專利名稱：：一種石蒜凝集素蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在石蒜中表達(dá)的l-Lectin(凝集素)蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。近20年來(lái)凝集素在生物學(xué)方面的應(yīng)用研究發(fā)展迅速，它最大的特點(diǎn)在于其能夠識(shí)別糖和糖類，每一種凝集素具有對(duì)某一種特殊的碳水化合物有專一結(jié)合的能力(AnnBiochem,1981,50207～231)。某些凝集素基因則具有較強(qiáng)的抗同翅目類昆蟲(chóng)包括蚜蟲(chóng)和飛虱功能(EntomolExpAppl,1993,66119～126；TransgenicRes,1995,418～25；EntomolExpAppl,1995,7551～59)。本發(fā)明中，我們?cè)谑庵锌寺〉窖┗ㄉ廹-Lectin凝集素(GNA)基因的同源基因l-Lectin。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本專利申請(qǐng)中提及的石蒜l-Lectin蛋白序列及其核酸序列。本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的石蒜基因l-Lectin，該基因是一個(gè)石蒜l-Lectin蛋白基因。本發(fā)明的第二目的是提供一種新的石蒜蛋白l-Lectin。本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述新的石蒜l-Lectin蛋白和核酸序列的方法。本發(fā)明還提供了這種石蒜l-Lectin蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有石蒜l-Lectin蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的石蒜l-Lectin蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是煙草。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有石蒜l-Lectin蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其步驟如下(1)將編碼具有石蒜l-Lectin蛋白活性多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成石蒜l-Lectin蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成石蒜l-Lectin蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)石蒜l-Lectin蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有石蒜l-Lectin蛋白活性的基本純的多肽。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.3中第32-508位的序列。本發(fā)明還提供了與l-Lectin蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，它包括多克隆抗體和單克隆抗體。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段己從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“石蒜l-Lectin蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有石蒜l-Lectin蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第32-508位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的編碼框第32-508位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO.3中第32-508位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDNO.4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的石蒜l-Lectin相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“石蒜l-Lectin蛋白或多肽”指具有石蒜l-Lectin蛋白活性的SEQIDNO.4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然石蒜l-Lectin相同功能的、SEQIDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括石蒜l-Lectin蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的石蒜l-Lectin多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與石蒜l-LectinDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗石蒜l-Lectin多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含石蒜l-Lectin多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括石蒜l-Lectin多肽的可溶性片段。通常，該片段具有石蒜l-Lectin多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中，“石蒜l-Lectin保守性變異多肽”是指與SEQIDNO.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGlu</table></tables>發(fā)明還包括石蒜l-Lectin蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然石蒜l-Lectin多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的石蒜l-Lectin多肽時(shí)，可以將石蒜l-Lectin編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成石蒜l-Lectin蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如煙草細(xì)胞等。還可用Nothern印跡法技術(shù)分析石蒜l-Lectin基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析石蒜l-Lectin的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。石蒜l-LectinDNA的Nothern印跡分析和石蒜l-Lectin特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實(shí)石蒜l-Lectin在生物樣本中的表達(dá)。此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有石蒜l-Lectin核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼石蒜l-Lectin的核酸分子。本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在石蒜l-Lectin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于石蒜l-Lectin核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的石蒜l-Lectin核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選石蒜l-Lectin同源基因或同源蛋白。為了得到與石蒜l-Lectin基因相關(guān)的石蒜cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選石蒜cDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)石蒜l-Lectin的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自石蒜的文庫(kù)。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech,Stratagene,PaloAlto,Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與石蒜l-Lectin相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的石蒜l-Lectin核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過(guò)先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明石蒜l-Lectin蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity,CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。利用本發(fā)明的石蒜l-Lectin蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與石蒜l-Lectin發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。表2為本發(fā)明的石蒜l-Lectin蛋白與雪花蓮g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的核苷酸序列(GenBankAccessionNo.M55556)的同源比較(FASTA)表。表3為本發(fā)明的石蒜l-Lectin蛋白與雪花蓮g-Lectin凝集素(GNA)蛋白的氨基酸序列(GenPeptAccessionNo.AAA33346)的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1石蒜l-Lectin基因的克隆1．組織分離(isolation)石蒜葉片來(lái)源于上海中醫(yī)藥大學(xué)，采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。2．mRNA的分離(mRNAisolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzolReagents,Gibco,NY,USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。3．基因的全長(zhǎng)克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據(jù)雪蓮花和其它石蒜科凝集素氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)3’---RACEPCR(AP+99001SSF2)得到99001SS3’(0.4kb)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer,USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知石蒜科植物凝集素基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)凝集素基因。(2)．5’-RACE第一輪PCR(AAP+99001SSR2)第二輪PCR(AUAP+99001SSR3)得到99001SS5’(0.4kb)(過(guò)程同(1))(3)．PCR擴(kuò)增99001SS編碼區(qū)(99001SSF1+R1)得到99001SS編碼區(qū)(0.5kb)(過(guò)程同(1))。BLAST的結(jié)果證明從石蒜中新得到的基因確為一個(gè)植物凝集素基因。由于已知的同源凝集素(GNA)基因具有較強(qiáng)的抗同翅目類昆蟲(chóng)包括蚜蟲(chóng)和飛虱功能(Hilder等，1995；Powell等，1993,1995；)，故推測(cè)此基因具有相同的功能。通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的石蒜l-Lectin蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開(kāi)放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物R15’-CCCAAACAAGCAAATCAACA-3’(SEQIDNO.1)為正向引物，寡核苷酸R25’-GCATGGAAGTTGCGTACAAG-3’(SEQIDNO.2)為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、59℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為669bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得SEQIDN0.3所示的序列。實(shí)施例2石蒜l-Lectin基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的石蒜l-Lectin全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為669bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO.3，其中開(kāi)放讀框位于32-508位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出石蒜l-Lectin的氨基酸序列，共158個(gè)氨基酸殘基，分子量17412.98，pI為8.28。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO.4。將l-Lectin的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與雪花蓮的g-Lectin(GNA)基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與雪花蓮g-Lectin基因的mRNA全編碼序列(GenBankAccessionNo.M55556)有83.4％的相同性(見(jiàn)表2)，在氨基酸水平上，它與雪花蓮g-Lectin蛋白(GenPeptAccessionNo.AAA33346)的第1-158位氨基酸殘基有72.7％的相同性和82.0％的相似性(見(jiàn)表3)。由上可見(jiàn)，l-Lectin基因與雪花蓮g-Lectin(GNA)基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。實(shí)施例3石蒜l-Lectin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1．石蒜l-Lectin蛋白的氨基酸序列blocks分析。將石蒜l-Lectin蛋白的氨基酸序列在blocks數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http//www.blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果(1)在氨基酸序列中，存在以下結(jié)構(gòu)域區(qū)加框區(qū)(24-49,64-98,103-122)Lectin蛋白功能模塊(Lectin)。(2)功能分析在該基因氨基酸序列中存在Lectin蛋白功能模塊，因而可預(yù)見(jiàn)其的確具有相應(yīng)功能。2．石蒜l-Lectin蛋白的氨基酸序列的前體蛋白和成熟蛋白分析。通過(guò)對(duì)石蒜l-Lectin蛋白同其它植物凝集素的核苷酸序列和氨基酸序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)石蒜l-Lectin蛋白基因編碼一前體蛋白含有信號(hào)肽序列、成熟蛋白序列和C-末端肽序列，按vanHeijne(1986)等預(yù)測(cè)凝集素蛋白信號(hào)肽的規(guī)則和對(duì)石蒜l-Lectin蛋白同其它植物凝集素如GNA蛋白的比較，鑒定出石蒜l-Lectin蛋白的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在第23氨基酸(S)和第24氨基酸(D)之間，該位置也符合目前已知的大多數(shù)甘露糖專一結(jié)合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA,VanDamme等，1991)、君子蘭凝集素(VanDamme等，1994)等的凝集素蛋白的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。通過(guò)比較大多數(shù)甘露糖專一結(jié)合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA,VanDamme等，1991)、君子蘭凝集素(VanDamme等，1994)等的凝集素蛋白的C-末端肽序列的剪切位置，以及SDS-PAGE垂直變性蛋白電泳顯示石蒜l-Lectin成熟蛋白為12KD(與GNA和君子蘭凝集素成熟蛋白大小相似，均為12KD，見(jiàn)圖1)，推測(cè)出石蒜l-Lectin蛋白的C-末端肽的剪切位置在第132位的H和第133位的R之間。因此，石蒜l-Lectin蛋白得凝集素成熟蛋白序列為DNILHSGKTLSPGEFLSYRSYVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSSGCHLSMQSDGNLVVYSPQNRPIWASDTGGQNDANYVLILQKDRNVVIYGPATLGHWNLH圖1．SDS-PAGE垂直蛋白電泳結(jié)果。1石蒜l-Lectin蛋白；2蛋白大小標(biāo)準(zhǔn)3雪花蓮g-Lectin(GNA)蛋白。所有蛋白樣品均在電泳前經(jīng)沸水中煮沸10分鐘變性處理。3．石蒜l-Lectin蛋白的專一結(jié)合糖基化分析。通過(guò)對(duì)石蒜l-Lectin蛋白同其它植物凝集素蛋白如雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素、水仙凝集素等的專一結(jié)合糖基化分析，發(fā)現(xiàn)石蒜l-Lectin蛋白同大多數(shù)甘露糖專一結(jié)合的凝集素如雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素、水仙凝集素等一樣，具有3個(gè)典型的甘露糖專一結(jié)合位點(diǎn)盒(QDNY)，見(jiàn)下表(表中甘露糖專一結(jié)合位點(diǎn)盒QDNY用方框框住)。因此證明石蒜l-Lectin蛋白也同雪花蓮凝集素(GNA)、君子蘭凝集素等一樣，為甘露糖專一結(jié)合的凝集素蛋白。實(shí)施例4石蒜l-Lectin多肽的制備和提純?cè)谠搶?shí)施例中，將全長(zhǎng)的石蒜l-Lectin編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。將石蒜l-Lectin多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)石蒜l-Lectin的成熟蛋白編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對(duì)應(yīng)于編碼序列5’和3’端的約20個(gè)以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將石蒜l-Lectin基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia,Piscataway,NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-l-Lectin表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-l-Lectin。表達(dá)GST-l-Lectin重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-l-Lectin工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0,1,2,3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-l-Lectin融合蛋白的工程菌。GST-l-Lectin融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-l-Lectin融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-l-Lectin。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20mlPBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-l-Lectin的谷胱苷肽Sepharose4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μlPBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE變性蛋白電泳，檢測(cè)純化效果。在12kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為石蒜l-Lectin成熟蛋白。實(shí)施例5石蒜l-Lectin蛋白或多肽在煙草細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)含目的基因(石蒜l-Lectin基因)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)石蒜l-Lectin的全長(zhǎng)編碼序列(SEQIDNO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將石蒜l-liectincDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121)，在保證閱讀框架的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤(pán)法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草1．用無(wú)菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽(yáng)性菌落，接種于2mlYEB液體(Sm+,Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；2．室溫下4,000g離心10min；3．棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600=0.5左右；4．取生長(zhǎng)兩周左右的煙草的無(wú)菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見(jiàn)方的小葉片；5．將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無(wú)菌濾紙上吸干菌液；6．把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時(shí)；7．將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kam50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見(jiàn)愈傷組織的形成；8．約20天后可見(jiàn)分化芽長(zhǎng)出，待芽長(zhǎng)大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kam25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9．等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。利用westernblot檢測(cè)GNA蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)1．蛋白的提取a)取50mg葉片，加入100ul1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl0.2g/l，NaCl8g/l)于1.5mleppondorf管中研磨；b)13000，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過(guò)程于冰上進(jìn)行。2．蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1mlBradford試劑，混勻后，分光光度計(jì)測(cè)OD595；蛋白含量計(jì)算1OD595=0.035ug。3．SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加樣前，將樣品置于含50mmol/LDTT的加樣緩沖液(2*加樣緩沖液甘油2.4g，1MTris-HClpH6.81ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；b)室溫100V電壓下聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部。4．蛋白質(zhì)向硝酸纖維膜上轉(zhuǎn)移a)轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmolTrisBase，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；b)室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移1h，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；5．膜上蛋白的檢測(cè)a)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動(dòng)、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml1*PBS(含0.5g疊氮鈉))；b)再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；c)加入第一抗體(抗石蒜l-Lectin的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌三次；d)加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌兩次；e)加入底物顯色顯色觀察蛋白條帶。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)．分子類型寡核苷酸(ⅲ)．序列描述SEQIDNO.1CCCAAACAAGCAAATCAACA20(2)SEQIDNO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅲ)序列描述SEQIDNO.2GCATGGAAGTTGCGTACAAG20(3)SEQIDNO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度669bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核苷酸(ⅲ)序列描述SEQIDNO.31CCCAAACAAGCAAATCAACACAAATTACAGAATGGCTAAGCCAAGTTTCC51TCATTCTGGCCACCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGT101GACAATATTCTGCACTCTGGCAAGACTCTCTCTCCCGGTGAATTTCTCAG151CTACCGTAGTTACGTTTTCATCATGCAGGAGGACTGCAATCTGGTCTTGT201ATGACGTCGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGCCTCTCCTCC251GGTTGCCACCTCAGCATGCAGTCCGATGGGAACCTGGTCGTGTACAGCCC301ACAGAACAGGCCGATCTGGGCGAGCGACACTGGGGGCCAGAACGATGCAA351ACTATGTGCTAATTCTTCAGAAGGACAGGAACGTTGTGATCTATGGACCT401GCGACGTTGGGCCACTGGAACTTACACCGGAACTGTTGGAATTCCCGGAT451CAGCGCCTGCGGGAAATATCCTACTGCTGGAATGATAAAGTTAGTGACCA501ACAAGTAATGACCGGTGATCTTTGAGCCTTGCATGCATGTGGAAGAGTAA551AAAATATGTGCATTTGAGACAATGCACATGGTGTTGTGGACCTAAAAATA601AATAATTATCGTGTATTGGATGTAAATGTAGTTCTGCTGCCTAGCTTAGT651TCCTTGTACGCAACTTCCA(4)SEQIDNO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度158氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅲ)序列描述SEQIDNO.41MAKPSFLILATIFLGVITPSCLSDNILHSGKTLSPGEFLSYRSYVFIMQE51DCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSSGCHLSMQSDGNLVVYSPQNRPIWASDT101GGQNDANYVLILQKDRNVVIYGPATLGHWNLHRNCWNSRISACGKYPTAG151MIKLVTNK表2l.seq石蒜l-Lectin蛋白的核酸序列g(shù).seq雪花蓮g-Lectin蛋白的核酸序列(GenBankAccessionNo.M55556)表372.7％identityin161aaoverlap，82.0％similarityin161aaoverlapl.pep石蒜l-Lectin蛋白氨基酸序列g(shù).pep雪花蓮g-Lectin蛋白氨基酸序列(GenBankAccessionNo.AAA33346)權(quán)利要求1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有石蒜l-Lectin蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列雜交。2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列。4．一種分離出的石蒜l-Lectin蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。6．一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于它包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。8．一種產(chǎn)生具有石蒜l-Lectin蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，特征在于其步驟如下(1)將編碼具有石蒜l-Lectin蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成石蒜l-Lectin蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第32-508位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成石蒜；l-Lectin蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)石蒜l-Lectin蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有石蒜l-Lectin蛋白活性的基本純的多肽。9．一種能與權(quán)利要求7所述的石蒜l-Lectin蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體，其特征在于它包括多克隆抗體和單克隆抗體。10．一種核酸分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。11．一種用于檢測(cè)樣品中是否存在石蒜l-Lectin核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用權(quán)利要求10所述探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于石蒜l-Lectin核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長(zhǎng)度為15～50個(gè)核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種在石蒜中表達(dá)的新的1－Lectin蛋白及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測(cè)石蒜1－Lectin核酸序列和多肽的方法。文檔編號(hào)C07K14/415GK1299870SQ00127700公開(kāi)日2001年6月20日申請(qǐng)日期2000年12月4日優(yōu)先權(quán)日2000年12月4日發(fā)明者唐克軒,姚劍虹,孫小芬申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)