SEQ ID No．6序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人HDGF3相同功能的、SEQ ID No．6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時(最好按表1所示進行)，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括HDGF3蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與HDGF3 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗HDGF3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含HDGF3多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了HDGF3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有HDGF3多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供HDGF3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然HDGF3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括HDGF3多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)HDGF3的表達。
本發(fā)明還包括可用作探針和引物的核酸分子，該分子通常具有HDGF3多肽編碼序列的約8-100個，較佳地約15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼HDGF3的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測HDGF3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于HDGF3多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
本發(fā)明還包括對HDGF3 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于HDGF3基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與HDGF3基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制HDGF3蛋白的分子，也包括那些并不影響HDGF3蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的HDGF3基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No．4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的HDGF3基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達HDGF3或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6511，1976；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N．Y．，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷HDGF3功能的抗體以及不影響HDGF3功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用HDGF3基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與HDGF3基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E．coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明HDGF3與小鼠HRP-2的核苷酸序列的同源比較見表2。其中，相同的核苷酸用“︱”標出。
本發(fā)明HDGF3與小鼠HRP-2蛋白的氨基酸序列的同源比較見表3。其中，相同的氨基酸用“︱”標出，相似的氨基酸用“．”標出，小鼠HRP-2蛋白的核定位信號用 標出。
本發(fā)明HDGF3與HDGF家族成員氨基酸序列氨基末端高度保守序列比較見表4。其中，相同的氨基酸用“*”標出；相似的氨基酸用“．”標出。
在本發(fā)明中，人HDGF3的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸A15’-TCAGCATGCCACACGCCTTCAAG-3’(SEQ ID No．1)和B15’-GACTCCGACTCCAAGGCCGATTC-3’(SEQ ID No．3)為正向引物，寡核苷酸A25’-CTTCACAGACACATCGGAGTCGG-3’(SEQ ID No．2)和B25’-TCTCTGCTCTGCTTTCCTGCGAG-3’(SEQ ID No．4)反向引物，進行PCR，PCR條件均為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘，68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片段，為約800和1400bp的目的片段。然后用限制性酶NocI對兩者進行酶切、連接，得到目的cDNA序列及雜帶。雜帶可用電泳等方法去除，從而得到濃度較高的目的cDNA序列。
肝癌細胞衍生生長因子(HDGF)是從人的肝癌細胞株HuH-7中分離到的肝素結(jié)合蛋白，它具有刺激細胞生長的活性，能夠促進成纖維細胞和一些肝癌細胞的生長。HDGF的C端的酸性氨基酸尾和．HMG-1／-2高度同源，而這段序列已知是組蛋白結(jié)合區(qū)域，因此HDGF很有可能作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮其刺激細胞生長的活性。HDGF的有絲分裂原活性使其在急性惡性肝炎和肝損傷的治療上存在著極大的應(yīng)用價值。
HDGF家族的已知各成員的表達模式是不同的，但是它們在睪丸中都有很高程度的富集，而且它們的5’非翻譯區(qū)均有高于70％的GC比，因而在雄性生殖細胞發(fā)育過程中有重要功能，并和DNA甲基化，染色質(zhì)構(gòu)象以及翻譯調(diào)控相關(guān)。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1HDGF3的cDNA序列的克隆和測定1．引物擴增以人睪丸λgtllcDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸A15’-TCAGCATGCCACACGCCTTCAAG-3’(SEQ ID No．1)和B15’-GACTCCGACTCCAAGGCCGATTC-3’(SEQ ID No．3)為正向引物，寡核苷酸A25’-CTTCACAGACACATCGGAGTCGG-3’(SEQ ID No．2)和B25’-TCTCTGCTCTGCTTTCCTGCGAG-3’(SEQ ID No．4)反向引物，進行PCR，PCR條件均為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘，68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片段，為約800和1400bp的目的片段。然后用限制性酶NocI對兩者進行酶切、連接，得到目的cDNA序列及雜帶。雜帶可用電泳等方法去除，從而得到濃度較高的目的cDNA序列。
2．PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的目的cDNA序列與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(EpicentreTechnologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共2118bp，詳細序列見SEQ ID No．5，其中開放讀框位于6-2033位核苷酸。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出HDGF3的氨基酸序列，共676個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID No．6。
實施例2同源比較用人HDGF3的編碼蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進行蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與HDGF家族成員在蛋白水平上都有一定的同源性與小鼠HRP-2蛋白(bdj︱BAA22896．1︱(D63850))有82．8％的同一性并有6％的相似性(見表2)，與小鼠HRP-3蛋白(dbj︱BAA90478．1︱(ABO29493))有52％的同一性并有11．9％的相似性，與人HDGF蛋白(dbj︱BAA03903．1︱(D16431))有44．6％的同一性并有11．3％的相似性，與小鼠HDGF蛋白(gb︱AAF65469．1︱AF251787_1(AF251787))有43％的同一性并有11％的相似性。HDGF家族成員氨基末端(hathregion，forhomologous to the amino terminus of the HDGF，)具有高度保守性，被認為是該家族成員的特征性序列，而本發(fā)明的人HDGF3其氨基末端與HDGF家族其他成員都有較高同源性(見表4)。鑒于本發(fā)明的上述特征認為其屬于肝癌細胞衍生生長因子(HDGF)家族，具有與該家族成員相似的功能。
HDGF是從人的肝癌細胞株HuH-7中分離到的肝素結(jié)合蛋白，它具有刺激細胞生長的活性，能夠促進成纖維細胞和一些肝癌細胞的生長(J．Biol．Chem．269(40)25143-25149，1994)。熒光免疫實驗顯示HDGF蛋白主要存在于細胞質(zhì)(J．Biol．Chem．269(40)25143-25149，1994)，但是該家族成員的氨基酸序列中都含有一段堿性區(qū)域-一個潛在的核定位信號(NLS)。成纖維細胞生長因子(FGF)必須依靠這段信號區(qū)域，使之定位于核內(nèi)而發(fā)揮其有絲分裂原的活性。HDGF的有絲分裂原活性使其在急惡性肝炎和肝損傷的治療上存在著極大的應(yīng)用價值(Clin．Chim．Acta．183273-284，1989)。研究表明，免疫血清刺激8-24小時后，HDGF在快速增長的平滑肌細胞(SMCs)中有高表達，外生性和內(nèi)生性的高表達HDGF都可刺激SMCs大量增殖及其DNA的大量合成，同時，在19日大鼠胎鼠(成鼠中無)大動脈的SMCs、成鼠腹主動脈收縮處SMCs均可檢測到天然型的HDGF，這暗示HDGF在SMCs發(fā)育及血管受損時可促進其細胞生長，起到調(diào)理作用(J．Clin．Invest105(5)567-575．，2000)。另外，HDGF的C端的酸性氨基酸尾和HMG家族的HMG-1／-2高度同源，而這段序列在HMG-1／-2中已知是組蛋白結(jié)合區(qū)域(Biochemistry 294419-4423，1990)。綜合上述現(xiàn)象，認為HDGF可能在內(nèi)化后作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮其刺激細胞生長的活性(Biochem．Biophys．Res．Commun．23826-32，1997)。本發(fā)明的HDGF3也可能具有類似活性。
盡管HDGF最初在肝癌細胞中被發(fā)現(xiàn)，但Northern雜交分析顯示它在人的心、腦、肺、肝等各個組織及各種癌細胞株中均有表達(J．Biol．Chem．269(40)25143-25149，1994)。HDGF在睪丸中都有很高程度的富集，而且它們的5’非翻譯區(qū)均有高于70％的GC比(Biochem．Biophys．Res．Commun．23826-32，1997)，因而它可能在雄性生殖細胞發(fā)育中有重要功能(J．Cell．Biol．115887-903，1990；Cell 62503-514，1990)。原位雜交顯示，腎發(fā)育階段可以在腎單位形成處檢測到含量極豐富的HDGF的mRNA，而在成人腎中含量很少，因而認為HDGF在腎發(fā)育過程中可能起有絲分裂原作用(J．ClinInvest 15102(6)；1208-19，1998)。此外，小鼠支氣管扎結(jié)后，HDGF表達量明顯增加，暗示HDGF與肺的生長成熟有關(guān)(J．Pediatr Surg35(1)113-8，2000)。本發(fā)明的HDGF3也可能具有類似功能。
在所有已知的HDGF家族成員中，本發(fā)明與小鼠HRP-2蛋白的同源度最高，除了HDGF家族的共性外，小鼠HRP-2蛋白還有其本身的特點。小鼠HRP-2蛋白富含絲氨酸(Ser)和脯氨酸(Pro)(分別為8．5％和12．4％)，這提示該蛋白可能具有磷酸激酶的作用。該蛋白的潛在核定位信號(氨基酸序列321-363位，見附表3)較長，其中酸性和堿性氨基酸含量都很高(．Lys+Arg20．6％，Glu+Asp19．7％)，可能具有核蛋白的作用。Northern雜交顯示，小鼠HRP-2在心、肝、肺、脾、腎等組織中均有表達，在肝中中度表達，在睪丸中高表達，其5’-非翻譯區(qū)有83％的GC比(Biochem．Biophys．Res．Commun．，23826-32，1997)，這些特點和一些在精巢或胚胎發(fā)育中特異表達的基因相似，因而它可能在雄性生殖細胞發(fā)育中有重要功能。本發(fā)明的人HDGF3與小鼠HRP-2在核酸水平上有78．2％的同一性，在氨基酸水平上有82．8％的同一性并有6％的氨基酸相似，氨基末端的高度保守序列一致，核定位信號對應(yīng)處氨基酸一致性為90．7％(見表3)，相似性為7％，Ser和Pro含量也較高(分別為12．7％和7．5％)，因而認為本發(fā)明具有與小鼠HRP-2蛋白相似的功能。
本發(fā)明的HDGF3還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明HDGF3還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，如將本發(fā)明HDGF3的N端與人的其它HDGF及鼠HDGF的N端進行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明HDGF3的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
實施例3HDGF3在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼HDGF3的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’-端的PCR寡核苷酸引物進行擴增。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為E15’-CGCCGGATCCATGCCACACGCCTTCAAGC-3’(SEQ ID No．7)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的HDGF3編碼序列的19個核苷酸；3’端引物序列為E25’-TGCCAAGCTTTCAGCTCTCCTCGTCCAGG-3’(SEQ ID No．8)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和HDGF3的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII的酶切位點對應(yīng)于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc．，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復(fù)制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子／操縱子(P／O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段混合物，隨后進行連接。再用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15／rep4的E．coli菌株，M15／rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用SalI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證HDGF3的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg／ml)和Kan(25μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O／N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0．4-0．6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P／O導(dǎo)致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的HDGF3。用6M鹽酸胍(pH5．0)從柱中洗脫HDGF3?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5．0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對含PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w／v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為約75kDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No．6的序列一致。
實施例4HDGF3在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼HDGF3的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得HDGF3 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為C15’-CGGCAAGCTTATGCCACACGCCTTCAAGC-3’(SEQ ID No．9)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的HDGF3編碼序列的19個核苷酸；3’端引物序列為C25’-TGCCGGATCCTCAGCTCTCCTCGTCCAGG-3’(SEQ ID No．10)
該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和HDGF3的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(fl ori)、一個病毒復(fù)制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和BamHI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E．coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用SalI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證HDGF3的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞是用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0．05％Triton的50mMTris·HCl(pH7．6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8．0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7．4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為75kDa。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No．6的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg／0．2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg／0．2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀HDGF3基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。本發(fā)明涉及的代號說明如下1．SEQ ID No．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．1TCAGCATGCC ACACGCCTTC AAG 232．SEQ ID No．2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．2CTTCACAGAC ACATCGGAGT CGG 233．SEQ ID No．3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．3GACTCCGACT CCAAGGCCGA TTC234．SEQ ID No．4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．4TCTCTGCTCT GCTTTCCTGC GAG235．SEQ ID No．5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2118bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)序列描述SEQ ID No．51 TCAGCATGCC ACACGCCTTC AAGCCCGGGG ACTTGGTGTT CGCTAAGATG AAGGGCTACC61 CTCACTGGCC TGCCAGGATC GACGACATCG CGGATGGCGC CGTGAAGCCC CCACCCAACA121 AGTACCCCAT CTTTTTCTTT GGCACACACG AAACAGCCTT CCTGGGACCC AAGGACCTGT181 TCCCCTACGA CAAATGTAAA GACAAGTACG GGAAGCCCAA CAAGAGGAAA GGCTTCAATG241 AAGGGCTGTG GGAGATCCAG AACAACCCCC ACGCCAGCTA CAGCGCCCCT CCGCCAGTGA301 GCTCCTCCGA CAGCGAGGCC CCCGAGGCCA ACCCCGCCGA CGGCAGTGAC GCTGACGAGG361 ACGATGAGGA CCGGGGGGTC ATGGCCGTCA CAGCGGTAAC CGCCACAGCT GCCAGCGACA421 GGATGGAGAG CGACTCAGAC TCAGACAAGA GTAGCGACAA CAGTGGCCTG AAGAGGAAGA481 CGCCTGCGCT AAAGATGTCG GTCTCGAAAC GAGCCCGAAA GGCCTCCAGC GACCTGGATC541 AGGCCAGCGT GTCCCCATCC GAAGAGGAGA ACTCGGAAAG CTCATCTGAG TCGGAGAAGA601 CCAGCGACCA GGACTTCACA CCTGAGAAGA AAGCAGCGGT CCGGGCGCCA CGGAGGGGCC661 CTCTGGGGGG ACGGAAAAAA AAGAAGGCGC CATCAGCCTC CGACTCCGAC TCCAAGGCCG721 ATTCGGACGG GGCCAAGCCT GAGCCGGTGG CCATGGCGCG GTCGGCGTCC TCCTCCTCCT781 CTTCCTCCTC CTCCTCCGAC TCCGATGTGT CTGTGAAGAA GCCTCCGAGG GGCAGGAAGC841 CAGCGGAGAA GCCTCTCCCG AAGCCGCGAG GGCGGAAACC GAAGCCTGAA CGGCCTCCGT901 CCAGCTCCAG CAGTGACAGT GACAGCGACG AGGTGGACCG CATCAGTGAG TGGAAGCGGC961 GGGACGAGGC GCGGAGGCGC GAGCTGGAGG CCCGGCGGCG GCGAGAGCAG GAGGAGGAGC1021 TGCGGCGCCT GCGGGAGCAG GAGAAGGAGG AGAAGGAGCG GAGGCGCGAG CGGGCCGACC1081 GCGGGGAGGC TGAGCGGGGC AGCGGCGGCA GCAGCGGGGA CGAGCTCAGG GAGGACGATG1141 AGCCCGTCAA GAAGCGGGGA CGCAAGGGCC GGGGCCGGGG TCCCCCGTCC TCCTCTGACT1201 CCGAGCCCGA GGCCGAGCTG GAGAGAGAGG CCAAGAAATC AGCGAAGAAG CCGCAGTCCT1261 CAAGCACAGA GCCCGCCAGG AAACCTGGCC AGAAGGAGAA GAGAGTGCGG CCCGAGGAGA1321 AGCAACAAGC CAAGCCCGTG AAGGTGGAGC GGACCCGGAA GCGGTCCGAG GGCTTCTCGA1381 TGGACAGGAA GGTAGAGAAG AAGAAAGAGC CCTCCGTGGA GGAGAAGCTG CAGAAGCTGC1441 ACAGTGAGAT CAAGTTTGCC CTAAAGGTCG ACAGCCCGGA CGTGAAGAGG TGCCTGAATG1501 CCCTAGAGGA GCTGGGAACC CTGCAGGTGA CCTCTCAGAT CCTCCAGAAG AACACAGACG1561 TGGTGGCCAC CTTGAAGAAG ATTCGCCGTT ACAAAGCGAA CAAGGACGTA ATGGAGAAGG1621 CAGCAGAAGT CTATACCCGG CTCAAGTCGC GGGTCCTCGG CCCAAAGATC GAGGCGGTGC1681 AGAAAGTGAA CAAGGCTGGG ATGGAGAAGG AGAAGGCCGA GGAGAAGCTG GCCGGGGAGG1741 AGCTGGCCGG GGAGGAGCTG GCCGGGGAGG AGGCCCCCCA GGAGAAGGCG GAGGACAAGC1801 CCAGCACCGA TCTCTCAGCC CCAGTGAATG GCGAGGCCAC ATCACAGAAG GGGGAGAGCG1861 CAGAGGACAA GGAGCACGAG GAGGGTCGGG ACTCGGAGGA GGGGCCAAGG TGTGGCTCCT1921 CTGAAGACCT GCACGACAGC GTACGGGAGG GTCCCGACCT GGACAGGCCT GGGAGCGACC1981 GGCAGGAGCG CGAGAGGGCA CGGGGGGACT CGGAGGCCCT GGACGAGGAG AGCTGAGCCG2041 CGGGCAGCCA GGCCCAGCCC CCGCCCGAGC TCAGGCTGCC CCTCTCCTTC CCCGGCTCGC2101 AGGAGAGCAG AGCAGAGA6．SEQ ID No．6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度676個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅲ)序列描述SEQ ID No．61 Met Pro His Ala Phe Lys Pro Gly Asp Leu Val Phe Ala Lys Met16 Lys Gly Tyr Pro His Trp Pro Ala Arg Ile Asp Asp Ile Ala Asp31 Gly Ala Val Lys Pro Pro Pro Asn Lys Tyr Pro Ile Phe Phe Phe46 Gly Thr His Glu Thr Ala Phe Leu Gly Pro Lys Asp Leu Phe Pro61 Tyr Asp Lys Cys Lys Asp Lys Tyr Gly Lys Pro Asn Lys Arg Lys76 Gly Phe Asn Glu Gly Leu Trp Glu Ile Gln Ash Asn Pro His Ala91 Ser Tyr Ser Ala Pro Pro Pro Val Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ala106 Pro Glu Ala Asn Pro Ala Asp Gly Ser Asp Ala Asp Glu Asp Asp121 Glu Asp Arg Gly Val Met Ala Val Thr Ala Val Thr Ala Thr Ala136 Ala Ser Asp Arg Met Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Lys Ser Ser151 Asp Asn Ser Gly Leu Lys Arg Lys Thr Pro Ala Leu Lys Met Ser166 Val Ser Lys Arg Ala Arg Lys Ala Ser Ser Asp Leu Asp Gln Ala181 Ser Val Ser Pro Ser Glu Glu Glu Ash Ser Glu Ser Ser Ser Glu196 Ser Glu Lys Thr Ser Asp Gln Asp Phe Thr Pro G1u Lys Lys Ala211 Ala Val Arg Ala Pro Arg Arg Gly Pro Leu Gly Gly Arg Lys Lys226 Lys Lys Ala Pro Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Lys Ala Asp Ser241 Asp Gly Ala Lys Pro Glu Pro Val Ala Met Ala Arg Ser Ala Ser256 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp Val Ser Val271 Lys Lys Pro Pro Arg Gly Arg Lys Pro Ala Glu Lys Pro Leu Pro286 Lys Pro Arg Gly Arg Lys Pro Lys Pro Glu Arg Pro Pro Ser Ser301 Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Asp Glu Val Asp Arg Ile Ser Glu316 Trp Lys Arg Arg Asp Glu Ala Arg Arg Arg Glu Leu Glu Ala Arg331 Arg Arg Arg Glu Gln Glu Glu Glu Leu Arg Arg Leu Arg Glu Gln346 Glu Lys Glu Glu Lys Glu Arg Arg Arg Glu Arg Ala Asp Arg Gly361 Glu Ala Glu Arg Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Asp Glu Leu Arg376 Glu Asp Asp Glu Pro Val Lys Lys Arg Gly Arg Lys Gly Arg Gly391 Arg Gly Pro Pro Ser Ser Ser Asp Ser Glu Pro Glu Ala Glu Leu406 Glu Arg Glu Ala Lys Lys Ser Ala Lys Lys Pro Gln Ser Ser Ser421 Thr Glu Pro Ala Arg Lys Pro Gly Gln Lys Glu Lys Arg Val Arg436 Pro Glu Glu Lys Gln Gln Ala Lys Pro Val Lys Val Glu Arg Thr451 Arg Lys Arg Ser Glu Gly Phe Ser Met Asp Arg Lys Val Glu Lys466 Lys Lys Glu Pro Ser Val Glu Glu Lys Leu Gln Lys Leu His Ser481 Glu Ile Lys Phe Ala Leu Lys Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Arg496 Cys Leu Asn Ala Leu Glu Glu Leu Gly Thr Leu Gln Val Thr Ser511 Gln Ile Leu Gln Lys Asn Thr Asp Val Val Ala Thr Leu Lys Lys526 Ile Arg Arg Tyr Lys Ala Asn Lys Asp Val Met Glu Lys Ala Ala541 Glu Val Tyr Thr Arg Leu Lys Ser Arg Val Leu Gly Pro Lys Ile556 Glu Ala Val Gln Lys Val Asn Lys Ala Gly Met Glu Lys Glu Lys571 Ala Glu Glu Lys Leu Ala Gly Glu Glu Leu Ala Gly Glu Glu Leu586 Ala Gly Glu Glu Ala Pro Gln Glu Lys Ala Glu Asp Lys Pro Ser601 Thr Asp Leu Ser Ala Pro Val Asn Gly Glu Ala Thr Ser Gln Lys616 Gly Glu Ser Ala Glu Asp Lys Glu His Glu Glu Gly Arg Asp Ser631 Glu Glu Gly Pro Arg Cys Gly Ser Ser Glu Asp Leu His Asp Ser646 Val Arg Glu Gly Pro Asp Leu Asp Arg Pro Gly Ser Asp Arg Gln661 Glu Arg Glu Arg Ala Arg Gly Asp Ser Glu Ala Leu Asp Glu Glu676 Ser7．SEQ ID No．7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．7CGCCGGATCC ATGCCACACG CCTTCAAGC 298．SEQ ID No．8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．8TGCCAAGCTT TCAGCTCTCC TCGTCCAGG 299．SEQ ID No．9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．9CGGCAAGCTT ATGCCACACG CCTTCAAGC 2910．SEQ ID No．10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQ ID No．10TGCCGGATCC TCAGCTCTCC TCGTCCAGG 29本發(fā)明涉及表格如下表1.保守性變異多肽氨基酸的取代
表2．人HDGF3與小鼠HRP-2核酸同源性比較 注人HDGF3與小鼠HRP-2核酸同一性為78．2％。
表3．人HDGF3與小鼠HRP-2氨基酸同源性比較 注人HDGF3與小鼠HRP-2氨基酸同一性為82．8％。
表4．人HDGF3與HDGF家族成員氨基末端特征性序列比較人HDGF3蛋白mpha-----fkpgdlvfakmkgyphwpariddiadgavkpppnkypifff 45小鼠HRP-2蛋白 mpha-----fkpgdlvfakmkgyphwpariddiadgavkpppnkypifff 45人HDGF蛋白 msrsnrqkeykcgdlvfakmkgyphwparidempeaavkstankyqvfff 50小鼠HDGF蛋白 msrsnrqkeykcgdlvfakmkgyphwparidempeaavkstankyqvfff 50*．．* *******．***．*******．．．．．*** *．*．．***人HDGF3蛋白gthetaflgpkdlfpydkckdkygkpnkrkgfneglweiqnnphasysap 95小鼠HRP-2蛋白 gthetaflgpkdlfpydkckdkygkpnkrkgfneglweiqnnphasysap 95人HDGF蛋白 gthetaflgpkdlfpyeeskekfgkpnkrkgfseglweiennp------- 93小鼠HDGF蛋白 gthetaflgpkdlfpyeeskekfgkpnkrkgfseglwiennp-------- 93***************．．*．*．*********．******．***注人HDGF3與HDGF家族成員氨基酸序列氨基末端特征性序列比較同一性為62．4％。
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴謹條件下與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No．6所示的序列。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID No．5中核苷酸6-2033位的序列。
4．一種分離的HDGF3蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No．6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID No．6序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其特征在于它包括原核細胞和真核細胞。
8．一種產(chǎn)生具有HDGF3蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有HDGF3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成HDGF3蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No．5中從核苷酸6-2033位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成HDGF3蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HDGF3蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HDGF3蛋白活性的多肽。
9．一種能與HDGF3蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，其特征在于，它包括單克隆抗體和多克隆抗體。
10．如權(quán)利要求9所述的抗體，其特征在于，還包括具有免疫原性的抗體質(zhì)粒，抗體重鏈，抗體輕鏈，遺傳工程改造的Fv分子及嵌合抗體。
11．一種探針分子，其特征在于，它含有具有HDGF3多肽編碼序列的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Ⅲ型人肝癌細胞衍生生長因子(HDGF3)的cDNA序列,該蛋白是小鼠HRP－2的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的制備方法。
文檔編號C07H21/00GK1291650SQ0011987
公開日2001年4月18日 申請日期2000年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月1日
發(fā)明者余龍, 章平肇, 蔣建明, 趙勇, 唐麗莎 申請人:復(fù)旦大學(xué)