專利名稱：Megsin啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達于腎細胞中的基因的啟動子。本發(fā)明的啟動子可應(yīng)用于諸如基因治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人體中六萬億的各種細胞具有基本相同的基因組DNA。就正常生理功能而言，這些基因的表達受到細胞系以及細胞所接受的信號的嚴格控制。因此，闡明具體每種細胞中表達的基因?qū)⒎浅Ｖ匾?br> 腎小球膜位于腎小球毛細管襻的小葉的中心，它是連接各小葉的一種核心組織。腎小球膜由腎小球基底膜覆蓋，它包括腎小球膜細胞和無定形物質(zhì)(腎小球膜基質(zhì))，所述腎小球膜細胞與毛細管腔被內(nèi)皮細胞隔開，所述無定形物質(zhì)與3層腎小球基底膜中的內(nèi)透明層相連。
已知腎小球膜細胞在維持腎小球的結(jié)構(gòu)和功能方面起關(guān)鍵作用，有觀點認為它是腎小球疾病如腎小球腎炎和腎小球硬化癥發(fā)病的主要原因。腎小球膜細胞是各類腎炎的發(fā)病目標(biāo)。例如，有觀點認為腎小球膜細胞的增生和腎小球膜細胞外基質(zhì)的累積是各種腎小球疾病(如慢性腎小球腎炎和糖尿病性腎炎)患者發(fā)生腎小球硬化癥的第一步，也是腎衰晚期的主要病因[D.Schlondorff，Kidney Int.，49，1583-1585(1996]；R.B.Sterzel等，腎小球膜細胞。免疫性腎病，595-626頁(1997)]。因此，對特異性表達于腎小球膜細胞的基因的鑒定以及對其表達的調(diào)節(jié)機制的闡明均有助于理解腎小球膜細胞的生物學(xué)特征和與腎小球膜細胞相關(guān)疾病的病因，并因此有助于與腎小球膜細胞相關(guān)的疾病的治療或診斷。
通過測定大批量DNA序列以及通過數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明人分離了在腎小球膜細胞中特異性強表達的名為MEGSIN的基因。本發(fā)明人還測定了該基因的全部堿基序列，并推導(dǎo)了新蛋白質(zhì)(人MEGSIN)的氨基酸序列，其由MEGSIN的全長cDNA編碼，含380個氨基酸。此外，利用SwissProt數(shù)據(jù)庫以FASTA程序進行的氨基酸序列同源性檢索表明，人的MEGSIN屬于SERPIN(絲氨酸蛋白酶抑制劑)超家族[R.Carrell等，Trends Biochem.Sci.，10，20(1985]；R.Carrell等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，52，527(1987)；E.K.O.Kruithof等，血液，86，4007(1995)；J.Potempa等，生物化學(xué)雜志，269，15957(1994)；E.Remold-O′Donnell，F(xiàn)EBS Lett.，315，105(1993)][T.Miyata等，臨床研究雜志，120，828-836(1998)]。
人的MEGSIN在人成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、和角化細胞中弱表達，但在腎小球膜細胞中強表達(這表明人的MEGSIN特異性表達于腎小球膜細胞)。當(dāng)在IgA腎病患者或糖尿病性腎病患者與健康人之間進行比較時，腎組織中MEGSIN的表達在IgA腎病患者或糖尿病性腎病患者中顯著增多[D.Suzuki等，J.Am.Soc.Nephrol.10，2606-2613(1999)]。此外，表達水平的增加也可在腎小球膜增生性大鼠模型中觀察到。
如上所述，很有可能MEGSIN基因的表達與腎病密切相關(guān)。因此，需要揭示MEGSIN基因表達之調(diào)節(jié)機制的真實情況，以便明確人的MEGSIN的體內(nèi)功能，并提供可用于診斷和治療諸如由MEGSIN突變所致的遺傳性疾病的有效啟動子或在腎小球膜細胞中特異性表達的啟動子。
另一方面，由于人MEGSIN所屬SERPIN超家族的成員之間在一級結(jié)構(gòu)上高度相似，因而它們被認為由共同的祖先蛋白質(zhì)衍生而來。即，根據(jù)對基于所述序列中突變的氨基酸數(shù)目[K.鈴木等，蛋白質(zhì)·核酸·酶，34，949-962(1989)]，以及對染色體基因結(jié)構(gòu)的分析而構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹的分析[J.J.Bao等，Biochem.，26，7755(1987)]，SERPIN超家族已在各種高等脊椎動物中進化了不少于五百萬年。MEGSIN基因的最顯著特征是，它特異性表達于腎小球中的腎小球膜細胞中。
最近有報道稱，離子通道的基因和與轉(zhuǎn)運有關(guān)的基因均特異性表達于腎臟[S.J.Lolait等，自然，357，336-339(1992]；Y.Kanai等，臨床研究雜志，93，397-404(1994)；S.Uchida等，生物化學(xué)雜志，268，3821-3824(1993)；S.Adachi等，生物化學(xué)雜志，269，17677-17683(1994)；K.Fushimi等，自然，361，549-552(1993)；G.Gamba等，生物化學(xué)雜志，269，17713-17722(1994)]。
但是，這些基因均位于腎小管的上皮細胞中，均未在腎小球膜細胞中表達。因此，對MEGSIN基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的鑒定可以為特定類型細胞中基因表達的機制提供重要的信息。這一信息還可以應(yīng)用于在分子遺傳學(xué)和基因轉(zhuǎn)移中靶向細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供MEGSIN基因啟動子及其應(yīng)用。
本發(fā)明人測定了約1.5kb長的包含MEGSIN基因序列上游(5’端)的基因組DNA的堿基序列，以揭示MEGSIN基因表達的調(diào)控機制。S1核酸酶保護作用的分析結(jié)果表明，在MEGSIN mRNA中存在4個轉(zhuǎn)錄起始位點。此外還表明，轉(zhuǎn)錄起始位點上游存在保守型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其包括AP1結(jié)合位點、cMyb結(jié)合位點、以及Oct-1等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點。構(gòu)建載體，使其中該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的各種區(qū)域缺失，并在3’中導(dǎo)入螢光素酶基因。用所述載體轉(zhuǎn)染細胞，通過檢測細胞的螢光素酶活性而測定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。結(jié)果鑒定了兩個能正調(diào)控轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。對位于3’末端的一個啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，通過以位點特異性誘變法導(dǎo)入堿基置換而進行詳細分析。結(jié)果，本發(fā)明人成功測定了在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用的DNA堿基序列。
因此，本發(fā)明涉及MEGSIN基因啟動子及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及(1)一種具有啟動子活性的DNA，其具有SEQ ID NO1所示堿基序列或其部分；(2)一種含(1)所述DNA的載體；(3)如(2)所述的載體，其中已將一外源基因連接在(1)所述DNA的下游并使其能表達；(4)用(3)所述載體轉(zhuǎn)化的細胞；(5)一種篩選與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，所述DNA含有SEQ ID NO1的堿基序列或其部分，該方法包括以下步驟(a)使待測樣品與所述含有SEQ ID NO1的堿基序列或其部分的DNA接觸，和(b)篩選能結(jié)合所述含有SEQ ID NO1的堿基序列或其部分之DNA的蛋白質(zhì)；(6)可通過(5)的方法分離的蛋白質(zhì)；和(7)如(6)所述的蛋白質(zhì)，其中該蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)錄因子。
本文中，“啟動子”指存在于轉(zhuǎn)錄起始位點附近且控制基因表達的DNA區(qū)。此外，“啟動子活性”指啟動子控制其下游基因表達的活性。
本發(fā)明提供了MEGSIN基因的啟動子。如實施例3所述，使MEGSIN基因5’上游區(qū)中-128位下游的堿基缺失或被取代，常顯示啟動子活性的顯著降低。因此本發(fā)明的啟動子包括MEGSIN基因5’上游區(qū)(SEQ ID NO1)中-128位下游的至少一部分。
本發(fā)明的啟動子可包含SEQ ID NO1的堿基序列(其中一個或多個核苷酸已被取代)，只要它包括-128位(SEQ ID NO1)下游區(qū)的至少一部分且只要它具有啟動子活性。然而，如圖7所示，-128位下游區(qū)中的下述突變可導(dǎo)致啟動子活性下降m1突變(位于-128位和-127位的堿基被取代)，m2突變(位于-120，-118，和-117位的堿基被取代)，m3突變(位于-116位和-115位的堿基被取代)，m4突變(位于-113位和-112位的堿基被取代)，m5突變(位于-106位和-105位的堿基被取代)，m6突變(位于-100位和-98位的堿基被取代)，以及m7突變(位于-94位和-93位的堿基被取代)。
因此，當(dāng)要求較高啟動子活性時，不優(yōu)選這些堿基的取代。
本發(fā)明的啟動子可用諸如基因組DNA文庫篩選法進行分離。即，可用已知MEGSIN cDNA或其部分作為探針通過與人或其它動物的基因組DNA文庫雜交來篩選所述啟動子，或利用根據(jù)MEGSIN cDNA或MEGSIN基因組DNA而設(shè)計的引物以及用人或其它動物的基因組DNA文庫為模板通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來篩選所述啟動子。
本發(fā)明的啟動子也可通過常規(guī)方法利用核酸的化學(xué)合成產(chǎn)生，如膦酰胺法[Mattencci，M.D.&Caruthers，M.H.，美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)103，3185(1981)]和亞磷酸三酯法[Hunkapiller，M.等，自然310，105(1984)]。
所述DNA片段中MEGSIN基因的啟動子區(qū)和增強子區(qū)(位于內(nèi)含子和3’非編碼區(qū)并包括能增加該基因表達的DNA區(qū))可通過如未審查的日本專利申請1994年181767或文獻[免疫學(xué)雜志(1995)155，2477-2486，美國國家科學(xué)院學(xué)報(1995)92，3561-3565]中所述的方法獲得。
通常，啟動子活性的存在或強度可通過將某蛋白質(zhì)的編碼基因(報道基因)以能表達的方式連接在待測啟動子的下游來判定，其中所述蛋白質(zhì)可通過如顏色反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)，或通過用它轉(zhuǎn)染宿主細胞，或通過檢測所述顏色反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)來定量測定。
具體地，啟動子區(qū)可通過如下方法獲得，但不限于此。
1)克隆包含上述基因組DNA或基因組文庫的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的DNA。
2)用限制性酶消化MEGSIN基因，以獲得含有MEGSIN基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子并在其上游含有啟動子區(qū)(2-5 kbp)的DNA。轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)通過用腎小球膜細胞的poly(A)+RNA為模板，用選自MEGSIN基因5’位點之cDNA序列的DNA為引物，經(jīng)引物延伸法測定。通過出所述堿基序列尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列而預(yù)測可能包含啟動子活性的位點。
3)將2)所獲DNA中除MEGSIN基因編碼區(qū)以外的DNA片段亞克隆至質(zhì)粒中，然后將報道基因(如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因或螢光素酶基因等)連接至該2-5 kbp DNA片段的下游，以構(gòu)建一個報道質(zhì)粒。類似地，對應(yīng)于MEGSIN基因上游各位點的DNA片段(其中5’和3’端的各個位點已被逐一除去)通過限制性酶消化或PCR等方法制備，以便包括可能的啟動子區(qū)。將報道基因連接至這些DNA片段的下游以構(gòu)建報道質(zhì)粒。制備一種DNA片段，該片段中一個或多個堿基已通過位點特異性誘變被適當(dāng)取代、缺失、添加、和/或插入。構(gòu)建一個報道質(zhì)粒，其中報道基因連接在所述DNA片段下游。
4)位于MEGSIN基因上游區(qū)的啟動子區(qū)可通過測定，用3)所構(gòu)建之報道質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的動物細胞的報道蛋白活性(例如CAT活性或螢光素酶活性等)來鑒定。
位于3’非編碼區(qū)或內(nèi)含子中的增強子區(qū)可通過，例如，以MEGSINcDNA為探針篩選基因組文庫，克隆MEGSIN的基因組DNA，并實施如上述啟動子的例子所述的方法來鑒定。
本發(fā)明的啟動子具有在腎臟(腎小球膜細胞)中高表達其下游基因的活性。因此，本發(fā)明的啟動子可用于，例如，開發(fā)能控制目標(biāo)基因在腎臟中的表達的載體。還可預(yù)計，本發(fā)明的啟動子可在能活化本發(fā)明啟動子的其它細胞(或器官)中發(fā)揮同樣的效應(yīng)。這類在腎臟中被特異性活化的啟動子可用于，例如，構(gòu)建腎臟疾病基因治療所用的載體。
當(dāng)本發(fā)明的啟動子用于基因的腎臟特異性表達時，將所需在腎臟表達的基因以可以表達的方式連接在所述啟動子的下游，并導(dǎo)入靶細胞?！耙钥梢员磉_的方式連接”指基因與本發(fā)明的啟動子連接后可以被表達。
將本發(fā)明的啟動子及受其控制的基因?qū)氚屑毎螅鼈兛烧现寥魏芜m當(dāng)?shù)妮d體。本發(fā)明的啟動子可以單獨使用或與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列如增強子和沉默子一起使用。
來自逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、新培斯病毒、及痘病毒的載體可用于基因治療。也可使用脂質(zhì)體制劑如熱敏感性脂質(zhì)體、血液穩(wěn)定性脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、pH依賴性脂質(zhì)體、含有病毒包膜蛋白的重排型脂質(zhì)體等；具有病毒之膜融合能力的膜融合脂質(zhì)體制劑如HVJ(仙臺病毒)-脂質(zhì)體[T. Nakagawa等，藥物運送系統(tǒng)，11，411(1996)]，VSV(水泡性口炎病毒)-脂質(zhì)體(日本專利申請1997年357506號)等。
已含有導(dǎo)入的載體的靶細胞可以是腎小球膜細胞、腎小管細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、以及腫瘤細胞。
為了制備本發(fā)明的啟動子和含有該啟動子的重組載體，并用該載體轉(zhuǎn)染細胞，除了上述方法，還可按“分子克隆-實驗室手冊”(冷泉港實驗室，紐約)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進行。
由于本發(fā)明的啟動子中發(fā)生突變可導(dǎo)致嚴重的遺傳疾病，故可將該啟動子應(yīng)用于基因診斷。這種基因診斷可通過對突變的檢測或分析實現(xiàn)，對突變的檢測可用諸如單鏈構(gòu)象多形性法、DNA指紋作圖法、和PCR法直接進行，對突變的分析可使用基因特異性寡核苷酸探針進行。
由于人的MEGSIN屬于SERPIN超家族，故人MEGSIN的紊亂可通過促進血液凝固的能力而導(dǎo)致血栓栓塞，還可通過促進纖維蛋白溶解而導(dǎo)致出血性疾病[鈴木等，蛋白質(zhì)·核酸·酶，34，949-962(1989)]。這提示，能影響本發(fā)明啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的藥物可以作用于這些疾病的發(fā)生或抑制。因此，本發(fā)明的啟動子可用于篩選針對這些疾病的藥物。
由于在IgA腎病患者和糖尿病腎病患者中MEGSIN的表達水平受到促進，故有人認為這種促進與腎臟疾病的發(fā)生有關(guān)。因此，可通過給與這些患者能控制本發(fā)明啟動子活性的藥物而抑制IgA腎病和糖尿病性腎病的發(fā)生或進展。
本發(fā)明涉及篩選能結(jié)合本發(fā)明啟動子的蛋白質(zhì)的方法。能結(jié)合本發(fā)明啟動子的蛋白質(zhì)可以是，例如，轉(zhuǎn)錄因子?！稗D(zhuǎn)錄因子”指能結(jié)合本發(fā)明的啟動子并正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)該啟動子下游基因的表達的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的篩選方法包括以下步驟(a)使待檢樣品與含有SEQ ID NO1所示堿基序列或其部分的DNA接觸，和(b)篩選能與含有SEQ ID NO1所示堿基序列或其部分的DNA的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的篩選方法可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行[參見最新細胞工程實驗方案，秀潤社；Biomanual series 5轉(zhuǎn)錄因子研究方法，羊土社；以及DNA和Cell生物學(xué)，13，731-742(1994)]，例如，利用了親和柱的方法，Southwestern法，指紋作圖法，凝膠移位(shift)法，和一步雜合子(one-hybrid)法。
親和柱法可如下實施將用上述方式獲得的本發(fā)明啟動子固定在Sepharose或乳膠珠上以制備層析柱，將核提取物上樣至該柱，洗柱，用含有與固定于柱中的DNA相同序列的DNA洗脫所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。
在Southwestern法中，可從來自細胞(如腎小球膜細胞)的mRNA構(gòu)建cDNA，所述細胞中，結(jié)合至本發(fā)明啟動子的轉(zhuǎn)錄因子將被表達。然后，將該cDNA整合至大腸桿菌表達載體，如λgtll，以構(gòu)建cDNA文庫，并合成與β-半乳糖苷酶的融合蛋白。將該融合蛋白吸附至硝酸纖維素膜上，用本發(fā)明啟動子的放射性標(biāo)記的DNA片段作為探針篩選能合成顯示結(jié)合活性之融合蛋白的噬菌體。
在指紋作圖法中，可利用放射性標(biāo)記的啟動子作為探針，將其與核提取物混合，用DNaseI消化，然后電泳，從而測定與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列。
在凝膠移位法中，用所述啟動子區(qū)中的序列構(gòu)建探針，并進行放射性標(biāo)記。然后將該探針與核提取物混合，經(jīng)電泳測定與該探針結(jié)合之核蛋白的存在或缺乏。
在一步雜合子法中，將含有MEGSIN啟動子序列至少3個拷貝之串聯(lián)重復(fù)序列的序列連接至所述報道基因的上游，然后整合至酵母基因組以構(gòu)建報道菌株。將上述cDNA與GAL4(與酵母DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄活化因子)活化區(qū)(GAL4 AD)的編碼區(qū)相連，構(gòu)建編碼該融合蛋白的活化區(qū)(AD)文庫，將其導(dǎo)入上述報道菌株。通過AD與DNA結(jié)合蛋白形成雜合蛋白并結(jié)合于MEGSIN啟動子序列上可活化轉(zhuǎn)錄。該效應(yīng)可通過報道基因的表達檢測。


圖1顯示人MEGSIN基因與PAI-2基因的外顯子和內(nèi)含子邊緣區(qū)的比較。大寫字母為外顯子，小寫字母為內(nèi)含子。
圖2顯示人MEGSIN基因第一個外顯子(5’-UTR)的序列以及上游1431bp的序列。由5’RACE獲得的克隆子的5’端用“*”表示。
圖3是一張照片，顯示用于測定人MEGSIN基因之轉(zhuǎn)錄起始位點的S1核酸酶分析的結(jié)果。
圖4顯示用于螢光素酶分析的載體的結(jié)構(gòu)。
啟動子，無；增強子，無；SV40晚期polyA信號，1772-1993；螢光素酶基因(luc+)，88-1737；上游polyA信號，4658-4811；多重克隆位點，1-58；β-內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)，3940-3083；復(fù)制起點f1，4073-4527；來自ColE1的質(zhì)粒的復(fù)制起點，2313。
圖5顯示使用各種細胞獲得的人MEGSIN基因之轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的螢光素酶分析結(jié)果。啟動子相對活性用β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)化，如圖示。
圖6顯示人MEGSIN基因之缺失型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的螢光素酶分析結(jié)果。啟動子的相對活性用β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)化(所述區(qū)未缺失時的值為100)，如圖示。(A)顯示人表皮樣腫瘤細胞系A(chǔ)431的結(jié)果，(B)顯示人腎小球膜細胞的結(jié)果。
圖7顯示人MEGSIN基因之轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)導(dǎo)入位點特異性突變后的螢光素酶分析結(jié)果。下圖顯示所導(dǎo)入的突變，上圖顯示所述啟動子已用β-半乳糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)化(所述區(qū)未缺失時的值為100)的相對活性。下圖中還顯示了Oct-1、c-Myb、及AP-1的結(jié)合位點。
圖8顯示了用人MEGSIN基因之轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(從-129至-89)進行的凝膠移位分析的結(jié)果。上圖為探針的DNA序列，下圖為結(jié)果。
圖9是一張照片，其顯示利用來自人的各種原代細胞提取物進行的人MEGSIN基因之轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(從-129至-89)凝膠移位分析的結(jié)果。其中使用了圖8所示的探針A和探針B。
實施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明用以下實施例詳細舉例說明，但應(yīng)理解其不限于此。
實施例1人腎小球膜細胞的原代培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(GIBCO)、100 IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、及200μg/mL L-谷氨酰胺的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)上培養(yǎng)人腎小球膜細胞(Clontech)。
實施例2人MEGSIN基因之轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的分離人MEGSIN基因的上游區(qū)用基因組步行(Genome Walker)試劑盒(Clontech)分離。然后，以基因組步行試劑盒的人類基因組文庫為模板，用根據(jù)MEGSIN cDNA序列[Miyata，T.等，臨床研究，120，828-836(1998)]設(shè)計的MEGSIN特異性引物(5’-CGTCGACGGACACGTCTCACGTCC GACG-3’/SEQ ID NO4)、試劑盒所附的銜接子引物、以及PCR緩沖液，經(jīng)嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴增人MEGSIN基因的上游區(qū)。用同樣的方法分離外顯子和內(nèi)含子之間的邊緣區(qū)基因組DNA。
此外，通過用TFSEARCH程序(Yutaka Akiyama京都大學(xué))分析TFMATRIX轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點數(shù)據(jù)庫(E.Wingender，R.Knueppel，P.Dietze，和H.KarasGBF-Braunschweig)來搜尋轉(zhuǎn)錄因子的高度保守型結(jié)合位點序列。
對基因組DNA序列分析的結(jié)果顯示，人MEGSIN基因有8個外顯子和7個內(nèi)含子，它由約20 kb的DNA編碼。外顯子-內(nèi)含子邊緣區(qū)(剪接位點)遵循GT-AG規(guī)則。結(jié)構(gòu)如表1所示。表1中大寫字母的序列表示外顯子，小寫字母表示內(nèi)含子。表1編號外顯子(bp) 內(nèi)含子(kbp)供體序列 受體序列1346 6.0 CTAGCgtgagtctagGCTGC2186 0.5 ATAAGgtcagtacagTTGCT351 0.9 GTCAGgtaaaaacagTCAGG4117 3.3 ATAAGgtaagtatagGACTA5118 3.0 ACATGgtgagaaaagGCAAA6143 3.0 CCAAGgtatgttcagTGCTC7147 3.5 CTGAAgtaagtacagATTGA81141
圖1顯示人MEGSIN基因與纖溶酶原活化因子2型抑制劑(PAI-2)基因的外顯子-內(nèi)含子邊緣區(qū)的堿基序列比較，其中PAI-2[Ye，R.D.，生物化學(xué)雜志，264，5495-5502(1989)]與MEGSIN一樣屬于Serpin超家族。由于這兩個序列均高度保守，故表明它們在系統(tǒng)發(fā)育中的關(guān)系十分密切。
人MEGSIN基因啟動子的堿基序列(從-1431至-1)如圖2及SEQ ID NO2所示。5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)(從1至181)的堿基序列如圖2及SEQ ID NO3所示。
實施例3熒光原位雜交(FISH)培養(yǎng)人外周血淋巴細胞，用植物血凝素(PHA)刺激，然后取中期相淋巴細胞的染色體用標(biāo)準(zhǔn)方法制備載玻片樣品。來自F581克隆的DNA經(jīng)缺口翻譯法標(biāo)記地高辛配基-dUTP，用它作探針進行FISH。將標(biāo)記的探針與50％甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，以及含有2x SSC的緩沖液混合，然后與上述載玻片樣品雜交。將發(fā)生雜交的載玻片樣品與熒光素標(biāo)記的抗地高辛配基抗體(Boehringer Mannheim)一起保溫。用4′，6′-二脒-2′-苯基吲哚二氫氯化物(DAPI)進行復(fù)染以檢測特異性雜交信號。將載玻片樣品與熒光素標(biāo)記的抗地高辛配基抗體(Boehringer Mannheim)以及德克薩斯紅(texas red)標(biāo)記的親和素(Boehringer Mannheim)一起保溫，然后通過DAPI復(fù)染來實施探針檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人MEGSIN基因位于染色體18q21.3。
實施例4通過S1核酸酶保護試驗鑒定轉(zhuǎn)錄起始位點人MEGSIN mRNA的5′末端，利用實施例1中從人的腎小球膜細胞提取的poly(A)+RNA，通過S1核酸酶保護試驗測定[Berk，A.J.等，美國國家科學(xué)院學(xué)報，75，1979(1978)]。
標(biāo)記的探針用多重引物(multiprime)法制備。使對應(yīng)于+161至+191bp的完全覆蓋所述起始位點的寡核苷酸引物(5′-ttccctgtac atgcacttag gaaggtgatg a-3′/SEQ ID NO5)與變性的MEGSIN啟動子退火。然后，將所述引物與Klenow酶在含有[32P]-dCTP的緩沖液中37℃保溫15分鐘。所得產(chǎn)物用Sephadex G-50柱(Pharmacia)純化，然后作為放射性標(biāo)記的探針使用。使該探針與來自培養(yǎng)的腎小球膜細胞的0.2g mRNA用S1試驗試劑盒(Ambion)于55℃雜交16小時。向該DNA-RNA雜合體中加入500g含S1核酸酶的S1緩沖液，于37℃保溫30分鐘。終產(chǎn)物進行電泳并通過放射自顯影分析(圖3)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人MEGSIN基因的第一外顯子為346bp，但另有三個轉(zhuǎn)錄起始位點。此外，以人的腎小球膜細胞總RNA為樣品，用5′-RACE試劑金(寶酒造)按說明書測定了轉(zhuǎn)錄起始位點(圖2)。
對堿基序列的分析表明，保守的啟動子區(qū)，包括AP-1結(jié)合位點、cMyb結(jié)合位點、及可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點的Oct-1均位于MEGSIN基因的上游區(qū)。未發(fā)現(xiàn)TATA盒[分子細胞生物學(xué)，1，281(1981)]或CAAT盒[科學(xué)，236，1237(1987)]的共有序列。
實施例5對MEGSIN轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的功能檢查為了檢查轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，制備下述載體，其中將MEGSIIN基因的上游區(qū)(KpnI-DraI片段從-1154至+59)或其缺失突變體與螢光素酶基因連接。用該試驗中所用的覆蓋該區(qū)域的配對引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備各種缺失突變型DNA。具體為，用引物13(5′-aggctgtccaaaggtgcagcctgcactctg-3′/SEQ IDNO18)作為反義引物、引物1(5′-ggtaccttctaattccaatagctttttac-3′/SEQ ID NO6)，引物2(5′-ccagttacttggataaatgttggctgtact-3′/SEQ ID NO7)，引物3(5′-ctcaggcagaaggaccaggcttgcagtcat-3′/SEQ ID NO8)，引物4(5′-acatacagctcaacctcatgatgctacggc-3′/SEQ ID NO9)，引物5(5′-cctcatgatgctacggccagaaactgaaat-3′/SEQ ID NO10)，引物6(5′-ccaagtttcagctcctatctgaagctgctc-3′/SEQ ID NO11)，引物7(5′-ggtccagatgaaaatctgagattggagaat-3′/SEQ ID NO12)，引物8(5′-atgtcttgacccaggctgacagatactgtt-3′/SEQ ID NO13)，引物9(5′-cctcctgaaatctgattcacatacaaactg-3′/SEQ ID NO14)，引物10(5′-aatgaactacataacaaccaccttagtcag-3′/SEQ ID NO15)，引物11(5′-tacataacaaccaccttagtcagatactac-3′/SEQ IDNO16)，或12(5′-tactactttgaaacctggttcaaaacctaa-3′/SEQ ID NO17)分別作為有義引物，構(gòu)建含MEGSIN基因中-1079至+59、-1040至+59、-1000至+59、-940至+59、-927至+59、-669至+59、-497至+59、-258至+59、-158至+59、-128至+59、-121至+59、或-97至+59的區(qū)域的缺失突變型DNA。螢光素酶表達載體(Picca基因基本載體2東洋Inki)(圖4)的多重克隆位點用KpnI和HindIII消化，將上述PCR產(chǎn)物插入該載體。將該載體用LiopfectAmine(Gibco-BRL)按說明書導(dǎo)入細胞首先，將含有不帶缺失的MEGSIN基因上游區(qū)(從-1154至+59)的載體轉(zhuǎn)化至各種細胞，檢測轉(zhuǎn)錄活性在不同細胞類型中的特異性(圖5)。載體于37℃轉(zhuǎn)染5小時[Derijard，B.等，細胞，76，1025-1037(1994)]。于37℃培養(yǎng)2天后，除去培養(yǎng)基，細胞用PBS洗3次。用細胞裂解緩沖液裂解細胞得到裂解物。將其離心，除去細胞沉淀。用Lumat LB9507發(fā)光儀(EG&G Berthold)直接檢測熒光量，將其除以(dividing)570nm波長下β-半乳糖苷酶發(fā)射光的量[Herbome，P.等，細胞，39，653-662(1984)]得到螢光素酶相對活性。
所用細胞為實施例1所述的培養(yǎng)的人腎小球膜細胞(Clontech)、人真皮成纖維細胞(HDF寶酒造)、以及人的腎皮質(zhì)上皮細胞(HRCE寶酒造)。結(jié)果僅在培養(yǎng)的人腎小球膜細胞中發(fā)現(xiàn)螢光素酶活性(圖5)。這表明，所用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)對腎小球膜細胞有特異性。
第二，含有缺失型突變的各種DNA用上述方式處理，將它們整合至載體，再轉(zhuǎn)染至人上皮樣癌細胞株A431，或?qū)嵤├?所述的培養(yǎng)的人腎小球膜細胞(Clontech)。然后測定螢光素酶活性。結(jié)果見圖6。該圖顯示了以MEGSIN基因上游區(qū)無缺失時的值為100％時的相對值。
當(dāng)-1154bp至-941bp的區(qū)缺失時，轉(zhuǎn)錄活性降低至約60％，因此表明正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的序列位于該區(qū)中。當(dāng)至-159bp的區(qū)缺失時，轉(zhuǎn)錄活性幾乎沒有降低。但缺失-158bp至-121bp的區(qū)時，轉(zhuǎn)錄活性比該區(qū)域完整時下降了5％當(dāng)缺失-128bp至-121bp的區(qū)時，轉(zhuǎn)錄活性大大下降，可以認為-128bp至-121bp的區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)十分重要。
由于-129至-90的區(qū)域含有AP-1(活化蛋白1)結(jié)合序列(cttagtcaga)[Lee，W.等，自然，325，368-372(1987)，F(xiàn)oletta，V.C.等，J.Leuk.Biol.,63，139-152(1998)]，c-Myb結(jié)合序列(aacaaccacc)(SEQ ID NO1中13-22位)，及Oct-1結(jié)合序列(ctacataacaac)(SEQ ID NO1中7-19位)[Rosenfeld，M.G.等，基因發(fā)展(Genes Dev.)，5,897-907(1991)]，因此提示轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點存在于該區(qū)域中。
為了進一步測定該區(qū)域是否涉及MEGSIN基因的轉(zhuǎn)錄活化，在該區(qū)域的各個位點導(dǎo)入突變，測定對轉(zhuǎn)錄活性的影響。具體為，用速變(Quick Change)定點誘變試劑盒(Stratagene)按說明書構(gòu)建各種突變體，來檢測特定核苷酸發(fā)生突變后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)能力的改變，所述突變體中-128至-127位已突變?yōu)間g(ml)，-120至-117位已突變?yōu)閏ccc(m2)，-116至-115位已突變?yōu)間g(m3)，-113至-112位已突變?yōu)間g(m4)，-106至-105位已突變?yōu)間g(m5)，-100至-98位已突變?yōu)間gc(m6)，-94至-93位已突變?yōu)間g(m7)。
這些突變體的構(gòu)建可通過實施雙脫氧核苷酸測序而直接證實。將這些突變體整合至載體，用上述方式獲得螢光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)m3-m7的螢光素酶活大大下降(圖7)。該圖顯示了以MEGSIN基因上游區(qū)無缺失時的值為100％時的相對值。
實施例6尋找啟動子結(jié)合蛋白由于實施例3顯示-128位(3′端)的下游區(qū)具有正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的活性，故用兩種探針[探針A(5′-GAATGAACTACATAACAACCACC-3′/SEQ ID NO19；-129至-107的區(qū))及探針B(5′-AACCACCTTAGTCAGATACTACTTT-3′/SEQID NO20；-113至-89的區(qū))]通過凝膠移位試驗檢測了與該區(qū)域結(jié)合的蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)。
每種探針的末端用標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記。然后，用Dignam等[Dignan，J.等，核酸研究，11，1475-1489(1983)]的方法制備實施例1之腎小球膜細胞的核提取物，然后在含10％甘油、5mM氯化鎂、1mM EDTA、25mM二硫蘇糖醇、50mM氯化鉀、10mM Hepes-KOH、3μg poly(dI-dC)、7μL核提取物、及標(biāo)記探針的反應(yīng)混合液中于室溫進行30分鐘的DNA-蛋白結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)后，進行電泳和放射自顯影。結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一探針均有DNA-蛋白復(fù)合物的移動帶，并鑒定出兩種轉(zhuǎn)錄因子(圖8)。
為了調(diào)查MEGSIN的腎小球膜細胞特異性表達是否受識別該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子量的影響，用實施例1所述的培養(yǎng)的人腎小球膜細胞(Clontech)、人平滑肌細胞(HSMCTakara)、人真皮成纖維細胞(HDFTakara)、以及人的腎皮質(zhì)上皮細胞(HRCETakara)進行凝膠移位試驗以便比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人腎小球膜細胞中，針對所有探針的DNA-蛋白復(fù)合物的量較其它細胞的大(圖9)。這表明，MEGSIN的腎小球膜細胞特異性表達受識別該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子的影響。
產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了MEGSIN基因的啟動子，其在腎小球膜細胞中特異性表達。本發(fā)明的啟動子可用于該基因在腎小球膜細胞中的特異性表達，還可用于例如，各種腎臟疾病的基因治療。它還可用于篩選與該啟動子結(jié)合的蛋白如轉(zhuǎn)錄因子。
權(quán)利要求
1.一種DNA，其含有SEQ ID NO1的堿基序列或其部分并具有啟動子活性。
2.一種載體，其含有權(quán)利要求1的DNA。
3.權(quán)利要求2的載體，其中已將一個外源基因以能表達的方式連接在權(quán)利要求1之DNA的下游。
4.一種細胞，其用權(quán)利要求3的載體轉(zhuǎn)染。
5.一種篩選與DNA結(jié)合的蛋白的方法，所述DNA含有SEQ ID NO1的堿基序列或其部分，該方法包括以下步驟(a)使待測樣品與含有SEQ ID NO1之堿基序列或其部分的DNA接觸，和(b)篩選能與含有SEQ ID NO1之堿基序列或其部分的DNA結(jié)合的蛋白。
6.一種蛋白，其可用權(quán)利要求5的方法分離。
7.權(quán)利要求6的蛋白，其中所述蛋白為轉(zhuǎn)錄因子。
全文摘要
本發(fā)明分離了一種基因組DNA區(qū),其含有MEGSIN基因上游區(qū)約1.5kb的一部分,本發(fā)明還測定了它的堿基序列。在該基因組DNA區(qū)中,鑒定了能正調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的兩個調(diào)節(jié)序列。此外,通過定點誘變在位于3’側(cè),上述兩個調(diào)節(jié)序列之間的啟動子區(qū)中導(dǎo)入了堿基取代,并因此成功鑒定了對啟動子活性具有重要作用的堿基序列。
文檔編號C07K14/435GK1343255SQ00804657
公開日2002年4月3日 申請日期2000年1月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月25日
發(fā)明者宮田敏男 申請人:宮田敏男, 黑川清