專利名稱：人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)的發(fā)明是有關(guān)在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中表達(dá)的基因群的發(fā)明。更詳細(xì)地講，本申請(qǐng)發(fā)明涉及到由在人樹突狀細(xì)胞中高度表達(dá)的100個(gè)基因組成的基因集合體，與人單核細(xì)胞相比在人樹突狀細(xì)胞中表達(dá)頻率高和低的各100個(gè)基因組成的基因集合體，這些基因群的相應(yīng)的cDNA群、這些基因群中包含的新基因(群)，以及用于特別確定這些基因和cDNA的寡核苷酸的集合體。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞群(dendritic cells:DCs)在諸如為CD4+原初的T細(xì)胞呈遞抗原等免疫系統(tǒng)中起著及其重要的作用。也有報(bào)道說DCs與B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白以及T細(xì)胞耐受性有直接的關(guān)系。淋巴細(xì)胞以及非淋巴組織的DCs由于它們表面的標(biāo)記和功能各不相同，因此有不同的稱呼(例如，來自皮膚的稱為朗氏細(xì)胞；來自淋巴節(jié)的稱為交錯(cuò)樹突細(xì)胞(interdigitating DC)；來自心臟、肺、腎和睪丸的稱為間質(zhì)DC；來自胸腺的稱為胸腺DC等)。
人們一直認(rèn)為DCs是屬于與單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞不同的另外系統(tǒng)，但據(jù)報(bào)道巨噬細(xì)胞和DCs是來自共同的干細(xì)胞。而據(jù)報(bào)道人DCs是在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或腫瘤壞死因子(TNF)-α的存在下由臍帶血和骨髓分離出的CD34+前體細(xì)胞生成的。另外也有報(bào)道說，與GM-CSF和白介素(IL)-4共同培養(yǎng)的血液單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變和分化為具有DCs形態(tài)、功能特征的非附著性的CD1a+CD14low/o。另外也已經(jīng)了解到DCs由于TNF-α、CD40配體、LPS或單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基的刺激向表達(dá)CD38的成熟DCs轉(zhuǎn)變。
然而，雖然知道DCs是從單核細(xì)胞分化的細(xì)胞，但現(xiàn)狀是其分化的過程還沒有完全闡明。
闡明由單核細(xì)胞向DCs分化的過程不僅是為了理解免疫系統(tǒng)的功能，而且對(duì)于與樹突狀細(xì)胞有關(guān)的各種疾病的診斷和治療的新的手段的開發(fā)也非常重要。為了闡明由單核細(xì)胞向DCs的分化過程，指認(rèn)在各個(gè)細(xì)胞中表達(dá)頻率高或低的基因群是一種有效的手段。
本申請(qǐng)發(fā)明是借鑒以上那樣的報(bào)道而形成的發(fā)明，以提供由在人樹突狀細(xì)胞表達(dá)的基因中表達(dá)最多的前100個(gè)基因組成的基因群作為課題。
另外提供由該基因群的各個(gè)cDNA組成的cDNA群、基因群中包含的新的基因(群)以及用于特定基因群和cDNA群的寡核苷酸群也是本申請(qǐng)的課題。
另外提供與單核細(xì)胞相比，由在來自單核細(xì)胞的人樹突狀細(xì)胞中表達(dá)頻率更高的前100個(gè)基因和表達(dá)頻率較低的前100個(gè)基因分別組成的基因群也是本申請(qǐng)的課題，而提供有關(guān)這些基因群的各個(gè)cDNA群、新的基因群和寡核苷酸群也是本申請(qǐng)的課題。
發(fā)明的公開本申請(qǐng)作為解決上述課題的發(fā)明，提供在人樹突狀細(xì)胞中表達(dá)的基因群，其特征是該基因群由在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞的基因中表達(dá)最多的前100個(gè)基因組成的，各個(gè)基因的cDNA連接在最靠近聚A區(qū)的堿基序列5’-CATG-3’上、分別具有序列1-100的堿基序列；提供由該基因群的各個(gè)cDNA組成的cDNA群；該基因群中包含的新基因，以及各該新的基因編碼的新的蛋白質(zhì)、抗體和拮抗劑，以及提供連接在堿基序列5’-CATG-3’上，由序列1-100的各個(gè)堿基序列組成的寡核苷酸群。而優(yōu)選的狀態(tài)是在該人樹突狀細(xì)胞中表達(dá)最多的基因群中，編碼具有序列1堿基序列的cDNA編碼的基因的表達(dá)頻率最高，其余99個(gè)基因的表達(dá)頻率依次為序列2-100號(hào)。
本申請(qǐng)還提供人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群，其特征是該基因群是與人單核細(xì)胞相比，由在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中更多表達(dá)的基因中表達(dá)最多的前100個(gè)基因組成的，各個(gè)基因的cDNA連接在最靠近聚A區(qū)的堿基序列5’-CATG-3’上、分別具有序列101-200的堿基序列；提供由該基因群的各個(gè)cDNA組成的cDNA群， 包含在該基因群中的新的基因，以及各該新的基因編碼的新的蛋白質(zhì)、抗體和拮抗劑，以及提供連接在堿基序列5’-CATG-3’上，由序列101-200的各個(gè)堿基序列組成的寡核苷酸群。而作為優(yōu)選的狀態(tài)是在該人樹突狀細(xì)胞中表達(dá)增加的基因群中，編碼具有序列101堿基序列的cDNA的基因的表達(dá)頻率與人單核細(xì)胞中該基因表達(dá)頻率之間的差最大，而其余99個(gè)基因的表達(dá)頻率與在人單核細(xì)胞中該基因表達(dá)頻率之間的差依次為102-200。
另外，本申請(qǐng)?zhí)峁┤藰渫粻罴?xì)胞中表達(dá)基因群，其特征是該基因群是與人單核細(xì)胞相比，由在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中表達(dá)較低的基因中表達(dá)最低的前100個(gè)基因組成的，各個(gè)基因的cDNA連接著最靠近聚A區(qū)的堿基序列5’-CATG-3’上、分別具有序列201-300的堿基序列；提供由該基因群的各個(gè)cDNA組成的cDNA群；在該基因群中包含的新基因，以及屬于該新基因群的各個(gè)基因編碼的新的蛋白質(zhì)、相應(yīng)的抗體和拮抗劑，以及提供連接在堿基序列5’-CATG-3’上、由序列201-300的各個(gè)堿基序列組成的寡核苷酸群。而作為優(yōu)選狀態(tài)是在該人樹突狀細(xì)胞表達(dá)低的基因群中，編碼含有序列201堿基序列的cDNA的基因的表達(dá)頻率與該基因在人單核細(xì)胞中的表達(dá)頻率之間的差最大，其余99個(gè)基因的表達(dá)頻率與該基因在人單核細(xì)胞中表達(dá)頻率之間的差依次為202-300。
由本申請(qǐng)的上述發(fā)明提供的各個(gè)基因群是由連接在堿基序列5’-CATG-3’上的序列1-300的Tag序列而特定的基因的各個(gè)集合體，這些由14bp組成的基因信息對(duì)鑒定各個(gè)基因的全長是十分有用的信息，通過克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)和它們的功能的解析，例如對(duì)人感染癥或炎癥疾病的診斷、監(jiān)控和預(yù)后的判定非常有用。另外cDNA群和寡核苷酸群作為對(duì)上述那樣疾病診斷用的微陣列或DNA芯片等的材料是很有用的。另外由于新的基因群參與人感染癥或炎癥疾病的成因的可能性很高，所以這些基因編碼的蛋白質(zhì)、其抗體、拮抗劑作為藥物開發(fā)的材料是很有用的。
附圖的簡要說明

圖1是對(duì)來自人血液單核細(xì)胞的DCs的表型進(jìn)行分析的熒光分析的結(jié)果。
圖2是在單核細(xì)胞和DCs中基因表達(dá)的比較結(jié)果。
圖3是4個(gè)人的血液供體(A、B、C、D)的單核細(xì)胞、GM-巨噬細(xì)胞以及DCs中的9個(gè)基因的RT-PCR分析的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方案本發(fā)明的各個(gè)人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群是在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中表達(dá)的100種不同種類的基因的集合體，這些基因群是通過眾所周知的SAGE基因表達(dá)順次分析法，Serial Analysis of GeneExpression法(Science 276:1268,1997；Cell 88:243,1997；Science270:484,1995；Nature 389:300,1997；美國專利第5,695,937號(hào))特別確定的。該SAGE法是確定賦予各個(gè)cDNA特征的10個(gè)堿基對(duì)DNA序列(Tag，標(biāo)記)的方法，這些cDNA是由在任意細(xì)胞表達(dá)的基因制備的。而通過由所得到的所有的Tag算出各個(gè)Tag的比例，也可確定各個(gè)基因的表達(dá)頻率(拷貝數(shù))。到目前為止，使用SAGE法分析了以下的基因表達(dá)。Cololectal癌輻照下的G2抑制(G2 arrest incololectal cancer irradiation)(Molecular Cell 1:3-1 1,1997)；油酸鹽培養(yǎng)基與Pip2q調(diào)節(jié)(Oleate medium and Pip2q regulation)(18屆國際酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)大會(huì)，18thIntemationalConference on Yeast Genetics and Molecular Biologys107:58,1997)；大鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Rat embryo fibroblast cells)(Oncogene 15:1079-1085,1997);p53表達(dá)(p53 expression)(Nature389:300,1997)；酵母基因組(Yeast genome)(Cell 88:243,1997)；胃腸道腫瘤(Gastrointestinal tumors)(Science 276:1268,1997)。另外本申請(qǐng)的發(fā)明人等利用SAGE法對(duì)在人單核細(xì)胞以及人巨噬細(xì)胞中表達(dá)最多的基因群以及單核細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞之間的表達(dá)頻率存在差別的基因群進(jìn)行了特定，已經(jīng)申請(qǐng)了專利(特愿平10-304550號(hào))。
本發(fā)明的在人樹突狀細(xì)胞表達(dá)的基因群分別為根據(jù)上述各個(gè)文獻(xiàn)以及美國專利記載的方法而特定的基因集合體，各個(gè)cDNA連接在最靠近聚A區(qū)的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有序列1-100、101-200、201-300堿基序列的基因集合體。這些基因例如可以通過以本發(fā)明的由14bp構(gòu)成的各個(gè)寡核苷酸作為探針對(duì)人基因組文庫進(jìn)行篩選來分離。
另外本發(fā)明的cDNA群是構(gòu)成上述各個(gè)基因群的基因的cDNA連接在最靠近聚A區(qū)的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有序列1-100、101-200、201-300的堿基序列的cDNA或其一部分序列的集合體。這些cDNA例如可以通過以本發(fā)明的各個(gè)寡核苷酸作為探針對(duì)人cDNA文庫進(jìn)行篩選來分離。
由構(gòu)成本發(fā)明的寡核苷酸的14bp組成的基因信息對(duì)于鑒定各個(gè)基因和cDNA的全長是充分的信息。
另外在本發(fā)明的cDNA群中也包括含有各cDNA的任一部分堿基序列的DNA片段(10bp以上)。另外由有意義鏈和反意義鏈構(gòu)成的DNA片段也包括在該cDNA群中。
另外經(jīng)常會(huì)看到人基因由于個(gè)體差異而產(chǎn)生的多型性。因此在本發(fā)明的基因群和cDNA群中由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失和/或通過其它的核苷酸和修飾核苷酸置換形成的基因以及cDNA也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的新基因群是通過數(shù)據(jù)庫檢索沒有對(duì)應(yīng)基因的基因，以及只是通過EST(表達(dá)序列標(biāo)記Expression Sequence Tag)特定的基因的集合體。這些新基因群例如可以以本發(fā)明的各個(gè)寡核苷酸作為標(biāo)記物的定位克隆、以該寡核苷酸為探針的cDNA文庫的篩選或基因庫的檢索等具體地特定。另外由新的基因可以得到該基因編碼的新的蛋白質(zhì)和針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體。蛋白質(zhì)例如可以利用對(duì)新的基因cDNA或其一部分序列進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的方法或通過在適當(dāng)?shù)乃拗?載體中大量表達(dá)等方法得到。另外抗體可以按照眾所周知的方法制備出多克隆抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明拮抗劑是針對(duì)屬于本發(fā)明的各個(gè)基因群的各個(gè)基因表達(dá)的拮抗劑，例如針對(duì)各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄因子的拮抗劑等。另外本發(fā)明的拮抗劑是針對(duì)屬于本發(fā)明的各個(gè)基因群的各個(gè)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)活性的拮抗劑，例如針對(duì)各個(gè)蛋白質(zhì)受體、或各個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合的靶蛋白的受體的拮抗劑等。即，屬于本發(fā)明的各個(gè)基因群的基因是在人DCs中表達(dá)多的基因、或與人單核細(xì)胞相比較表達(dá)較多或較少的基因的集合體，由于它們參與人感染癥或炎癥的發(fā)病的可能性高，所以針對(duì)這些基因或蛋白質(zhì)的拮抗劑作為感染癥或炎癥的預(yù)防藥物或治療藥物的成分是有用的。
而拮抗劑可以通過上述各個(gè)基因的體外表達(dá)體系或以各個(gè)蛋白質(zhì)為對(duì)象的常規(guī)的篩選等特定。或者通過蛋白質(zhì)以及其受體的結(jié)構(gòu)解析等，通過化學(xué)合成等來制備。
以下就有關(guān)本發(fā)明的各個(gè)基因群的具體的特定方法和被特定的基因群進(jìn)行說明。
(A)細(xì)胞的制備按照常規(guī)方法從健康人(8名)的靜脈血抽取末梢血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells:PBMC)，使該P(yáng)BMC通過磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)分離單核細(xì)胞，對(duì)該細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)得到高度純化的單核細(xì)胞。
另外將該單核細(xì)胞按照常規(guī)方法與GM-CSF一起培養(yǎng)，制備巨噬細(xì)胞(GM-巨噬細(xì)胞)。
另外將對(duì)末梢血CD14顯陽性的單核細(xì)胞與GM-CSF、IL-4和TNF-α一起培養(yǎng)5天，制備DCs。即利用該培養(yǎng)條件使單核細(xì)胞分化為非附著性的CD14-、CD1a+、CD80low/-、CD86low/-、HLA-DR+、CD33-和CD83-(圖1)。這些細(xì)胞具有未成熟DCs的樹突狀形態(tài)。
(B)SAGE分析由上述(1)制備的各個(gè)細(xì)胞分別生成相應(yīng)的mRNA，使用生物素化寡(dT)合成cDNA。這些cDNA(DC文庫)用限制酶NlaⅢ消化，利用抗生物素蛋白-磁珠純化各個(gè)cDNA的3’端片段。由于NlaⅢ切斷部位變成了5’-CATG-3’，純化的cDNA 3’端片段的5’末端的序列一律變成了“CATG”。然后再將cDNA分成2部分，在各個(gè)5’末端附加上不同的接頭，用限制酶BsmF1在接頭3’末端開始的14個(gè)堿基對(duì)下游處切斷cDNA。這14個(gè)堿基對(duì)的DNA片段無論那一個(gè)5’端的CATG序列都是共同的，其余的10個(gè)堿基對(duì)因各個(gè)cDNA的不同而不同，所以這10個(gè)堿基對(duì)變成了賦予cDNA特征的Tag了。而為了對(duì)這些Tag的集合進(jìn)行克隆，首先對(duì)BsmF1切斷部位進(jìn)行平端化，然后將分開的兩段cDNA片段連接起來，以對(duì)應(yīng)于各個(gè)接頭的寡核苷酸作為引物通過PCR擴(kuò)增DNA。由此，得到兩端含有接頭序列(5’-GGATG-3’)和與5’-CATG-3’及各自互補(bǔ)的各個(gè)序列，在各自的3’末端連接了不同的Tag序列的DNA片段(Ditag)。擴(kuò)增的DNA片段用NlaⅢ切斷后，連接各個(gè)Ditag，作成concatemer，克隆到載體pZerol中。
(C)在人DCs表達(dá)的基因群通過以上操作，由在人DCs表達(dá)的cDNA得到58540個(gè)Tag，通過這些Tag可以特定17000以上的基因，其中也包含同一個(gè)Tag存在兩次以上的5000個(gè)以上的基因。而從這些全部Tag按照重復(fù)多少(即該Tag指定的cDNA的表達(dá)頻率高)的順序選擇100個(gè)，如序列1-100所示。
序列1-100的Tag就象上述說明所表明的那樣，是連接存在于最靠近在人DCs中表達(dá)的基因cDNA的聚A區(qū)域位置的堿基序列CATG的10個(gè)堿基對(duì)。因此對(duì)已有的DNA數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行檢索，對(duì)于序列已知的cDNA情況，找出最靠近該DNA序列的聚A區(qū)域的堿基序列CATG，通過對(duì)照與該序列相連接的10個(gè)堿基序列，可以特定該Tg指定的cDNA(以及對(duì)該cDNA進(jìn)行編碼的基因)。表1和表2是序列1-100的Tag(B欄)、Tag數(shù)(A欄)、根據(jù)各個(gè)Tag檢索數(shù)據(jù)庫(GenBank)的結(jié)果特定的基因(C欄)和數(shù)據(jù)庫的登錄號(hào)(D欄、E欄、F欄)。
表1
表1

表2

就象表1和表2所表示的那樣，在人DCs中表達(dá)最多的基因是HLADR不變鏈(invariant chain)(表達(dá)頻率為1.17％)。已經(jīng)確認(rèn)在DC文庫中所有表達(dá)的基因都是與MHC Class Ⅰ、Class Ⅱ、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞骨架相關(guān)的基因。
(D)與人單核細(xì)胞相比在人DCs中表達(dá)更多的基因群與上述(B)一樣，特定在人單核細(xì)胞和人GM-巨噬細(xì)胞中表達(dá)的各個(gè)基因的Tag，比較在人單核細(xì)胞和人DCs中表達(dá)的基因。在這些細(xì)胞中，幾乎所有的基因(20000以上)表現(xiàn)出類似的表達(dá)模式(圖2)。然而在單核細(xì)胞中表達(dá)的313個(gè)基因與在DCs中表達(dá)模式存在著顯著性差異(p＜0.01)。即，313個(gè)基因中，181個(gè)基因的表達(dá)水平在DCs中降低，而相反有132個(gè)基因在DCs中表達(dá)頻率比單核細(xì)胞高。表3和4給出了在人DCs中表達(dá)比在人單核細(xì)胞多的前100個(gè)基因。另外在表3、4中，也給出了在GM-巨噬細(xì)胞和DCs中表達(dá)基因的比較結(jié)果。即在表3和4中，A欄Tag在單核細(xì)胞和DCs中表達(dá)頻率的倍數(shù)，B欄在單核細(xì)胞中的Tag拷貝數(shù)，C欄在巨噬細(xì)胞中的Tag拷貝數(shù)，D欄DCs中的Tag拷貝數(shù)，E欄Tag序列(序列101-200)，F(xiàn)欄與基因庫數(shù)據(jù)一致的蛋白質(zhì)，G、H、和I欄基因庫(Genbank)登錄號(hào)。
在表4中，行編號(hào)63的F欄的完整蛋白質(zhì)的全稱是“酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白，β-多肽”“tyrosine3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activationprotein,beta polypeptide”，而行編號(hào)95的F欄是“人克隆24860Ena-VASP樣蛋白mRNA序列，部分cds”“Homo sapiens clone24860 Ena-VASP like protein mRNA sequence,partial cds”。
表3

表4

就象表3、4所表示的那樣，GM-巨噬細(xì)胞和DCs表現(xiàn)出類似的基因表達(dá)模式。另外與單核細(xì)胞相比，在DCs中表達(dá)頻率高的基因是編碼象凝膠溶素和紐帶蛋白那樣的與細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白質(zhì)、象溶酶體酸脂肪酶和載脂蛋白C-1那樣的與脂質(zhì)代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)、象TARC、MDCMCR-4那樣的ケモカイン的基因。而編碼凝膠溶素、溶酶體酸脂肪酶、MDC、脂肪酸結(jié)合蛋白類似物、酸性磷酸酶5型、GA733-1、CD9、HPS27等的基因無論在巨噬細(xì)胞還是在DCs中都增加。另外編碼TARC、肝細(xì)胞生長促進(jìn)抑制因子2型(HAI-2)、血小板型磷酸果糖激酶、因子ⅩⅢ、CD23、組織蛋白酶C、MCP-4、金屬蛋白酶在DCs中表達(dá)頻率特別高(圖3)。
(E)與單核細(xì)胞相比在DCs中表達(dá)少的基因群與上述(D)一樣，比較在人單核細(xì)胞和人DCs中表達(dá)的基因，表5和6給出了與單核細(xì)胞相比在DCs中表達(dá)少的100基因。表示形式與表3和4一樣。另外表6的行編號(hào)58F欄是“B細(xì)胞抑制劑κ輕多肽基因增強(qiáng)子核因子，α”“nuclear factor of kappa lightpolypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor,alpha”，行編號(hào)59F欄是“單核細(xì)胞活化抗原或尿激酶樣纖維蛋白溶酶原活化受體”“monocyte activation antigen or urokinase-type plasminogenactivator receptor”。
在DCs中表達(dá)最少的基因是編碼補(bǔ)體蛋白(ficolin和備解素(properdin))、DNA結(jié)合蛋白(GOS3、GOS2和c-fos)、表面蛋白質(zhì)(CDl4)。在DCs中表達(dá)減少的基因在GM-巨噬細(xì)胞中也表現(xiàn)出同樣的傾向。另外與GM-巨噬細(xì)胞相比，表達(dá)降低了10倍以上的基因是MRP-14、MRP-1α、CDl4、alpha 1 antitypsin、HLA-B和tranleolase。另外CD14在DCs中的減少利用圖1給出的熒光分析結(jié)果也可確認(rèn)。
表5

表6

另外象上述那樣的各個(gè)基因表達(dá)的SAGE分析用從8人的血液中制備的細(xì)胞進(jìn)行。這里為了研究各個(gè)基因表達(dá)的差別是否與血液供體的基因的差別有關(guān)，以9個(gè)基因?yàn)閷?duì)象，對(duì)4個(gè)人的血液樣品實(shí)施RT-PCR。結(jié)果就象圖3所示那樣，SAGE分析的結(jié)果可以確認(rèn)，各個(gè)基因表達(dá)頻率的差異并不是由血液供體的基因引起的，而是依賴于在GM-巨噬細(xì)胞和DCs細(xì)胞中基因表達(dá)頻率的差異。
另外本申請(qǐng)的cDNA群是構(gòu)成上述各個(gè)基因群的基因的cDNA，連接在最靠近聚A區(qū)域的堿基序列5’-CATG-3’上，是分別具有序列1-100、101-200、201-300的堿基序列的cDNA或其一部分序列的集合體。在本發(fā)明的cDNA群中也包括含有各個(gè)cDNA的任何一部分堿基序列的DNA片段(10bp以上)。而由有意義鏈和反意義鏈構(gòu)成的DNA片段也包括在該cDNA群中。
另外經(jīng)常會(huì)看到人基因由于個(gè)體差異而產(chǎn)生的多型性。因此在本發(fā)明的基因群和cDNA群中由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失和/或通過其它的核苷酸置換形成的基因以及cDNA也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如上所述，本發(fā)明提供的基因群也含有新的基因，是全部在人DCs中表達(dá)的基因，而且是表達(dá)量最多的前100個(gè)基因。本發(fā)明提供的基因群與人單核細(xì)胞相比，在DCs(以及GM-巨噬細(xì)胞)中是表達(dá)量相對(duì)高的基因群和表達(dá)量相對(duì)低的基因群。因此這些基因群和cDNA，或者指定它們的Tag的集合體例如可以應(yīng)用于以下那樣的領(lǐng)域內(nèi)。
(1)新基因的特定例如，就本發(fā)明提供的基因群，可以以該Tag序列的5’端附加了5’-CATG-3’的寡核苷酸作為標(biāo)記物的定位克隆、以該寡核苷酸為探針的cDNA文庫的篩選或基因庫的檢索等特定這些新的基因。另外由新的基因可以得到該基因編碼的新的蛋白質(zhì)和對(duì)應(yīng)該蛋白質(zhì)的抗體和拮抗劑。蛋白質(zhì)例如可以利用對(duì)新的基因cDNA或其一部分序列進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的方法或通過在適當(dāng)?shù)乃拗?載體中大量表達(dá)等方法得到。另外抗體可以按照眾所周知的方法制備出多克隆抗體或單克隆抗體。而拮抗劑可以通過蛋白質(zhì)以及其受體的結(jié)構(gòu)解析等，通過化學(xué)合成等來制備。
(2)疾病基因的特定與人DCs有關(guān)的疾病(例如萎縮性皮炎、哮喘等)的發(fā)病基因是在DCs中高頻率表達(dá)的基因的可能性高。例如在本發(fā)明提供的DCs表達(dá)基因群中包含的特定基因的過量表達(dá)或表達(dá)量降低、缺損、或基因變異等。另外如上所述，在單核細(xì)胞和DCs中存在著表達(dá)量明顯不同的基因。因此這些表達(dá)量不同的基因也有可能是與各個(gè)細(xì)胞功能有關(guān)的疾病的原因基因的潛在的候補(bǔ)。因此本發(fā)明提供的各個(gè)基因群對(duì)闡明這些疾病基因和該疾病發(fā)病機(jī)制是有用的。
(3)藥物的開發(fā)上述(2)中的原因基因和發(fā)病機(jī)制的闡明對(duì)開發(fā)上述疾病的治療藥物是有用的。例如使過量表達(dá)的基因的表達(dá)量降低的藥物等。
(4)診斷手段的開發(fā)Tag的集合體在與人DCs有關(guān)的疾病的診斷手段的開發(fā)中很有用。例如用于利用了針對(duì)原因基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗體的EIA和RIA的試劑盒、或重組了基因的一部分或全長DNA的DNA芯片等。特別是DNA芯片在與多個(gè)基因有關(guān)的疾病的診斷中是有用的，由于能夠重組入基盤上的DNA片段數(shù)被限制，所以必須選擇對(duì)診斷必需的基因。本發(fā)明提供表達(dá)量高的基因和cDNA，由于它們是對(duì)細(xì)胞功能起著重要作用的基因和它們的cDNA的集合，所以作為構(gòu)成DNA芯片的DNA的候補(bǔ)是非常有用的。另外含有Tag序列的本發(fā)明的寡核苷酸群由于是正確特定各個(gè)基因的序列，所以也可以用作重組到DNA芯片中的最低限度的DNA序列。
另外，由本發(fā)明提供的新的基因的14bp構(gòu)成的基因信息對(duì)鑒定各個(gè)基因的全長是非常有用的信息，通過克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)和它們功能的解析，與藥物和拮抗劑等開發(fā)聯(lián)系在一起。
工業(yè)實(shí)用性通過本申請(qǐng)的發(fā)明提供由在人DCs中高度表達(dá)的100個(gè)基因組成的基因群，與人單核細(xì)胞相比在人DCs中高頻率表達(dá)和低頻率表達(dá)的各100個(gè)基因群。這些基因群不僅在理解由單核細(xì)胞向DCs的分化過程非常有用，而且對(duì)于單核細(xì)胞和DCs起著重要作用的各種人疾病的診斷和治療的新的手段的開發(fā)也非常有用。
序列表<110> 科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán)<120> 人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群<150>JP 11-095481<151>1999-4-1<160>300<210>1<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1GTTCACATTA 10<210>2<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2CCCTGGGTTC 10<210>3<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3GGGCATCTCT 10<210>4<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4TTGGTGAAGG 10<210>5<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5CCTGTAATCC 10<210>6<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6TGCCTGCACC 10<210>7<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7CAAGCATCCC 10<210>8<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>8TTGGTCCTCT 10<210>9<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>9TTGGGGTTTC 10<210>10<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>10GTGAAACCCC 10<210>11<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11CTAAGACTTC 10<210>12<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>12GTGACCACGG 10<210>13<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>13CCACTGCACT 10<210>14<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>14GGGGAAATCG 10<210>15<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>15GTTGTGGTTA 10<210>16<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16TGTGTTGAGA 10<210>17<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17CCCATCGTCC 10<210>18<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18TTCATACACC 10<210>19<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19GTGAAACCCT 10<210>20<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>20TCCAAATCGA 10<210>21<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>21TGGGTGAGCC 10<210>22<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>22TTGGCCAGGC 10<210>23<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>23CACAAACGGT 10<210>24<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>24AGCCCTACAA 10<210>25<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>25GGCTGGGGGC 10<210>26<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>26CACCTAATTG 10<210>27<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>27CTGACCTGTG 10<210>28<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>28ACTTTTTCAA 10<210>29<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>29TGGTGTTGAG 10<210>30<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>30GGAGGTGGGG 10<210>31<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>31TGTACCTGTA 10<210>32<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>32TGATTTCACT 10<210>33<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>33TGCACGTTTT 10<210>34<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>34TCACCGGTCA 10<210>35<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>35CCTCAGGATA 10<210>36<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>36ATGGCTGGTA 10<210>37<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>37GGCACAAAGG 10<210>38<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>38GCCTGCTGGG 1 0<210>39<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens·<400>39TTCCCTTCTT 10<210>40<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4010AGAAGTGTCC<210>41<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>41CCAGAACAGA 10<210>42<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>42CCTAGCTGGA 10<210>43<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>43TAGGTTGTCT 10<210>44<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>44AGGCTACGGA 10<210>45<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>45GTGCTGAATG 10<210>46<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>46ACGCAGGGAG 10<210>47<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>47GCTTTATTTG 10<210>48<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>48AAAACATTCT 10<210>49<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>49CCCCCTGGAT 10<210>50<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>50TGAAAACTAC 10<210>51<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>51ATGAGCTGAC 10<210>52<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>52TTGTAATCGT 10<210>53<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>53CCCGTCCGGA 10<210>54<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>54CTGGGTTAAT 10<210>55<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>55GCAGTTCTGA 10<210>56<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>56GGGGCAACAG 10<210>57<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>57CCGTCCAAGG 10<210>58<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>58AAGACAGTGG 10<210>59<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>59TGTGATCAGA 10<210>60<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>60AGCCACCGCA 10<210>61<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>61TGGCCCCAGG 10<210>62<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>62AGGTGGCAAG 10<210>63<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>63GACGACACGA 10<210>64<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>64ACCCTTGGCC 10<210>65<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>65CCTGTAGTCC 10<210>66<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>66GCGACCGTCA 10<210>67<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>67GAAGCAGGAC 10<210>68<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>68ACACAGCAAG 10<210>69<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>69AGGGCTTCCA 10<210>70<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>70CGCTGGTTCC 10<210>71<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>71AGCACATTTG 10<210>72<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>72GGGCTGGGGT 10<210>73<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>73ACCGCCGTGG 10<210>74<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>74GCCGAGGAAG 10<210>75<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>75CTCATAAGGA 10<210>76<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>76GTGCGCTGAG 10<210>77<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>77GCCCCCAATA 10<210>78<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>78CGCCGCCGGC 10<210>79<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>79AAGTTGCTAT 10<210>80<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>80TGGCTCCTCC 10<210>81<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>81TCGAAGCCCC 10<210>82<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>82AGCACCTCCA 10<210>83<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>83CGCCGGAACA 10<210>84<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>84AGGTCAGGAG 10<210>85<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>85GTGTGTTTGT 10<210>86<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>86GTAATCCTGC 10<210>87<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>87CACCACGGTG 10<210>88<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>88CCATTGCACT 10<210>89<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>89TAATAAAGGT 10<210>90<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>90CACTACTCAC 10<210>91<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>91CCTGGGGTAA 10<210>92<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>92ATTCTCCAGT 10<210>93<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>93ATAATTCTTT 10<210>94<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>94GGATTTGGCC 10<210>95<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>95TTCACTGTGA 10<210>96<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>96GAGGGAGTTT 10<210>97<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>97AGCTCTCCCT 10<210>98<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>98ACTAACACCC 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10<210>291<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>291GGAGGTGGAG 10<210>292<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>292TCCGTCCGGA 10<210>293<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>293ATCGTGCGCT 10<210>294<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>294CATCCCGTGA 10<210>295<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>295CTCTGGGTTC 10<210>296<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>296TTTGGGACCC 10<210>297<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>297AGGAGATGCT 10<210>298<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>298ATACCTGGAT 10<210>299<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>299GGGTTCCAGT 10<210>300<211>10<212>DNA<213>Homo sapiens<400>300TATATTGATT 10
權(quán)利要求
1．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群，其特征是該基因群由在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中表達(dá)的基因中表達(dá)最多的前100個(gè)基因組成的，各個(gè)基因的cDNA連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有1-100的堿基序列。
2．權(quán)利要求1的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群，其中編碼具有序列1堿基序列的cDNA的基因的表達(dá)頻率最高，其余99個(gè)基因的表達(dá)頻率依次順序?yàn)樾蛄?-100。
3．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因的cDNA群，其特征是由構(gòu)成權(quán)利要求1的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群的各個(gè)基因的cDNA構(gòu)成，它們連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，由分別具有1-100的堿基序列的cDNA或其一部分序列構(gòu)成的。
4．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)新基因，其特征是該基因是包含在權(quán)利要求1基因群中的新的基因，該基因的cDNA連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有序列7、12、17、18、24、28、35、48、53、62、64、71、75、81、86、87或90的堿基序列。
5．權(quán)利要求4的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)的新基因編碼的新的蛋白質(zhì)。
6．抗權(quán)利要求5的新蛋白質(zhì)的抗體。
7．針對(duì)屬于權(quán)利要求1的基因群的各個(gè)基因表達(dá)的拮抗劑。
8．針對(duì)屬于權(quán)利要求1的基因群的各個(gè)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的活性的拮抗劑。
9．連接在堿基序列5’-CATG-3’上，由序列1-100的各個(gè)堿基序列組成的寡核苷酸群。
10．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群，其特征是由與單核細(xì)胞相比，在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中表達(dá)比較多的基因中表達(dá)最多的前100個(gè)基因組成，各個(gè)基因的cDNA連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有序列101-200的堿基序列。
11．權(quán)利要求10的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群，其中編碼含有序列101堿基序列的cDNA的基因的表達(dá)頻率與該基因在人單核細(xì)胞中的表達(dá)頻率之間的差最大，其余99個(gè)基因的表達(dá)頻率的差依次為102-200。
12．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因的cDNA群，其特征是該cDNA群由構(gòu)成權(quán)利要求10的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因的各個(gè)基因的cDNA構(gòu)成，它們連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，由分別具有序列101-200的堿基序列的cDNA或是由其一部分序列構(gòu)成的。
13．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)新基因，其特征是該基因是包含在權(quán)利要求10的基因群中的新的基因，各個(gè)基因的cDNA連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有序列107、108、110、122-124、126、127、131、132、134、136、137、139、142、148、158、159、162、172、174、181、184、187、190、192、196、198或200的堿基序列。
14．權(quán)利要求13的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)新基因編碼的新蛋白質(zhì)。
15．抗權(quán)利要求14新蛋白質(zhì)的抗體。
16．針對(duì)屬于權(quán)利要求10的基因群的各個(gè)基因表達(dá)的拮抗劑。
17．針對(duì)屬于權(quán)利要求10的基因群的各個(gè)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的活性的拮抗劑。
18．連接在堿基序列5’-CATG-3’上，由序列101-200的各個(gè)堿基序列組成的寡核苷酸群。
19．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群，其特征是該基因群由與人單核細(xì)胞相比，在來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中表達(dá)比較低的基因中的表達(dá)最低的前100個(gè)基因組成的，各個(gè)基因的cDNA連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有序列201-300的堿基序列。
20．權(quán)利要求19的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群，其中編碼含有序列201堿基序列的cDNA的基因的表達(dá)頻率與該基因在人單核細(xì)胞中表達(dá)頻率之間的差最大，其余99個(gè)基因的表達(dá)頻率的差依次為202-300。
21．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因的cDNA群，其特征是該cDNA群由構(gòu)成權(quán)利要求19的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因的各個(gè)基因的cDNA構(gòu)成，它們連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，由分別具有序列201-300的堿基序列的cDNA或由其一部分序列構(gòu)成的。
22．人樹突狀細(xì)胞表達(dá)新基因，其特征是該基因是包含在權(quán)利要求19的基因群中的新的基因，各個(gè)基因的cDNA連接在最靠近聚A的堿基序列5’-CATG-3’上，分別具有序列225、234、240、245、257、265、268、269、274-276、284、286、292、293或295的堿基序列。
23．權(quán)利要求22的人樹突狀細(xì)胞表達(dá)新基因編碼的新蛋白質(zhì)。
24．抗權(quán)利要求23新蛋白質(zhì)的抗體。
25．針對(duì)屬于權(quán)利要求19的基因群的各個(gè)基因表達(dá)的拮抗劑。
26．針對(duì)屬于權(quán)利要求19的基因群的各個(gè)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的活性的拮抗劑。
27．連接在堿基序列5’-CATG-3’上，由序列201-300各個(gè)堿基序列組成的寡核苷酸群。
全文摘要
本申請(qǐng)發(fā)明是有關(guān)來自人單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞表達(dá)基因群的發(fā)明。更詳細(xì)地講,本申請(qǐng)發(fā)明涉及到由人樹突狀細(xì)胞中表達(dá)頻率高的100個(gè)基因組成的基因集合體,與人單核細(xì)胞相比在人樹突狀細(xì)胞中表達(dá)頻率高和低的各100個(gè)基因組成的基因集合體,這些基因群的相應(yīng)的cDNA群,這些cDNA連接在最靠近聚A的堿基序列5’一CATG－3’上,分別具有1—100堿基序列,這些基因群中包含的新的基因(群),以及特定這些基因和cDNA的寡核苷酸的集合體。
文檔編號(hào)C07K14/475GK1304448SQ00800747
公開日2001年7月18日 申請(qǐng)日期2000年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月1日
發(fā)明者橋本真一, 松島綱治, 鈴木拓司 申請(qǐng)人:科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán)