專利名稱：腦膜炎奈瑟氏菌多肽basb052的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(這里指“BASB052多核苷酸”)、它們編碼的多肽(這里指“BASB052”或“BASB052多肽”)、重組物質以及它們的制備方法。在另一個方面，本發(fā)明涉及使用這種多肽和多核苷酸包括抵抗細菌感染的疫苗的方法。再一方面，本發(fā)明涉及檢測特定病原體感染的診斷試驗。
背景技術：
腦膜炎奈瑟氏菌(腦膜炎球菌)是一種能經常從人的上呼吸道分離到的革蘭氏陰性細菌。它偶爾能導致侵襲性的細菌疾病如血癥和腦膜炎。腦膜炎疾病的發(fā)生顯示出地理、季節(jié)和年度差異(Schwartz，B.Moore，P.S.，Broome，C.V.；《臨床微生物綜述》2(增刊)，S18-S24，1989)。在溫帶國家，多數(shù)疾病是由血清型B菌株引起的，年發(fā)病率在總人數(shù)的十萬分之一至十萬分之十之間變化，有時會達到更高的數(shù)值(Kaczmarski，E.B.(1997)，Commun.Dis.Rep.Rev.7R55-9，1995；Scholten，R.J.R.M.，Bijlmer，H.A.，Poolman，J.T.等《臨床感染性疾病》16237-246，1993；Cruz，C.，Pavez，G.，Aguilar，E.，等《感染流行病學》105119-126，1990)。
由血清型A腦膜炎球菌引起的流行病，主要在中部非洲，有時能達到每年十萬分之一千(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.《臨床微生物綜述》2(增刊)，S18-S24，1989)。就腦膜炎疾病的整體來看，幾乎所有的病例都是由血清型A、B、C、W-135和Y腦膜炎球菌引起的，并且可以使用一種4價A、C、W-135、Y的多糖疫苗(Armand，J.，Arminjon，F(xiàn).，Mynard，M.C.，Lafaix，C.，《J.Biol.Stand》10335-339，1982)。多糖疫苗目前正通過將它們與載體蛋白化學偶聯(lián)的方式進行改進(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.等，JAMA 2751499-1503，1996)。
尚未獲得一種血清型B的疫苗，因為B的莢膜多糖被發(fā)現(xiàn)是非免疫原性的，很可能是由于它與宿主成分具有結構上的相似性(Wyle，F(xiàn).A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.等，《傳染病雜志》126514-522，1972；Finne，J.M.，Leinonen，M.，Mkel，P.M.《柳葉刀》ii355-357，1983)。
為開發(fā)以腦膜炎球菌外膜為基礎的疫苗，人們已經努力了多年(deMoraes，J.C.，Perkins，B.，Camargo，M.C.等《柳葉刀》3401074-1078，1992；Bjune，G.，Hoiby，E.A.Gronnesby，J.K.等，3381093-1096，1991)。這種疫苗已證明在大兒童(＞4歲)和成年人中的有效性為57％-85％。
這些疫苗中存在許多細菌外膜組分，例如PorA、PorB、Rmp、Opc、Opa、FrpB，這些成分對觀察到的保護作用所作的貢獻仍需進一步確定。使用動物或人抗體已經確定了可能與保護性免疫的誘導相關的其他細菌外膜組分，例如TbpB和NspA(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R.，《實驗醫(yī)學雜志》1851173-1183，1997；Lissolo，L.，Maitre-Wilmotte，C.，Dumas，P等，Inf.Immun.63884-890，1995)。保護性免疫的機制將涉及抗體介導的殺菌活性和吞噬調理作用。
一種菌血動物模型已被用來組合所有的抗體介導機制(Saukkonen，K.，Leinonen，M.，Abdillahi，H.Poolman，J.T.《疫苗》7325-328，1989)。一般認為，晚期補體組分介導的殺菌機制對抵抗腦膜炎疾病的免疫來說至關重要(Ross，S.C.，Rosenthal P.J.，Berberic，H.M.，Densen，P.J.《傳染病雜志》1551266-1275，1987)。
在過去幾十年中，腦膜炎奈瑟氏菌的發(fā)病率有了很大的提高。這已被歸咎為多重抗生素抗性菌株的出現(xiàn)和具有較弱的免疫系統(tǒng)的人群體的增加。分離對某些或所有標準抗生素具有抗性的菌株不再是異常。這種現(xiàn)象就使我們產生了針對這種微生物的新型抗微生物試劑、疫苗、藥物篩選方法和診斷試驗的永不滿足的需求。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及BASB052特別是BASB052多肽和BASB052多核苷酸、重組物質以及它們的制備方法。在另一個方面，本發(fā)明涉及使用這種多肽和多核苷酸的方法，包括微生物疾病的預防與治療及其他。在一個進一步的方面，本發(fā)明涉及檢測與微生物感染有關的疾病及與這樣的感染有關的癥狀的診斷試驗，例如檢測BASB052多核苷酸或多肽的表達或活性的試驗。
通過閱讀下面的描述和本公開的其他部分，本領域的技術人員將很容易理解在本發(fā)明公開的精神和范圍之內的各種改變和修飾。
發(fā)明詳述如下文的詳細介紹，本發(fā)明涉及BASB052多肽和多核苷酸。具體地說，本發(fā)明涉及腦膜炎奈瑟氏菌的BASB052的多肽和多核苷酸，BASB052與淋病奈瑟氏菌tcp蛋白在氨基酸序列上具有同源性。本發(fā)明尤其涉及具有分別列于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的核苷酸和氨基酸序列的BASB052。應當理解，在后面的序列表中列舉為“DNA”的序列代表本發(fā)明的一個實施方案的舉例，因為普通的技術人員就知道，這樣的序列通常被用作多核苷酸，包括多核糖核苷酸。多肽在本發(fā)明的一個方面，提供了在這里被稱為“BASB052”和“BASB052多肽”的腦膜炎奈瑟氏菌的多肽，及其在生物學、診斷、預防、臨床或治療上有用的變體，以及含有它們的組合物。本發(fā)明進一步提供(a)含有這樣一種氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列與SEQ IDNO2的氨基酸序列至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；(b)由含有如下一種多核苷酸序列的分離多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸序列分別與SEQ ID NO1的整個長度具有至少85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；或者(c)由含有如下一種多核苷酸序列的分離多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸序列編碼這樣一種多肽，這種多肽與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；SEQ ID NO2中提供的BASB052多肽是來自腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC13090的BASB052多肽。
本發(fā)明還提供BASB052多肽的一種免疫原性片段，即BASB052多肽的一個連續(xù)的部分，它與含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是說，該片段(必要時可與一種載體偶聯(lián))能夠產生能識別BASB052多肽的免疫應答。這種免疫原性片段可包括諸如缺少N-末端前導序列和/或跨膜區(qū)域和/或C-末端錨定區(qū)域的BASB052多肽。在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的BASB052的免疫原性片段包含基本上一種多肽的所有胞外結構域，其中該多肽與SEQ ID NO2在SEQ ID NO2的整個長度上至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性。
片段是這樣一種多肽，它具有與本發(fā)明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分而不是全部完全相同的氨基酸序列。就BASB052多肽而言，片段可以是“獨立存在”，或處于一個較大的多肽中，在一個單獨的較大多肽中組成一個部分或區(qū)域，優(yōu)選是一種單個的連續(xù)區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，諸如具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的一個部分的截短的多肽或其變體，例如包括氨基末端和或羧基末端氨基酸序列的連續(xù)殘基系列。用或在一種宿主細胞中制備的本發(fā)明的多肽的降解形式也是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是具有結構或功能特征的片段，例如含有α螺旋和α螺旋形成區(qū)域、β折疊和β折疊形成區(qū)域、轉角和轉角形成區(qū)域、線團和線團形成區(qū)域、親水區(qū)域、疏水區(qū)域、α兩親性區(qū)域、B兩親性區(qū)域、柔性區(qū)域、表面形成區(qū)域、底物結合區(qū)域和高抗原性區(qū)域的片段。
更優(yōu)選的片段包括含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸；或含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列具有從SEQ ID NO2的氨基酸序列截短或缺失的至少15、20、30、40、50或100個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明的多肽片段可用于通過肽合成制備相應的全長多肽；因此，這些片段可用作制備本發(fā)明的全長多肽的中間體。
特別優(yōu)選的是變體，其中以任何組合方式取代、缺失或添加了幾個、5-10、1-5、1-3、1-2或1個氨基酸。
本發(fā)明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是一種較大蛋白如前體或融合蛋白的一部分。通常優(yōu)選包含含有分泌或前導序列、前序列、能協(xié)助純化的序列如多組氨酸殘基，或能在重組制備過程中起穩(wěn)定作用的額外序列。而且，還考慮加入外源性多肽或脂類尾巴或多核苷酸序列以增加最終分子的免疫原性能力。
在一個方面，本發(fā)明涉及遺傳工程制備的可溶性融合蛋白，這種融合蛋白含有本發(fā)明的一種多肽或其片段以及各亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的是，免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1的恒定區(qū)部分，而融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個特別的實施方案中，F(xiàn)c部分可簡單地通過引入一個切割序列而去除，這種切割序列可用血凝因子Xa切割。
而且，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及涉及它們在藥物篩選、診斷和治療中的應用。本發(fā)明的一個進一步的方面還涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術的例子可在國際專利申請Nos.WO94/29458和WO94/22914中發(fā)現(xiàn)。
蛋白質可通過化學方法接合，或以重組融合蛋白的形式表達，這種融合蛋白形式能比非融合蛋白在一種表達系統(tǒng)以較高水平制備。融合配體可幫助提供T輔助表位(免疫性融合配體)，優(yōu)選的是能被人識別的T輔助表位；或者能幫助蛋白比原來的重組蛋白以較高產量進行表達的T輔助表位(表達增強子)。融合配體優(yōu)選既是一種免疫性融合配體，又是表達增強子配體。
融合配體包括來自流感嗜血桿菌的蛋白D和來自流感病毒的非結構蛋白NS1(血凝素)。另一種融合配體是被稱為LytA的蛋白。優(yōu)選使用該分子的C末端部分。LytA來自肺炎鏈球菌，它合成一種N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶---LytA酰胺酶(由lytA基因編碼{《基因》43(1986)265-272頁})，后者是一種自溶素，它特異性地降解肽聚糖骨架中的某些鍵。LytA蛋白的C末端區(qū)域負責與膽堿或某些膽堿類似物如DEAE的親和性。這種特性已被用于發(fā)展能用于融合蛋白表達的大腸桿菌C-LytA表達質粒。在其氨基端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化已經有介紹{《生物技術》10卷(1992)795-798頁}?？梢允褂肔ytA分子中在C末端發(fā)現(xiàn)的重復部分，從殘基178開始，例如殘基188-305。
本發(fā)明還包括前面提到的多肽的變體，即通過保守性氨基酸取代與參照物不同的多肽，其中一種殘基被另一種具有相似特征的殘基取代。典型的這種取代在如下氨基酸之間Ala、Val、Leu和Ile；Ser和Thr；酸性殘基Asp和Glu；Asn和Gln；堿性殘基Lys和Arg；或芳族殘基Phe和Tyr。
本發(fā)明的多肽可以任何合適的方式進行制備。這種多肽包括分離的天然產生的多肽、重組制備的多肽、合成制備的多肽、或用這些方法的組合制備的多肽。制備這種多肽的方法在本領域是熟知的。
本發(fā)明的多肽更優(yōu)選來自腦膜炎奈瑟氏菌，但它也優(yōu)選可獲自相同分類學屬的其他生物體。本發(fā)明的多肽還可獲自諸如相同分類學科或目的生物體。多核苷酸本發(fā)明的一個目的是提供編碼BASB052多肽的多核苷酸，特別是編碼這里被稱為BASB052的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，多核苷酸包含一個編碼BASB052多肽的區(qū)域，該區(qū)域包含一個列于SEQ ID NO1的序列，它包括一個全長的基因或其變體。
SEQ ID NO1中提供的BASB052多核苷酸是來自腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC13090的BASB052多核苷酸。
本發(fā)明的一個進一步的方面提供了編碼和/或表達BASB052多肽和多核苷酸特別是腦膜炎奈瑟氏菌的BASB052多肽和多核苷酸的分離核酸分子，包括諸如未加工的RNAs、核酶RNAs、mRNAs、cDNAs、基因組DNAs、B-和Z-DNAs。本發(fā)明的進一步的實施方案包括在生物性、診斷性、預防性、臨床或治療性有用的多核苷酸和多肽以及含有它們的組合物。
本發(fā)明的另一個方面涉及至少包括一個全長基因的分離多核苷酸，該基因編碼一種具有SEQ ID NO2的推定氨基酸序列的BASB052，以及與其密切相關的多核苷酸及其變體。
在本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了一種來自腦膜炎奈瑟氏菌的BASB052多肽，它包括或由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其變體組成。
使用這里提供的信息，例如SEQ ID NO1列出的多核苷酸序列，本發(fā)明的編碼BASB052多肽的多核苷酸可使用標準的克隆和篩選方法獲得，例如使用那些用于從細菌中克隆和測序染色體DNA片段的方法以腦膜炎奈瑟氏菌作為起始物質，接著獲得一個全長克隆。例如，為獲得本發(fā)明的一種多核苷酸序列，例如SEQ ID NO1中給出的多核苷酸序列，通常使用一種來自部分序列的放射性標記的寡核苷酸，優(yōu)選17-mer或更長，對大腸桿菌或其他合適宿主中的腦膜炎奈瑟氏菌的染色體DNA克隆文庫進行篩選。攜帶與探針相同DNA的克隆接著用嚴緊雜交條件進行區(qū)分。通過用根據(jù)原來的多肽或多核苷酸序列設計的測序引物對這樣用雜交方法鑒定的單個克隆進行測序，就有可能在兩個方向延伸多核苷酸序列，從而確定全長的基因序列。這種測序常規(guī)使用諸如由質?？寺≈苽涞淖冃缘碾p鏈DNA來進行。合適的技術見Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook等《分子克隆實驗室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)。(具體見雜交篩選1.90和變性雙鏈DNA模板測序13.70)。也可應用直接的基因組DNA測序來獲得全長的基因序列。為說明本發(fā)明，SEQ ID NO1列出的每個多核苷酸都從來自腦膜炎奈瑟氏菌的DNA文庫中發(fā)現(xiàn)。
而且，SEQ ID NO1中列出的每個DNA序列都含有一個編碼如下蛋白的開放閱讀框，該蛋白含有SEQ ID NO2中列出的氨基酸殘基數(shù)目，其推導的分子量可使用本領域技術人員熟知的氨基酸殘基的分子量數(shù)值進行計算。
SEQ ID NO1的多核苷酸位于SEQ ID NO1的起始密碼子的核苷酸號碼1和從核苷酸號碼1066開始的終止密碼子之間，編碼SEQ IDNO2的多肽。
在一個進一步的方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，該核苷酸包括或由以下組成(a)一種多核苷酸序列，它與SEQ ID NO1分別在SEQ ID NO1的整個長度上至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；或(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與SEQ ID NO2的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2的整個長度上具有至少85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或100％完全相同。
編碼本發(fā)明的一種多肽的多核苷酸，包括來自除腦膜炎奈瑟氏菌以外的種類的同源物或同源進化物，可通過一種包括以下步驟的方法來獲得在嚴緊雜交條件下(例如使用45-65℃的溫度范圍，SDS的濃度為0.1-1％)用一種標記的或可檢測的探針對合適的文庫進行篩選，其中探針包含或由SEQ ID NO1的序列或其一個片段組成，并分離含有所說多核苷酸序列的全長基因和/或基因組克隆。
本發(fā)明提供一種在其整個長度上與SEQ ID NO1的編碼序列(開放閱讀框)相同的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供單獨的成熟多肽或其片段的編碼序列以及與另一個編碼序列在一個閱讀框內的成熟多肽或其片段的編碼序列，另一個編碼序列的例子為編碼一種前導或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白的序列。本發(fā)明的多核苷酸也可含有至少一種非編碼序列，包括但不限于，諸如至少一種非編碼的5’和3’序列，例如轉錄但不翻譯的序列、終止信號(例如rho-依賴和非rho-依賴的終止信號)、核糖體結合位點、Kozak序列、穩(wěn)定mRNA的序列、內含子和聚腺苷酸化信號。多核苷酸序列也可包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可以編碼一種能促進融合多肽純化的標記序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，標記序列是一種6組氨酸肽，由pQE載體提供(Qiagen，Inc.)，見Gentz等《美國科學院院刊》86821-824，(1989)中的介紹；或是一種HA肽尾巴(Wilson等，《細胞》37767(1984)；兩種標記序列都可用于純化與它們融合的多肽。本發(fā)明的多核苷酸還包括但不限于，包含一種結構基因和其天然相連的控制基因表達的序列。
編碼SEQ ID NO2的BASB052多肽的核苷酸序列可以與SEQ IDNO1的核苷酸1至1065所含的多肽編碼序列相同。另外，它可以是這樣一種序列，即由于遺傳密碼豐余(簡并性)也編碼SEQ ID NO2的多肽。
用于此處，“編碼一種多肽的多核苷酸”一詞涉及包括一種編碼本發(fā)明的多肽的序列的多核苷酸，本發(fā)明的多肽具體說是一種細菌多肽，更具體說是腦膜炎奈瑟氏菌BASB052多肽，它具有SEQ ID NO2所列的氨基酸序列。該詞還涉及這樣一種多核苷酸，它包括編碼該肽的一個單一的連續(xù)區(qū)域或非連續(xù)區(qū)域(例如被整合的噬菌體、整合的插入序列、整合的載體序列、整合的轉座子序列或因RNA編輯或基因組DNA重排所打斷的多核苷酸)以及另外的區(qū)域，這種另外的區(qū)域也可含有編碼和/或非編碼序列。
本發(fā)明進一步涉及這里介紹的多核苷酸的變體，這種變體能編碼具有SEQ ID NO2的推定氨基酸序列的多肽的變體。本發(fā)明的多核苷酸的片段可用于諸如合成本發(fā)明的全長多核苷酸。
更加特別優(yōu)選的實施方案是編碼BASB052變體的多核苷酸，該變體具有在SEQ ID NO2中幾個、少數(shù)、5至10、1至5、1至3、2、1或沒有氨基酸被以任何組合方式取代、修飾、缺失和/或添加的BASB052多肽的氨基酸序列。在它們中尤其優(yōu)選的是并不改變BASB052多肽的特性和活性的沉默取代、添加和缺失。
本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案是與編碼具有SEQ ID NO2列出的氨基酸序列的BASB052多肽的多核苷酸在其整個長度上至少有85％相同的多核苷酸；以及與這種多核苷酸互補的多核苷酸。就此而言，特別優(yōu)選的是在整個長度上至少有90％的同一性的多核苷酸，而在這些特別優(yōu)選多核苷酸中，至少有95％的同一性的多核苷酸更為優(yōu)選，而且在這些至少有95％的同一性的多核苷酸中，至少有97％相同的多核苷酸更優(yōu)選，同樣在它們中，至少有98％和至少有99％相同的多核苷酸尤其更加優(yōu)選，其中至少有99％相同的多核苷酸更優(yōu)選。
優(yōu)選的實施方案是編碼基本上保留了SEQ ID NO1的DNA編碼的成熟多肽的相同生物功能或活性的多肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的特定優(yōu)選實施方案，本發(fā)明提供能與BASB052多核苷酸序列例如SEQ ID NO1的多核苷酸序列雜交，尤其是在嚴緊條件下雜交的多核苷酸。
本發(fā)明進一步涉及能與這里提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。就此而言，本發(fā)明特別涉及能在嚴緊條件下與這里介紹的多核苷酸雜交的多核苷酸。用于此處，“嚴緊條件”和“嚴緊雜交條件”的意思是雜交只發(fā)生在序列之間至少有95％優(yōu)選至少有97％相同時。嚴緊雜交條件的一個具體例子是在42℃在一種溶液中溫育過夜，該溶液包括50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml的變性剪切鮭精DNA，接著在0.1x SSC中在約65℃時洗滌雜交支持物。雜交和洗滌條件是眾所周知的，并在Sambrook等《分子克隆實驗室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)中特別是11章中舉例。溶液雜交也可用本發(fā)明提供的多核苷酸序列進行。
本發(fā)明還提供含有或由這樣一種多核苷酸序列組成的多核苷酸，該多核苷酸序列通過用一種探針在嚴緊雜交條件下篩選一種合適的文庫并分離所述多核苷酸序列來獲得，其中文庫含有SEQ ID NO1列出的多核苷酸序列的完整基因，而探針具有SEQ ID NO1列出的所說多核苷酸序列的序列?？捎糜讷@得這樣一種多核苷酸的片段包括諸如本文的其他部分詳細介紹的探針和引物。
如本發(fā)明在這里的其他部分對多核苷酸試驗的討論，例如，本發(fā)明的多核苷酸可用作RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針來分離編碼BASB052的全長cDNAs和基因組克隆，并分離與BASB052基因具有高同一性特別是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。這種探針一般具有至少15個核苷酸殘基或堿基對，這種探針優(yōu)選具有至少30個核苷酸殘基或堿基對，也可具有至少50個核苷酸殘基或堿基對。特別優(yōu)選的探針具有至少20個核苷酸殘基或堿基對，并少于至少30個核苷酸殘基或堿基對。
BASB052基因的編碼區(qū)可通過使用SEQ ID NO1提供的DNA序列合成一種寡核苷酸探針進行篩選來分離。然后使用與本發(fā)明的基因序列互補的標記寡核苷酸篩選一種cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，來確定該探針雜交的文庫成員。
對本領域的技術人員來說，有幾種方法是可以使用和熟知的，可以用來獲得全長DNAs或延伸短的DNAs，例如以cDNA末端快速擴增(RACE)方法為基礎的方法(見諸如Frohman等，《美國科學院院刊》858998-9002，1988)。這種技術的最近修改，例如MarathonTM技術(Clontech Laboratories Inc.)，明顯簡化了對較長cDNAs的尋找。在MarathonTM技術中，cDNAs用從一種選擇的組織中抽提的mRNA制備，并在每個末端連上一種“接頭”。然后使用基因特異的和接頭特異的寡核苷酸組合進行核酸擴增(PCR)來擴增“丟失”的DNA的5’末端。然后使用“巢式”引物重復PCR反應，巢式引物即設計來與擴增產物的內部退火的引物(通常為與接頭序列的3’退火的一種接頭特異性引物和與所選擇的基因序列的5’退火的一種基因特異性引物)。然后用DNA測序對該反應的產物進行分析，通過將產物直接與已有的DNA連接產生一個完整的序列，或者使用設計5’引物的新序列信息進行一個單獨的全長PCR，來構建一個全長的DNA。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可用作諸如發(fā)現(xiàn)疾病特別是人疾病的治療和診斷的研究試劑和物質，如同這里與多核苷酸試驗有關的討論。
本發(fā)明的多核苷酸是衍生自SEQ ID NO1-2序列的寡核苷酸，它們可用于這里介紹的方法，但更優(yōu)選用于PCR，用來確定這里鑒定的多核苷酸是否全部或部分能在細菌或感染組織中轉錄。應當理解，這種序列也可用于診斷感染的階段和所獲得病原體的感染類型。
本發(fā)明也提供編碼這樣一種多肽的多核苷酸，這種多肽是一種成熟蛋白加上另外的氨基或羧基末端氨基酸、或成熟多肽內部的氨基酸(例如，當成熟形式含有一個以上的多肽鏈時)。這種序列可在將一種蛋白從前體加工成成熟形式時起作用，可允許蛋白運輸，可延長或縮短蛋白的半壽期，或可便于蛋白用于試驗或制備時的操作。通常在體內時，另外的氨基酸可通過細胞酶從成熟蛋白上加工除去。
對于本發(fā)明的每一種和所有的多核苷酸，都提供一種與之互補的多核苷酸。這些互補多核苷酸優(yōu)選與它們互補的每一種多核苷酸完全互補。
一種含有多肽的成熟形式與一種或多種原序列融合的前體蛋白可能是該多肽的無活性形式。當除去原序列時，這種無活性的前體一般被激活。在活化前，一些或所有的原序列可被除去。這種前體一般被稱為蛋白原。
核苷酸除了用標準的A、G、C、T/U表示外，“N”也可用來描述本發(fā)明的特定多核苷酸。“N”指4種DNA或RNA核苷酸的任何一個都可出現(xiàn)在DNA或RNA序列的該指定位點，但優(yōu)選N不是一種核酸，當它與相鄰的核苷酸位置組合在一起，當按正確的閱讀框閱讀時，在該閱讀框中產生一種成熟前的終止密碼子。
總而言之，本發(fā)明的多核苷酸可編碼一種成熟蛋白、一種成熟蛋白加一種前導序列(它可被稱為一種前蛋白)、含有一種或多種非前蛋白的前導序列的原序列的成熟蛋白的前體、或原蛋白的前體前原蛋白，其具有一種前導序列和一種或多種原序列，它們通常在產生多肽的活性和成熟形式的加工過程中被除去。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供本發(fā)明的多核苷酸在治療性或預防性目的特別是遺傳免疫方面的應用。
本發(fā)明的多核苷酸在遺傳免疫方面的應用優(yōu)選使用一種合適的傳遞方法，例如直接將質粒DNA注射進肌肉(Wolff等《人類分子遺傳學》(1992)1363，Manthorpe等，《人類基因治療》(1983)4419)；將DNA與特異性蛋白載體復合后進行傳遞(Wu等，《生物化學雜志》(1989)26416985)，將DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvenisty&Reshef，《美國科學院院刊》(1986)839551)；將DNA用各種形式的脂質體包裹(Kaneda等，《科學》(1989)243375)；粒子轟擊(Tang等，《自然》(1992)356152，Eisenbraun等《DNA與細胞生物學》(1993)12791)以及使用克隆的逆轉錄載體進行體內感染(Seeger等，《美國科學院院刊》815949)。載體、宿主細胞、表達系統(tǒng)本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體進行了遺傳工程改造的宿主細胞以及通過重組技術制備本發(fā)明的多肽。無細胞翻譯系統(tǒng)也可用于使用來自本發(fā)明的DNA結構物的RNAs制備這樣的蛋白。
本發(fā)明的重組多肽可使用本領域技術人員熟知的方法由含有表達系統(tǒng)的遺傳工程宿主細胞進行制備。因此，在一個進一步的方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的表達系統(tǒng)、用這種表達系統(tǒng)遺傳工程改造的宿主細胞以及用重組技術制備本發(fā)明的多肽。
為進行本發(fā)明的多肽的重組制備，宿主細胞可通過遺傳工程改造來整合表達系統(tǒng)或其部分或本發(fā)明的多核苷酸。將多核苷酸導入宿主細胞可通過多種標準實驗室手冊介紹的方法來完成，例如Davis等《分子生物學基本方法》(1986)和Sambrook等《分子克隆實驗室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)，例如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、載體轉染(transvection)、顯微注射、陽離子脂介導的轉染、電穿孔、轉導、劃痕接種、轟擊導入和感染。
合適宿主的代表性例子包括細菌細胞如鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、鏈霉菌、藍細菌、枯草芽孢桿菌、粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌的細胞；真菌細胞如克魯維氏酵母、糖酵母等酵母、白色假絲酵母和曲霉等擔子菌的細胞；昆蟲細胞如果蠅S2和草地夜蛾Sf9的細胞；動物細胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞如裸子植物或被子植物的細胞。
多種表達系統(tǒng)可用于制備本發(fā)明的多肽。這種載體包括染色體型、游離型、病毒型衍生載體，例如由細菌質粒、細菌噬菌體、轉座子、酵母游離體、插入元件、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒、微小RNA病毒、逆轉錄病毒和甲型病毒衍生的載體或由它們的組合物衍生的載體，例如由質粒和噬菌體遺傳元件衍生的載體，如粘粒和噬菌粒。表達系統(tǒng)結構物可含有調節(jié)以及引起表達的控制區(qū)域。就這個方面一般來說，任何適合于維持、增殖或表達多核苷酸和/或在一種宿主中表達一種多肽的系統(tǒng)或載體都可用于表達。合適的DNA序列可通過任何熟知的和常規(guī)的技術插入到表達系統(tǒng)中，例如Sambrook等《分子克隆實驗室指南》(上文)中列出的技術。
在真核細胞重組表達系統(tǒng)中，為使翻譯蛋白分泌到內質網(wǎng)層中、周質間或胞外環(huán)境中，可將合適的分泌信號整合到表達的多肽中。這些信號對多肽來說可以是內源性的，或者也可以是異源性的。
本發(fā)明的多肽可通過熟知的技術從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化，這些技術包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。更優(yōu)選將金屬離子親和層析(IMAC)用于純化。熟知的用于蛋白重新折疊的技術可用于當多肽在胞內合成、分離和/或純化過程中變性時活性構象的再生。
表達系統(tǒng)也可是一種重組的活微生物，例如一種病毒或細菌。目標基因可插入到活的重組病毒或細菌的基因組中。接種和體內感染這種活的載體將導致抗原的體內表達和免疫應答誘導。用于此目的的病毒和細菌是諸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀禽痘病毒)、甲病毒(辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、微小RNA病毒(脊髓灰質炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒等)、李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、奈瑟氏菌、BCG。這些病毒和細菌可以是毒性的、或用各種方法減毒來獲得一種活疫苗。這種活疫苗也是本發(fā)明的一個部分。診斷、預測、血清分型和突變試驗本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的BASB052多核苷酸和多肽用作診斷試劑。在真核細胞特別是哺乳動物細胞尤其是人細胞中檢測BASB052多核苷酸和/或多肽可為診斷疾病、疾病階段或感染生物體對藥物的應答提供一種診斷方法。真核細胞，特別是哺乳動物細胞，尤其是人細胞，特別是那些感染或懷疑感染了含有BASB052基因或蛋白的生物體的細胞，可在核酸或氨基酸水平通過多種熟知的技術以及這里提供的方法進行檢測。
用于預測、診斷或其他分析的多肽和多核苷酸可獲自假定感染和/或感染個體的機體物質。來自任何這些來源的多核苷酸尤其是DNA或RNA可直接用于檢測，或者可在分析前使用PCR或其他任何擴增技術進行酶促擴增。RNA特別是mRNA、cDNA和基因組DNA也可以相同方式使用。使用擴增方法，通過對生物體的所選多核苷酸的基因型進行分析，可對感染性或個體中存在的定居生物體的種類和菌株進行鑒定。缺失和插入可通過擴增產物與一種選自相關生物體的參考序列的基因型相比的大小變化進行檢測，優(yōu)選與相同屬的不同種或相同種的不同株進行比較。點突變可通過將擴增DNA與標記的BASB052多核苷酸序列進行雜交來鑒定。對于DNA或RNA來說，通過DNase或RNase消化分別可將非?；蛎黠@匹配的序列與匹配不佳或明顯錯配的雙體區(qū)分開來，或者通過檢測融解溫度或復性動力學的差異進行區(qū)分。多核苷酸序列差異也可通過多核苷酸片段在凝膠中與一種參考序列相比的電泳遷移的改變來檢測。這可使用或不使用變性試劑。多核苷酸差異也可通過直接的DNA或RNA測序來檢測。見諸如Myers等，《科學》2301242(1985)。特殊位置的序列改變也可通過核酸酶保護試驗如RNase、V1和S1保護試驗或化學裂解方法來顯示。見諸如Cotton等《美國科學院院刊》854397-4401(1985)。
在另一個實施方案中，可以構建一系列含有BASB052核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針，來對諸如遺傳突變、血清型、分類或鑒定進行有效的篩選。平行技術方法是眾所周知的，具有通用性，可用來解決分子遺傳學中的多種問題，包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變異(見諸如Chee等《科學》274610(1996)。
因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，它包括(a)本發(fā)明的一種多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO1的核苷酸序列或其片段；(b)與(a)的核苷酸序列互補的核苷酸序列；
(c)本發(fā)明的一種多肽，優(yōu)選SEQ ID NO2的多肽或其片段；或(d)針對本發(fā)明的多肽的抗體，優(yōu)選針對SEQ ID NO2的多肽的抗體。
在任何這樣一種試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可優(yōu)選含有一種基本組分。這種試劑盒可用于疾病或對疾病的易感性的診斷或其他。
本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的多核苷酸用作診斷試劑。對本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選SEQ ID NO1的與一種疾病或致病性相關的突變形式的檢測，可提供一種診斷手段，這種診斷手段可增加或限定由于該多核苷酸的低表達、過量表達或表達改變而引起的一種疾病的診斷、疾病過程的預測、疾病階段、或疾病的易感性的確定。在這樣的多核苷酸中帶有突變的生物體特別是感染性生物體可通過各種技術例如這里任何地方介紹的技術在多核苷酸水平進行檢測。
來自在本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽中帶有突變或多態(tài)性(等位突變)的生物體的細胞也可用來使用多種技術在多核苷酸或多肽水平進行檢測，從而進行諸如血清學分型。例如，RT-PCR可用來檢測RNA中的突變。優(yōu)選將RT-PCR與自動檢測系統(tǒng)如GeneScan結合起來進行使用。RNA、cDNA或基因組DNA也可用于相同的目的---PCR。例如，與編碼BASB052多肽的多核苷酸互補的PCR引物可用來鑒定和分析突變。
本發(fā)明進一步提供從5’和/或3’末端除去1、2、3或4個核苷酸的引物。這些引物可與其他材料一起用于擴增從個體獲得的一種樣品如機體物質中分離的BASB052 DNA和/或RNA。這些引物可用于擴增從感染個體中分離的一種多核苷酸，這樣，該多核苷酸可隨后通過各種技術來闡明多核苷酸序列。通過這種方法，可檢測多核苷酸序列中的突變，并用于診斷和/或預測感染或其階段或過程，或進行感染因子的血清學分型和/或分類。
本發(fā)明進一步提供診斷疾病，優(yōu)選是細菌感染，更優(yōu)選是由腦膜炎奈瑟氏菌引起的感染的方法，這包括在從個體獲得的樣品如一種機體物質中檢測具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸的表達水平的提高。BASB052多核苷酸表達的增加或減少可使用本領域任何已知的用于多核苷酸定量的方法進行檢測，例如擴增、PCR、RT-PCR、RNase保護、Northern印跡、分光光度和其他雜交方法。
此外，根據(jù)本發(fā)明的用于檢測BASB052多肽與正常對照組織樣品相比過量表達的診斷試驗可用來檢測例如一種感染的存在。可用來測定BASB052多肽在來自一種宿主如一種機體物質中的水平的試驗技術對本領域的技術人員來說是熟知的。這種試驗方法包括放射免疫試驗、競爭結合試驗、Western印跡、抗體夾心試驗、抗體檢測和ELISA試驗。
本發(fā)明的多核苷酸可用作多核苷酸列陣優(yōu)選是高密度列陣或載網(wǎng)的組分。這些高密度列陣對于診斷和預測目的特別有用。例如，各含一種不同基因并進一步含有本發(fā)明的多核苷酸的一套點可用于探針檢測，例如使用雜交或核酸擴增，使用來自或衍生自一種機體樣品的探針，來檢測一種特別的寡核苷酸序列或相關序列在一個個體中的存在。這種存在可說明一種病原體尤其是腦膜炎奈瑟氏菌的存在，并可用來診斷和/或預測疾病或疾病過程。優(yōu)選的是一種含有多種SEQ IDNO1的核苷酸序列的變體的載網(wǎng)。含有編碼SEQ ID NO2的多肽序列的多核苷酸序列的多種變體的載網(wǎng)也是優(yōu)選的?？贵w本發(fā)明的多肽和多核苷酸或其變體或者表達它們的細胞可用作免疫原來制備分別針對這種多肽或多核苷酸的抗體。
在本發(fā)明的特定優(yōu)選實施方案中，提供針對BASB052多肽或多核苷酸的抗體。
針對本發(fā)明的多肽或多核苷酸制備的抗體可通過使用傳統(tǒng)的方法獲得，即將本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸、或它們之一或兩者的攜帶表位的片段、它們之一或兩者的類似物、或表達它們之一或兩者的細胞給藥于一種動物，優(yōu)選是一種非人類的動物。本領域任何能提供用連續(xù)細胞系培養(yǎng)制備的抗體的技術都可以使用。例子包括各種技術，例如Kohler，G.和Milstein，C.《自然》256495-497(1975)；Kozbor等《今日免疫學》472(1983)；Cole等《單克隆抗體和癌癥治療》，AlanR.Liss，Inc.(1985)的77-96頁。
制備單鏈抗體的技術(美國專利No.4,946,778)可修改來制備針對本發(fā)明的多肽或多核苷酸的單鏈抗體。轉基因鼠或其他生物體或動物如其他哺乳動物也可用來表達對本發(fā)明的多肽或多核苷酸免疫特異的人源化抗體。
另外，噬菌體顯示技術可用來從含有抗BASB052的人淋巴細胞的PCR擴增的V-基因文庫或天然文庫中選擇對本發(fā)明的多肽具有結合活性的抗體基因(McCafferty等(1990)《自然》348552-554；Marks等(1992)《生物技術》10779-783)。這些抗體的親和性也可通過諸如鏈置換技術進行提高(Clackson等，(1991)《自然》352628)。
上面介紹的抗體可用來分離或鑒定能夠表達本發(fā)明的多肽或多核苷酸的克隆，來通過諸如親和層析純化這些多肽或多核苷酸。
這些抗體以及其他針對BASB052多肽或BASB052多核苷酸的抗體可用來治療感染，特別是細菌感染。
多肽變體包括抗原性、表位性或免疫性等價的變體，它們組成了本發(fā)明的一個特別的方面。
抗體或其片段優(yōu)選通過修飾，使之在個體中具有較小的免疫原性。例如，如果個體是人，抗體可更優(yōu)選是一種“人源化”的抗體，其中雜交瘤來源抗體的互補決定區(qū)被移植到人單克隆抗體中，例如Jones等(1986)《自然》321，522-525或Tempest等(1991)《生物技術》9，266-273中的介紹。拮抗劑和激動劑---試驗和分子本發(fā)明的多肽和多核苷酸還可用來評價小分子底物與配體在諸如細胞、無細胞抽提物、化學文庫和天然產物混合物中的結合。這些底物和配體可以是天然底物和配體，或者可以是結構或功能模擬物，見諸如Coligan等《當代免疫學方法》1(2)5章(1991)。
篩選方法可通過一種直接或間接與候選化合物連接的標記簡單地測量候選化合物與多肽或多核苷酸、或者攜帶多肽或多核苷酸的細胞或膜、或者多肽的融合蛋白的結合。此外，篩選方法可包括與一種標記的競爭物進行競爭。而且，這些篩選方法可檢測候選化合物是否導致一種由多肽或多核苷酸的活化產生的信號，這可使用與含有多肽或多核苷酸的細胞適宜的檢測系統(tǒng)來進行?；罨囊种苿┮话阍诖嬖谝环N已知激動劑的情況下進行試驗，并觀察候選化合物對激動劑活化作用的影響。組成型活性多肽和/或組成型表達的多肽和多核苷酸可根據(jù)需要，在沒有一種激動劑或拮抗劑的情況下，用于逆轉激動劑或抑制劑的篩選方法，這可通過檢測候選化合物是否導致多肽或多核苷酸的活化的抑制來進行。而且，篩選方法可簡單地包括以下步驟，將一種候選化合物與含有本發(fā)明的一種多肽或多核苷酸的溶液混合，形成一種混合物；檢測混合物中BASB052多肽和/或多核苷酸的活性；將混合物中BASB052多肽和/或多核苷酸的活性與一種標準進行比較。融合蛋白如這里介紹的Fc部分與BASB052多肽制備的融合蛋白也可用于高通量的篩選試驗，用來鑒定本發(fā)明的多肽的拮抗劑以及系統(tǒng)發(fā)育和/或功能上相關的多肽(見D.Bennett等《分子識別雜志》852-58(1995)和K.Johanson等《生物化學雜志》270(16)9459-9471(1995))。
能夠與本發(fā)明的一種多肽結合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗體也可用于設計檢測加入的化合物對細胞中mRNA和/或多肽產生的影響的篩選方法。例如，可以設計一種ELISA試驗，使用單克隆和多克隆抗體，按照本領域的標準方法，測量多肽的分泌或細胞結合水平。這可用來發(fā)現(xiàn)能抑制或增強多肽在合適的操作細胞或組織中產生的試劑(分別也被稱為拮抗劑或激動劑)。
本發(fā)明還提供一種篩選化合物的方法，用來鑒定能夠增強(激動劑)或阻斷(拮抗劑)BASB052多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是能夠抑菌和/或殺菌的化合物。這種篩選方法可使用高通量技術。例如，為篩選激動劑或拮抗劑，將一種合成反應混合物、一種細胞組分如膜、細胞包膜或細胞壁、或者它們的任何制備物、包括BASB052多肽和一種標記底物或這種多肽的配體，在一種可能是BASB052激動劑或拮抗劑的候選分子存在或不存在的條件下，進行溫育。候選化合物激動或拮抗BASB052多肽的能力反映于標記配體的結合降低或這種底物的產物的產生減少。無效結合即不誘導BASB052多肽的效果的分子很可能是優(yōu)秀的拮抗劑。根據(jù)情況，結合良好并增加產物由底物產生的速率、增加信號轉導或增加化學通道活性的的分子即是激動劑。根據(jù)情況，產物由底物產生、信號傳導或化學通道活性的速率或水平的檢測可通過使用一種報告系統(tǒng)來增強?？捎糜诖四康膱蟾嫦到y(tǒng)包括但不限于比色、標記底物轉變成產物、一種對BASB052多核苷酸或多肽的變化應答的報告基因以及本領域熟知的結合試驗。
BASB052激動劑試驗的另一個例子是一種競爭試驗，該試驗將BASB052和一種可能的激動劑與BASB052結合分子、重組BASB052結合分子、天然底物或配體、或底物或配體的模擬物組合在一起，在合適的條件下進行競爭抑制試驗。BASB052可進行標記，例如用放射活性或比色化合物標記，使結合到一種結合分子上或轉化成產物的BASB052分子的數(shù)目可以精確測定，來評價可能的拮抗劑的作用。
可能的拮抗劑包括能與本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽結合并因而抑制或壓制其活性或表達的小有機分子、肽、多肽以及抗體及其他?？赡艿霓卓箘┮部梢允沁@樣的小有機分子、肽、多肽如密切相關的蛋白或抗體，它們結合在結合分子的相同位點，例如一種結合分子，但不誘導BASB052誘導的活性，從而通過阻止BASB052多肽和/或多核苷酸結合來抑制BASB052多肽和/或多核苷酸的活化或表達。
可能的拮抗劑包括這樣的小分子，它們結合和占據(jù)多肽的結合位點，因而阻止其與細胞結合分子結合，從而抑制正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小有機分子、肽或肽樣分子。其他可能的拮抗劑包括反義分子(見Okano，《神經化學雜志》56560(1991)；《寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑》CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988)，對這些分子的介紹)。優(yōu)選的可能的拮抗劑包括與BASB052及其變體有關的化合物。
在一個進一步的方面，本發(fā)明涉及遺傳工程的可溶性融合蛋白，這種蛋白包括本發(fā)明的一種多肽或其片段以及各種亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1重鏈的恒定區(qū)部分，其中融合發(fā)生于鉸鏈區(qū)。在一個特別的實施方案中，F(xiàn)c部分可通過以下方法簡單地除去引入一個切割序列，該序列可用血液凝集因子Xa。而且，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，并涉及將其用于藥物篩選、診斷和治療。本發(fā)明的一個進一步的方面還涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術的例子可見于國際專利申請Nos.WO94/29458和WO94/22914。
這里提供的每個多核苷酸序列可用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)抗菌化合物。編碼蛋白通過表達可用作篩選抗菌藥物的靶。此外，編碼所編碼蛋白的氨基末端區(qū)域或相應mRNA的SD或其他翻譯促進區(qū)域的多核苷酸序列可用于構建反義序列來控制目標編碼序列的表達。
本發(fā)明還提供將本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動劑或拮抗劑用于干擾一種病原體或多種病原體與一種對感染繼發(fā)癥敏感的真核生物優(yōu)選是哺乳動物宿主之間的最初生理相互作用。具體地說，本發(fā)明的分子可用于抑制細菌具體說是革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細菌粘附于真核生物優(yōu)選是哺乳動物的深埋裝置的細胞外基質蛋白或粘附于傷口的細胞外基質蛋白；阻斷真核生物優(yōu)選是哺乳動物的細胞外基質蛋白與細菌BASB052蛋白之間的細菌性粘附，后者介導組織損傷；和/或阻斷不管是深埋裝置植入還是其他外科技術引起的感染的正常致病過程。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供BASB052激動劑和拮抗劑，優(yōu)選是抑菌或殺菌性激動劑和拮抗劑。
本發(fā)明的拮抗劑和激動劑可用于例如阻止、抑制和/或治療疾病。
在一個進一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽的模擬表位。模擬表位是一種肽序列，與天然肽足夠相似(序列上或結構上)，它能被識別天然肽的抗體識別，或在與一種合適載體偶聯(lián)時能夠產生識別天然肽的抗體。
肽模擬表位可通過添加、缺失或取代所選擇的氨基酸用于特別的目的。因此，肽可被修飾以易于與一種蛋白載體連接。例如，對于某些化學結合方法，需要含有一個末端半胱氨酸。此外，對于肽與一種蛋白載體結合，需要包含一個遠離肽結合末端的疏水末端，使肽的未結合的游離末端保持與載體蛋白表面的相互作用。從而使肽具有一種構象，這種構象與肽在整個天然分子結構中具有的構象非常相似。例如，肽可被修改來具有一個N末端半胱氨酸和一個C末端疏水的酰胺化的尾巴。另外，可以進行一種或多種氨基酸的D立體異構體的添加或取代，來制備一種有用的衍生物，用來例如增強肽的穩(wěn)定性。
此外，肽模擬表位可通過諸如噬菌體顯示技術(EP 0 552 267 B1)使用能與本發(fā)明的多肽結合的抗體來鑒定。這種技術產生大量的模擬天然肽的結構的肽序列，這些肽序列因此能夠結合抗天然肽的抗體，但可能不足以與天然多肽具有明顯的序列同源性。疫苗本發(fā)明的另一個方面涉及在個體特別是哺乳動物優(yōu)選是人中誘導免疫應答的方法，這種方法包括用BASB052多核苷酸和/或多肽或其片段或變體接種個體，它們足以產生抗體和/或T細胞免疫應答，保護個體不被感染，特別是細菌感染，尤其是腦膜炎奈瑟氏菌感染。本發(fā)明還提供產生這種免疫應答以延緩細菌復制的方法。本發(fā)明的另一個方面涉及在個體中誘導免疫應答的方法，包括給予這種個體一種指導BASB052多核苷酸和/或多肽表達或其片段或變體表達的核酸載體、序列或核酶，來在體內表達BASB052多核苷酸和/或多肽表達或其片段或變體，從而誘導一種免疫應答，例如產生抗體和/或T細胞免疫應答，包括諸如產細胞因子T細胞或細胞毒T細胞，來保護所述個體，優(yōu)選是人免于患病，而不管這種疾病是已經在個體中存在還是不存在?；蚪o藥的一個例子是將其作為顆?；蚱渌镔|的包被物來促進其進入所需的細胞。這種核酸載體可包括DNA、RNA、核酶、修飾的核酸、DNA/RNA雜合體、DNA蛋白復合物或RNA-蛋白復合物。
本發(fā)明的一個進一步的方面涉及一種免疫組合物，該組合物在導入個體優(yōu)選是人時，能夠誘導一種免疫應答，即在該個體中誘導針對BASB052多核苷酸和/或由其編碼的多肽的免疫應答。其中組合物包含重組的BASB052多核苷酸和/或由其編碼的多肽；和/或包含能夠編碼和表達所述BASB052多核苷酸、由其編碼的多肽或本發(fā)明的其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫應答可用于治療或預防目的，并且可采用抗體免疫和/或細胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T細胞引起的細胞免疫。
因此，BASB052多肽或其片段可與輔助蛋白或化學半分子融合，輔助蛋白或化學半分子能夠或不能自身產生抗體，但能夠使第一種蛋白穩(wěn)定，并產生一種融合的或修飾的蛋白，后者具有抗原性和/或免疫原性，優(yōu)選是保護性。這樣的融合重組蛋白優(yōu)選進一步含有一種抗原性輔助蛋白，例如來自流感嗜血桿菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或β-半乳糖苷酶或其他任何能夠穩(wěn)定蛋白并促進其制備和純化的大輔助蛋白。而且，輔助蛋白在對接受該蛋白的生物體的免疫系統(tǒng)提供一種標準刺激時，可用作一種佐劑。輔助蛋白可連接在第一種蛋白的氨基端或羧基端。
在本發(fā)明的疫苗組合物中，BASB052多肽和/或多核苷酸或其片段、模擬表位(mimotope)、或變體可以存在于一種載體中，如上述活細菌載體等活重組載體。
BASB052多肽的無生命載體也是合適的，例如細菌外膜囊泡或“小泡(bleb)”。OM小泡衍生自革蘭氏陰性細菌雙層膜的外膜，已在多種革蘭氏陰性細菌包括C.trachomatis和C.psittaci中報導(Zhou，L等，1998，F(xiàn)EMS微生物通訊，163223-228)。據(jù)報導產生小泡的細菌病原體的非限制性實例也包括百日咳博德特氏菌、布氏疏螺旋體、馬爾他布魯氏菌、羊布魯氏菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌、銅綠假單胞菌和小腸結腸炎耶爾森氏菌。
小泡的優(yōu)勢是以天然構象提供外膜蛋白，因此在疫苗中特別有用。小泡也可以通過工程改造細菌以改變外膜上一個或多個分子的表達而用于疫苗。因此，例如可以引入或上調(如通過改變啟動子)BASB052多肽等所需的免疫原性蛋白在外膜的表達。另一種方式或者進一步，不相關(如非保護性抗原或免疫優(yōu)勢但可變的蛋白)或有害(如LPS等毒性分子，或自身免疫應答的潛在誘導物)的外膜分子的包括可以被下調。這些方式以下詳述。
BASB052基因的非編碼旁側區(qū)含有基因表達中重要的調控元件。這種調控既存在于轉錄水平又存在于翻譯水平。這些區(qū)域(無論是基因開放閱讀框的上游還是下游)的序列可以通過DNA測序獲得。這種序列信息可以確定潛在的調控基元，如不同的啟動子元件、終止子序列、可誘導序列元件、阻遏物、負責相轉變的元件，核糖體結合序列、具有參與調控的潛在二級結構，以及其它類型的調控基元或序列。該序列是本發(fā)明的另一方面。
該序列信息允許調節(jié)BASB052基因的天然表達?；虮磉_的上調也可通過改變啟動子、核糖體結合序列、潛在阻遏物或操縱基因元件或任何其它有關元件。同樣，表達的下調可以通過類似的調控實現(xiàn)?；蛘?，通過改變相轉變序列，基因的表達可以置于相轉變控制之下，或者可以與這種調控解偶聯(lián)。另一種途徑是，該基因的表達可以置于一個或多個允許調節(jié)表達的可誘導元件的控制之下。這種調節(jié)的實例包括但不限于通過溫度轉變的誘導，加入選定碳水化合物或其衍生物等誘導底物、痕量元素、維生素、輔因子、金屬離子等。
上述改變可以通過幾種不同方式導入。改變參與基因表達的序列可以通過體內隨機誘變然后選擇所需表型來實現(xiàn)。另一種途徑是分離目標區(qū)域，通過隨機誘變或定點置換、插入或缺失誘變改變之。改變的區(qū)域可以通過同源重組重新導入細菌基因組，基因表達的效果可以被評價。另一種途徑是，目標區(qū)域的序列知識可以用于置換或缺失天然調控序列的全部或部分。這種情況下，分離和改變目標調控區(qū)，以包括來自其它基因的調控元件，來自不同基因的調控元件的組合，合成調控區(qū)，或任何其它調控區(qū)，或缺失野生型調控序列的選定部分。這些改變的序列可以通過同源重組被重新導入細菌基因組中?？梢杂糜谏险{基因表達的優(yōu)選啟動子的非限制性實例包括來自腦膜炎奈瑟氏菌或淋病奈瑟氏菌的啟動子proA，proB，1bpB，tbpB，p110，1st，hpuAB；來自M.Catarrhalis的TbpB；來自流感嗜血桿菌的p1，p2，p4，p5，p6，1pD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。
在一個實例中，基因表達可以通過將其啟動子換成較強的啟動子(通過分離該基因的上游序列，體外修飾該序列，通過同源重組再導入基因組中)加以改變。上調的表達可以在細菌以及來自該細菌的外膜囊泡中實現(xiàn)。
在一個實例中，上述途徑可以用來產生疫苗應用中性能改進的重組細菌菌株。這些可以是減毒菌株，選定抗原的表達增加的菌株，干預免疫應答的基因敲除(或表達降低)的菌株，免疫優(yōu)勢蛋白的表達改變的菌株，外膜囊泡的脫落改變的菌株，但不限于此。
因此，本發(fā)明也提供BASB052基因的改變的上游區(qū)，這些改變的區(qū)域也含有異源調控元件，其改變位于外膜蛋白的BASB052蛋白的表達水平。本發(fā)明這方面的上游區(qū)包括BASB052基因的上游序列。上游區(qū)始于BASB052基因的上游，通常延伸至ATG起始密碼子上游不到約1000bp處。在基因位于多順反子序列(操縱子)中時，上游區(qū)可以剛好始于目的基因之前，或操縱子第一個基因之前。優(yōu)選，本發(fā)明這方面的改變上游區(qū)含有位于ATG上游500到700bp位置處的異源啟動子。
因此，本發(fā)明提供在改變的細菌小泡中的BASB052多肽。本發(fā)明也提供能夠產生基于非生命膜的小泡載體的修飾宿主細胞。本發(fā)明還提供含有BASB052基因的核酸載體，所述基因具有含有異源調控元件的改變上游區(qū)。
本發(fā)明還提供制備本發(fā)明的宿主細胞和細菌小泡的方法。
本發(fā)明也提供含有本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及免疫調節(jié)DNA序列如Sato，Y.《科學》273352(1996)中介紹的DNA序列的組合物，特別是疫苗組合物，以及方法。
本發(fā)明還提供在腦膜炎奈瑟氏菌感染的動物模型的這種遺傳免疫實驗中所用的多核苷酸結構物中使用所介紹的多核苷酸或其特殊片段的方法，其中多核苷酸或其特殊片段已經顯示編碼細菌細胞表面蛋白的非可變區(qū)。這種實驗可特別用于鑒定能夠激發(fā)預防性或治療性免疫應答的蛋白表位?？梢韵嘈?，這種方法將能夠用于隨后由成功地抵抗或清除了感染的動物的必需的器官，制備有特殊價值的單克隆抗體，用于發(fā)展哺乳動物特別是人的治療細菌性感染特別是奈瑟氏菌感染的預防性試劑或治療性試劑。
本發(fā)明還包括疫苗制劑，這種制劑包括本發(fā)明的一種免疫原性重組多肽和/或多核苷酸以及一種合適的載體，例如一種可藥用載體。因為多肽和多核苷酸可能在胃中會被打斷，它們都優(yōu)選經腸道外給藥，包括諸如皮下、肌肉、靜脈或皮內，適用于腸道外給藥的制劑包括水和非水的無菌注射溶液，它們可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和能夠使制劑與個體的體液優(yōu)選是血液等滲的溶劑，以及可包含懸浮劑或增稠劑的水和非水無菌懸液。制劑可置于單劑量或多劑量的容器內，例如密封的安瓶和小瓶，并可貯存于冷凍干燥的環(huán)境，只需在使用前加入無菌的液體載體。
本發(fā)明的疫苗制劑也可包括佐劑系統(tǒng)，用來增強制劑的免疫原性。優(yōu)選佐劑系統(tǒng)優(yōu)先引發(fā)TH1型應答。
免疫應答大體上可分為兩個典型的種類，即體液或細胞介導的免疫應答(一般分別用其保護作用的抗體和細胞效應機制來區(qū)分)。這些應答種類被稱為TH1型應答(細胞介導的應答)和TH2型免疫應答(體液應答)。
典型的TH1型免疫應答的特征是產生抗原特異的單元型限制的細胞毒T淋巴細胞和自然殺傷型細胞應答。在小鼠中，TH1型應答的特征通常是產生IgG2a亞型的抗體，而在人中，它們的對應物是IgG1型抗體。TH2型免疫應答的特征是產生廣譜的免疫球蛋白同種型，在小鼠中包括IgG1、IgA和IgM。
可以想象得到，這兩種類型的免疫應答之后的驅動力是細胞因子。高水平的TH1型細胞因子優(yōu)先誘導針對所給抗原的細胞介導的免疫應答，而高水平的TH2型細胞因子優(yōu)先誘導針對抗原的體液免疫應答。
TH1和TH2型免疫應答的區(qū)分不是絕對的。事實上，一個個體可以支持一種被描述為TH1優(yōu)勢或TH2優(yōu)勢的免疫應答。但是，通常方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細胞克隆中的介紹來考慮細胞因子的家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)，TH1和TH2細胞淋巴因子的不同分泌模式導致不同的功能特性。《免疫學年鑒》7卷，145-173頁)。通常，TH1型應答與T淋巴細胞產生INF-γ和IL-2細胞因子相關。其他通常直接與TH1型免疫應答誘導有關的細胞因子如IL-12不由T細胞產生。相反，TH2型應答與IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有關。
已知特定的疫苗佐劑特別適合于刺激TH1或TH2型細胞因子應答。疫苗接種或感染后免疫應答的TH1∶TH2平衡的最佳指標通常包括在體外用抗原再刺激后直接測量T淋巴細胞產生的TH1或TH2細胞因子，和/或測量抗原特異的抗體應答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1型佐劑是在體外用抗原再刺激時優(yōu)先刺激分離的T細胞群體產生高水平的TH1型細胞因子和促進CD8+細胞毒T淋巴細胞和與TH1型同種型相關的抗原特異的免疫球蛋白應答產生的佐劑。
能夠優(yōu)先刺激TH1細胞應答的佐劑在國際專利申請No.WO94/00153和WO95/17209中介紹。
3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這可由GB2220211(Ribi)知道。它在化學上是3 De-O酰化單磷酰類脂A與4、5或6酰基鏈的混合物，并由Ribi Immunochem，Montana制造。3De-O-酰化單磷酰類脂A的一種優(yōu)選形式在歐洲專利0 689 454(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公開。
3D-MPL顆粒優(yōu)選小到足以通過一個0.22μm微孔濾膜進行過濾除菌(歐洲專利0 689 454)。
3D-MPL以每劑10μg-100μg，優(yōu)選是20-25μg的范圍存在，而抗原通常以每劑2-50μg的范圍存在。
另一個優(yōu)選的佐劑包含QS21，它是一種來自Quillaja SaponariaMolina的莖的Hplc純化的無毒組分。它可選用來與3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)混合，并可與一種載體一起使用。
制備QS21的方法在美國專利No.5,057,540中公開。
含有QS21的非反應性的佐劑制劑在以前已有介紹(WO96/33739)。含有QS21和膽甾醇的這種制劑在與抗原一起配制時已顯示是成功的TH1刺激佐劑。
優(yōu)先刺激TH1型細胞應答的進一步的佐劑包括免疫調節(jié)性的寡核苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO96/02555中的公開。
不同TH1刺激性佐劑如上文所介紹的佐劑的組合也被認為是能提供一種優(yōu)先刺激TH1型細胞應答的佐劑。例如，QS21可與3D-MPL組合配制。OS213D-MPL的比率通常為1∶10至10∶1，優(yōu)選為1∶5至5∶1，并且通常為大約1∶1。優(yōu)選的最佳組合范圍是2.5∶1至1∶1的3D-MPLQS21。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物還優(yōu)選含有一種載體。載體可以是一種水包油乳劑，或一種鋁鹽如磷酸鋁或氫氧化鋁。
水包油乳劑優(yōu)選包含一種可代謝的油，例如角鯊烯、α-生育酚和Tween 80。在一個特別優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物中的抗原與QS21和3D-MPL在這樣一種乳劑中組合。另外，該水包油乳劑可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。
在對人給藥時，疫苗中QS21和3D-MPL的范圍是每劑1μg-200μg，例如10-100μg，優(yōu)選是10μg-50μg。水包油通常含有2至10％的角鯊烯、2至10％的α-生育酚和0.3至3％的Tween 80。在以更穩(wěn)定的乳劑形式提供時，角鯊烯α-生育酚Tween 80的比例優(yōu)選相同或少于1。還可包含1％水平的Span85。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗優(yōu)選進一步含有一種穩(wěn)定劑。
非毒性的水包油乳劑優(yōu)選在一種水載體中含有一種非毒性的油如角鯊烷或角鯊烯、一種乳化劑如Tween 80。水載體可以是例如磷酸緩沖鹽水。
WO95/17210中介紹了一種特別強有力的佐劑制劑，它含有在一種水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本發(fā)明還提供一種多價的疫苗組合物，它含有本發(fā)明的疫苗制劑以及其他抗原，特別是對治療癌癥、自身免疫疾病和相關病癥有用的抗原。這樣一種多價疫苗組合物可包括一種如前所述的TH1誘導型佐劑。
雖然本發(fā)明對特定的BASB052多肽和多核苷酸進行了介紹，但應當理解它們覆蓋了天然產生的多肽和多核苷酸以及含有添加、缺失或取代的相似多肽和多核苷酸，這些添加、缺失或取代基本上不影響重組多肽或多核苷酸的免疫原特征。
抗原也可以完整細菌(死的或活的)或亞細胞組分的形式進行傳遞，這些可能性包括腦膜炎奈瑟氏菌自身。組合物、試劑盒和給藥在本發(fā)明的一個進一步的方面，提供含有用于對一個細胞或一個多細胞生物體給藥的BASB052多核苷酸和/或BASB052多肽的組合物。
本發(fā)明還涉及含有這里討論的多核苷酸和/或多肽或它們的激動劑或拮抗劑的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可與一種非無菌或無菌載體或用于細胞、組織或生物體的載體，例如一種適用于對個體給藥的藥用載體組合使用。這種組合物包括例如一種介質添加劑或一種治療有效劑量的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及一種可藥用載體或賦形劑。這種載體可包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。制劑應適合于給藥模式。本發(fā)明進一步涉及診斷和藥用包裝和試劑盒，它們含有一種或多種容器，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的上面提到的成分。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨或與其他化合物例如治療性化合物一起使用。
藥用組合物可通過任何有效、傳統(tǒng)的方式進行給藥，包括諸如通過局部、口、肛門、陰道、靜脈內、腹膜內、肌肉、皮下、鼻內或皮內途徑及其他途徑進行給藥。
在用于治療或預防時，活性試劑可以一種可注射的組合物的形式給藥于個體，例如以無菌水分散物優(yōu)選是等滲的形式給藥。
在一個進一步的方面，本發(fā)明提供藥用組合物，它包含一種治療有效劑量的多肽和/或多核苷酸例如本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸的可溶形式、激動劑或拮抗劑或小分子化合物、以及一種可藥用載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。本發(fā)明進一步涉及藥用包裝和試劑盒，它們含有一種或多種容器，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的上面提到的成分。本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨或與其他化合物例如治療性化合物一起使用。
組合物應采用一種給藥途徑，例如通過一種全身性或經口途徑。全身性給藥的優(yōu)選形式包括注射，通常通過靜脈注射。其他的注射途徑例如皮下、肌肉或腹膜都可以采用。全身性給藥的其他方法包括使用滲透劑如膽鹽或梭鏈孢酸或其他去污劑經粘膜和皮膚給藥。此外，如果本發(fā)明的一種多肽或其他化合物可配制成一種腸溶或一種膠囊制劑，經口途徑也可以使用。這些化合物的給藥也可經表皮和/或局部，以藥膏、帖膏、凝膠、溶液、粉末等形式使用。
為對哺乳動物特別是人進行給藥，活性試劑的每日劑量水平應從0.01mg/kg至10mg/kg，通常為1mg/kg左右。在任何情況下，醫(yī)生應確定最適合于個體的實際劑量，并根據(jù)年齡、體重和特殊個體的應答而不同。當然，在個體情況時，可以使用更高或更低的劑量范圍，這些也都在本發(fā)明的范圍內。
所需的劑量范圍依賴于所選擇的肽、給藥途徑、制劑的性質、用藥者病癥的性質以及醫(yī)師的判斷。但合適的劑量為每kg 0.1-100μg的范圍。
疫苗組合物一般采用注射形式。傳統(tǒng)的佐劑可用來增強免疫應答。疫苗接種的合適單位劑量為0.5-5μg/kg的抗原，這樣的劑量優(yōu)選給藥1-3次、間隔1-3周。對于指定的劑量范圍，本發(fā)明的化合物在給藥于合適的個體時，不會觀察到毒副作用。
但考慮到可以使用不同的化合物以及不同給藥途徑可產生不同的效果，所需的劑量有廣泛的變化。例如，口服途徑比靜脈注射需要更高的劑量。這些劑量水平的變化可按照本領域熟知的方法使用標準的優(yōu)化實踐途徑進行調整。序列數(shù)據(jù)庫、有形介質中的序列以及算法多核苷酸和多肽序列組成了有價值的信息來源，用來確定它們的二維和三維結構以及進一步鑒定相似同源的序列。這些方法可很方便地通過下述步驟來進行，即將它們存入計算機可讀介質，然后將數(shù)據(jù)存入一個已知的大分子結構程序或使用熟知的搜索工具如GCG程序包搜索一個序列數(shù)據(jù)庫。
本發(fā)明還提供分析特征序列或鏈特別是基因序列或編碼蛋白序列的方法。優(yōu)選的序列分析的方法包括諸如序列同源性分析方法如同一性和相似性分析、DNA、RNA和蛋白結構分析、序列排列、進化分析、序列基元分析、開放閱讀框確定、核酸堿基召喚、密碼子使用分析、核酸堿基整理、和序列層析峰分析。
本發(fā)明提供了一種以計算機為基礎的方法，用于進行同源性鑒定。此方法包括以下步驟提供在一種計算機可讀介質中的含有本發(fā)明的一種多核苷酸序列的第一個多核苷酸序列，將所述第一個多核苷酸與至少一種第二個多核苷酸或多肽序列比較，來確定同源性。
本發(fā)明提供了一種以計算機為基礎的方法，用于進行同源性鑒定。所述方法包括以下步驟提供在一種計算機可讀介質中的含有本發(fā)明的一種多肽序列的第一個多肽序列，將所述第一個多肽序列與至少一種第二個多核苷酸或多肽序列比較，來確定同源性。
本申請書中引用的所有出版物和參考文獻，包括但不限于專利和專利申請，在這里都全文引入作為參考，如同它們各自都特別地和個別地在此全文列出。本申請要求優(yōu)先權的任何專利申請也以與上面對出版物和參考所介紹的相同方式在此全文引入作為參考。定義“同一性”如同本領域所熟知的，是兩種或多種多肽序列或兩種或多種多核苷酸序列之間的相關性，根據(jù)具體情況，可通過序列比較來確定。在本領域，“同一性”還指多肽或多核苷酸序列之間序列相關的程度，根據(jù)具體情況，可通過這些序列的鏈的匹配來確定?！巴恍浴笨墒褂靡阎姆椒ǚ奖愕赜嬎?，包括但不限于(《計算分子生物學》，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988；《生物計算機信息和基因組計劃》Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計算機分析》I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯，HumanaPress，New Jersey，1994；《分子生物學中的序列分析》von Heine，G.，Academic Press，1987；和《序列分析引物》Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，《SIAM J.Applied Math》481073(1988)。測定同一性的方法被設計來給出檢測序列之間的最大匹配。而且，測定同一性的方法在公眾可獲得的計算機程序中編碼。用來測定兩種序列之間的同一性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.等《核酸研究》12(1)387(1984)、BLASTP、BLASTN(Altschul，S.F.等《分子生物學雜志》215403-410(1990)以及FASTA(Pearson和Lipman《美國科學院院刊》852444-2448(1988)。BLAST程序家族可從NCBI和其他來源獲得(《BLAST手冊》Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等《分子生物學雜志》215403-410(1990)。著名的Smith Waterman算法也可用來測定同一性。
多肽序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物學雜志》48443-453(1970)比較矩陣Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62《美國科學院院刊》8910915-10919(1992)缺口補償8缺口長度補償2使用這些參數(shù)的程序可以從Genetics Computer Group，Madison WI以“缺口”程序的形式獲得。上述參數(shù)是多肽比較的缺省參數(shù)(對末端缺口無補償)。
多核苷酸序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物學雜志》48443-453(1970)比較矩陣匹配＝+10，不匹配＝0缺口補償50缺口長度補償3來源Genetics Computer Group，Madison WI的“缺口”程序。上述參數(shù)是核酸比較的缺省參數(shù)。
多核苷酸和多肽的“同一性”的優(yōu)選含義根據(jù)情況在下面(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸實施方案進一步包括含有如下核苷酸序列的分離多核苷酸，該核苷酸序列與SEQ ID NO1的參考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1的參考序列相同，或者與參考序列相比，可包括一定數(shù)量的核苷酸改變，其中這種改變可以選自至少一個核苷酸缺失、置換(包括轉換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個或多個毗連群散布在參照序列中，其中核苷酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO1中的總核苷酸數(shù)乘以相應同一性百分數(shù)(除以100)，然后將其結果從SEQ ID NO1的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO1中的核苷酸總數(shù)，v對50％來說是0.50，對60％來說是0.60，對70％來說是0.70，對80％來說是0.80，對85％來說是0.85，對90％來說是0.90，對95％來說是0.95，對97％來說是0.97，對100％來說是1.00，而·是乘法運算的符號，對xn和y的結果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸的改變可能在該編碼序列中產生無義、錯義或移碼突變，因此改變后的多核苷酸編碼的多肽會發(fā)生變化。
例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的核苷酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個核苷酸缺失、置換(包括轉換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個或多個毗連群散布在參照序列中。核苷酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO1中的總核苷酸數(shù)乘以相應同一性百分數(shù)(除以100)，然后將其結果從SEQ ID NO1的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn為核苷酸改變數(shù)量，xn為SEQ ID NO1的總核苷酸數(shù)，v值在70％時為0.70，在80％時為0.80，在85％時為0.85，依此類推，·為乘法運算的符號，其中若xn和y的結果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。
(2)多肽實施方案進一步包括含有如下多肽序列的分離多肽，該多肽序列與SEQ ID NO2的參考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多肽序列可以與SEQ IDNO2的參考序列相同，或者與參考序列相比，可包括一定數(shù)量的氨基酸改變，其中所述改變選自至少一個氨基酸缺失、取代(包括保守性或非保守性取代)或插入，而且所述改變可發(fā)生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何地方、分別散布在參考序列的氨基酸中或者以一個或多個毗連群散布在參考序列中，并且所述氨基酸改變的數(shù)目如下確定SEQ ID NO2中的總氨基酸數(shù)乘以相應同一性百分數(shù)(除以100)，然后將其結果從SEQ ID NO2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為SEQ ID NO2中的氨基酸總數(shù)，v對50％來說是0.50，對60％來說是0.60，對70％來說是0.70，對80％來說是0.80，對85％來說是0.85，對90％來說是0.90，對95％來說是0.95，對97％來說是0.97，對100％來說是1.00，而·是乘法運算的符號，若xa和y的結果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。
例如，本發(fā)明的多肽序列可以與SEQ ID NO2的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個或多個毗連群散布在參照序列中。同一性百分數(shù)一定時氨基酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO2中的總氨基酸數(shù)乘以相應同一性百分數(shù)(除以100)，然后將其結果從SEQ ID NO2的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)
其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為SEQ ID NO2的總氨基酸數(shù)，v值在70％時為0.70，在80％時為0.80，在85％時為0.85，依此類推，而·是乘法運算的符號，其中若xa和y的結果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。
“個體”在用于此處指示一種生物體時，是指一種多細胞真核生物，包括但不限于后生動物、哺乳動物、卵生動物、?？?、猿、靈長動物和人。
“分離的”表示“通過人工”改變其天然狀態(tài)，即如果“分離的”組合物或物質在自然界中存在，則它已經從其原始環(huán)境改變或取出或者已經取出并改變。例如，在本文中使用該術語時，在活動物體內存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但已經與天然狀態(tài)下共存的物質分開的同樣多核苷酸或多肽就是“分離的”。而且，一種多核苷酸或多肽在通過轉化、遺傳操作或任何其他重組方法導入一種生物體時，即使它仍然存在于所述生物體中，它也是“分離”的，該生物體可以是活的或死的。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它可以是修飾或非修飾的RNA或DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)域。
“變體”指不同于參照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸變體的核苷酸序列與參照多核苷酸不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可能導致參照序列編碼的多肽中氨基酸的置換、添加、缺失、融合和截短。一般多肽變體的氨基酸序列與參照多肽不同。通常，差異有限，因此參照多肽和變體的序列在總體上是極其近似的，在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以有任何組合形式的一個或多個置換、添加、缺失的區(qū)別。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，如等位變體，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可以通過誘變技術或直接合成制備。
“疾病”是指任何由細菌感染導致或與之有關的疾病，包括諸如上呼吸道感染、侵襲性細菌疾病如菌血癥和腦膜炎。
實施例下面的實施例使用標準的技術進行，這些技術對本領域的技術人員來說是熟知的和常規(guī)的，除非它們在其他地方詳細介紹。實施例是說明性的，不能限制本發(fā)明。實施例1腦膜炎奈瑟氏血清型B菌株ATCC13090中的BASB052序列腦膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC13090的BASB052基因序列示于SEQID NO1。SEQ ID NO2中所示的BASB052多核苷酸序列的翻譯結果與淋病奈瑟氏菌tcp蛋白有氨基酸序列同源性。BASB052多肽含有脂蛋白特征性的信號序列。實施例2表達重組BASB052的質粒的構建ABASB052的克隆將NdeI和XhoI限制位點分別插入正向Lip10-Fm/p(5′-AGG CAGAGG CAT ATG TCC GAA AAC AAA CAA AAC GAA GTC-3′，SEQ IDNO3)和反向Lip10-RCf/p(5′-AGG CAG AGG CTC GAG TTC ATT CGTTAC CTG ACC GGC GAT GCC GTG-3′，SEQ ID NO4)擴增引物，它們允許BASB052 PCR產物定向克隆至低拷貝大腸桿菌表達質粒pTLZ2中，使得BASB052蛋白可以表達成C末端含有(His)6親和層析標志的融合蛋白。BASB052 PCR產物使用硅膠基自旋柱(QiaGen)按照廠商說明由擴增產物中純化。為了產生克隆所需的NdeI和XhoI末端，純化的PCR產物用NdeI和XhoI限制酶按照廠商(Life Technologies)說明依次消化完全。
第一次限制消化后，PCR產物同上通過自旋柱純化以除去鹽，在第二次酶消化之前，用無菌水洗脫。消化的DNA片段在與pTLZ2質粒連接前使用硅膠基自旋柱再次純化。B表達載體制備為了制備連接用的表達質粒pTLZ2，將其用NdeI和XhoI同樣消化完全，然后按照廠商說明用牛腸磷酸酶(CIP，約0.02單位/皮摩爾5′末端，Life Technologies)處理以防止自身連接。將相對制備的載體約5倍摩爾過量的消化片段用來進行連接反應。標準的20μl連接反應(約16℃，約16小時)利用本領域已知的技術使用T4 DNA連接酶(約2.0單位/反應，Life Technologies)進行。連接反應(約5μl)的等分試樣按照本領域已知技術用來轉化電感受態(tài)JM109細胞。在約1.0毫升LB培養(yǎng)液中37℃下生長約2-3小時后，轉化細胞涂布于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上。在選擇培養(yǎng)基中包括抗生素以確保所有轉化細胞攜帶pTLZ2質粒(ApR)。平板在37℃溫育約16小時。單獨的ApR菌落用無菌牙簽挑出，“片狀”接種新鮮LB ApR平板以及約1.0ml LB ApRR培養(yǎng)液。片狀平板和培養(yǎng)液在標準溫育箱(平板)或水浴搖床上37℃溫育。
進行全細胞PCR分析以確證轉化子含有BASB052 DNA插入物。將約1.0毫升LB Ap過夜培養(yǎng)物轉移到1.5毫升聚丙烯管中，在Beckman離心機中離心收集細胞(約3分鐘，室溫，約12000×g)。細胞沉淀重懸于約200μl無菌水中，約10μl等分試樣用于進行終體積約50μl的PCR反應，其中含有BASB052正向和反向擴增引物。PCR反應成分的終濃度基本上與實施例2中相同，但使用約5單位Taq聚合酶。開始的95℃變性步驟增加到3分鐘以確保細菌細胞的熱裂解和質粒DNA的釋放。使用ABI 9700型熱循環(huán)儀，進行32循環(huán)的3步熱循環(huán)，循環(huán)條件為95℃45秒；55-58℃45秒；72℃1分鐘，以擴增裂解的轉化子樣品的BASB052 PCR片段。熱循環(huán)后，取約20μl反應等分試樣通過瓊脂糖凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中的0.8％瓊脂糖)進行分析。凝膠電泳后使用UV照射和溴化乙錠染色顯示DNA片段。DNA分子量標準(1Kb梯度，Life Technologies)與試樣平行電泳，用于估計PCR產物的大小。產生預期PCR產物的轉化子鑒定為含有BASB052表達構建體的菌株。然后分析含有表達質粒的菌株中重組BASB052的誘導表達。CPCR陽性轉化子的表達分析對于以上鑒定的每一個PCR陽性轉化子，約5毫升含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)液用來自片狀平板的細胞接種，37℃振蕩(約250rpm)生長過夜。過夜種子培養(yǎng)物的等分試樣(約1.0ml)接種含有約25毫升LB Ap培養(yǎng)液的125毫升燒瓶中，37℃振蕩(約250rpm)生長過夜，直至培養(yǎng)物濁度達到O.D.600約為0.5，即中對數(shù)期(通常需約1.5到2.0小時)。此時，約一般培養(yǎng)物(約12.5ml)被轉移到第二個125毫升燒瓶中，通過加入IPTG(無菌水中制備的1.0M原液，Sigma)至終濃度1.0mM誘導重組BASB052蛋白的表達。IPTG誘導和未誘導培養(yǎng)物在37℃下再振蕩溫育約4小時。誘導和未誘導培養(yǎng)物樣品(約1.0毫升)在誘導期后取出，室溫下在離心機中離心約3分鐘收集細胞。單獨的細胞沉淀懸浮于約50μl無菌水中，然后與等體積含有2-巰基乙醇的2×Laemmli SDS-PAGE樣品緩沖液混合，置于沸水浴中約3分鐘以變性蛋白。等體積(約15μl)IPTG誘導和未誘導細胞粗裂解物上樣于兩塊12％ Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚Mini-gels，Novex)。誘導和未誘導裂解物樣品與預先染色的分子量標記(SeeBlue，Novex)在常規(guī)條件下一起電泳，使用標準SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)。電泳后，一塊凝膠用考馬斯亮藍R250(BioRad)染色，然后脫色以顯示新的BASB052 IPTG誘導蛋白。第二塊凝膠使用BioRad Mini-Protean II印跡裝置和Towbin甲醇(20％)轉移緩沖液在4℃下電印跡約2小時轉移到PVDF膜(0.45微米孔徑，Novex)。膜的封閉和抗體溫育按照本領域已知技術進行。使用單克隆抗(His)5抗體，然后是輟合有HRP(QiaGen)的兔抗小鼠抗體，以確證BASB052重組蛋白的表達和身份。使用ABT不溶底物或使用Amersham ECL化學發(fā)光系統(tǒng)的Hyperfilm顯示抗His抗體反應性特征。實施例3重組BASB052脂化(lipidation)狀態(tài)為了確定BASB052重組蛋白是否脂化，使用3H-甘油和3H-棕櫚酸作為脂特異性摻入標記進行放射標記實驗。含有表達質粒的BL21DE3大腸桿菌菌株培養(yǎng)物在M9基本培養(yǎng)基上生長，用50μCi3H-甘油或3H-棕櫚酸在3小時IPTG誘導期間進行脈沖標記。洗滌除去未摻入的同位素后，放射標記培養(yǎng)物的全細胞裂解物在梯度聚丙烯酰胺凝膠(4-20％)上電泳，固定，然后干燥。在70℃將干凝膠對Hyperfilm(Amersham)曝光約7天產生放射自顯影圖。兩種標記均產生了與IPTG誘導的考馬斯亮藍可染色蛋白大小相同的可見帶。摻入到IPTG誘導蛋白的3H-標記支持大腸桿菌中BASB052蛋白有一定程度的脂化的結論。實施例4產生重組BASB052細菌菌株含有編碼腦膜炎奈瑟氏菌BASB052的pTLZ2質粒的大腸桿菌JM109的重組表達被用來產生純化重組蛋白的細胞群體。表達菌株在LB瓊脂平板上培養(yǎng)，平板中含有100μg/ml氨芐青霉素(Ap)以確保質粒存在。為了在-80℃下冷藏，菌株在含有相同濃度的抗生素的LB培養(yǎng)液中增殖，然后與等體積含有30％(w/v)甘油的LB培養(yǎng)液混合。
培養(yǎng)基用于產生重組蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基為含有100μg/ml Ap的2X YT培養(yǎng)液(Difco)。向發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加入消泡劑至0.25ml/L(Antifoam204，Sigma)。為了誘導BASB052重組蛋白的表達，向發(fā)酵罐中加入IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃苷)(1mM，終濃度)。
發(fā)酵含有50毫升工作體積的500毫升種子培養(yǎng)燒瓶中接種0.3毫升迅速解凍的冰凍培養(yǎng)物或來自選擇性瓊脂平板上的幾個菌落，在搖床(Innova 2100，New Brunswick Scientific)上以150rpm在37±1℃溫育約12小時。該種子培養(yǎng)物用來接種含有2X YT培養(yǎng)液和Ap、工作體積為5升的發(fā)酵罐。發(fā)酵罐(Bioflo 3000，New Brunswick Scientific)的運行條件為37±1℃、0.2-0.4 VVM通氣、Rushton葉輪250rpm。燒瓶種子培養(yǎng)物和發(fā)酵罐中的pH無需控制。發(fā)酵期間，發(fā)酵罐中的pH為6.5到7.3。當培養(yǎng)物達到生長的中對數(shù)期時(O.D.600為約0.7單位)，向發(fā)酵罐中加入IPTG(1.0M原液，在無菌水中制備)。誘導細胞2-4小時，然后，使用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速離心機(Srovall Instruments)離心收集細胞。細胞沉淀保存在-20℃待用。
純化咪唑和生物技術級或更高級別試劑均獲自Ameresco Chemical，Solon，Ohio。Triton X-100(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Triton X-114、一價磷酸鈉、尿素均為試劑級或更優(yōu)級別，均獲自Sigma ChemicalCompany，St.Louis，Missouri。Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水(1×PBS)獲自Quality Biologicai，Inc.，Gaithersburg，Maryland。Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水(10×PBS)獲自BioWhittaker，Walkersville，Maryland。無BSA的五His抗體獲自QiaGen，Valencia，California。過氧化物酶輟合的親和純級羊抗小鼠IgG獲自Jackson Immuno Research，West Grove，Penn。所有其它試劑均為試劑級或更高級別。
Ni螯合Sepharose速流樹脂獲自Pharmacia，Sweden。預制Tris-甘氨酸4-20％和10-20％聚丙烯酰胺凝膠、所有電泳緩沖液和溶液、SeeBlue預先染色標準、多標記多色標準和PVDF轉移膜獲自Novex，San Diego，California。SDS-PAGE銀染試劑盒獲自Daiichi PureChemicals Company Limtid，Toyko，Japan?？捡R斯染色溶液獲自Bio-RadLaboratories，Hercules，California。AcrodiscPF 0.2m注射器式濾器獲自Pall Gelman Science，Ann Arbor，Michigan。GD/X 25mm一次性注射器式濾器獲自Whatman Inc.，Clifton，New Jersey。透析管8,000 MWCO獲自BioDesign Inc.Od New York，Carmak New York。BCA蛋白分析試劑和Snake Skin透析管3,500 MWCO獲自Pierce Chemical Co.Rockford，Illinois。
提取步驟細胞沉淀在室溫解凍30到60分鐘。稱取5到6克材料至50毫升一次性離心管中。重組BASB052抗原通過溶菌酶處理和超聲處理提取。所得的材料離心，沉淀通過超聲處理懸浮于50 mM Tris緩沖液pH7.5，含有8M尿素、20％甘油和0.005％ triton X100。該材料再次離心，沉淀通過鎳螯合Sepharose速流柱。然后用200 mM咪唑洗脫蛋白，以親和純化組氨酸標記的蛋白，獲得超過90％的純蛋白。該含有洗脫蛋白的級分對含有0.5M精氨酸和0.1％ Triton X100的PBS(pH7.4)透析。
最終制劑BASB052對0.1％ Triton X-100和1×PBS，pH7.4透析過夜，更換3次透析液。鑒定純化蛋白并如下所述用于產生抗體。
生物化學鑒定SDS-PAGE和蛋白印跡分析重組純化蛋白在4-20％聚丙烯酰胺凝膠上分離，如前所述在100V下1小時電轉移到PVDF膜上(Thebaine等，1979，美國國家科學院院刊，764350-4354)。PVDF膜然后用25ml含有5％無脂奶粉的Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水預處理。所有進一步的溫育均使用該預處理緩沖液進行。
PVDF膜用抗His尾抗體稀釋液室溫溫育1小時。然后用洗滌緩沖液(20 mM Tris緩沖液，pH7.5，含有150mM氯化鈉和0.05％Tween-20)洗膜兩次。PVDF膜然后用25毫升1∶5000稀釋的過氧化物酶標記種特異性輟合物室溫溫育30分鐘。PVDF膜然后用洗滌緩沖液洗滌4次，用Zymed(San Francisco，CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和脲過氧化物顯色。
SDS-PAGE結果(

圖1A)顯示有一純度大于90％的約49kDa蛋白，SDS-PAGE的蛋白印跡(圖1B)中其與抗四His抗體反應。實施例5用重組BASB052免疫小鼠部分純化的在大腸桿菌中表達的重組BASB052蛋白在第0天、14天和28天三次注射給BalB/C小鼠(10只動物/組)。動物通過皮下途徑注射，每劑量為5μg左右抗原，所述抗原有兩種不同的制劑形式或者吸附于100μg磷酸鋁上，或者配制在SBAS2乳劑(每劑含有5μg MPL和1μg QS21的SB62乳劑)中。在實驗中也加入陰性對照組，其由僅用SBAS2乳劑免疫的小鼠組成。小鼠在第28天(14天Post II)和35天(7天Post III)放血，以檢測特異性的抗BASB052抗體。特異性抗BASB052抗體通過部分純化的BASB052蛋白以及大腸桿菌蛋白的Elisa測定?？贵w應答也通過對不同腦膜炎奈瑟氏菌B菌株的蛋白印跡進行。來自制劑組(僅7天Post III)的混合血清(來自10只小鼠/組)在這些實驗中測定。圖2所示結果清楚地表明抗體應答極佳，而抗大腸桿菌抗體應答(圖3)盡管也呈陽性，但較特異性BASB052應答(圖2)低約10倍。磷酸鋁制劑誘導最高的抗體水平。圖4和5所示的蛋白印跡證實BASB052蛋白在預期的50kDa MW處清晰可見。
通過蛋白印跡對不同腦膜炎奈瑟氏菌菌株上的BASB052表位進行識別在此試驗中，通過蛋白印跡檢測經免疫小鼠的血清(混合血清)以對7株不同的腦膜炎奈瑟氏菌B菌株以及部分純化的重組BASB052蛋白上的BASB052表位進行識別，7株菌株為H44/76(B15P1.7，譜系ET-5)、M97 250987(B4P1.15)、BZ10(B2bP1.2，譜系A4)、BZ198(BNT*-，譜系3)、EG328(BNT*，譜系ST-18)、NGP165(B2aP1.2，ET 37簇)和ATCC 13090(B15P1.15)腦膜炎奈瑟氏菌B菌株。(*NT未分型)。
簡而言之，將用樣品緩沖液處理(95℃ 10分鐘)的每種樣品的10μl(＞108細胞/泳道)置于SDS-PAGE梯度凝膠(Tris-甘氨酸4-20％，Novex，code n°EC60252)。在125伏電泳90分鐘(35mA/凝膠)。然后使用Bio-rad轉印系統(tǒng)(code n°170-3930)在100伏經過1∶30小時將蛋白轉移至硝酸纖維素膜(0.45μm，code n°162-0114)。濾膜用PBS-0.05％ Tween 20在室溫封閉過夜，然后與含有抗BASB052抗體的小鼠血清溫育，所述血清源自磷酸鋁和SBAS2制劑。這些血清在PBS-0.05％ Tween 20中稀釋100倍，并在硝酸纖維素膜上在室溫下振蕩溫育2小時。將硝酸纖維素膜在PBS-0.05％ Tween 20中洗滌5分鐘，重復此步驟3次，然后將硝酸纖維素膜與在相同洗滌緩沖液中按1/500稀釋的合適輟合物(生物素化的山羊抗小鼠Ig抗體，Amersham code n°RPN1001)在室溫下輕輕振蕩溫育1小時。按前面的介紹將膜洗滌3次，并與在洗滌緩沖液中按1/1000稀釋的鏈親和素-過氧化物酶復合物(Amersham code n°1051)振蕩溫育30分鐘。經過最后3次重復的洗滌步驟，在含有30mg 4-氯-1-萘酚(Sigma)、10ml甲醇、40ml PBS和30μl H2O2的50ml溶液中溫育20分鐘進行顯色。將膜在蒸餾水中洗滌數(shù)次終止顯色。
圖4和5中的結果顯示，所有檢測菌株都與約10kDa左右主要帶反應，另有少數(shù)較高分子量的帶，這可能也與抗原有關。這說明BASB052蛋白可能在全部腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株中表達。在圖4和圖5中，小鼠血清識別的重組BASB052蛋白具有相同的分子量。但是，小鼠血清識別的最小帶(＜9kDa)似乎與大腸桿菌污染有關，這可由大腸桿菌提取物的最后一個泳道(圖4右邊部分)證實。
序列信息BASB052多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO1腦膜炎奈瑟氏菌ATCC13090菌株的BASB052多核苷酸序列ATGTCCGAAAACAAACAAAACGAAGTCCTGAGCGGTTACGAACAACTCAAACGGCGCAACCGCCGCCGTCTCGTAACGGCAAGCTGCCTGGTTGCCGCCTCCTGCCTGCTGCTGGCGGCCGCCCTCAGTTCCGATCCTGCCGAAAATCCCCCTGCCGCACCGACTGACGAAACAGGCAGCATGGAAAACCAAGCGGCAAGCACGGTACAAACCCCGACCTTAAAATCCGCCTCAGAAGGTGTTGAACCCGCCGCCGACAAACCTCAAGACCTGGCCAGTGAAGAACAAGCACCTGCCGCCGACAATGGAATCAGCGAACCTGAAGACGTAGGCGCACCATTGGTCATCATCAACGACCGACTCGACGACAGCAATATCAAAGGCTTGGAGTCATCCGCAAAACCGAAACAGGGAGAAGCTGCCGAGAAACCGCAGCAGGCAGAAACTGCCAAAACCGCACCGAAGCAGGCAAAACAACGCGCTGCCGAAAAAGTGTCGGCAACTGCCGACAGTACGGATACGGTAGCGGTTGAAAAACCGAAACGCACTGCCGAAACAAAACCGCAAAAAGCGGAACGCACTGCCGAAGCCAAGCCCAAAGCCAAAGAAACCAAAACCGCCGAAAAAGTTGCCGACAAACCGAAAACTGCCGCCGAAAAAACCAAACCGGATACGGCAAAATCCGACAGCGCGGTAAAAGAAGCGAAAAAAGCCGACAAGGCTGAAGGCAAAAAAACAGCCGAAAAAGACCATTCGGACGGGAAAAAACACGAAACGGCACAAAAAAGCGACAAAGCGGACAAGACCAAAACCGCCGAAAAAGAAAAATCCGAAAATTCCGGCAAAAAAGCCGCCATTCAGGCAGGTTATGCCGAAAAAGAACGCGCCTTGAGCCTCCAGCGCAAAATGAAAGCGGCGGGTATCGATTCGACCATTACTGAAATCATGACCGACAACGGCAAAGTTTACCGCGTCAAATCAAGCAACTATAAAAACGCAAGGGATGCCGAGCGCGATTTGAACAAACTGCGCGTGCACGGCATCGCCGGTCAGGTAACGAATGAATAASEQ ID NO2由SEQ ID NO1多核苷酸推導的腦膜炎奈瑟氏菌BASB052多肽序列MSENKQNEVLSGYEQLKRRNRRRLVTASCLVAASCLLLAAALSSDPAENPPAAPTDETGSMENQAASTVQTPTLKSASEGVEPAADKPQDLASEEQAPAADNGISEPEDVGAPLVIINDRLDDSNIKGLESSAKPKQGEAAEKPQQAETAKTAPKQAKQRAAEKVSATADSTDTVAVEKPKRTAETKPQKAERTAEAKPKAKETKTAEKVADKPKTAAEKTKPDTAKSDSAVKEAKKADKAEGKKTAEKDHSDGKKHETAQKSDKADKTKTAEKEKSENSGKKAAIQAGYAEKERALSLQRKMKAAGIDSTITEIMTDNGKVYRVKSSNYKNARDAERDLNKLRVHGIAGQVTNESEQ ID NO3AGG CAG AGG CAT ATG TCC GAA AAC AAA CAA AAC GAA GTCSEQ ID NO4AGG CAG AGG CTC GAG TTC ATT CGT TAC CTG ACC GGC GAT GCC GTG
保藏材料含有腦膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的保藏物已于1997年6月22日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(這里表示為“ATCC”)進行保藏，保藏號為13090。該保藏物為腦膜炎奈瑟氏菌(Albrecht和Ghon)，是一種從腦膜炎奈瑟氏菌分離物構建的1.5-2.9kb插入文庫的凍干物。該保藏物在《Iht.Bull.Bacteriol.Nomencl.Taxon.》81-15(1958)中介紹。
該腦膜炎奈瑟氏菌菌株保藏物在此被稱為“保藏菌株”或“保藏菌株的DNA”。
保藏菌株含有全長的BASB052基因。保藏菌株中所含的多核苷酸以及編碼的任何多肽的氨基酸序列與本文的序列描述不一致時，以前者為準。
保藏菌株的保藏是根據(jù)《國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約》的條款進行的。在專利被授予時，該菌株即可不受限制地無條件向公眾發(fā)放。提供該保藏菌株僅為方便本領域技術人員，本發(fā)明的實施并不一定需要該保藏材料，如同35U.S.C.ξ112.的要求。
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1002年7月)
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicals<120>新化合物<130>BM45350<160>4<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1068<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)<400>1atgtccgaaa acaaacaaaa cgaagtcctg agcggttacg aacaactcaa acggcgcaac 60cgccgccgtc tcgtaacggc aagctgcctg gttgccgcct cctgcctgct gctggcggcc 120gccctcagtt ccgatcctgc cgaaaatccc cctgccgcac cgactgacga aacaggcagc 180atggaaaacc aagcggcaag cacggtacaa accccgacct taaaatccgc ctcagaaggt 240gttgaacccg ccgccgacaa acctcaagac ctggccagtg aagaacaagc acctgccgcc 300gacaatggaa tcagcgaacc tgaagacgta ggcgcaccat tggtcatcat caacgaccga 360ctcgacgaca gcaatatcaa aggcttggag tcatccgcaa aaccgaaaca gggagaagct 420gccgagaaac cgcagcaggc agaaactgcc aaaaccgcac cgaagcaggc aaaacaacgc 480gctgccgaaa aagtgtcggc aactgccgac agtacggata cggtagcggt tgaaaaaccg 540aaacgcactg ccgaaacaaa accgcaaaaa gcggaacgca ctgccgaagc caagcccaaa 600gccaaagaaa ccaaaaccgc cgaaaaagtt gccgacaaac cgaaaactgc cgccgaaaaa 660accaaaccgg atacggcaaa atccgacagc gcggtaaaag aagcgaaaaa agccgacaag 720gctgaaggca aaaaaacagc cgaaaaagac cattcggacg ggaaaaaaca cgaaacggca 780caaaaaagcg acaaagcgga caagaccaaa accgccgaaa aagaaaaatc cgaaaattcc 840ggcaaaaaag ccgccattca ggcaggttat gccgaaaaag aacgcgcctt gagcctccag 900cgcaaaatga aagcggcggg tatcgattcg accattactg aaatcatgac cgacaacggc 960aaagtttacc gcgtcaaatc aagcaactat aaaaacgcaa gggatgccga gcgcgatttg1020aacaaactgc gcgtgcacgg catcgccggt caggtaacga atgaataa 1068<210>2<211>355<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)<400>2Met Ser Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Leu Ser Gly Tyr Glu Gln Leu15 10 15Lys Arg Arg Asn Arg Arg Arg Leu Val Thr Ala Ser Cys Leu Val Ala20 25 30Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Ser Ser Asp Pro Ala Glu35 40 45Asn Pro Pro Ala Ala Pro Thr Asp Glu Thr Gly Ser Met Glu Asn Gln50 55 60Ala Ala Ser Thr Val Gln Thr Pro Thr Leu Lys Ser Ala Ser Glu Gly65 70 75 80Val Glu Pro Ala Ala Asp Lys Pro Gln Asp Leu Ala Ser Glu Glu Gln85 90 95Ala Pro Ala Ala Asp Asn Gly Ile Ser Glu Pro Glu Asp Val Gly Ala100 105 110Pro Leu Val Ile Ile Asn Asp Arg Leu Asp Asp Ser Asn Ile Lys Gly115 120 125Leu Glu Ser Ser Ala Lys Pro Lys Gln Gly Glu Ala Ala Glu Lys Pro130 135 140Gln Gln Ala Glu Thr Ala Lys Thr Ala Pro Lys Gln Ala Lys Gln Arg145 150 155 160Ala Ala Glu Lys Val Ser Ala Thr Ala Asp Ser Thr Asp Thr Val Ala165 170 175Val Glu Lys Pro Lys Arg Thr Ala Glu Thr Lys Pro Gln Lys Ala Glu180 185 190Arg Thr Ala Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Glu Thr Lys Thr Ala Glu195 200 205Lys Val Ala Asp Lys Pro Lys Thr Ala Ala Glu Lys Thr Lys Pro Asp210 215 220Thr Ala Lys Ser Asp Ser Ala Val Lys Glu Ala Lys Lys Ala Asp Lys225 230 235 240Ala Glu Gly Lys Lys Thr Ala Glu Lys Asp His Ser Asp Gly Lys Lys245 250 255His Glu Thr Ala Gln Lys Ser Asp Lys Ala Asp Lys Thr Lys Thr Ala260 265 270Glu Lys Glu Lys Ser Glu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ala Ile Gln Ala275 280 285Gly Tyr Ala Glu Lys Glu Arg Ala Leu Ser Leu Gln Arg Lys Met Lys290 295 300Ala Ala Gly Ile Asp Ser Thr Ile Thr Glu Ile Met Thr Asp Asn Gly305 310 315 320Lys Val Tyr Arg Val Lys Ser Ser Asn Tyr Lys Asn Ala Arg Asp Ala325 330 335Glu Arg Asp Leu Asn Lys Leu Arg Val His Gly Ile Ala Gly Gln Val340 345 350Thr Asn Glu355<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3aggcagaggc atatgtccga aaacaaacaa aacgaagtc 39<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4aggcagaggc tcgagttcat tcgttacctg accggcgatg ccgtg 4權利要求
1.含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列與SEQ IDNO2的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
2.權利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
3.權利要求1的分離多肽，含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO2的分離多肽。
5.權利要求1-4任一項的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原活性基本上與SEQ ID NO2的多肽相同。
6.含有編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。
7.含有SEQ ID NO1的多核苷酸的分離多核苷酸。
8.含有編碼SEQ ID NO2的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸，它可通過在嚴緊雜交條件下，用具有SEQ ID NO1或其片段的序列的標記探針篩選合適的文庫獲得。
9.含有權利要求6-8任一項的分離多核苷酸的表達載體或重組的活微生物。
10.表達權利要求6-8任一項的多核苷酸的方法，包括用含有至少一種所述多核苷酸的表達載體轉化宿主細胞，并在足以表達任何一種所說多核苷酸的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
11.含有有效量的權利要求1至5任一項的多肽和可藥用載體的疫苗組合物。
12.含有有效量的權利要求6至8任一項的多核苷酸和可藥用載體的疫苗組合物。
13.權利要求11或12任一項的疫苗組合物，其中所述組合物至少含有一種另外的腦膜炎奈瑟氏菌抗原。
14.對權利要求1至5任一項的多肽或免疫性片段具有免疫特異性的抗體。
15.診斷腦膜炎奈瑟氏菌感染的方法，包括鑒定在來自懷疑具有這種感染的動物的生物樣品中存在的權利要求1-5任一項的多肽、或對所述多肽具有免疫特異性的抗體。
16.含有免疫有效量的權利要求1-5任一項的多肽的組合物在制備用于在動物中產生免疫應答的藥物中的用途。
17.含有免疫有效量的權利要求6-8任一項的多核苷酸的組合物在制備用于在動物中產生免疫應答的藥物中的用途。
18.用于治療患有腦膜炎奈瑟氏菌疾病的人的治療組合物，它包括至少一種抗權利要求1-5的多肽的抗體以及合適的藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明提供BASB052多肽和編碼BASB052多肽的多核苷酸以及通過重組技術生產這種多肽的方法。本發(fā)明還提供診斷性、預防性和治療性的應用。
文檔編號C07K14/22GK1350585SQ00804978
公開日2002年5月22日 申請日期2000年1月10日 優(yōu)先權日1999年1月15日
發(fā)明者J·－L·呂勒 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司