專利名稱：土槿乙酸衍生物及其藥物組合及在抗腫瘤抗真菌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物，涉及某些具有與天然的和合成的土槿乙酸衍生物及其藥物組合，其在抗腫瘤、抗病毒、抗真菌活性藥學(xué)中的用途。
土槿皮，又叫土荊皮、金錢松、水松皮、荊樹皮，來源為松科植物金錢松Pseudolarix amabilis(Nelson)Regd.[P.kaempferi Gord]的根皮和近根樹皮。土槿皮性辛，溫。有毒，止癢殺蟲。最早見于清代趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》，是指四川以外的地區(qū)所產(chǎn)的木槿之皮，用于治療癬癥。自50年代以來土槿皮發(fā)展成抗真菌藥物，主要用于治療手腳癬、神經(jīng)性皮炎、濕疹、癩痢頭等(中藥材，1994.02.15；17(2)15～19)。其中的土槿酸，有抑制我國常見的致病真菌作用(中華皮膚科雜志，1960，818)。后來，經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)一步分離得土槿甲酸(1)、土槿乙酸(2)和土槿丙酸(3)等。其中土槿乙酸(pseudolaric acid B)是主要成分，分子式C23H30O8，結(jié)構(gòu)式為2.(化學(xué)學(xué)報(bào)，1982，40，447).此外尚有土槿甲酸苷和土槿乙酸苷。藥理研究表明土槿總酸有抑制我國常見致病真菌的作用。 R1R2R31.CH3COCH3H2.COOCH3COCH3H3.COOH COCH3H4.COOH H H5.CH3H H6.CH3COCH3CH37.COOCH3H CH3
8.CH3H CH3目前臨床上應(yīng)用較多的有抗真菌抗生素，如灰黃霉素、制菌霉素、兩性霉素B、克念霉素等；水楊酸類如水楊酸、水楊酰胺和化學(xué)合成的抗真菌唑類藥物，如克霉唑、咪康唑、益康唑、酮康唑、伊康唑、氟康唑等。其中尤以唑類藥物發(fā)展迅速，肟康唑、芬康唑、的康唑、異康唑、聯(lián)苯芐唑等先后出現(xiàn)，此外還合成了親脂性的新型唑類抗真菌藥，但上述藥物多不同程度地存在毒性或刺激性較大的缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用，因此，人們將目光轉(zhuǎn)向了天然產(chǎn)物。
本發(fā)明的一方面提供了通式(I)化合物 其中Y分別獨(dú)立地表示O或NH；R1獨(dú)立地表示甲基或COXR’，其中X獨(dú)立地表示O或NH，R’獨(dú)立地表示H，烷基；鏈烯基；芳基(未取代的或1個(gè)、2個(gè)獨(dú)立地選自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)；雜環(huán)基；雜環(huán)烷基；goniotriol。)，R3分別獨(dú)立地表示H，烷基，鏈烯基，芳基(未取代的或1個(gè)、2個(gè)獨(dú)立地選自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)，雜環(huán)基，雜環(huán)烷基，goniotriol。R2表示H，烷基，烷基?；?，芳基烷?；蓟；?，雜環(huán)基酰基，鏈烯基酰基，芳基(未取代的或1個(gè)、2個(gè)獨(dú)立地選自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)?；?br> 當(dāng)該化合物為已知的土槿乙酸及甲酸單體時(shí)的抗真菌，抗病毒，抗腫瘤活性。
本發(fā)明還包括應(yīng)用式(I)化合物治療腫瘤，病毒和真菌。
可以用藥學(xué)上適用的堿成鹽。本發(fā)明化合物的醫(yī)藥上允許的鹽的制造方法。以使用將在有機(jī)合成化學(xué)領(lǐng)域中通常使用的方法進(jìn)行適當(dāng)組合后形成的組合物。
本發(fā)明還包括一個(gè)應(yīng)用式(I)的藥物組合物，或多種藥物賦形劑的藥物組合物。具體講，如可以堿性溶液對含有游離的本發(fā)明化合物的溶液成鹽。
將本發(fā)明化合物作為抗腫瘤制劑或抗真菌制劑使用時(shí)的藥劑形態(tài)可以選擇各種形態(tài)，例如片劑、膠囊、散劑、顆粒制劑、液體制劑等，將本發(fā)明化合物作為口服抗腫瘤制劑或抗真菌制劑使用時(shí)的藥劑形態(tài)，可以選擇各種形態(tài)，例如片劑、膠囊、散劑、顆粒制劑、液體制劑等。
將本發(fā)明化合物作為非口服制劑等.可以選擇各種形態(tài)如注射劑，外用的霜劑，栓劑，液體制劑等。賦形制劑一般含有0.1～100重量％、最好含有1～100重量％的有效成分。
本發(fā)明化合物的實(shí)際理想的給藥量可以根據(jù)使用的化合物的種類、配合的組合物的種類、適用的頻度以及可以治療的疾病的部位和患者確定。
本發(fā)明化合物可以按以下方式提取，分離，合成。實(shí)例土槿乙酸呋喃-2甲酯(A)的合成 土槿皮10kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇滲漉，所得浸膏用乙醚或苯提取，蒸去溶劑后得1.6kg提取物。經(jīng)柱硅膠層析，收集7∶3石油醚-乙醚流分，經(jīng)多次柱層析得土槿皮乙酸7.2g，在石油醚-乙醚中重結(jié)晶得柱狀晶m.p.127.3-128.5℃(文獻(xiàn)127-128℃)和混合物A(主要成分是土槿皮甲酸)。IR(KBr)cm-13550(COOH)，2950，1700(C＝O)，1220.
土槿乙酸0.35g(0.9mmol)溶于100ml無水CH2Cl2中，依次加入糠醇2.4g(24mmol)，DCC 1.9g(30mmol)及催化量DMAP，室溫?cái)嚢?4h。反應(yīng)物經(jīng)硅藻土過濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析(乙醚∶石油醚1∶1)，得無色固體100.29g，收率68.85％.乙醚-石油醚中重結(jié)晶，無色柱晶，mp.117-118℃。1HNMR(300MHz，CDCl3)δppm1.62(3H，s，C11Me)；1.95(3H，d，J＝1.2Hz，C16Me)；2.12(3H，s，OCOCH3)；1.62-2.12，2.61-3.28(11H，m，CH)；3.71(3H，s，C19OCH3)；5.13(2H，s，C’-H2O)；5.86(1H，d，J＝15.9Hz，C13-H)，6.35(1H，d，J＝2.1，C’4-H)，6.35(1H，d，J＝2.1，C’6-H)6.51(1H，dd，J＝3.6 15.9Hz，C14-H)，7.14-7.19(2H，m，C8-H；C15-H 3’，5’-H)，7.42(1H，d，d J＝0.6，0.6Hz，5’-H).C28H32O9[α]16D-35.1(EtOH，c 0.11)，元素分析M512.55。計(jì)算值％C 65.61 H 6.29；實(shí)測值％C，H溶解性可溶于甲醇、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析Rf值0.67，展開溶劑乙醚∶石油醚(2∶1)本發(fā)明的式(1)化合物在作為抗腫瘤制劑或抗病毒制劑或抗真菌制劑可以使用。例1材料 RPMI1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，Hoechst33342和碘化丙啶(PI)均為Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所生產(chǎn)。瓊脂糖和溴化乙錠(EB)為Sigma公司產(chǎn)品，細(xì)胞系K562細(xì)胞系由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)所饋贈，常規(guī)培養(yǎng)于10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中37℃，5％CO2溫育24h傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別經(jīng)1×10-4mol/L，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L土槿乙酸處理，另設(shè)對照組不加土槿乙酸繼續(xù)培養(yǎng)30h，收集細(xì)胞作凋亡細(xì)胞檢測。
用Hoechst33342/PI熒光雙染法檢測細(xì)胞凋亡比例。
DNA電泳分析 收集2×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌，按常規(guī)方法提取DNA，溶于30ulTE中；1％瓊脂糖凝膠(含0.5ug/ml溴化乙啶)，電壓50v，電泳4h后，紫外燈下拍照。
倒置光顯微鏡觀察 K562細(xì)胞為懸浮生長，細(xì)胞呈圓形，土槿乙酸在1×10-4M～1×10-6M的濃度范圍內(nèi)用藥19h，可見細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞變?yōu)闄E圓形，桿狀，亞鈴形，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞密度下降，并有膜包凋亡小體形成。
熒光顯微鏡觀察 經(jīng)熒光雙染法，可見對照組細(xì)胞核均勻一致，被hoechst33342染成蘭色熒光。連續(xù)培養(yǎng)40h后，可見有40％以上細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、邊移，出現(xiàn)多個(gè)染色質(zhì)凝集小體，被hoechst33342染成蘭色熒光。
MTT法測定結(jié)果 結(jié)果見(表1)所示。不同濃度土槿乙酸處理細(xì)胞48h，明顯抑制K562細(xì)胞生長，抑制率呈濃度依賴關(guān)系，其IC50值是5×10-5M。
表1土槿乙酸作用K562細(xì)胞48h后的抑制率組別藥物濃度(mol/L)A570抑制(％)空白組 0.359±0.019對照組 1.430±0.062實(shí)驗(yàn)組 5×10-40.580±0.044* 79.371×10-40.743±0.081* 64.155×10-50.794±0.105* 59.381×10-51.019±0.089* 38.385×10-61.170±0.052* 24.281×10-61.179±0.069* 23.445×10-71.286±0.094 13.451×10-71.330±0.098 9.34*與對照組比較P＜0.01.DNA瓊脂糖凝膠電泳分析 凋亡細(xì)胞典型的生化改變之一是核酸分子被核酸內(nèi)切酶在核小體之間切成180bp左右及其倍數(shù)的DNA片段組成的“DNAladder”。1×10-5M和1×10-6M兩種濃度土槿乙酸處理K562細(xì)胞，在40h時(shí)出現(xiàn)清晰的“DNA ladder”。例2參照文獻(xiàn)方法將對數(shù)生長期細(xì)胞稀釋成1×104cell/ml，立即接種于96孔培養(yǎng)板，0.1ml/孔，然后在實(shí)驗(yàn)孔中加入含不同濃度的培養(yǎng)基，每濃度平行3孔，對照組加等體積容劑，置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96小時(shí)，離心(1000rpm，20min)，棄上清液，每孔加0.2ml新鮮配制的0.2mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，再離心，傾出血清后，0.2ml DEIMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型超聲震蕩器震蕩5min混勻，在MR700型酶標(biāo)儀上測定570nm處的光密度，計(jì)算抑制腫瘤細(xì)胞生長率IC50化合物A對A2780的抑制率為3.12×10-5mol/L，K562細(xì)胞的抑制率為7.15×10-5mol/L?；衔顰的抗真菌活性紅色毛癬菌(BMU-16467)，須癬毛癬菌(BMU-16466，ATCC-28185)，白色念珠菌(BMU-16443，ATCC-11006)1實(shí)驗(yàn)方法參照試管稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)。2結(jié)果菌株MIC(mg/ml) MFC(mg/ml)紅色毛癬菌(BMU-16467) 18.822.6須癬毛癬菌(BMU-16466，ATCC-45.349.528185)白色念球菌(BMU-16443，ATCC-73.695.211006)
權(quán)利要求
1.一種土槿乙酸衍生物及其組合物，其特征為 其中Y分別獨(dú)立地表示O或NH；R1獨(dú)立地表示甲基或COXR’，其中X獨(dú)立地表示O或NH，R’獨(dú)立地表示H，烷基；鏈烯基；芳基(未取代的或1個(gè)、2個(gè)獨(dú)立地選自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)；雜環(huán)基；雜環(huán)烷基；goniotriol。)，R3分別獨(dú)立地表示H，烷基，鏈烯基，芳基(未取代的或1個(gè)、2個(gè)獨(dú)立地選自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)，雜環(huán)基，雜環(huán)烷基，goniotriol。R2表示H，烷基，烷基酰基，芳基烷?；?，芳基?；?，雜環(huán)基酰基，鏈烯基酰基，芳基(未取代的或1個(gè)、2個(gè)獨(dú)立地選自氯、溴、氟、甲氧基、硝基芳烷基)?；?。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土槿乙酸及其衍生物，其特征為該化合物為土槿乙酸及其衍生物及甲酸單體時(shí)，可應(yīng)用在抗真菌，抗腫瘤活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土槿乙酸及其衍生物的制造方法，其特征為本化合物可以采用醫(yī)藥上允許的鹽的制造方法，使用有機(jī)合成化學(xué)領(lǐng)域中通常使用的方法進(jìn)行適當(dāng)組合后形成的醫(yī)藥上允許的鹽組合物。
全文摘要
一種土槿乙酸衍生物及其組合物具有抗腫瘤細(xì)胞活性、抗病毒活性及抗真菌活性。本化合物可以是醫(yī)藥上允許的鹽。其中虛線獨(dú)立地表示可有可無的鍵;Y分別獨(dú)立地表示O或NH;R
文檔編號C07C69/757GK1361106SQ0013666
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月29日
發(fā)明者陳虹, 李靈芝, 胡迎慶 申請人:中國人民武裝警察部隊(duì)醫(yī)學(xué)院