專利名稱：抗變形鏈球菌粘附的多肽混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗細(xì)菌粘附的多肽，尤其是關(guān)于抗變形鏈球菌粘附的多肽混合物及其在制造防齲產(chǎn)品中的應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)表明，變形鏈球菌(streptococcus mutans)是主要的致齲細(xì)菌，主要有三個原因1.其產(chǎn)酸力強(qiáng)，產(chǎn)酸迅速，且耐酸。2.能合成細(xì)胞外多糖和細(xì)胞內(nèi)多糖，從而介導(dǎo)變形鏈球菌在牙面的粘附，參與菌斑基質(zhì)的形成，促進(jìn)菌斑成熟。3.對牙面有很高的親和力，并具有致光滑面齲的能力。變形鏈球菌表面蛋白SAI/II是目前研究最多且被認(rèn)為是變形鏈球菌較肯定的粘結(jié)素，研究顯示SAI/II可與牙面獲得性膜中的不同受體結(jié)合，如與粘蛋白，酸性蛋白等結(jié)合，這是致齲重要的步驟(劉天佳，《口腔疾病的微生物學(xué)基礎(chǔ)》PP.53-55，人民衛(wèi)生出版社，1999年)。
Kelly等在1990年(C.Kelly等，Archives of Oral Biology，35Suppl.，PP.33-38，1990)對變形鏈球菌表面蛋白SAI/II(185000分子量)的蛋白基因SpaP進(jìn)行了DNA測序。Kelly等又在1999年(C.Kelly等，NatureBiotechnology，17(1)，PP.42-47，1999)證實(shí)SAI/II155KD蛋白中對應(yīng)于1025-1044氨基酸殘基的多肽片段(稱作P1025，分子量3001道爾頓)有較強(qiáng)的抗粘附功能，并通過丙氨酸取代的方法證明Q1025，E1037及FVLV1041-1043是主要的結(jié)合位點(diǎn)，并用表面胞質(zhì)團(tuán)共振(Surface Plasmon Resouance)測定的方法證實(shí)，粘附抑制隨P1025多肽濃度的增加而增加，在濃度為100μmd時有最強(qiáng)的抑制。但Kelly等沒有給出最低的有效抑制濃度。
Kelly等用的P1025多肽是人工合成的19肽產(chǎn)物，純化后純度為97％。但實(shí)際應(yīng)用時，這樣高純度的產(chǎn)物作為防齲產(chǎn)品中的原料應(yīng)用，顯然會使生產(chǎn)成本過高，而使實(shí)際防齲產(chǎn)品的開發(fā)無法實(shí)現(xiàn)。
為此，本發(fā)明的目的是提供一種抗變形鏈球菌粘附的P1025多肽混合物，其中19肽占75-96.99重量％，18肽及18肽以下的多肽占3.01-25重量％，該多肽混合物在極低的濃度下也具有抗變形鏈球菌粘附的功能，能大規(guī)模大范圍應(yīng)用于預(yù)防蛀牙的防齲產(chǎn)品的開發(fā)。
本發(fā)明提供一種P1025多肽混合物，該多肽混合物含有由20個氨基酸殘基組成的19肽的P1025多肽及由19個或19個以下的氨基酸殘基組成的18肽及18肽以下的P1025不完全多肽。其中19肽占75-96.99重量％，18肽及18肽以下的多肽占3.01-25重量％。P1025多肽混合物為白色或微灰黃色粉末或細(xì)顆粒，分子量為230-3001道爾頓，能溶于水，呈無色或微白色透明或輕微乳白狀溶液。
19肽的P1025多肽的氨基酸順序是Glu-Leu-Lys-Thr-Ala-Asp-Leu-Pro-Ala-Gly-Arg-Asp-Glu-Thr-Thr-Ser-Phe-Val-Leu-Val本發(fā)明P1025多肽混合物的合成工藝P1025多肽混合物的合成工藝采用常用的固相合成法(參見黃惟德等，多肽合成，科學(xué)出版社，1985年)。肽鍵的逐步延長是在不溶性的樹脂小圓珠上進(jìn)行，合成多肽的羥基一端以共價鍵先結(jié)合到樹脂上，第二個氨基酸的氨基用叔丁基氧甲?；Ｗo(hù)后，以二異丙基碳二亞胺為縮合劑，接在第一個氨基酸的氨基上，重復(fù)這個步驟，使肽鏈按照上述P1025順序延長合成多肽。多肽合成到最后一步時，把樹脂懸浮在無水三氟乙酸中，通入干燥HBr，使多肽從樹脂上解離下來，同時一些保護(hù)基也被除去，得到的產(chǎn)物即為本發(fā)明P1025多肽混合物不作提純，直接冷凍干燥備用。
P1025多肽混合物合成工藝流程圖參見圖1。
為了表明本發(fā)明P1025多肽混合物對變形鏈球菌在牙面上粘附有抑制作用，采用H3標(biāo)記細(xì)菌羥磷灰石法對P1025多肽混合物進(jìn)行了體外抗粘附試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，P1025多肽混合物在濃度為1pmol-1μmol時，對變形鏈球菌(S.mutans Ingbritt)及遠(yuǎn)緣鏈球菌(S.sobrinus 6715)均有抑制作用，抑制作用隨多肽濃度增加而增加，多肽濃度在1μmol時有較強(qiáng)的抑制作用，但1pmol仍有有效抑制作用。
本發(fā)明P1025多肽混合物的抗粘附試驗(yàn)證明，它具有抗變形鏈球菌在牙面上粘附的生物功能，而且給出了最低的有效濃度為1pmol，因此P1025多肽混合物可以應(yīng)用來制成有利于預(yù)防蛀牙的各種防齲產(chǎn)品，如防齲漱口水，防齲牙膏，防齲口香糖、奶糖等糖果，防齲牛奶、酸奶、果奶等乳制品以及防齲飲料等有很大的開發(fā)應(yīng)用市場。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供一種P1025多肽混合物，其中19肽占75-96.99重量％，19肽純度要低于Kelly的報道值，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)也具有抗變形鏈球菌在牙面上粘附的生物功能。本發(fā)明P1025多肽混合物具有低濃度范圍的抑制作用，并給出了最低有效濃度1pmol，對變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌都有抑制作用。此外，由于本發(fā)明是一種多肽混合物，在合成工藝最后一步不要求作提純，直接冷凍干燥即可得產(chǎn)物凍干粉，因此得率高，生產(chǎn)成本低。而且由于作用濃度低，在制造防齲產(chǎn)品時僅需要加入極微量多肽混合物即可。本發(fā)明P1025多肽混合物適用于大規(guī)模大范圍的防齲產(chǎn)品的開發(fā)。
通過下列附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明范圍。


圖1是P1025多肽混合物合成工藝流程圖。
圖2是不同濃度的P1025多肽混合物對S.mutans Ingbritt細(xì)菌粘附于羥磷灰石的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果圖。
圖3是不同濃度的P1025多肽混合物對S.sobrinus 6715細(xì)菌粘附于羥磷灰石的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果圖。
實(shí)施例1 P1025多肽混合物體外抗粘附試驗(yàn)參見梁景平等，現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000年14卷第1期PP.1-3進(jìn)行以下試驗(yàn)。將P1025多肽混合物溶液(濃度為1pmol，10pmol，100pmol，1μmol)分別加入含有包被測試唾液的羥磷灰石顆粒40mg的Eppendorf管中，37℃，6rmp旋轉(zhuǎn)1小時，然后加入7ml含10uCi/ml3H-胸腺嘧啶(3H-TDR)的細(xì)菌懸液(變形鏈球菌S.mutans Ingbritt或遠(yuǎn)緣鏈球菌S.sobrinus 6715)37℃，6rmp旋轉(zhuǎn)1小時，用KCl緩沖溶液(含有0.05mol KCl，1mmolKH2PO4，1mmol CaCl2，1mmol MgCl2，PH6.0)洗三次，60℃烘干過夜。將Eppendorf管中加入1ml閃爍液(0.4％PPO(2，2’-對-苯撐-2，2(5-苯惡唑))液體閃爍測量儀(LS6500，Beckman公司)計數(shù)測量同位素放射量CPM。以同量標(biāo)記菌懸液60℃烘干過夜后，直接加入1ml閃爍液，作細(xì)菌總量對照；以KCL緩沖液代替多肽，與上述試驗(yàn)相同進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)步驟作為粘附陽性對照；以KCL緩沖液代替菌懸液，有多肽和無多肽的羥磷灰石顆粒與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)步驟，作為陰性對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，取均值。結(jié)果見圖2和圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P1025多肽混合物對S.mutans Ingbritt和S.sobrinus 6715細(xì)菌粘附于羥磷灰石有抑制作用，濃度在1μmol時為最強(qiáng)，但1pmol仍有有效抑制作用。
實(shí)施例2 P1025多肽混合物的合成稱取對甲基二苯甲胺樹脂(0.5-0.7meg)100mg，放入尼龍濾布袋中封口，一起放入50ml三角燒杯中，用5ml二氯甲烷洗滌樹脂，再用5％濃度的二異丙基乙胺每次5ml活化樹脂，處理二次。再用二氯甲烷每次5ml洗滌樹脂，洗滌二次。P1025多肽的氨基酸順序C末端是Val(纈氨酸)，用BOC-纈氨酸(叔丁氧羰基-纈氨酸)的二氯甲烷溶液(0.26mol/l)，2.2ml和偶聯(lián)縮合劑二異丙基碳二亞胺的二氯甲烷溶液(0.26mol/l)2.2ml在常溫下反應(yīng)4小時，接著用二氯甲烷洗滌樹脂及二甲基甲酰胺洗滌樹脂，用無水三氟醋酸5ml在常溫下反應(yīng)30分鐘，以解離氨基酸保護(hù)基團(tuán)，再用二氯甲烷5ml洗滌樹脂及異丙醇5ml洗滌樹脂，以去除殘余的三氟醋酸。按P1025C末端第二個氨基酸為亮氨酸，按上述步驟循環(huán)重復(fù)合成，這樣依次反復(fù)進(jìn)行，肽鏈就可按P1025多肽的順序延長，直到20個氨基酸全部接上去。多肽合成到最后一步時，把樹脂懸浮在無水三氟醋酸中，通入干燥HBr氣體，使多肽混合物與樹脂解離，同時一些保護(hù)基也被除去，該多肽混合物產(chǎn)物不作提純，直接于-20℃冷凍干燥，得P1025多肽混合物凍干粉(備用)。分子量是3001，多肽混合物中19肽占85重量％，18肽及18肽以下的多肽占15重量％。
實(shí)施例3 防齲牙膏的制備將實(shí)施例2制得的P1025多肽混合物凍干粉500mg溶于蒸餾水中，配制成濃度為1pmol的多肽溶液，并將它濃縮200倍制成用于制備防齲牙膏的濃縮液，然后按每1000g牙膏中加入600μg濃縮液的比例加入任何一種市售牙膏原料中混勻，即成防齲牙膏。
實(shí)施例4 防齲口香糖的制備將實(shí)施例2制得的P1025多肽混合物凍干粉500mg溶于蒸餾水中，配制成濃度為1pmol的多肽溶液，并將它濃縮50倍制成用于制備防齲口香糖的濃縮液，然后按每1000g口香糖中加入150μg濃縮液的比例加入任何一種市售口香糖原料中混勻，即成防齲口香糖。
實(shí)施例5 防齲牛奶的制備將實(shí)施例2制得的P1025多肽混合物凍干粉按3μg加入1000ml牛奶中的比例加入牛奶半成品中攪拌混勻，即成防齲牛奶。
權(quán)利要求
1.一種抗變形鏈球菌粘附的多肽混合物，其特征在于它是P1025多肽混合物，其中19肽占75-96.99重量％，18肽及18肽以下的多肽占3.01-25重量％。
2.權(quán)利要求1所述多肽混合物的應(yīng)用，其特征在于該多肽混合物在制備預(yù)防蛀牙的防齲產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.按權(quán)利要求2所述多肽混合物的應(yīng)用，其特征在于所述防齲產(chǎn)品是防齲漱口水、防齲牙膏、防齲口香糖、防齲糖果、防齲牛奶、酸奶、果奶及防齲飲料。
全文摘要
一種抗變形鏈球菌粘附的P
文檔編號C07K7/00GK1350002SQ00125739
公開日2002年5月22日 申請日期2000年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月20日
發(fā)明者江靜, 賀堅(jiān)慧, 俞炳耀, 遲波, 周文達(dá) 申請人:上海億康生物化學(xué)工程有限公司