專利名稱：高獲得率提取替曲朵辛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能以高獲得率從河豚魚內(nèi)部組織(例如卵巢)中提取替曲朵辛的方法。
替曲朵辛屬于小分子非蛋白的高活性神經(jīng)毒素，主要存在于河豚魚的卵巢、肝臟和血液中，其它部分含量極微。TTX也在其它動(dòng)物甚至海藻中發(fā)現(xiàn)，包括蜥蜴，加州蠑螈，虎蝦魚，藍(lán)環(huán)章魚等。替曲朵辛化學(xué)名是八氫-12-(羥甲基)-2-亞氨基-5，97，10 α-二甲橋-10αH-[1，3]二橋氧并[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇分子式C11H17N308分子量319.27其結(jié)構(gòu)式為 TTX的結(jié)構(gòu)特征是僅有一個(gè)碳環(huán)，一個(gè)胍基，六個(gè)羥基和-個(gè)半醛糖內(nèi)酯基團(tuán)。純的″替曲朵辛″是無(wú)色的結(jié)晶粉末。加熱到220℃結(jié)晶變暗沒有分解。″替曲朵辛″溶于酸性水溶液，不溶于水及有機(jī)溶劑在水溶液中的Pka為8.76，屬于堿性動(dòng)物生物堿。在中性或有機(jī)酸性溶劑中對(duì)熱相當(dāng)穩(wěn)定，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性水溶液中迅速破壞。
用高壓液相法分離、測(cè)定的天然河豚魚中的毒素是含有10余種類似物的混合物，其中主要成分叫″替曲朵辛″它的含量在70％-80％之間。另外三種主要類似物為河豚酸、4一表替曲朵辛和脫水4一表替曲朵辛。這三個(gè)″替曲朵辛″的化學(xué)性質(zhì)，有些微小的差別，但生物活性差別較大，例如它們的毒性，TTX的毒性為4500鼠單位/毫克，4-表替曲朵辛″的毒性僅為710鼠單位/毫克，而脫水4去4替曲朵辛″的毒性降低到92鼠單位/毫克(Toxicon，23 271-7276(1985))。
獲取TTX的方法有2種，即人工合成和生物提取。1975年日本山口大學(xué)農(nóng)業(yè)化學(xué)系的岸義人等人成功地合成了外消旋TTX。對(duì)TTX的生物提取始于本世紀(jì)初的1909年，日本人田原(J.pharm-soc.Japan 22 587(1909)，Biochem-z.30255，1911)用醋酸鉛與氨水處理河豚魚卵巢，得到了毒力為4.1γ(對(duì)1克小鼠平均極限致死量表示為MLD4.1γ/g，簡(jiǎn)寫為4.1γ)的粗品，并將其命名為現(xiàn)在使用的″Tetrodotoxin″。在以后兒十年中，又出現(xiàn)了多種提取方法，有代表性的如橫尾在1950年(日本化學(xué)雜志71 590，1950)用水浸取其卵巢，蒸干，得到于物質(zhì)后，用醋酸鉛與氨水使毒素共同沉淀，用磷鎢酸，苦味酸汞除去不純物，用苯肼除糖，再用苦味酸汞處理，最后依次用苦酮酸、甲醇、苦酮酸再處理，從20公斤卵巢中僅獲得MLD0.8的結(jié)晶毒素13mg。
永井1951年(福岡醫(yī)志經(jīng)1(1954))第一次使用離子交換樹脂AmberliteIRe-50吸附毒素，用鹽酸洗脫，再用Amberlite IR-4B除去鹽酸，濃縮后用無(wú)水乙醇提取毒素，最后從20公斤卵巢中得到MLD 0.008r的毒素結(jié)晶2.5mg。
1952年，津田與河村搞了一個(gè)用活性炭層析的大規(guī)模生產(chǎn)法(津田，化學(xué)的η領(lǐng)域，增刊，80 9(1967))，可以處理1000公斤卵巢并獲得MLD 10μg/kg的毒素10克。在此同時(shí)，美國(guó)哈佛大學(xué)的Woodward(R.B.Woodward，Pure Appl.chem..9249-74(1964))也獲得類似的結(jié)果。
1964年後藤俊夫等(後藤俊夫、高橋等，日本化學(xué)雜志85 508，1964)使用離子交換和活性炭吸附的提純方法，從100公斤卵巢可以獲得他們稱的粗毒素1-2克，使得率有了明顯的提高。其工藝流程見

圖1.。
1980年代后，陸續(xù)有學(xué)者報(bào)導(dǎo)了一些新的提取方法，迄今為止發(fā)表的提取方法不少于十幾種，但得率并沒有大的提高，僅為100公斤卵巢中提取TTX 1-2g。而本專利申請(qǐng)的提取方法，可以從100公斤卵巢中提取TTX 4-6g，得率高出已有方法的3倍。其工藝流程見圖2.。
″替曲朵辛″(簡(jiǎn)稱TTX)結(jié)晶品提取采用如圖1所示工藝流程操作。
1.水浸取過(guò)程取河豚魚有毒性的卵巢數(shù)十公斤，絞碎為小于1厘米的碎塊，放置于浸取一過(guò)濾裝置中，加入1∶1.5的去離子水，為了使TTX更好地從卵巢中浸取出，加入卵巢重量0.1-1％的乙酸。開動(dòng)攪拌，在室溫?cái)嚢钄?shù)小時(shí)，停止攪拌，然后開動(dòng)真空泵減壓過(guò)濾，數(shù)分鐘后，開動(dòng)壓縮機(jī)，讓浸取一過(guò)濾裝置上部壓力達(dá)到0.5-1公斤/平方厘米。收集濾液，快速加熱至70-95℃，加熱時(shí)間3-25分鐘，冷卻后過(guò)濾出析出的蛋白，得黃色透明液體，稱為第一次浸取清液。
用0.4毫升第一次浸取清液注射于20克重量小白鼠的腹腔，如果小白鼠在50秒內(nèi)死亡，則該卵巢定為猛毒性原料如果小白鼠在50-70秒內(nèi)死亡，則該卵巢被認(rèn)為強(qiáng)毒性原料如果小白鼠在70-90秒內(nèi)死亡，則卵巢被認(rèn)為弱毒性原料超過(guò)90秒死亡的卵巢浸取液，沒有使用價(jià)值。最好使用條紋東方豚的強(qiáng)毒性卵巢。
向第一次浸取過(guò)濾后的濾渣加入去離子水，攪拌數(shù)小時(shí)，如第一次浸取一樣，過(guò)濾，加熱，過(guò)濾，收集第二次浸取液。用類似的方法，收集第三次、第四次浸取清液。如果使用猛毒性和強(qiáng)毒性卵巢，仍需收集第四次浸取清液，如果使用弱毒性卵巢，只需收集第三次浸取清液。
將第一、第二、第三和第四次浸取液合并在一起，叫做浸取清液，用生物法或HPLC法測(cè)定浸取清液毒素含量。
2.離子交換富集和分離毒素過(guò)程將浸取清液用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值達(dá)6.0-7.5，如果有沉淀產(chǎn)生，過(guò)濾出沉淀，將過(guò)濾所得浸取清液通過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂柱，流出速度為2000-3750毫升/小時(shí)，流出液用硅膠薄版監(jiān)控有沒有毒素泄露。如果發(fā)現(xiàn)有TTX泄漏立即換新的樹脂柱。
浸出清液全部通過(guò)柱子后，用去離子水洗柱子直到洗到交換柱不再保留蛋白為止。再用5-12％的乙酸溶液洗交換柱，洗脫流出速度500-2500毫升/小時(shí)，按每份1500毫升收集洗脫液，每份用TLC檢測(cè)、收集含有毒素的洗脫液。
3.活性炭純化過(guò)程合并從離子交換柱上用乙酸洗脫出含有毒素的溶液，用濃氨水調(diào)節(jié)溶液pH值為8-9，該條件下的時(shí)間應(yīng)控制在2-4小時(shí)。然后通過(guò)由活性炭和另一組份硅藻土填充的柱子，去離子水洗柱子后，用含有酸的醇溶液(酸和醇濃度在0.5-40％之間)洗柱，盡可能洗下所吸附的毒素(用TLC檢測(cè))。
4.濃縮結(jié)晶過(guò)程將全部從柱上洗脫下來(lái)的含有毒素的溶液在減壓下濃縮，冷卻后，用氨水調(diào)節(jié)溶液pH值為8-9，放置后讓TTX沉淀.然后過(guò)濾出沉淀，用去離子水洗沉淀數(shù)次，然后抽干將沉淀溶于乙酸，再加氨水讓TTX沉淀再沉淀，如此操作再重復(fù)一次，將獲得的TTX結(jié)晶放在真空干燥器中干燥24小時(shí)，干燥至恒重后，得到TTX結(jié)晶。用HPLC方法測(cè)定其含量。
然后，將上述濾液合并，濾液被加熱到80℃5分鐘，冷卻后，過(guò)濾出凝固的蛋白。用氨水調(diào)節(jié)過(guò)濾出蛋白后的清液pH值達(dá)7.5。將pH值達(dá)7.5的清液通過(guò)直徑6cm，填充D-152樹脂(中國(guó)天津南開大學(xué)化工廠生產(chǎn))銨型的1米高弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂柱，所有清液通過(guò)樹脂柱后，用去離子水洗柱子，柱子被洗清后用10％乙醋水溶液淋洗出TTX。收集含TTX洗脫液，用濃氨水中和至pH8.5。將pH8.5含TTX溶液通過(guò)活性炭.硅藻土柱，讓TTX吸附在活性炭.硅藻土柱上，然后用含0.1％乙酸的20％乙醇水溶液洗出TTX，洗出的含TTX溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮到10-20毫升，冷卻后用濃氨水調(diào)節(jié)濃縮液至pH等于9，放置冰箱中冷卻析出TTX結(jié)晶，將結(jié)晶過(guò)濾出，溶于5％乙酸，再用濃氨水調(diào)節(jié)溶液pH等于9，再一次沉淀出TTX.過(guò)濾出TTX，獲得TTX結(jié)晶后放在真空干燥器中干燥24小時(shí)，干燥至恒重后，TTX結(jié)晶經(jīng)HPLC測(cè)定，其含量為86.17％(見圖3)，從20公斤卵巢獲得TTX結(jié)晶1200mg，如按100公斤算，可得TTX結(jié)晶6.0克。比現(xiàn)有方法收率提高3倍。
權(quán)利要求
1.從河豚魚卵巢中提取替曲朵辛的方法具有以下特征(a)用含乙酸的水浸泡河豚魚內(nèi)部組織，然后加壓快速過(guò)濾得到浸取液。(b)在沸點(diǎn)以下的溫度加熱浸取液除去可溶性蛋白。(c)用有機(jī)堿溶液調(diào)節(jié)清液的pH值，過(guò)弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂富集替曲朵辛。(d)調(diào)節(jié)含替曲朵辛溶液的pH值，并在一定時(shí)間內(nèi)通過(guò)活性炭與硅藻土柱。去除堿性氨基酸。(e)真空濃縮替曲朵辛溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述河豚魚內(nèi)部組織包括但不局限于卵巢。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟(a)中，所述水的重量為所述內(nèi)部組織重量的1.2到1.7倍。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(a)中，加乙酸的量為卵巢重量的0.1-1％。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(a)中，對(duì)浸取液采用加壓快速過(guò)濾的方法可重復(fù)3-4次。
6.如權(quán)利要求1所述的方法其進(jìn)一步的特征在于加熱浸取液的時(shí)間為3-25分鐘。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(b)中，加熱溫度為70℃到95℃。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(c)中，pH值調(diào)節(jié)到6.0-7.5，最好為7.0。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(d)中，用氨水調(diào)節(jié)含替曲朵辛溶液pH值為8-9。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(d)中，通過(guò)活性炭柱的時(shí)間應(yīng)控制在2-4小時(shí)內(nèi)。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(e)中，最佳濃縮溫度為40-50℃。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于在步驟(e)中，濃縮過(guò)程在4小時(shí)內(nèi)完成。
全文摘要
從河豚魚卵巢中提取替曲朵辛的方法包括以下5個(gè)步驟:第一步:用水和加入卵巢重量0.1%－1%的乙酸浸泡河豚魚卵巢數(shù)小時(shí),然后加壓快速過(guò)濾。第二步:加熱浸取液70－95℃除去可溶蛋白。第三步:用有機(jī)堿的水溶液(例如氨水)調(diào)節(jié)過(guò)濾出蛋白的清液pH值在6.0－7.5之間,過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂富集“替曲朵辛”。第四步:調(diào)節(jié)含替曲朵辛溶液的pH值并在一定時(shí)間內(nèi)通過(guò)活性炭與硅藻土柱,去除堿性氨基酸。第五步:真空濃縮純化”替曲朵辛”結(jié)晶。按照該提取方法,可將替曲朵辛的提取率提高到現(xiàn)有技術(shù)的3倍,即以100公斤河豚魚有毒卵巢計(jì)算,可以提取出純度為80－88%的“替曲朵辛”4－6克。
文檔編號(hào)C07D491/18GK1343669SQ0012451
公開日2002年4月10日 申請(qǐng)日期2000年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月18日
發(fā)明者周茂青, 沈希光 申請(qǐng)人:威克斯醫(yī)療儀器有限公司