專利名稱:副粘病毒衍生的rnp的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及副粘病毒衍生的核糖復合體及其應用。
背景技術:
副粘病毒是一種含有負鏈RNA作為基因組的病毒。負鏈RNA病毒載體具有許多明顯不同于逆轉錄病毒、DNA病毒或正鏈病毒載體的特征。負鏈RNA病毒的基因組和反基因組不直接象mRNA那樣起作用,因此它們不能引起病毒蛋白合成和基因組的復制。這些病毒的RNA基因組和反基因組通常表現(xiàn)為核糖核蛋白復合體(RNP)的形式,因此它們幾乎不會造成反義鏈的問題,如在正鏈RNA病毒的情況下,mRNA與裸基因組RNA混合而干擾基因組與RNP的組配。這些病毒包括它們自身的利用RNA復合體作為模板進行病毒mRNAs轉錄或病毒基因組復制的RNA聚合酶。值得一提的是反鏈RNA(nsRNA)病毒只在宿主細胞的細胞質上增殖,并不造成其結合到染色體上,因為它們不經過DNA階段。而且,在RNAs中仍未識別到類似的重組。這些性質被認為非常有助于作為基因表達載體的負鏈RNA病毒的穩(wěn)定性和安全性。
在負鏈RNA病毒中,本發(fā)明者已將其注意力傾注于仙臺病毒(SeV)。仙臺病毒是屬于副粘病毒屬的非片斷類型負鏈RNA病毒,并且是鼠副流感病毒的一種類型。據(jù)說這種病毒對人不具有致病性。此外,已分離出仙臺病毒的一種僅在嚙齒動物,天然宿主上引起輕度肺炎的減毒實驗室菌株(Z菌株)(J.General Virology91997)78,3207-3215)。該菌株已廣泛地用作用于分子水平研究副粘病毒轉錄-復制機理的研究模型。仙臺病毒結合到該宿主細胞膜上并通過它的兩個包膜糖蛋白、血細胞凝集素-神經氨酸苷酶(HN)和融合蛋白(F)造成膜融合,并有效地將其自身RNA聚合酶和以核糖核蛋白復合體(RNP)的形式存在的RNA基因組釋放至宿主細胞的細胞質內以進行病毒mRNA的轉錄和其上的基因組復制(Bitzer,M.et.al.,J.Virol.71(7)5481-5486,1997)。
迄今本發(fā)明者研制了一種從對應于仙臺病毒基因組的cDNA上回收感染的仙臺病毒粒子的方法。例如,在該方法中,在用編碼T7 RNA聚合酶牛痘病毒感染LLC-MK2細胞之后,在T7促進劑、仙臺病毒的核蛋白的(NP)和RNA聚合酶蛋白(P和L)的控制下,進一步分別用三種編碼仙臺病毒的反基因組同時轉染以形成作為在細胞中病毒基因組復制的中間產物的反基因組核糖核蛋白復合體(RNPs),然后生物復制能引起病毒蛋白轉錄和病毒顆粒裝配的活性(功能性)基因組RNPs。在回收野生型仙臺病毒時,將這些功能性基因組RNPs與重建細胞注入到雞蛋的絨毛尿囊中以進行病毒顆粒的增殖(Kato,A.et al.,Genes cells 1,569-579(1996))。
但是,已知在病毒顆粒的形成過程中仙臺病毒在其上結合宿主細胞蛋白(J.Biol.Chem.(1997)272,16578-16584),而該結合的蛋白可能是其被轉移到靶細胞時的抗原性和細胞毒性的原因。
在這點上,盡管存在利用RNP作為載體而不利用仙臺病毒顆粒的明顯需求,仍沒有有關這種利用的報道。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的在于分離來源于副粘病毒科病毒的RNP,并提供將其作為載體的應用。在優(yōu)選的實施方案中,提供了包括RNP復合體和陽離子化合物的載體。
本發(fā)明者已從屬于副粘病毒科的仙臺病毒中制得RNPs,并研究其作為載體的應用。
具體地說,本發(fā)明者首先制得缺陷作為這種病毒的一種包膜蛋白的F蛋白基因的仙臺病毒基因組cDNA,從而在靶細胞上不產生野生型仙臺病毒,并進一步構建載體以在細胞內表達cDNA(將GFP基因插入到載體內作為在F基因缺陷位點的報道基團)。將如此制得的載體轉移到表達RNP形成所需的蛋白的細胞上以產生含有F缺陷基因的基因組的RNP。然后,重復以下循環(huán)從細胞中除去RNP冷凍并融化細胞、與陽離子脂轉染反應劑混合,并轉移到F基因表達細胞上。結果在轉入RNP的細胞內檢測到作為報道基因的GFP表達。
也就是說,本發(fā)明者不僅成功地從仙臺病毒上制得功能性RNP,還發(fā)現(xiàn)即使在采用基因轉移反應劑如陽離子脂質體而不只是將作為仙臺病毒的構成成分的RNP感染細胞而將該RNP轉移到靶細胞時,表達RNP中所含的外源基因并因此實現(xiàn)本發(fā)明的可能性。
也就是說,本發(fā)明涉及副粘病毒衍生的RNP和其作為載體的應用,更為具體地說涉及(1)一種復合體包括(a)負鏈單鏈RNA的復合體,其中該RNA被修飾為不表達至少一種副粘病毒的包膜蛋白,和(b)由該負鏈單鏈RNA編碼并與其結合的蛋白;(2)根據(jù)(1)的復合體,其中該負鏈單鏈RNA被修飾為表達NP、P和L蛋白但不是F、HN或M蛋白,或者它們的任意組合;(3)根據(jù)(1)或(2)的復合體,其中該負鏈單鏈RNA來源于仙臺病毒;(4)根據(jù)(1)-(3)的任一復合體,其中該負鏈單鏈RNA進一步編碼外源基因;(5)一種用于基因轉移的組合物,包括根據(jù)(4)的復合體和陽離子脂類;(6)一種用于基因轉移的組合物,包括根據(jù)(4)的復合體和陽離子聚合物;(7)一種在細胞內表達外源基因的方法,包括往細胞內引入根據(jù)(5)或(6)的用于基因轉移的組合物的步驟。
副粘病毒科病毒的“NP、P、M、F、HN和L基因”指分別編碼核殼、磷酸、基質、融合、血細胞凝集素-神經氨酸苷酶和大蛋白質的基因。副粘病毒科的亞科的各種病毒基因一般表示如下。NP基因一般還描述為“N基因”。
屬 NP/C/V MFHN-L呼吸道病毒屬 NP/C/ MFHN (SH) L風疹病毒屬 NP/C/V MFH -L麻疹病毒歸類于副粘病毒科呼吸道病毒的仙臺病毒基因的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫入藏號是NP基因為M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218,P基因為M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、XOO583、X17007和X17008,M基因為D11446、KO2742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、XOO584和X53056,F(xiàn)基因為DOO152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、XOO152和XO2131,HN基因為D26475、M.12397、M30202、M30203、M30204、M69046、XOO586、XO2808和X56131,而L基因為DOOO53、M30202、M30203、M30204、M69040、XOO587和XS8886。
本發(fā)明涉及一種來源于副粘病毒科病毒的任何包膜基因缺陷的核糖核蛋白復合體(RNP)。該復合體被修飾為在不存在包膜蛋白的情況下在靶細胞上不產生具有包膜蛋白的病毒。也就是說,根據(jù)本發(fā)明的RNP包括(a)來源于副粘病毒并被修飾為不表達至少一種副粘病毒包膜蛋白的負鏈單鏈RNA,(b)由該負鏈單鏈RNA編碼并與其結合的蛋白。
能與負鏈單鏈RNA結合的蛋白指直接或間接地與負鏈單鏈RNA結合以形成具有負鏈單鏈RNA的RNP復合體的蛋白。一般來說,副粘病毒的負鏈單鏈RNA(基因組RNA)結合到NP、P和L蛋白上。RNP中所含的RNA用作RNA轉錄和復制的模板(Lamb,R.A.and D.Kolakofsky,1996,ParamyxoviridaeThe viruses and thir replication,pp.1177 1204.InFields Virology,3rdedn.Fields,B.N.,D.M.Knipe,and P.M.Howley et al.(ed.),Raven Press,New York,N.Y.)。本發(fā)明的復合體包括含有來源于副粘病毒的負鏈單鏈RNAs和同樣來源于副粘病毒并結合到RNAs上的蛋白。例如,本發(fā)明的復合體為含有結合這些蛋白(NP、P和L蛋白)的負鏈單鏈RNA的RNP復合體。一般而言,副粘病毒的RNP復合體能自主地在宿主細胞上自我復制。因此,轉移到細胞的RNPs在細胞內增殖以增加基因(RNP復合體中所含的RNA)的復制數(shù),借此導致從攜帶外源基因的RNP上高水平表達外源基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選能在被轉染的細胞中復制復合體(RNP)所含的RNA。
本發(fā)明RNP復合體的來源沒有限制,只要它是副粘病毒科的病毒,但是特別優(yōu)選屬于副粘病毒屬的仙臺病毒。除了仙臺病毒之外,本發(fā)明的RNPs可以來源于麻疹病毒、猿副流感病毒(SV5)和人副流感病毒類型3,但其來源并不限于此。
構建本發(fā)明的RNPs中所含的負鏈單鏈RNAs以抑制表達至少一種副粘病毒的包膜蛋白。表達受到抑制的包膜蛋白的實例為F蛋白、HN蛋白或M蛋白,或它們的任意組合。構建負鏈單鏈RNA以表達RNPs形成所需的NP、P和L蛋白。例如可以修飾本發(fā)明RNPs中所含的負鏈單鏈RNAs以表達NP、P和L蛋白,而不是F和/或HN蛋白。
在仙臺病毒(SeV)的情況下,天然病毒的基因組大小約為15,000個核苷酸,而該負鏈包括跟隨3’-短前導區(qū)和另一端的短5’-尾隨區(qū)成一長行排列的六個編碼NP(核殼)、P(磷)、M(基質)、F(融合)、HN(血細胞凝集素-神經氨酸苷酶)和L(大)蛋白的基因。在本發(fā)明中,可以通過設計缺陷任何F、HN和M基因或其任意組合的基因組而將該基因組修飾為不表達包膜蛋白。優(yōu)選F基因或HN基因或這兩者缺陷。由于RNP形成不需要這些蛋白,可以在NP、P和L蛋白存在下轉錄該基因組RNA(正或負鏈)來制造本發(fā)明的RNPs。例如在L1C-MK2細胞等中進行RNP形成??梢酝毎霐y帶這些蛋白各自基因的表達載體中而提供NP、P和L蛋白(cf.例)。還可以往宿主細胞的染色體內結合各基因。用于表達形成RNP的NP、P和L基因無需與RNP所含基因組中編碼的基因完全相同。也就是說,這些基因編碼的蛋白質氨基酸序列可以不與RNP基因組編碼的蛋白質氨基酸序列相同,而只要它們可以結合到基因組RNA上和能夠在細胞中復制RNP,并可以具有突變或被其它病毒的同源基因所置換。一旦形成RNP,NP、P和L基因表達形成RNP,從而在細胞中自主地復制RNP。
為了重建和擴增細胞中的RNP,將RNP轉移到表達包膜蛋白的細胞中(輔助細胞),其中通過修飾RNP中所含的負鏈單鏈RNA而抑制其表達,或者可以在這些細胞中重建RNP。例如,為了從已被修飾為不表達F基因的負鏈單鏈RNA上擴增RNP,排列F蛋白以被細胞中的NP、P和L蛋白所表達。這樣便構建了保留包膜蛋白的病毒載體,并通過其對輔助細胞的感染而將其擴增。
此外,還可以使用與通過修飾負鏈單鏈RNA而使其表達受到抑制的包膜蛋白不同的包膜蛋白。這種包膜蛋白的類型沒有特別的限定。其它病毒包膜蛋白的一個實例是水泡性口炎病毒(VSV)的的G蛋白(VSV-G)。例如,可以使用表達VSV的G蛋白(VSV-G)的細胞來擴增本發(fā)明的RNP復合體。
通??梢酝ㄟ^(a)往表達包膜蛋白的細胞(輔助細胞)中引入編碼已被修飾為不表達至少一種副粘病毒的病毒包膜蛋白的副粘病毒衍生的負鏈單鏈RNA,或該RNA的互補鏈的載體DNA來表達該RNAs,和(b)培養(yǎng)這些細胞以從其培養(yǎng)上清液或細胞提取物中回收RNP復合體。通過在載體DNA表達時同時表達NP、L和P蛋白,形成RNPs并構建具有包膜蛋白的病毒。
在輔助細胞中被表達的載體DNA編碼本發(fā)明復合體中所含的負鏈單鏈RNA(負鏈)或其互補鏈(正鏈)。雖然在細胞內被轉錄的鏈可以是正或負鏈,優(yōu)選排列為轉錄正鏈以改進復合體的重建效率。例如,編碼負鏈單鏈RNA的DNA或其互補鏈連接到T7啟動子的下游以通過T7聚合酶被轉錄到RNA上。
例如,可以通過將表達包膜基因缺陷的重組仙臺病毒基因組的質體與表達該缺陷包膜蛋白的載體和NP、P/C和L蛋白表達載體一起轉染到宿主細胞內來重建含有RNP復合體的病毒。例如可選擇采用其染色體結合有F基因的宿主細胞來制造RNP復合體。從該病毒基因組外部提供的蛋白組的氨基酸序列無需與來源于該病毒的氨基酸序列相同。只要這些蛋白與天然類型的蛋白在向細胞中轉移核酸的活性相等或更大,則可以通過引入突變或用來自其它病毒的同源基因置換來修飾編碼這些蛋白質的基因。一般來說,已知由于包膜蛋白的細胞毒性和細胞形狀變異活性因而有時難以長期培養(yǎng)這些宿主細胞,因此可以將它們排列成僅在引入啟動子控制下重建載體時被表達。
一旦形成RNP或含有RNP的病毒,就可以通過再次往上述的輔助細胞中引入該RNP或病毒并對其培養(yǎng)來擴增本發(fā)明的復合體。該方法包括步驟(a)往表達包膜蛋白的細胞引入本發(fā)明的復合體或含有該復合體的病毒載體,和(b)培養(yǎng)這些細胞并從培養(yǎng)上清液或細胞提取物中回收病毒顆粒。
例如,可將RNP與脂轉染胺和聚陽離子脂質體一起作為復合體引入到細胞。具體地說,可以使用各種的轉染劑。其實例為DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boheringer#1811169)等??梢约尤肼瓤苑乐筊NP在核內體中分解(Calos,M.P.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 803015)。
一旦在宿主細胞中如此構建了病毒載體,可以通過采用表達包膜蛋白的細胞培養(yǎng)這些細胞來進一步將本發(fā)明的復合體或含有該復合體的病毒載體擴增。如在實施例12中所述,優(yōu)選的實例為在產生細胞的病毒上增加表達包膜蛋白的細胞的方法。
例如,本發(fā)明的復合體可以含有由已被修飾為降低抗原性或增加轉錄和復制效率的復合體RNA編碼的病毒基因。
本發(fā)明的復合體可以包括在其負鏈單鏈RNA上編碼外源基因的RNA。任何在靶細胞中表達所期望的基因可以被用作外源基因。例如,在要進行基因治療時,將治療目標疾病的基因插入到編碼該復合體所含的RNA的載體DNA中。例如,在將外源基因插入到該載體DNA如仙臺病毒載體DNA上的情況下,優(yōu)選在轉錄終止序列(E)和轉錄起始序列(S)之間插入含有核苷酸數(shù)目為6的倍數(shù)的序列(Journal of Virology Vol.67,No.8,1993,p.4822-4830)。可以在各個病毒基因(NP、P、M、F、HN和L基因)之前或之后插入該外源基因(cf.例)。在外源基因之前或之后適宜地插入E-I-S序列(轉錄起始序列-間插序列-轉錄終止序列)或其部分以在外源基因之前或之后不干擾基因的表達。可以采用在外源基因的上游和基因插入位點加入的轉錄起始序列和在該基因之前或后的核苷酸序列類型來調節(jié)所插入的外源基因的表達水平。例如,在仙臺病毒中,插入位點與負鏈RNA的3’-端越近(在野生型病毒基因組的基因排列中,與NP基因越近),則插入基因的表達水平越高。為了確保外源基因的高表達水平,優(yōu)選在NP基因的上游(在負鏈的3’-側)或在NP和P基因之間插入外源基因。相反,插入位點與負鏈RNA的5’-端越近(在野生型病毒基因組的基因排列中,與L基因越近),則該插入基因的表達水平越低。例如,為了將外源基因的表達抑制在低水平,將外源基因插入到最遠的該負鏈的5’-側,也就是野生型病毒基因組L基因的下游(在負鏈中與L基因相鄰的5’-側)或L基因的上游(在負鏈中與L基因相鄰的3’-側),為了便于插入外源基因,要以在插入位點設計一個克隆位點。例如,可以將克隆位點排列為限制酶的識別序列??梢詫⑼庠椿蚱瑪嗖迦氲骄幋a該基因組的載體DNA的限制酶位點??梢詫⒖寺∥稽c排列為所謂的含有多個限制酶識別序列的多克隆位點。本發(fā)明復合體的RNA基因組可以藏匿在除了上述以外的外源基因的插入位點。
例如,可以根據(jù)如以下在“Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16578-587”和“Yu,D.et al.,1997,Genes Cells 2457-466”中的描述,構建含有來源于攜帶有外源基因的重組仙臺病毒的RNP復合體的病毒載體。
首先,制備含有期望的外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA試樣。該DNA試樣優(yōu)選可被電泳識別為濃度為25ng/μl或更大的單一質體。以下將利用NotI位點將外源基因插入到編碼病毒基因組的DNA的情況作為一個實例予以描述。當在目標cDNA核苷酸序列上包括NotI識別位點時,優(yōu)選預先采用位點-特異性誘變修飾該核苷酸序列來檢測該NotI位點,并使該方法不改變該cDNA編碼的氨基酸序列。從該DNA中擴增期望的基因并通過PCR回收。為了在擴增的DNA片斷的兩端具有NotI位點并進一步往一端加入仙臺病毒的轉錄終止序列(E)、間插序列(I)和轉錄起始序列(S)(EIS序列)的副本,制備正向副合成DNA序列和逆向副合成DNA序列(反義鏈)作為含有NotI限制酶分解位點序列、轉錄終止序列(E)、間插序列(I)、轉錄起始序列(S)目標基因部分序列的引物。
例如,為了確保通過NotI分解,將正向副合成DNA序列排列成這樣的形式其中在該合成DNA的5’-側上選擇任何兩個或兩個以上的核苷酸(優(yōu)選4個來自NotI識別位點的除了GCG和GCC之外的核苷酸序列,更優(yōu)選ACTT);將NotI識別位點“gcggccgc”加入它的3’-側;在它的3’-側,加入任意期望的9個核苷酸或9個核苷酸加6的倍數(shù)個核苷酸作為間隔序列;而在其3’-側,加入約25個核苷酸當量的含有期望的cDNA的初始密碼子ATG的ORF。優(yōu)選從期望的cDNA上選擇約25個核苷酸作為正向副合成DNA序列以在它的3’-端具有作為最終核苷酸的G或C。
在逆向副合成DNA序列中,從該合成DNA的5’-側上選擇任何兩個或兩個以上的核苷酸(優(yōu)選4個來自NotI識別位點的除了GCG和GCC之外的核苷酸序列,更優(yōu)選ACTT);將NotI識別位點“gcggccgc”加入它的3’-側;在它的進一步的3’-側,加入寡DNA作為插入片斷以調節(jié)長度,該寡DNA設計為包括NotI識別位點“gcggccgc”、cDNA的互補序列和以下所述的來源于病毒的仙臺病毒基因組EIS核苷酸序列的核苷酸總數(shù)成為6的倍數(shù)(所謂的“6的規(guī)則(rule of six)”;Kolakofski,D.et al.,J.Virol.72891-899,1998);進一步往插入片斷的3’-側加入與仙臺病毒的S序列互補的序列,優(yōu)選為5’-CTTTCACCCT-3’、I序列優(yōu)選5’-AAG-3’和與E序列互補的序列,優(yōu)選5’-TTTTTCTTACTACGG-3’;而進一步在其3’-側,選擇并加入從該期望的cDNA序列的終止密碼子上呈逆向計數(shù)的大約25核苷酸當量的互補序列作為逆向副合成DNA3’-端,該序列的長度調節(jié)為具有作為終止核苷酸的G或C。
可以根據(jù)常規(guī)的方法采用如ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)完成PCR。優(yōu)選采用vent聚合酶(NEB)進行PCR,而用NotI消化如此擴增的期望的片斷,然后將其插入到質體載體p藍本(pBluescript)的NotI位點。用序列分析儀確認如此得到的PCR產物的核苷酸序列以選擇具有正確序列的質體。采用NotI從該質體上切除該插入的片斷,并克隆至攜帶包膜基因缺陷的基因組cDNA的質體的NotI位點??蛇x擇地,可以通過往該NotI位點直接插入該片斷而不借助質體載體p藍本(pBluescript)獲得重組仙臺病毒cDNA。
還可以在試管或細胞中轉錄編碼病毒基因組的載體DNA,用病毒L、P和NP蛋白重建RNP,并產生含有該RNP的病毒載體??梢愿鶕?jù)現(xiàn)有技術中已知的方法采用細胞表達包膜蛋白從該載體DNA上進行病毒的重建(WO97/16539和97/16538Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235323-332;Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 928388-8392;Schnell,M.J.et al.,1994,EMBO J.134195-4203;Radecke,F(xiàn).et al.,1995,EMBO J.145773-5784;Lawson,N.D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924477-4481;Garcin,D.et al.,1995,EMBO J.146087-6094;Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1569-579;Baron,M.D.和Barrett,T.,1997,J.Virol.711265-1271;Bridgen,A.和Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9315400-15404)。在制備F、HN和/或M基因缺陷的病毒載體DNA時,采用這種缺陷載體不形成感染的病毒顆粒。但是,可以通過分別將這些缺陷基因、編碼其它病毒包膜蛋白的基因等轉移到宿主細胞并在那里表達它們來形成感染的病毒顆粒和擴增含有該復合體的病毒。
將載體DNA轉移到細胞的方法包括以下1)制備可被目標細胞攝入的DNA沉淀物的方法;2)制備含有適于被目標細胞攝入的復合體和不具強細胞毒性并具有正電荷的DNA的方法;和3)立即在目標細胞膜上鉆出足以通過電泳使DNA分子穿透寬度的孔的方法。
在方法2)中,可以利用各種轉染反應劑,例如DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boheringer#1811169)等。方法1)的一個實例為采用磷酸鈣的轉染方法,其中將進入細胞的DNA結合到吞噬體內,并往該核內結合足夠的數(shù)量(Graham,F(xiàn).L.和Van Der Eb,J.,1973,,Virology 52;456;Wigler,M.和Silverstein,S.1977,Cell 11223)。Chen和Okayama已研究了這種轉移技術的優(yōu)化,并報道可以在以下條件下獲得優(yōu)化的DNA沉淀物,其中1)在2-4%的CO2氣氛下于35℃下用DNA對細胞培養(yǎng)15-24小時,2)具有比在使用線性DNA時更高沉淀物-形成活性的環(huán)DNA,和3)在沉淀混合物中將DNA濃縮至20-30μg/ml(Chen,C.和Okayama,H.,1987,Mol.Cell.Biol.72745)。方法2)適于瞬間轉染。本技術中已知一種老方法,其中以期望的DNA濃度比率制備DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885,M.W.5×105)混合物以進行轉染。由于大部分的復合體在核本內分解,可以加入氯奎以增強轉染效果(Calos,M.P.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA803015)。方法3)被指示作為電穿孔,且比方法1)和2)更為通用,因為它不具有細胞選擇性。認為方法3)在以下的優(yōu)選條件下有效脈沖電流持續(xù)時間、脈沖形狀、電場效力(電極間隙,電壓)、緩沖器導電率、DNA濃度和細胞密度。
在上述的三類方法中,轉染試劑(方法2)適用于本發(fā)明,因為方法2)易于操作,并有助于利用大量的細胞檢查試樣。優(yōu)選使用Superfect轉染試劑(QIAGEN,Cat.No.301305)或DOSPER脂質體轉染試劑(BoechringerMannheim,Cat.No.1811169)。
具體而言,可以如下從cDNA中進行病毒載體的重建。
采用含有10%胎牛血清(FCS)和抗生素(100單位/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素)在24-孔至6-孔塑料培養(yǎng)皿或100mm直徑的培養(yǎng)皿培養(yǎng)來自猿腎臟的LLC-MK2細胞直到70-80融合,并用在2PFU/細胞上表達T7聚合酶的重組牛痘病毒vTF7-3感染該細胞。已通過在1μg/ml的補骨脂素的存在下用UV照射處理20分鐘將該病毒滅活(Fuerst,T.R.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838122-8126,1986;Kato,A.et al.,GenesCells 1569-579,1996)??梢赃m當?shù)卣{節(jié)加入的補骨脂素的數(shù)量和UV照射的時間。在該感染一小時后,通過同時利用表達全長度仙臺病毒基因組所需的反式作用病毒蛋白的質體(24-0.5μg的PGEM-N、12-0.25μg的PEM-P和24-0.5μg的PEM-L,更優(yōu)選為1μg的PGEM-N、0.5μg的PEM-P和1μg的PEM-L)(Kato,A.et al.,Genes Cells 1569-579,1996)和Superfect(QIAGEN)的脂轉染法等,采用2-60μg、更優(yōu)選為3-5μg的上述重組仙臺病毒cDNA轉染該細胞。在含有100μg/ml的各利福平(Sigma)和需要時所用的阿糖胞苷(AraC),優(yōu)選只含有40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)的不含血清的MEM中被轉染的細胞,并可以將反應劑的濃度設至最適條件以使由于牛痘病毒的細胞毒最小化和使病毒的回收率最大化(Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1,569-579)。在該轉染后培養(yǎng)約48-72小時后,回收這些細胞,重復三次冷凍和融化將其破裂,轉染到表達包膜蛋白的LLC-MK2細胞上并加以培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)3-7天以后,收集該培養(yǎng)物溶液。可選擇通過轉染已表達具有表達NP、L和P蛋白的質體的包膜蛋白的LLC-MK2細胞,或與包膜-轉染質體一起轉染而更為有效地獲得感染的病毒載體??梢酝ㄟ^培養(yǎng)覆蓋在表達包膜蛋白的LLC-MK2細胞上的這些細胞(cf.例)而擴增病毒載體。可以通過測定血細胞凝集活性(HA)來確定該培養(yǎng)上清液中所含的病毒的滴定度,其中血細胞凝集活性(HA)可以通過“endo-point dilution method”(Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1,569-579)來測定。如此得到的病毒原種可在-80℃下貯藏。
用于病毒重建所需的宿主細胞的類型沒有特別限制,只要RNP復合體或病毒載體可以在其中重建。例如,在仙臺病毒載體或RNP復合體的重建中,可以使用培養(yǎng)細胞如來源于猿腎的CV-I細胞和LLC-MK2細胞、來源于倉鼠腎的BHK細胞等等。還可以通過在這些細胞中適宜地表達包膜蛋白而獲得具有包膜的感染病毒顆粒。為了獲得大量的仙臺病毒載體,可以通過將RNP或從上述宿主細胞上得到的病毒載體與表達包膜基因的載體一起接種到含胚雞蛋中。可選擇采用結合包膜蛋白基因的轉基因雞蛋。采用雞蛋制造病毒液的方法已被提出(Nakanishi,et al.(eds.),1993,“xhinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gijutu Protocol III(HighTechnology Protocol III of Neuroscience Research),Milecular NeurocytePhysiology,Koseisha,Osaka,pp.153-172”。例如,具體地說將受精卵放在孵化器中并在37-38℃下孵化9-12天以生長胚胎。將仙臺病毒載體或RNP復合體與表達包膜蛋白的載體一起接種到蛋的絨毛尿囊腔中,在培養(yǎng)數(shù)日以增殖病毒。條件如培養(yǎng)持續(xù)時間可以根據(jù)所用的重組仙臺病毒的類型而變。然后,加收含有該病毒的絨毛尿囊液。可以根據(jù)標準方法進行仙臺病毒載體的分離和純化(Tashiro,M.,“Virus ExperimentProtocols”,Nagai和Ishihama(eds.),Medicalview,pp.68-73(1995))。
作為表達包膜蛋白的載體,可以使用本發(fā)明的復合體或含有本發(fā)明復合體的病毒載體自身。例如,在將兩種病毒基因組上的基因缺陷不同的RNP復合體類型轉移到相同的細胞上時,通過表達另一種復合體而提供缺陷一種RNP復合體的包膜蛋白從而使彼此互補,借此導致形成感染的病毒顆粒和活化擴增該病毒的復制循環(huán)。也就是說,當兩種或更多種類型的本發(fā)明RNP復合體或含有這些復合體的病毒載體組合接種到細胞以互被彼此的包膜蛋白時,可以大量而低成本地生產缺陷各自包膜蛋白的病毒載體的混合物。如此產生的混合病毒可以用于疫苗等的生產。由于包膜蛋白的缺陷,這些病毒與完整的病毒相比具有更小的基因組大小,因而它們能藏匿更長的外源基因。而且,由于將這些源于非傳染性病毒的病毒在細胞外加以稀釋,且難以保持它們的共感染,因此它們的是無菌的,而這有利于使它們釋放到環(huán)境中去。
例如可以采用以下的超離心方法由病毒制備本發(fā)明的RNP。將TritonX-100加到含有病毒顆粒的濾液中以制得最終濃度為0.5%,使該混合物在室溫下保持10-15分鐘。以10-40%的蔗糖密度梯度將如此得到的上清液分層,并在20,000-30,000rpm下離心30分鐘以回收含有RNP的部分。
可選擇將該病毒溶于含有0.6%的NP40、1%的脫氧膽酸鹽、1M的KCl、10mM的β-氫硫基乙醇、10mM的Tris-HCl(PH 7.4)和5mM的EDTA(最終濃度)的混合物中,在20℃下保持20分鐘,然后在11,000×g下離心20分鐘。將含有RNP的上清液置于含有0.2%的NP40、30mM的NaCl、10mM的Tris-HCl和1mM的EDTA的50%的甘油中,在39,000rpm和4℃下離心2小時以回收沉淀物。可以通過以下方法將該沉淀物中所含的RNP復合體純化將該沉淀物再次分散在含有0.5%的Triton X-100的溶液中,在10-40%的蔗糖密度梯度下分層該分散體,并在20,000-30,000rpm下離心30分鐘以回收含有高度純化的RNP的單光譜帶。
可以采用生理鹽水和磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)適宜稀釋本發(fā)明的復合體以制備組合物。當在雞蛋等等中增殖本發(fā)明的復合體時,該組合物可以包括絨毛尿囊液。含有本發(fā)明的復合體的組合物可以含有生理學上可接受的培養(yǎng)液如去離子水、50%葡聚糖水溶液等等,而且還可以含有其它穩(wěn)定劑和抗生素。
一旦制得插入外源基因的含有RNP的RNA,可以采用基因轉移試劑將它轉移到靶細胞上。作為基因轉移試劑,優(yōu)選陽離子脂質或陽離子聚合物。
陽離子脂質包括在國際專利公開號Hei5-508626的公開的日文譯文中式(I)所代表的化合物。陽離子脂質為優(yōu)選的合成脂化合物。陽離子脂質還可以是二醚或二酯化合物,優(yōu)選為脂肪醚。特定的實例為以下的化合物DOGS(TransfectamTM)或DOTMA(LipofectinTM)(二醚化合物);DOTAP(二酯化合物);DOPE(二油酰磷脂?;掖及?;DOPC(二油酰磷脂?;憠A);DPRI Rosenthal抑制劑(RI)(DL-2,3-二硬脂酰氧丙基(二甲基)β-羥乙銨溴化物(Sigma)的二棕櫚酰衍生物);和DORI(以上化合物的二油酰衍生物)。
陽離子聚合物為陽離子高分子化合物,優(yōu)選為合成分子。特定的實例為聚賴氨酸、脂肪聚胺、聚乙乙烯亞胺等等。
本發(fā)明的復合體可與上述的陽離子脂質或陽離子聚合物混合以制備用于基因轉移的組合物。用于基因轉移的組合物可以適宜地與培養(yǎng)液如生理鹽水和溶液如鹽、穩(wěn)定等組合。通過加入本發(fā)明的用于基因轉移的組合物,可以將本發(fā)明的復合體轉移到細胞內以從該復合體所含的RNA上表達基因。
在將治療基因用作外源基因時可以進行基因治療。在將本發(fā)明的復合體用于基因治療時,可以通過直接或間接(體外)給予該復合體來表達預期治療效果的外源基因和患者體內不足的內源基因。外源基因的類型沒有特別的限制,除了編碼蛋白質的核酸以外,它們可以是不編碼蛋白質的核酸,如反義或核酶。此外,當采用編碼在傳染性疾病中所涉及的細菌或病毒的抗原的基因作為外源基因時,通過將這些基因給予動物可以在動物上引入免疫。也就是說,這些基因可以用作疫苗。
在用作疫苗時,這些基因可以用于癌、傳染性疾病或其它全身疾病。例如,作為癌治療,可以在腫瘤細胞或抗原呈遞細胞(APC)如DC細胞上表達具有治療效果的基因。這種基因的實例為編碼腫瘤抗原Muc-1或Muc-1類似的突變子串聯(lián)重復肽(美國專利號5,744,144)、黑素瘤gp100抗原等。這種采用基因的治療已廣泛應用于乳腺、結腸、胰腺、前列腺、肺等處的癌。在基因治療中與細胞因子組合以增強輔助效果也是有效的。這種基因的實例為i)與IL-2組合的單鏈IL-12(Proc.Natl. Acad.Sci.USA 96(15)8591-8596,ii)與IL-2組合的干擾素-γ(美國專利號5,798,100),iii)單獨使用的粒細胞菌落刺激因子(GM-CSF),和iv)與IL-4組合的用于治療腦瘤的GM-CSF(J.Neurosurgery,90(6),1115-1124(1999))等等。
用于治療傳染性疾病的基因的實例為編碼以下蛋白的基因毒性菌株H5N1類型的流感病毒的包膜蛋白、日本腦炎病毒的包膜嵌合體蛋白(Vaccine,Vol.17,No.15-16,1869-1882(1999))、AIDS病毒的HIV gag或SIV gag蛋白(J.Immunology(2000),Vol.164,4968-4978)、被結合用作裝入給藥的聚乳酸乙二醇共聚物微粒膠囊中的口服疫苗的HIV包膜蛋白(Kanko,H.et al.,Virology 267,8-16(2000))、霍亂毒素的B亞單元(CTB)(Arakawa,T.et al.Nature Biotechnology(1998)15(10)934-8;Arakawa,T.et al.,Nature Biotechnology(1998)16(3)292-297)、狂犬病病毒的糖蛋白(Lodmell,D.L.et al.,1998,Nature Medicine 4(8)949-52)和引起頸癌的人乳頭瘤病毒6的衣殼蛋白(J.Med.virol.,60,200-204(2000)。
還可以將基因治療用于全身疾病。例如,在糖尿病的情況下,已在I型糖尿病模型動物上,通過接種編碼肽的質體DNA而進行胰島素肽片斷的表達(Coon,B.et al.,J.Clin.Invest.,1999,104(2)189-94)。
附圖的簡要說明
圖1為表示采用Western印跡法通過Cre-loxP-引入表達系統(tǒng)對F蛋白表達的分析結果的圖形。它顯示了通過化學發(fā)光法檢測與抗-SeV-F抗體交叉反應的轉移膜上蛋白質的結果。
圖2顯示了表示通過Cre-loxP系統(tǒng)引入其表達的F蛋白的細胞表面顯示分析結果的圖表。它表示了采用抗-SeV-F抗體對LLC-MK2/F7進行流動血細胞計數(shù)分析的結果。
圖3顯示了表示采用Western印跡法由胰蛋白酶確認被表達的F蛋白的分解的結果圖。
圖4顯示了表明確認在細胞表面吸收到紅細胞上的實驗中HN的細胞表面表達的結果的圖。
圖5顯示了表明通過嘗度采用細胞表達缺陷蛋白而收獲缺陷病毒所得的結果圖。它揭示了通過用于F缺陷的SeV重建的牛痘病毒快速地終止輔助細胞系的F蛋白的表達。
1.LLC-MK2和CV-1代表來自各細胞類型的細胞溶解產物。
2.LLC-MK2/F+ad和CV-1/F+ad代表來自各個已被引入表達且已被加入腺病毒AxCANCre的細胞的細胞溶解產物。
3.LLC-MK2/F-ad和CV-1/F-ad代表來自已加入F基因但未加入腺病毒AxCANCre的細胞系的細胞溶解產物。
4.LLC-MK2/F+ad 3 rd代表來自由腺病毒AxCANCre引入其表達然后進一步傳代三次的細胞的細胞溶解產物。
5.1d和3d分別表示在引入表達的一天或三天之后。
6.Vacld和Vac3d分別表示在感染牛痘病毒的1天或3天后的細胞。
7.Vacld和Vac3d分別表示在加入Arac的1天或3天后的細胞。
8.CHX 1d和CHX 3d分別表示在加入蛋白合成抑制劑放線菌酮的1天或3天后的細胞。
圖6所顯示的圖表示了在將含有F缺陷的SeV cDNA的GFP(pSeV181/ΔF-GFP)轉移至不表達F的LLC-MK2細胞之后通過觀測GFP表達而獲得的結果(RNP的檢測)。在對照組中,用NP基因在3’-端改組F基因,然后使用已在F缺陷的位點引入GFP的SeV cDNA。記號“all”表示用指導NP基因、P基因和L基因(pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L)表達的質體與SeV cDNA同時轉染的細胞;“cDNA”表示只用cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)轉染的細胞。為了RNP轉染,收集表達GFP的P0細胞;將細胞(107細胞/ml)懸浮在optiMEM(GIBCO BRL)中;將100μl在采用冷卻-融化循環(huán)處理三次后而制得的溶解產物與25μl的陽離子脂質體DOSPER9Boehringer Mannheim)混合并于室溫下靜置15分鐘;將該混合物加到已引入表達F的細胞(+ad)中完成RNP轉染。使用未引入重組腺病毒的表達Cre DNA重組酶的細胞作為細胞對照組(-ad)。其結果表明GFP的表達取決于在LLC-MK2細胞的P0中的SeV的RNP形成;而F缺陷的病毒的擴增取決于在P1中表達F的引入。
圖7顯示的圖表示研究是否可以通過F-表達輔助細胞拯救由F缺陷基因組cDNA重建的功能性RNA并形成該缺陷病毒的感染病毒顆粒的結果。RNP/o表示覆蓋RNP的細胞;RNP/t表示用RNP轉染的細胞。
圖8顯示的圖表示F缺陷病毒的F-表達細胞特異性生長的證據(jù)。如在實施例2所示,將包含由該基因缺陷的基因組構成的功能性RNP的溶解產物脂轉染到表達F的細胞上;然后除去培養(yǎng)上清液。將該培養(yǎng)上清液加到表達F的細胞的培養(yǎng)液中以實現(xiàn)感染;在第三天,移出培養(yǎng)上清液并同時將其加到F-表達細胞和未表達過F的細胞;然后在存在或不存在胰蛋白酶的情況下培養(yǎng)三天。這里顯示了結果。在F-表達細胞中僅在存在胰蛋白酶的情況下擴增該病毒。
圖9顯示的圖表示F缺陷細胞在引入表達F的細胞中以后特異性地釋放到培養(yǎng)上清液的證據(jù)。如在實施例2所示,將包含由該基因缺陷的基因組構成的功能性RNP的溶解產物脂轉染到表達F的細胞上;然后除去培養(yǎng)上清液。將該培養(yǎng)上清液加到表達F的細胞的培養(yǎng)液中以實現(xiàn)感染;在第三天,移出培養(yǎng)上清液并同時將其加到F-表達細胞和未表達F的細胞;然后在存在或不存在胰蛋白酶的情況下培養(yǎng)三天。下方圖案表示了不表達F的細胞上清液的結果。
圖10顯示的圖表示了通過以下步驟所得到的結果從表達F的細胞的培養(yǎng)上清液中回收病毒、提取全部RNA并采用F和HN作為探針進行Northen印跡分析以校正從F缺陷cDNA中回收到的病毒顆粒的基因組結構。在從表達F的細胞中回收到的病毒中,檢測到HN基因但F基因不能被檢測;因此它表明了在病毒基因組中不存在F基因。
圖11顯示的圖表示RT-PCR的結果,它表明如在cDNA的構成物一樣,在已被檢測到F的位點存在GFP基因。1+18-NP,用于確認存在+18 NotI位點;2M-GFP,用于確認在F基因缺陷區(qū)域存在GFP基因;3F基因,用于確認存在F基因。在上圖中顯示了野生型SeV和F缺陷GFP表達SeV的基因組結構。它被校正為GFP基因存在于F缺陷位點,源于+18的NotI位點存在于NP的3’-端,而F基因在RNA基因組的任何部分都不存在。
圖12顯示的圖是采用與病毒的F或HN特異性反應的黃金膠體結合的IgG(抗-F、抗-HN)進行免疫-電子顯微檢查而獲得的。它表明峰狀結構的病毒包膜含有F和HN蛋白。
圖13顯示的圖表表示RT-PCR的結果,它表明除了GFP基因之外的基因結構與野生型的基因結構相同。
圖14顯示的圖表示采用電子顯微檢查F缺陷病毒顆粒形態(tài)而獲得的結果。與野生型病毒顆粒類似,F(xiàn)缺陷病毒顆粒內部具有螺旋狀RNP結構和峰狀結構。
圖15顯示的圖表示采用具有高效力的F缺陷基因SeV載體在體內將基因轉移到各種細胞的結果。
圖16顯示的圖表表示在往小鼠的原發(fā)骨髓細胞(BM c-kit+/-)中引入F缺陷SeV載體以后得到的分析結果。開口的柱代表PE-陽性/GFP-陰性;封閉的柱代表PE-陽性/GFP-陽性。
圖17顯示的圖表示將載體在體內給予大鼠大腦室的結果。
圖18顯示的圖表示如此得到的結果采用含有從表達F的細胞回收的F缺陷SeV病毒的培養(yǎng)上清液以感染不表達F的LLC-MK2細胞,在存在或或不存在胰蛋白酶下培養(yǎng)細胞三天以通過HA測定確認在上清液中存在病毒。
圖19的圖表示在已用絨毛尿囊液(通道11和12)從圖18B中的HA-陽性含胚卵中培養(yǎng)含胚雞蛋二天以后進行絨毛尿囊液的HA分析而獲得的結果。
圖20顯示的圖表示通過免疫電子顯微檢查HA-陽性和不具有傳染性的病毒液體而獲得的結果。查證病毒顆粒的存在,并發(fā)現(xiàn)病毒顆粒包膜對識別用金膠體標記的HN蛋白的抗體具有活性,但對識別用金膠體標記的F蛋白的抗體不具有活性。
圖21顯示的圖表示將F缺陷病毒顆粒轉染至細胞內的結果。
圖22顯示的圖表示形成共表達F和HN的細胞的結果,它是采用Western印跡法進行評價的。LLC/VacT7/pGEM/FHN代表采用pGEM/FHN質體轉染疫苗感染的LLC-MK2細胞而獲得的細胞。LLCMK2/FHNmix代表已引入F和HN基因但不克隆的LLC-MK2細胞。LLC/FHN代表已引入F和HN基因并由腺病毒引入表達(三天后)的LLC-MK2細胞。1-13、2-6、2-16、3-3、3-18、3-22、4-3和5-9為在克隆中細胞系的數(shù)字(名稱)。
圖23顯示的圖表示確認病毒形成取決于pGEM/FHN的存在或不存在的的結果。將FHN缺陷的GFP表達的SeV cDNA、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN混合并引入到LLC-MK2細胞中。在基因轉移3小時,用含有Arac和胰蛋白酶的MEM置換培養(yǎng)液然后進一步培養(yǎng)細胞三天。在該基因轉移2天后,用實體鏡熒光顯微鏡進行觀測以評價根據(jù)pGEM/FHN的存在或不存在的差異,并在擴散GFP表達細胞的基礎上查證病毒的形成。這里顯示了結果。當在重建時加入pGEM/FHN,則識別到GFP-表達的細胞的擴散;但是當不加入pGEM/FHN,只觀測到單一細胞的GFP-表達。
圖24顯示的圖表示RNP轉染和FHN缺陷的病毒的生長的重建結果。在引入表達后的第三天,采用P0 RNP增加物或DOSPER脂轉染共表達FHN(12孔)的細胞,然后在4天后觀測GFP。在進行RNP轉染時,與對F缺陷細胞(上圖)一樣成功地收獲P1表達FHN的細胞的病毒。在將含有病毒的液體接種到在用Ade/Cre感染的6或更多小時后引入FHN蛋白質的表達的細胞中以后,查證FHN缺陷的病毒的生長。
圖25顯示的圖表示了將含有從FHN缺陷的GFP表達的cDNA重建的病毒的液體接種到LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN,并在存在或不存在胰蛋白酶下培養(yǎng)它們而獲得的結果。在培養(yǎng)3天后查證表達GFP蛋白的細胞的擴散。這里顯示了結果。僅用LLC-MK2/FHN觀測到了GFP的擴散,并因此查證在該液體中所含的病毒的生長方式對FHN共表達具有特異性且取決于胰蛋白酶。
圖26的圖表示對來自表達FHN的細胞上清液的RNA的基因組結構進行確認的結果。
圖27的圖表示對來自用FHN缺陷的病毒感染的表達F的細胞上清液的RNA的基因組結構進行確認的結果。
圖28的圖表示當補骨脂素濃度在補骨脂素/UV照射下變化時牛痘病毒和T7活性的滅活。
圖29的圖表示當在補骨脂素/UV照射下UV照射的持續(xù)時間變化時牛痘病毒和T7 RNA聚合酶活性的滅活。
圖30顯示的圖表示在補骨脂素/UV照射以后牛痘病毒的細胞毒性(CPE)。將3×105的LLC-MK2細胞植到6孔平板上。培養(yǎng)過夜后,用Moi=2的牛痘病毒感染細胞。24小時后,測定CPE。在A中顯示了用牛痘病毒模擬處理的CPE結果。在B、C和D中分別顯示了在用牛痘病毒處理15、20或30分鐘后的CPE。
圖31的圖表表示牛痘病毒的UV處理持續(xù)時間對仙臺病毒的重建效率的影響。
圖32的圖表表示在仙臺病毒的重建實驗之后在細胞中殘留的能復制的牛痘病毒的滴定度。
圖33的圖表示采用抗-VSV-G抗體進行Western印跡分析的結果。
圖34顯示的圖表表示采用抗-VSV-G進行流動血細胞計數(shù)分析的結果。它表示在AxCANCre感染(moi=0、2.5、5)后的第四天LLC-MK2細胞系(L1)對引入VSV-G表達的分析結果。使用的主要抗體為抗-VSV-G抗體(MoAb I-1);次要抗體為FITC標記的抗-小鼠Ig。
圖35顯示的圖表示以下的結果其中,在用變化數(shù)量的AxCANCre(MOI=0、1.25、2.5、5、10)、恒量的具有F基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒感染后除去上清液,在VSV-G引入(-)之前和引入(+)之后進一步用將該上清液感染細胞,并在5天后觀測表達GFP的細胞。
圖36顯示的圖表示病毒產生數(shù)量期間所得的結果。
圖37顯示的圖表示檢查通過具有F基因缺陷的基因組的假型的仙臺病毒處理,傳染性是否受到影響的結果,它是采用VSV-G-表達的細胞系和用抗-VSV抗體處理的FHN缺陷的仙臺病毒而得到的。
圖38顯示的圖表示以下結果,其中在采用含GFP基因的F和HN缺陷的仙臺病毒感染VSV-G基因表達的細胞LLCG-L1之后,測試GFP基因的表達作為確定在其衣殼中具有VSV-G的假型病毒的產生存在的指數(shù)。
圖39顯示的圖表示通過Western分析感染的細胞提取物中的蛋白質確認在VSV-G基因表達細胞內生長的病毒缺陷F和HN基因。
圖40顯示的圖表示在熒光顯微鏡下觀測GFP-表達細胞的結果。
圖41的圖表表示通過結合使用包膜表達的質體和細胞增加物而改進了SeV/ΔF-GFP的重建效率。在P0(在傳代之前)的d3-d4(3天至4天)識別到相當?shù)母倪M。
圖42的圖表表示評價通過結合使用包膜表達的質體和細胞增加物而重建SeV/ΔF-GFP的處理條件的結果。GFP-陽性細胞代表重建的病毒數(shù)。
圖43的圖表表示測試從cDNA中拯救F缺陷仙臺病毒的結果。它表示通過結合使用包膜表達的質體和細胞增加物而改進了SeV/ΔF-GFP的重建效率。所有的測試在第7天為陽性。但是,在第成功的機率適中的第三天評價效率。
圖44顯示的圖表示含有l(wèi)acZ、F缺陷但不含有GFP的仙臺病毒載體的LacZ表達的結果。
圖45顯示的圖表表示亞克隆仙臺病毒基因組cDNA片斷(A)和用最新引入的NotI位點(B)構造的5個仙臺病毒基因組cDNAs的結構。
圖46的圖表表示用于克隆以向SEAP加入NotI位點、轉錄起始信號、間插序列和轉錄終止信號的質體的結構。
圖47顯示的圖表示各仙臺病毒載體的噬斑分析的結果。它顯示了由LAS1000得到的在噬斑分析中的部分熒光圖。
圖48的圖表表示各仙臺病毒載體之間彼此比較報道基因(SEAP)變化的表達水平的結果將SeV18+/SEAP的數(shù)據(jù)看作100,而各個表示都是相對于它的。已發(fā)現(xiàn)在將SEAP置于更下游時,活性即表達水平減小。
圖49顯示的顯微圖表示在共表達FHN的P1細胞內GFP的表達。
圖50顯示的圖表示采用抗F抗體(抗F)、抗HN抗體(抗HN)和抗仙臺病毒抗體(抗仙臺病毒),對由VSV-G假型的Sev/FGFP感染的細胞提取物進行Western印跡法分析的結果。
圖51顯示的圖表示在存在或不存在中和抗體(VGV抗體)的情況下被VSV-G假型SeV感染的F和HN缺陷的細胞上發(fā)出的熒光。
圖52顯示的圖表示Westem分析由密度梯度超離心而分離出來的,具有F基因缺陷或F和HN基因缺陷的基因組的VSV-G假型仙臺病毒的結果。
圖53顯示的圖表示由具有F基因缺陷的基因組的仙臺病毒、或F基因缺陷或者F基因和HN基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒參與的血細胞凝集測試。
圖54顯示的圖表示對具有F基因缺陷的基因組的仙臺病毒或VSV-G假型的仙臺病毒的培養(yǎng)細胞的感染特異性。
圖55顯示的圖表示確認表達NGF、F缺陷仙臺病毒(NGF/SeV/F)的結構。
圖56的圖表表示由被F缺陷SeV感染的含NGF的細胞表達的NGF的活性。經最初的培養(yǎng),將SeV感染的細胞或NGF蛋白(對照)的稀釋上清液加至一個分離的基本雞脊神經后根神經節(jié)(DRG)神經元培養(yǎng)物上。三天后,采用線粒體減少活性作為指數(shù)(n=1)來計算存在活的細胞。加入的培養(yǎng)上清液的數(shù)量相當于1000倍的稀釋液。
圖57顯示的圖表示被F缺陷SeV感染的含NGF的細胞表達的NGF的活性。經最初的培養(yǎng),將SeV感染的細胞或NGF蛋白(對照)的稀釋上清液加至一個分離的基本雞脊神經后根神經節(jié)(DRG)神經元培養(yǎng)物上。三天后,在顯微鏡下觀測試樣。
A)對照(不含NGF);B)加入NGF蛋白(10ng/ml);C)加入NGF/SeV感染的細胞的培養(yǎng)上清液(100倍稀釋);D)加入NGF/SeV感染的細胞的培養(yǎng)上清液(100倍稀釋);E)加入NGF/SeV/F感染的細胞的培養(yǎng)上清液(100倍稀釋),和;F)加入NGF/SeV/F感染的細胞的培養(yǎng)上清液(100倍稀釋)。
圖58的圖表示Ad-Cre的Moi和F蛋白的表達水平。
圖59顯示的圖表示通過Adeno-Cre的LLC-MK2/G的表達。
圖60的圖表示在傳代期間的表達持久性。
圖61的圖表示F在傳代期間的F蛋白的定位。
圖62的圖表表示GFP-CIU和抗-SeV-CIU之間的聯(lián)系。
本發(fā)明的最佳實施方式以下參照實施例對本發(fā)明的進行詳細地例舉,但不要理解為是對本發(fā)明的限制。
構建F缺陷仙臺病毒<1>構建F缺陷SeV基因組cDNA和表達F的質體用SphI/KpnI消化仙臺病毒的全長度基因組cDNA(SeV),pSeV18+b(+)(Hasan,M.K.et al.,1997,J.General Virology 782813-2820)("pSeV18+b(+)"也稱為"pSeV18+"),回收所得的片斷(14673bp)并克隆至PUC18中,稱它為質體PUC18/KS。其F破裂位點建構在PUC18/KS上。結合使用PCR-連接方法進行F基因的破裂,結果是除去了F基因(ATG-TGA=1698 bp)的ORF;將atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO1)連接它上面以構建F缺陷SeV基因組cDNA(pSeV18+/F)。在PCR中,將采用引物對(正向5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO2,逆向5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO3)產生的PCR產物上游連接到F基因上,而將由引物對(正向5’-atgcatgccggcagatga/SEQ IDNO4,逆向5’-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO5)產生的另一PCR產物上游連接到F基因的EcoT22I位點。用SacI和SalI消化所得的質體,然后回收生成含有F破裂位點的區(qū)域的片斷(4931bp)并克隆至PUC18中以產生PUC18/dFSS。用DraIII消化該PUC18/dFSS?;厥账玫钠瑪?,用來自pSeV18+的含有F基因的區(qū)域的DraIII片斷取代,并進行連接以產生質體pSeV18+/F。
為了進一步建構已在F破裂位點引入EGFP的cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP),通過PCR擴增EGFP基因。為了設置具有6的倍數(shù)的EGFP基因(Hausmann,S.et al.,RNA 2,1033-1045(1996)),在5′端采用NsiI尾隨的引物(5’-atgcatatggtgatgcggttttggcagtacSEQ ID NO6)而在3′端采用NgoMIV尾隨的引物(5′-TgccggctattattacttgtacagctcgtcSEQ ID NO7)進行PCR。用限制酶NsiI和NgoMIV消化PCR產物,然后從凝膠中回收該片斷;將該片斷連接到破裂F所處的NsiI和NgoMIV限制酶位點之間的pUC18/dFSS位點,并測定該序列。除去含有EGFP基因的DraIII片斷,并從該位點回收,取代pSeV18+的含F(xiàn)基因區(qū)域的DraIII片斷;然后進行連接以獲得質體pSeV18+/ΔF-GFP。
另一方面,通過采用PCR擴增SeV F基因,確認該序列,并插入到質體pCALNdlw的獨特位點SwaI來建構用于F基因表達的Cre-loxP引入表達質體,(Arai et.al.,J.Virology 72,1998,pll15-1121),其中已設計采用Cre DNA重組酶引入基因產物的表達,以得到質體pCALNdLw/F。
<2>制備引入SeV-F蛋白表達的輔助細胞為了回收來自F缺陷基因組的傳染性病毒顆粒,建立一種表達SeV-F蛋白的輔助細胞菌株。所用的細胞為常用于SeV生長的LLC-MK2細胞和來自猴腎的細胞菌株。在含有10%熱處理滅活的牛胎血清(FBS)、青霉素鈉G(50單位/ml)和鏈霉素(50μg/ml)的MEM中于37℃和5%的CO2氣體下培養(yǎng)該LLC-MK2細胞。由于SeV-F基因產物有細胞毒性,因而采用磷酸鈣法(根據(jù)基因轉移方案的哺乳動物轉染試劑盒(Stratagene))將上述的設計用于通過Cre DNA重組酶引入F基因產物的表達的質體pCALNdLw/F引入到LLC-MK2細胞中。
將10μg質體pCALNdLw/F引入到10cm的平板中的生長到40%融合的LLC-MK2細胞,在保溫箱中在10ml含有10%的FBS的MEM中于37℃和5%的CO2氣體下培養(yǎng)該細胞24小時。24小時后,刮去細胞,將其懸浮在10ml的培養(yǎng)液中;然后將細胞植入5個具有10cm直徑的皿(一個5ml的皿,二個2ml的皿,二個0.2ml的皿)的含有10ml 10%的FBS和1200μg/ml的G418(GIBCO-BRL)的MEM中以進行培養(yǎng)。培養(yǎng)持續(xù)14天,同時每2天間隔換一次培養(yǎng)液,以選擇已穩(wěn)定引入基因的細胞系。采用克隆環(huán)回收30個細胞菌株作為在培養(yǎng)液生長的抗G418細胞。在10cm的平板中將每一克隆培養(yǎng)至融合。
在采用表達Cre DNA重組酶的重組腺病毒AxCANCre感染各克隆以后,如以下通過Western印跡法采用抗-SeV-F蛋白單克隆IgG(f236;J.Biochem.1231064-1072)測試各細胞的SeV-F蛋白表達。
在6cm的皿中生長至融合以后,根據(jù)Saito等人的方法在moi=3處采用腺病毒AxCANCre感染各克隆(Saito etal.,Nucl.Acids Res.233816-3821(1995);Arai,T.et al.,JVi.rol 72,1115-1121(1998))。在感染之后,培養(yǎng)細胞3天。棄去培養(yǎng)上清液并用PBS緩沖劑洗滌細胞兩次,用刮棒刮去細胞,并在1500x g下離心五分鐘來收集細胞。
在-80℃下保存細胞且在需要時可將其融化。將收集到的細胞懸浮在150μl的PBS緩沖劑中,向其加入相當于2×Tris-SDS-BME樣品裝載量的緩沖劑(0.625M Tris、PH6.8、5%SDS、25%2-ME、50%甘油、0.025%BPB;OWL)。在98℃下熱處理該混合物3分鐘,然后將其用作電泳試樣。通過在SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Multi Gel 10/20,Daiichi Pure Chemicals)電泳而分離出試樣(1×105細胞/通道)。通過半干燥印跡法將分離的蛋白轉移到PVDF轉移膜(Immobilon-P轉移膜;微孔)。在恒定的電流1mA/cm2下在已在100%甲醇中浸泡30秒,然后在水中浸泡30分鐘的轉移膜上進行轉移1小時。
在含有0.05%Tween 20和1%BSA(BlockAce;Snow BrandMilkProducts)阻斷溶液搖晃該轉移膜1小時,然后在室溫下用已被1000倍的含有0.05%Tween 20和1%BSA的阻斷溶液稀釋的抗-SeV-F抗體(f236)培養(yǎng)2小時。在20ml的PBS-0.1%Tween 20中洗滌該轉移膜3次,同時搖晃5分鐘,然后在PBS緩沖劑中洗滌同時搖晃5分鐘。將該轉移膜在10ml用含有0.05%Tween 20和1%BSA的阻斷溶液稀釋2000倍的過氧化酶連接的抗小鼠IgG抗體(山羊抗小鼠IgG;酶)中培養(yǎng)1小時。用20ml的PBS-0.1%Tween 20中洗滌該轉移膜3次,同時搖晃5分鐘,然后在PBS緩沖劑中洗滌同時搖晃5分鐘。
采用化學發(fā)光法檢測在轉移膜上與該抗-SeV-F抗體交叉反應的蛋白(ECL western印跡檢測試劑;Amersham)。結果如圖1所示。檢測對AxCANCre感染具有特異性的SeV-F表達以確認引入SeV-F基因產物表達的LLC-MK2的形成。
通過流式細胞術,采用抗-SeV-F抗體分析多種所得細胞系之一的LLC-MK2/F7細胞(圖2)。具體而言,通過在15,000rpm下于4℃下離心5分鐘而沉淀出1×105細胞,用200μl的PBS洗滌,并使其在含有100倍稀釋的抗F單克隆抗體(f236)、0.05%疊氮化鈉、2%的FCS的FACS(NIKKEN CHEMICALS)的PBS中于4℃下在黑暗處反應一小時。再次將該細胞在15,000rpm下于4℃下離心5分鐘,用200μl的PBS洗滌,然后使其在冰上與1μl/ml的FITC標記的抗小鼠IgG(CAPPEL)反應30分鐘。再次用200μl的PBS洗滌該細胞,然后將該細胞在15,000rpm下于4℃下離心5分鐘。將該細胞懸浮在1ml FACS的PBS中,然后采用EPICS ELITE(計數(shù)器)氬激光在488nm的激發(fā)波長和525nm的熒光波長處分析。結果表明LLC-MK2/F7以對SeV-F基因表達引入特異性的方式表現(xiàn)出對抗體的高度活性,并因此查證在細胞表面表達SeV-F蛋白。
確認由輔助細胞表達的SeV-F蛋白的功能測試由輔助細胞引入其表達的SeV-F蛋白是否保持了來源蛋白的功能。
在放置于6cm的皿中并生長至融合以后,根據(jù)Saito等人的方法用腺病毒AxCANCre在moi=3處感染LLC-MK2/F7細胞(上述)。然后在保溫箱中在含有腺蛋白酶(7.5μg/ml;GIBCOBRL)的MEM(不含血清)中于37℃和5%的CO2氣體下培養(yǎng)該細胞三天。
棄去培養(yǎng)上清液并用PBS緩沖劑洗滌細胞兩次,用刮棒刮去細胞,并在1500x g下離心五分鐘來收集細胞。用上述的Western印跡法查證被表達的F蛋白的破裂(圖3)。合成SeV-F作為非活性蛋白前體F0,然后在通過胰蛋白酶進行蛋白分解而該前體消化至兩個亞單元F1和F2中之后將該前體活化。與普通的細胞一樣,在引入F蛋白表達之后的LLC-MK2/F7細胞因而繼續(xù)表達F表達,即使在被傳代之后,沒有觀測到由被表達的F蛋白調節(jié)的細胞毒性,也沒有觀測到表達F蛋白的細胞發(fā)生細胞融合。但是,在將SeV-HB表達質體(pCAG/SeV-HN)轉染至表達F的細胞并在含有胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)該細胞三天時,頻繁的觀測到細胞融合。在采用吸附到細胞表面的紅細胞的實驗中確認了在該細胞表面的HN的表達(血吸附測試;Had測試)(圖4)。具體而言,將1%的雞紅細胞以1ml/皿的濃度加到培養(yǎng)細胞中并使該混合物在4℃下靜置10分鐘。用PBS緩沖劑洗滌該細胞3次,然后在該細胞表面觀測到紅細胞群。在紅細胞聚集的細胞確認了細胞融合;已發(fā)現(xiàn)通過F蛋白與HN的相互作用引入了細胞融合;因此表明在LLC-MK2/F7中保留其表達的F蛋白仍保留了它的原始功能。
含有F缺陷基因組的功能性RNP和病毒顆粒的形成為了從該缺陷病毒上回收病毒顆粒,有必要使用表達該缺陷蛋白的細胞。因此,嘗試采用表達該缺陷蛋白的細胞回收該缺陷病毒,但是發(fā)現(xiàn)采用輔助細胞系的F蛋白的表達由于在F缺陷SeV的重建中所用的牛痘病毒而快速終止(圖5),并因此使以輔助細胞系直接提供F蛋白為基礎的病毒的重建失敗。已報道牛痘病毒的復制能力被滅活,但T7表達的活性沒有因在加入補骨脂素下采用長波長紫外光線(長波UV)而進行的牛痘病毒處理(PLWUV處理)而受損(Tsung et al.,J Virol 70,165-171,1996)。因此,嘗試采用PLWUV處理的牛痘病毒(PLWUV-VacT7)進行病毒的重建。采用配有5個15瓦燈泡的UV Stratalinker 2400(Catalog No.400676(100V);Stratagene,La Jolla,CA,USA)進行紫外光線照射。結果表明F蛋白的表達由于在該重建中所用的表達F的細胞而受到抑制,但在來自用該PLWUV-VacT7重組的細胞的溶解產物被感染至該輔助細胞以后在araC的存在下疫苗幾乎不生長,并且還發(fā)現(xiàn)采用輔助細胞系的F蛋白的表達幾乎不受到影響。而且,采用該PLWUV-VacT7的野生型SeV的重建可以實現(xiàn)從甚至103個細胞中回收病毒,而采用先前的方法這是不可能的除非存在105或更多的細胞,因此大大改進了病毒重建的效率。因此,嘗試采用該方法進行缺陷SeV病毒的重建。
<F缺陷SeV病毒的重建和擴增>
用在上述的pSeV18+/ΔF-GFP轉染LLC-MK2細胞以后觀測GFP的表達,其中已根據(jù)6n規(guī)則以下述的方式往F破裂的位點引入增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因作為報道基因。還測試了存在作為RNP形成中所需的三種組分,病毒衍生的基因NP、P和L的影響。
將LLC-MK2細胞以5×106細胞/皿的濃度置于100mm陪替氏培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)完成后,用補骨脂素和長波(365nm)紫外光線處理該細胞20分鐘,并用表達T7 RNA聚合酶(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126(1986))的重組牛痘病毒在室溫下感染該細胞1小時(moi=2)(moi=2-3;優(yōu)選moi=2)。在洗滌該細胞三次以后,將質體pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato,A.et al.,Genescells 1,569-579(1996))分別以12μg、4μg、2μg和4μg/皿的量懸浮在OptiMEM(GIBCO)中;向其加入SuperFect轉染試劑(1μgDNA/5μlSuperFect;QiAGEN);將該混合物在室溫下靜置10分鐘;然后將其加到3ml含有3%FBS的OptiMEM中;向其加入細胞并培養(yǎng)。采用野生型SeV基因組cDNA(pSeV(+))(Kato,A.et al.,Genes cells 1,569-579(1996))作為對照代替pSeV18+/ΔF-GFP。在培養(yǎng)3小時后,用不含血清的MEM洗滌該細胞兩次,然后在含有胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC,40μg/ml;Sigma)和胰蛋白酶(7.5μg/ml;GIBCO)的MEM中培養(yǎng)70小時。收獲這些細胞,并將這些粒狀物懸浮在OptiMEM(107細胞/ml)中。在冷凍和融解處理重復3次以后,用脂轉染試劑DOSPER(Boehringer Mannheim)(106細胞/25μl DOSPER)混合這些細胞,并使其在室溫下靜置15分鐘。然后轉染表達F的LLC-MK2/F細胞系(在12孔平板為106細胞/孔),在不含血清的MEM(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)中培養(yǎng)該細胞。
結果表明,僅在存在來源于該病毒的所有組分,NP、P和L時才確認GFP的表達,并可以產生表達外源基因的缺陷病毒RNP(圖6)。
<確認F缺陷病毒顆粒>
測試通過表達F的輔助細胞是否可以拯救采用上述方法由F缺陷基因組cDNA重建的功能性RNP,并形成F缺陷病毒的傳染性病毒顆粒。用陽離子脂質體混合細胞溶解產物;如上述,在形成功能性RNP的條件下(PSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L同時被轉染的條件)或不形成功能性RNP的條件下(兩種質體pSeV18+/ΔF-GFP和pGEM/NP被轉染的條件)通過冷凍/融化從重建的細胞中制得該溶解產物;將該溶解產物脂轉染到表達F的細胞和不表達的細胞中;根據(jù)表達GFP的細胞分布的擴散來觀測病毒顆粒的形成。結果表明僅在采用于重建功能性RNP的條件下獲得的溶解產物而引入表達F的細胞的時候識別到了表達GFP的細胞的分布的擴散(圖7)。而且,即使在噬斑測定中,僅在相同的條件下看到噬斑的形成。根據(jù)這結果,揭示了由F缺陷病毒基因組產生的功能性RNPs在來源于表達F的細胞的F蛋白的存在下進一步轉化成傳染性病毒顆粒并從該細胞中釋放出該顆粒。
通過以下的實驗表明在培養(yǎng)上清液中存在傳染性F缺陷病毒顆粒。如實施例2所述,將含有由F基因缺陷的基因組構建的功能性RNP的溶解產物脂轉染到表達F的細胞中,并回收該培養(yǎng)上清液。將該培養(yǎng)上清液加到表達F的細胞中以獲得感染;在第三天,回收該培養(yǎng)上清液并同時將其加到表達F的細胞和不表達F的細胞上;然后在胰蛋白酶存在或不存在下培養(yǎng)三天。在表達F的細胞中,僅在存在胰蛋白酶下擴增病毒(圖8)。還發(fā)現(xiàn)非傳染性病毒釋放到不表達F的細胞上清液中(在圖9的下圖)或從不存在胰蛋白酶下培養(yǎng)的表達F的細胞中釋放出來。以上說明的總結如下F缺陷表達GFP的病毒的生長對表達F的細胞具有特異性并取決于采用胰蛋白酶的蛋白水解。如此生長的傳染性F缺陷仙臺病毒的滴定度范圍為0.5×107-1×107CIU/ml。
分析F缺陷表達GFP的病毒為了確認從F缺陷cDNA中回收的病毒顆粒的基因組結構,從表達F的細胞培養(yǎng)上清液中回收病毒,提取全部RNA并采用F和HN作為探針進行Northern印跡分析。結果表明在從表達F的細胞上收獲的病毒中HN基因是可檢測的,但F基因是不可檢測的,它表明在該病毒基因組中不存在F基因(圖10)。而且,通過RT-PCR GFP,如在cDNA的建構中所示,已確認在F的檢測位點存在該基因(圖11),而其它基因的結構與野生型的結構相同。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn),已表明在病毒重建過程中沒有發(fā)生基因組的重排。此外,通過電子顯微鏡檢查回收的F缺陷病毒顆粒的形態(tài)。與野生型病毒相似,F(xiàn)缺陷病毒顆粒內部具有螺旋狀RNP結構和峰樣結構(圖14)。而且,通過免疫電子顯微法,采用與F或HN特異性反應的金膠體連接的IgG(抗-F、抗-HN)檢查這些病毒。結果表明,該病毒包膜的峰樣結構包括F和HN蛋白(圖12),這表明該病毒顆粒中有效地結合了由輔助細胞產生的F蛋白。以下將詳細描述該結果。
<檢查全部RNA、Northern印跡分析和RT-PCR>
根據(jù)該方案,從利用QIAamp病毒RNA微型試劑盒(QIAGEN),用該病毒感染表達F的細胞LLC-MK2/F7的3天后得到的培養(yǎng)上清液提取全部RNA。在1%的含有甲醛的變性瓊脂糖凝膠中通過電泳分離該純化的全部RNA(5μg),然后在一真空印跡儀器(Amersham-Pharmacia)中將其轉移到Hybond-N+膜上。用0.05M的NaOH固定所制得的膜,用2倍稀釋的SSC緩沖劑(Nacalai tesque)沖洗,然后在雜交溶液(BoehringrerMannheim)中使其預雜交30分鐘;向其加入采用地高辛配基(DIG)-dUTP(堿敏感性)由隨機引物DNA標記(DIG DNA標記試劑盒;BoehringerMannheim)制得的F或HN基因探針,然后進行雜交16小時。接著,洗滌該膜,并使其與堿性磷酸酶結合的抗-DIG抗體(抗地高辛配基AP)反應;采用DIG檢測試劑盒進行分析。結果表明在從表達F的細胞中收獲的病毒中可檢測HN基因但不可檢測F基因,它表明在該病毒基因組中不存在F基因(圖10)。
進一步地,采用RT-PCR進行詳細地分析。根據(jù)該方案,在RT-PCR中,首先采用SUPERSCRIPTII預擴增系統(tǒng)(Gibco BRL)從該純化的病毒RNA中合成鏈cDNA;采用LA PCR試劑盒(TAKARA ver2.1)并使用以下的PCR條件94℃/3分;30次循環(huán)94℃/45秒、55℃/45秒、72℃/90秒的擴增;在72℃下培養(yǎng)10分鐘;然后將該試樣在2%的瓊脂糖凝膠中在100v下電泳30分鐘,用溴化乙錠固定該凝膠以進行照相成像。插入到F缺陷位點的用于確認M基因和EGFP的引物是正向15′~atcagagacctgcgacaatgc(SEQ ID NO8)和逆向15′-aagtcgtgctgcttcatgtgg(SEQ ID NO9);用于確認插到F缺陷位點的EGFP和HN基因的引物為正向25’-acaaccactacctgagcacccagtc(SEQ ID NO10)和逆向25′-gcctaacacatccagagatcg(SEQ ID NO11);而采用正向35′-acattcatgagtcagctcgc(SEQ ID NO;12)逆向2引物(SEQ ID NO11)確認M基因和HN基因之間的連接。結果表明在F缺陷位點存在GFP基因,如cDNA的結構所示(圖11),而其它基因與來自野生型的基因相同(圖13)。以上所示的發(fā)現(xiàn)表明在病毒的重建期間沒有發(fā)生基因組的重排。
<采用金膠體連接的免疫球蛋白的電子顯微分析>
用電子顯微鏡檢查回收的F缺陷病毒顆粒的形態(tài)。首先,將用該缺陷病毒感染的細胞的培養(yǎng)上清液于28,000rpm下離心30分鐘以獲得病毒顆粒,然后將該顆粒再次懸浮在10倍量稀釋的濃度為1×109HAU/ml的PBS中;將一滴該懸浮液滴到具有一個支承過濾器的微細網眼上,然后在室溫下干燥該網眼;用含有3.7%的福爾馬林的PBS處理該網眼15分鐘以進行固定,然后用含有0.1%的BSA的PBS溶液預處理30鐘;進一步將用相同的溶液200倍稀釋的抗-F單克隆抗體(f236)或抗-HN單克隆抗體(Miura,N.et al.,Exp.Cell Res.(1982)141~409-420)滴到該網眼上并使其在潮濕條件下反應60分鐘。接著,用PBS洗滌該網眼,然后用無菌蒸餾水洗滌,并在室溫下風干;將4%的乙酸鈾溶液放在該網眼上染色2分鐘并將該網眼干燥;在JEM-1200EXII電子顯微鏡(JEOL.)觀測并拍攝試樣。結果表明病毒包膜的峰樣結構包括F和HN蛋白(圖12),它說明已將由輔助細胞產生的F蛋白有效地結合到病毒顆粒上。此外,與野生型病毒類似,F(xiàn)缺陷病毒顆粒內部具有螺旋RNP結構和峰樣結構(圖14)。
在體內通過F缺陷SeV載體將高效基因轉移到各種細胞上<引入到大鼠大腦皮質神經細胞的基本培養(yǎng)細胞>
如下制備并培養(yǎng)大鼠大腦皮質神經細胞的基本培養(yǎng)細胞用二乙醚深度麻醉在懷孕第18天的SD大鼠(SPF/VAF CrjCD,雌性,332g,至多9周大;Charles River),然后從腋動脈放血將其處死。從腹部后的子宮移出胎兒。切下顱皮和骨并取出大腦。在立體顯微鏡下將小腦半球轉移到工作溶液DMEM(含5%的馬血清、5%小牛血清和10%的DMSO);將它們切下并向其加入冰凍的木瓜蛋白酶溶液(1.5U,0.2mg的半胱氨酸,0.2mg的牛血清清蛋白,5mg的葡萄糖,0.1mg/ml的DNase);將含有該切片組織的溶液培養(yǎng)15分鐘,同時在32℃下通過反轉小瓶而搖晃15分鐘。在查證懸浮液已充分混濁而組織部分半透明時,用移液管將該組織部分壓碎成小片。將該懸浮液在1200rpm下于30℃下離心5分鐘,然后將該細胞再次懸浮在B27-補充的神經基本培養(yǎng)液(GibcoBRL,Burlington,Ontario,Canada)。將該細胞置于涂有聚-d-賴氨酸的密度為1×105細胞/皿的平板上(Becton Dickinson Labware,Bedford,MA,U.S.A.),然后在37℃下在5%的CO2下培養(yǎng)。
在來自大腦皮質神經細胞(5×105/孔)基本培養(yǎng)物培養(yǎng)5天后,用F缺陷SeV載體(moi=5)感染該細胞并進一步培養(yǎng)3天。在室溫下在含有1%的低聚甲醛、5%的山羊血清和0.5%的Triton-X的固定溶液中將該細胞固定5分鐘。在室溫下采用BlockAce(Snow Brand Milk Products)進行阻斷反應2小時,然后在室溫下用500倍稀釋的山羊抗大鼠微管相關的蛋白2(MAP-2)(Boehringer)IgG培養(yǎng)1小時。進一步用PBS(-)洗滌該細胞15分鐘,然后在室溫下用被5%的山羊血清/PBS作100稀釋的cys3-連接的抗小鼠IgG培養(yǎng)1小時。進一步地,在用PBS(-)洗滌該細胞15分鐘后,往該細胞中加入Vectashield封固劑(Vector Laboratories,Burlingame,U.S.A.);用同焦顯微鏡(Nippon Bio-Rad MRC 1024,Japan)和配備470-500nm或510-550nm的激發(fā)帶通濾波器反轉Nikon Diaphot 300熒光觀測已被MAP-2免疫染色和GFO熒光雙染色的細胞。結果表明已在大約100%的MAP2-陽性的神經細胞中引入了GFP。
<引入到正常人細胞中>
從DAINIPPON PHARMACEUTICAL購得正常人平滑肌細胞、正常人肝細胞和正常人肺毛細血管內皮細胞(細胞系統(tǒng)),并在37℃和5%的CO2氣體下用SFM CS-C培養(yǎng)基試劑盒(細胞系統(tǒng))培養(yǎng)。
用F缺陷SeV載體(m.o.i=5)感染正常人平滑肌細胞(圖15,肌肉)、正常人肝細胞(圖15,肝)和正常人肺毛細血管內皮細胞(圖15,肺),然后觀測GFP的表達。已查證引入效率大約為100%,而在所有的細胞中以非常高的水平表達GFP基因(圖15)。
<引入到小鼠基本骨髓細胞中>
進一步進行實驗,其中利用血統(tǒng)標記分離小鼠基本骨髓細胞,并用F缺陷SeV載體對其進行感染。首先,通過腹膜內注射(IP注射)給予C57BL小鼠(6周大雄性)150mg/kg劑量的5-氟尿嘧啶;在給藥2天以后,從股骨中收集骨髓細胞。采用Lympholyte-M(Cedarlane)通過密度梯度離心法分離單核細胞。將已涂有生物素標記的抗-CD45R(B220)、抗-Ly6G(Gr-a)、抗-Ly-76(TER-119)、抗-1(Thyl.2)和抗-Mac-1的鏈霉抗生物素蛋白-磁性玻珠(Pharmingen;Funakoshi)的混合物加到該單核細胞(3×106細胞),將所得的混合物在4℃下反應1小時;回收已用磁體除去其Lin+細胞的部分(Lin-細胞)(Erlich,S.et al.,Blood 1999,93(1),80-86)。往4×105的Lin-細胞中加入2×107HAU/ml的SeV,進一步向其加入重組大鼠SCF(100ng/ml,BRL)和重組人IL-6(100 U/ml)。此外,將4×107HAU/ml的F缺陷SeV加到8×105的全骨髓細胞中,將5×107HAU/ml的GFP-SeV加到1×106細胞中。通過插入PCR擴增的NotI片斷制得GFP-SeV,它含有綠色熒光蛋白(GFP)基因(該結構基因的長度為717bp),在該基因的SeV轉錄單元pUC18/T7HJRz.RNA(+18)的限制酶NotI分解位點加入轉錄起始(R1)、終止(R2)信號和間插(IG)序列(Genes Cells,1996,1569-579)。根據(jù)已知的方法(Genes Cells,1996,1569-579),采用LLC-MK2細胞和含胚卵進行含有GFP基因的病毒的重建,然后回收含有有用基因的病毒。在用GFP-SeV感染后經48小時的培養(yǎng),將細胞分成兩組;其中一組與藻紅蛋白(PE)標記的抗-CD117(c-試劑盒;Pharmingen)反應1小時;另一組為對照組。用PBS洗滌該細胞3次,然后在流式血細胞計數(shù)器中分析(EPICSElite ESP;Coulter,Miami,F(xiàn)L)。
結果表明已將F缺陷載體感染到富含已被用作血原始干細胞標記的抗-c-抗體的骨髓細胞上,并觀測到GFP基因的表達(圖16)。通過在往LLC-MK2細胞中加入與胰蛋白酶反應的細胞培養(yǎng)上清液三天后測定表達GFP的細胞的存在,確認了在該培養(yǎng)上清液中存在傳染性顆粒。它表明這些細胞都沒有釋放出傳染性病毒顆粒。
腦室的載體給藥通過腹膜內注射用重量鹽水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.)作10倍稀釋的(5mg/ml)戊巴比妥鈉溶液(Dainabot)將大鼠(F334/Du Crj,6周大,雌性,Charles River)麻醉。對于小動物(DAVID KOPF)采用大腦趨實體性容器給予病毒。在距離耳間線的前囟5.2mm、距離人字縫尖右耳2.0mm、大腦表面下2.4mm的點,采用30G可交換探針(Hamilton)注射20μl(108CIU)。在室管膜細胞上觀測到了GFP蛋白的高水平表達(圖17)。而且,在F缺陷SeV載體的情況下,僅在與病毒發(fā)生接觸的室管膜細胞或注射位點周圍的神經細胞上觀測到GFP蛋白的表達,而在該區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)損害。直到解剖時在給藥的大鼠上沒有到行為和體重變化的異常。在解剖后,在大腦或任何被分析的組織和器官如肝、肺、腎、心、脾、胃、腸等沒有發(fā)現(xiàn)損害。
由F缺陷SeV基因組形成F缺陷病毒顆粒<1>
用F缺陷SeV病毒感染不表達F的LLC-MK2細胞和表達F的LLC-MK2細胞(LC-MK2/F7)并采用(+)或不采用(-)胰蛋白酶培養(yǎng)。在圖18A中顯示了3天后細胞培養(yǎng)上清液的HA測定結果。將該培養(yǎng)上清液接種到含胚雞蛋中,在圖18中顯示了2天的培養(yǎng)后絨毛尿囊液的HA測定的結果。上方圖的“C”代表用作對照組的PBS。在“Dilution”下顯示的數(shù)字表示該病毒溶液的稀釋倍數(shù)。進一步地,將含胚雞蛋(通道11和12)中的HA陽性絨毛尿囊液再次接種到含胚雞蛋中,并在培養(yǎng)兩天后,采用HA測定檢查該絨毛尿囊液(圖19C)。結果是發(fā)現(xiàn)不表達F的細胞或被F缺陷SeV病毒感染的含胚雞蛋為HA陽性。但是,如果該HA-陽性病毒溶液不具有二次傳染性的話,則病毒在被接種到含胚雞蛋以后并不繁殖。
<2>
檢查在不表達F的細胞內擴增的非傳染性病毒溶液中病毒顆粒的存在。采用QIAamp病毒RNA微試劑盒(QIAGEN),利用F基因和HN基因作為探針,對由來自表達F的細胞、HA-陽性、非傳染性絨毛尿囊液和野生型SeV的培養(yǎng)上清液制得的全部RNA進行Northern印跡分析。結果是,在將HN基因用作探針時檢測到了來自表達F的細胞培養(yǎng)上清液的絨毛尿囊液或病毒的RNA的光譜帶(圖10)。它證明HA-陽性、非傳染性液體含有具有F缺陷基因組的非傳染性病毒樣顆粒。進一步地,通過免疫電子顯微鏡法分析HA-陽性、非傳染性病毒溶液揭示了病毒顆粒和與識別金膠體標記的HN蛋白的抗體反應的病毒顆粒包膜的存在(圖20)。該結果表明F缺陷病毒顆粒的存在,證明即使不存在F蛋白,該病毒可以單獨形成為具有HN基因的病毒顆粒(Leyer,S.et al.,J Gen.Virol79,683-687(1998)),而該結果第一次證明了可以單獨用HN蛋白形成SeV病毒顆粒。因此,在含胚雞蛋中可以批量地瞬間產生F缺陷病毒顆粒的事實表明可以批量地產生包裝SeV F缺陷的RNP的病毒粒子。
<3>如上所述,在含胚雞蛋中瞬間擴增的F缺陷病毒顆粒對由仙臺病毒感染的細胞不具有傳染性。為了確認功能性RNP結構包裝在包膜中,用陽離子脂質體(DOSPER Boehringer Mannheim)混合表達F的細胞和不表達的細胞,并在室溫下通過培養(yǎng)15分鐘而進行轉染。結果是,在不用陽離子脂質體混合該細胞時根據(jù)觀測不到表達GFP的細胞,而用陽離子脂質體混合時所有的細胞都不表達GFP。在不表達F的細胞中,僅在個別細胞中觀察到GFP表達,且這種表達并沒有擴張到相鄰細胞,而在表達F的細胞中,表達GFP的細胞擴張形成了菌群(圖21)。因此,顯然在含胚雞蛋中瞬間擴增的非傳染性病毒顆粒在采用諸如轉染的方法被引到細胞時不能表達基因。
從FHN缺陷的SeV基因組中重建和擴增病毒<構建FHN缺陷的基因組cDNA>
為了構建FHN缺陷的SeV基因組cDNA(pSeV18+/FHN),首先用EcoRI消化PUC18/KS以構建PUC18/Eco,然后檢測從F基因的起始密碼子至HN基因的終止密碼子的全序列(4866-8419),接著將其連接到BsiwI位點(cgtacg)。在用堿基序列確認FHN檢測區(qū)域的序列以后,從凝膠中回收EcoRI片斷(4057bp)以取代PUC18/KS的EcoRI片斷,從而完成構建。從凝膠中回收含有FHN檢測區(qū)域的KpnI/sphI片斷(14673bp)以取代pSeV18+的KphnI/SphI片斷,從而獲得質體pSeV18+/FHN。
另一方面,如下完成構建由GFP引入的的FHN缺陷的SeV cDNA。從pSeV18+/FHN中回收SalI/XhoI片斷(7842bp),將其克隆至pGEM11Z(Promega)。將所得的質體稱為pGEM11Z/SXdFHN。通過BsixI酶的消化將在d2EGFP的ATG-TAA(846bp)的兩端具有BsixI位點的PCR產物(Clontech)連接到pGEM11Z/SXdFHN的FHN缺陷的位點。所得的質體稱為pSeV18+/FHN-d2GFP。
<建立FHN缺陷、蛋白質共表達的細胞系>
表達F基因的質體與用于建立FHN缺陷、蛋白質共表達的細胞系的質體,并類似地構建表達HN基因的質體,并將HN的含有ORF的片斷插入到pCALNdlw(Arai et al.上述)的獨特的SwaI位點以得到稱為pCALNdLw/HN的質體。
根據(jù)制造者的方案,將LLC-MK2細胞與等量或不同比率的pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN混合,以采用哺乳動物轉染試劑盒(Stratagene)引入基因。在用G418進行三周的選擇之后克隆細胞。用表達Cre DNA重組酶的重組腺病毒(Ade/Cre,Saito et al.,上述)(moi=10)感染所得的抗藥克隆。接著在用PBS(-)洗三次后,誘發(fā)F和HN蛋白的表達三天,之后收集這些細胞,采用Western印跡法使用單抗SeV-F蛋白和抗-SeV HN蛋白的單克隆IgG探測它們(圖22)。
<構建pGEM/FHN>
將用于構建pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN的F和HN片斷克隆至pGEM4Z和pGEM3Z(Promega)以分別獲得pGEM4Z/F和pGEM3Z/F?;厥胀ㄟ^PvuII消化含有T1啟動子和pGEM3Z/HN的HN的區(qū)域而獲得的片斷,并連接到在pGEM4Z/F的F基因下游的SacI獨特位點削切的平位點。通過Western印跡法采用在以相同方向排列時同時被表達的抗-F或抗HN單克隆抗體確認F和HN蛋白。
<FHN缺陷的病毒的重建>
以兩種方式進行FHN缺陷的病毒的重建。一種是采用如在F缺陷病毒的重建中所用的RNP轉染方法,另一種是采用T7以提供共表達質體。同時,在T7啟動子的調節(jié)下,分別構建表達F和HN蛋白的質體,并采用提供用于重建的質體F和HN蛋白。在兩種方法中,通過FHN共表達細胞擴增重建的病毒。以12μg/10cm皿、4μg/10cm皿、2μg/10cm皿、4μg/10cm皿和4μg/10cm皿(最終容積,3ml/10cm皿)的比率混合FHN缺陷、表達GFP的SeV cDNA(pSeV18+/FHN-d2GFP)、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN以與上述的F缺陷SeV重建的方式將基因引入到LLC-MK2細胞中。在引入基因3小時后,將培養(yǎng)液換成含有AraC(40μg/ml,SIGMA)和胰蛋白酶(7.5μg/ml,GIBCO)的MEM,并進一步培養(yǎng)3天。在基因引入2天后采用熒光立體顯微鏡進行觀測,通過擴散表達GFP的細胞確認病毒的形成。結果是,如果在重建時加入pGEM/FHN,則觀測到表達GFP的細胞的擴散,而如果不加入pGEM/FHN而沒有觀測到該擴散,且僅在單一細胞上觀測到GFP表達(圖23)。它表明在FHN重建時的加入導致病毒顆粒的形成。另一方面,在RNP轉染的情況下,與在F缺陷情況上一樣,在P1的表達FHN的細胞上成功地完成病毒回收(圖24,上圖)。
在用FHN缺陷的病毒溶液感染被引入以在Ade/Cre感染的6或更多小時之后表達FHN蛋白的細胞以后確認病毒的擴增(圖24,下圖)。
用由FHN缺陷的表達GFP的SeV cDNA重建的病毒溶液感染LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN細胞,并在加入或不加入胰蛋白酶的情況下進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)3天后,分析表達GFP蛋白的細胞的擴散。結果是,僅在LLC-MK2/FHN中觀測到GFP的擴散,確認可以通過FHN共表達和依賴胰蛋白酶的方式擴增該病毒溶液(圖25)。
為了確認FHN缺陷的病毒基因組,將從LLC-MK2/FHN細胞上回收的培養(yǎng)上清液離心,根據(jù)制造者的方案,采用QIAamp病毒RNA微試劑盒(QIAGEN)提取RNA。采用該RNA利用用于第一鏈合成的Superscript預擴增系統(tǒng)(GIBCO BRL)進行RT-PCR的模板合成,并采用TAKARA Z-Taq(Takara)進行PCR。將F缺陷病毒用作對照組。選擇PCR引物組作為M基因和GFP基因的組合,或M基因和L基因的組合(用于M基因和GFP基因的組合(M-GFP),正向5’-atcagagacctgcgacaatgc/SEQ ID NO13,5’-aagtcgtgctgcttcatgtgg/SEQ IDNO14;用于M基因和L基因的組合(M-L),正向5’-gaaaaacttagggataaagtccc/SEQ ID NO15,5’-gttatctccgggatggtgc/SEQ IDNO16)。結果是,在RT條件下在采用M和GFP基因作為引物時在F缺陷和FHN缺陷的病毒上都獲得了特定的光譜帶。在采用M和L基因作為引物的情況下,檢測FHN缺陷的試樣的包含GFP的給定大小的光譜帶,并檢測F缺陷試樣的包含HN基因具有該大小的延長光譜帶。因此,證明了在基因組結構中FHN缺陷(圖26)。
另一方面,與在采用F缺陷病毒的情況類似,用FHN缺陷的病毒感染表達F的細胞,并在4天后回收培養(yǎng)上清液以進行對LLC-MK2、LLC-MK2/F和LLC-MK2-FHN的感染。結果是,在任何被感染的細胞上都沒有觀測到GFP表達,表明該病毒對這些細胞不具有傳染性。但是,已報道F蛋白單獨就足以形成病毒顆粒(Kato,A.et al.,Genes cells 1,569-579(1996)),而脫唾液酸糖蛋白受體(ASG-R)調節(jié)對肝細胞的特定感染(Spiegel et al.,J.Virol72,5296-5302,1998)。因此,含有FHN缺陷的RNA基因組和僅用F蛋白構造的病毒包膜的病毒被釋放到表達F的細胞的培養(yǎng)上清液上。因此,回收用FHN缺陷的病毒感染的表達F的細胞的培養(yǎng)上清液,并在離心之后,如上述提取RNA并采用上述的RT-PCR方法對其進行分析。結果是,如在圖27所示,證明了含有FHN缺陷的基因組的RNA的存在。
病毒顆粒變成具有VSV-G的假型的Western印跡分析清楚地表明沒有表達F和HN基因。因此可以說,這里建立了FHN缺陷的病毒的病毒顆粒的生產系統(tǒng)。
而且,將從表達F蛋白的細胞中釋放的病毒顆粒在與陽離子脂質體(50μl/DOSPER/500μl/孔)混合或不混合的情況下加到表達FHN或不表達的LLC-MK2細胞上。結果是,在作為與DOSPER的混合物加入時觀測到表達GFP的細胞的擴散,而HN缺陷的病毒顆粒根本不具有傳染性,沒有表現(xiàn)出表達GFP的細胞,而這可以在上述F缺陷顆粒的情況下看到。在不表達FHN的細胞中觀測到表達GFP的細胞,但沒有發(fā)現(xiàn)關于病毒重新形成或擴散的證據(jù)。
這些從表達F的細胞中回收的病毒樣顆??梢愿腥境掷m(xù)地表達ASG-R基因的細胞、不表達ASG-R的細胞或肝細胞,并可以采用Spiegel等人的方法檢查該感染是肝特異性還是ASG-R特異性。
缺陷基因組RNA病毒載體的應用1.用F缺陷病毒包膜封閉在上述系統(tǒng)中擴增的F缺陷RNP??梢圆捎没瘜W修飾方法等等往該包膜上加入任何所需的細胞引入能力,或采用基因引入試劑或基因槍等(RNP轉染,或RNP注射)而將該包膜引入到細胞中,并可以復制重組RNA基因組和在細胞中自主和持續(xù)地產生蛋白質。
2.可以生產具有特定靶向能力的載體,此時HN的細胞內區(qū)域按目前狀況在左方,HN的細胞間區(qū)域與能以特定的方式靶向作用于其它受體的配體融合,而往病毒基因組中結合能產生化學蛋白的重組基因。此外,可以在產生重組蛋白的細胞中制備該載體。這些載體可用于基因治療,如作為疫苗等等。
3.由于已成功地完成兩種FHN缺陷的SeV病毒的重建,可以通過以下方法制得靶向載體將該具有靶向能力的包膜嵌合蛋白基因代替GFP基因引入到FHN檢測位點,采用與在FHN缺陷的載體的情況下對它進行重建,在F缺陷細胞上擴增產物一次,將產物感染到不表達的細胞上,回收僅由該病毒基因組轉錄的具有靶向能力的嵌合包膜蛋白形成的病毒顆粒。
4.已報道通過往細胞中引入NP、P、L和F基因形成仙臺病毒的微基因組和具有由包裝微基因組的F蛋白的病毒顆粒(leyer et al.,J Gen.Virol 79,683-687,1998)。還已報道了這樣的載體,其中采用仙臺F蛋白將鼠白血病病毒轉化為假型(Spiegel et al.,J.Virol 72,5296-5302,1998)。目前還報道了通過ASG-R的調節(jié)將胰蛋白酶分解的F蛋白特異性地靶向作用于肝細胞(Bitzer et al.,J.Virol.71,5481-5486,1997)。前一報道是瞬間顆粒形成系統(tǒng),但它難以持續(xù)地回收載體顆粒。雖然Spiegel等人已報道采用仙臺F蛋白將后病毒載體轉變?yōu)榧傩?,但這種方法帶來了其固有一些問題如后病毒僅將基因引入到有絲分裂細胞中。本發(fā)明中采用共FHN缺陷的SeV病毒基因組回收該病毒顆粒,而且僅有作為包膜蛋白的F蛋白是能夠在細胞質中自主地復制而不管細胞有絲分裂的有效RNA載體。它們是新的病毒顆粒,并且是便于大量生產的實用系統(tǒng)。
從FHN缺陷的SeV基因組中重建和擴增病毒已成功建立從克隆該病毒基因組的cDNA中為許多單鏈負鏈RNA病毒如仙臺病毒、麻疹病毒重建傳染性病毒顆粒的技術。
在大部分的這些系統(tǒng)中,通過往細胞中引入已在T7啟動子的下游引入cDNA、NP、P和L基因的質體,并采用T7聚合酶表達cDNA和各基因而進行重建。為提供T7聚合酶,主要采用表達T7聚合酶的重組牛痘病毒。
表T7的牛痘病毒可以在大部分的細胞中有效地表達T7聚合酶。雖然,由于牛痘病毒誘發(fā)的細胞毒性,被感染的細胞僅可存活2或3天。在大部分的情況下,將利福平用作一種抗疫苗試劑。在Kato等人的系統(tǒng)中(Kato,A.et al.,Genes cellsl,569-579(1996)),同時使用Arac和利福平以將牛痘病毒生長抑制到最低水平,并有效地重建仙臺病毒。
除了仙臺病毒,檢查腺病毒作為提供T7聚合酶的一種方法,但沒有獲得良好的效果。牛痘病毒編碼在細胞質內作用的RNA封端酶作為除了T7聚合酶之外的自身的酶,但是認為該酶通過將在細胞質內由T7啟動子轉錄的RNA封端而增強翻譯的效率。本發(fā)明試圖采用補骨脂素-長波UV方法處理牛痘病毒而增強仙臺病毒的重建效率,從而避免由牛痘病毒引起的細胞毒性。
通過與補骨脂素交聯(lián)的DNA和長波紫外光線,可以獲得這樣一種狀態(tài),其中具有DNA基因組的病毒的復制被抑制,同時又不特別影響早期基因表達。在該系統(tǒng)中通過活化這些病毒而觀察到的顯著效果歸功于具有長基因組的牛痘病毒(Tsung,K.et al.,J Virol 70,165-171(1996))。
在可以自主繁殖的野生型病毒的情況下,即使是通過重建而形成的單一病毒顆粒,也可以通過將被轉染的細胞接種到含胚雞蛋中而繁殖仙臺病毒。因此不必多加考慮重建和該仙臺牛痘病毒的效率。
但是,在重建各種用于研究病毒復制、顆粒形成機理等的突變型病毒的情況下,人們不得不使用表達來自病毒等而不是含雞蛋的蛋白的細胞系,以繁殖該病毒。而且,很可能該突變型病毒或缺陷病毒的繁殖明顯比野生型病毒慢。
為了采用這種突變體繁殖仙臺病毒,應將被轉染的細胞加到其下一代的細胞上并長期培養(yǎng)。在這種情況下,重建效率和牛痘病毒的殘留滴定度可能是未定的。在本發(fā)明的方法,成功地減少了存活的牛痘病毒的滴定度,同時提高了重建的效率。
采用本發(fā)明的方法,可以通過重建(F,F(xiàn)HN缺陷的病毒)而成功地獲得在先前的系統(tǒng)中采用未處理的牛痘病毒而未能得到的突變型病毒。本發(fā)明的系統(tǒng)可以是可能在未來更多采用的重建突變型病毒的強大武器。因此,本發(fā)明者檢查了補骨脂素的數(shù)量和紫外光線(UV),以及牛痘病毒滅活的條件。
<實驗>
首先,采用固定的2分鐘照射時間測試補骨脂素的濃度。通過以下方法測試滅活由噬斑形成來測定牛痘病毒的滴定度,在T7啟動子和仙臺病毒的微基因組的控制下由pGEM-Luci質體測定T7聚合酶的活性。仙臺病毒的微基因組的T7聚合酶活性的測定是這樣一個系統(tǒng)其中與仙臺病毒的微基因組質體和通過T7表達仙臺病毒的Np-、P-和L-蛋白的pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L質體同時轉染細胞,以檢查在形成核糖核蛋白復合體之后采用仙臺病毒的RNA聚合酶轉錄螢蟲素酶蛋白。
在2分鐘的UV照射之后,觀察到取決于補骨脂素濃度的牛痘病毒的滴定度降低。但是,對于至多0、0.3和1μg/ml的補骨脂素濃度來說,T7聚合酶的活性沒有改變,但在10μg/ml時大約降低到1/10(圖28)。
進一步地,通過將補骨脂素的濃度固定于0.3μg/ml而檢查UV照射時間。與照射時間增加一致的是,牛痘病毒的滴定降低,雖然直到30分鐘的照射沒有發(fā)現(xiàn)對T7聚合酶活性的影響。在這種情況下,在0.3μg/ml和30分鐘的照射的條件,在不影響T7聚合酶活性的情況下滴定度被降低到1/1000(圖29)。
但是,在滴定度降低至1/1000的牛痘病毒中,在moi=2處的感染24小時后校正至預處理滴定(moi=0.002作為在處理后的殘留滴定度)的CPE與在moi=2處感染的非處理的病毒沒有不同(圖30)。
采用在上述條件下處理的牛痘病毒,檢查仙臺病毒的重建效率。采用下述的方法,修正的上述的Kato等人的方法進行重建。將LLC-MK2細胞以3×106細胞/孔的濃度播種到6-孔微板上,并在培養(yǎng)過夜后,在PLWUV處理之間將牛痘病毒稀釋到校準的6×105pfu/100μl,并將其感染PBS洗滌的細胞。在感染1小時以后,分別加入100μl的OPTI-MEM和1、0.5、1和4μg的質體pGEM-NP、P、L和cDNA,進一步加入10μlSuperfect(QIAGEN),并在室溫下放置15分鐘,在加入1ml的OPTI-MEM(GIBCO)(含Rif.和AraC)之后,將其覆蓋到這些細胞上。
在轉染的2、3和4天之后,回收細胞,將其離心并懸浮在300μl/孔的PBS上。將100μl含有由其自身懸浮液或通過稀釋該懸浮液10或100倍而制備的溶液的細胞接種到飼養(yǎng)10天后的含胚雞蛋中,有4個雞蛋用于各種稀釋(分別為1×105、1×104和1×103細胞)。3天后,從蛋中回收尿囊液并通過HA試驗檢查病毒的重建(表1)。對于分別用1×105、1×104和1×103細胞接種的蛋,給具有HA活性的蛋打分為1點、10點和100點,從而計算重組計分(圖31)。公式如表1所示。
表1牛痘病毒的UV處理持續(xù)時間對仙臺病毒重建效率的影響
重建打分=(a1+a2+a3)×b而且,在細胞內轉染的2、3和4天以后的牛痘病毒的殘留滴定度比處理組的要小,并與在轉染之前的給定的滴定度成正比(圖32)。
采用PLWUV滅活牛痘病毒,可以將滴定度降低到1/1000而不影響T7聚合酶的活性。但是,來自牛痘病毒的CPE在顯微觀察下并沒有不同于高100倍滴定度的未處理病毒的CPE。
利用由上述用于重建仙臺病毒的條件處理的牛痘病毒重建效率提高了10-100倍(圖31)。同時,轉染后牛痘病毒的殘留滴定度不為5pfu/105細胞或更大。因此,可復制的牛痘病毒的存活率保持在0.005%或更小。
假型仙臺病毒的重建<1>制備引入VSV-G基因產物的輔助細胞因為VSV-G基因產物具有細胞毒性,采用質體pCALNdLG(Arai T.etal.,J.Virology 72(1998)p1115-1121)在LLC-MK2細胞中建立穩(wěn)定的轉變,其中VSV-G基因產物可由Cre重組酶產生。根據(jù)附屬的手冊,采用磷酸鈣方法(CalphosTMMammalian轉染試劑盒,Clontech)完成將質體引入到LLC-MK2細胞中。
將10微克的質體pCALNdLG引入到在10cm的培養(yǎng)皿中生長到60%融合的LLC-MK2細胞中。在5%的CO2的保溫箱中用10ml MEM-FBS 10%的培養(yǎng)液,于37℃下培養(yǎng)該細胞24小時。
24小時后,刮去細胞,將其懸浮在10ml的培養(yǎng)液中;然后采用5個10cm的培養(yǎng)皿,1、2和2個皿分別播種5ml、2ml和0.5ml。
然后在10ml含有1200μg/ml的G418(GIBCO-BRL)的10%的MEM-FCS 10%的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14天,同時隔于改換培養(yǎng)液以選擇穩(wěn)定的轉化。采用克隆環(huán)中移取28個在培養(yǎng)物中生長的抗G418的克隆。在10cm的平板中將每一克隆擴散至融合。
對于每一克隆,在用含有Cre重組酶的重組腺病毒AxCANCre進行感染之后,通過上述的Western印跡法,采用抗-VSV-G單克隆抗體檢查VSV-G的表達。
各克隆在6cm的培養(yǎng)皿中生長至融合,之后采用Saito等人的方法在MOI=10處感染腺病毒AxCANCre(參見以上),并培養(yǎng)3天。在除去培養(yǎng)上清液以后,用PBS洗滌這些細胞,加入0.5ml含有0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA(乙二胺四乙酸)的PBS從該培養(yǎng)物中分離該細胞,并在37℃下培養(yǎng)5分鐘。在將這些細胞懸浮在3ml的PBS中以后,在1500xg下離心五分鐘來收集這些細胞。將收集到的細胞再次懸浮在2ml的PBS中,然后在1500x g下離心五分鐘來收集細胞。
可以在-20℃下保存細胞且根據(jù)需要可將其融化。將收集到的細胞溶解于100μl的細胞溶解液中(RIPA緩沖劑,Boehringer Mannheim),并采用這些細胞的全蛋白(1×105細胞每通道)進行Western印跡法。將細胞溶解產物溶于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試樣緩沖劑(含有6mMTris-HCL(PH6.8)、2%SDS、10%甘油、5%的2-氫硫基乙醇的緩沖劑),并使其在95℃下加熱5分鐘后作為電泳的試樣。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Multigel 10/20,Daichi Pure Chemicals Cl.,Ltd)通過電泳分離試樣,然后通過半干燥印跡法將分離的蛋白轉移到轉移膜(Immobilon-P轉移膜;微孔)。在恒定的電流1mA/cm2下在已在100%甲醇中浸泡30秒,然后在水中浸泡30分鐘的轉移膜上進行轉移1小時。
在40ml的阻斷溶液中搖晃該轉移膜(BlockAce;Snow BrandMilkProducts)1小時,并在PBS中洗滌一次。
將該轉移膜和5ml已被含有10%阻斷溶液的PBS稀釋的抗-VSV-G抗體(克隆P4D4,Sigma)封裝于乙烯袋中并在4℃靜置。
將該轉移膜兩次浸泡在40ml的PBS-0.1%Tween20中5分鐘,并在洗滌之后在PBS浸泡5分鐘以進行洗滌。
將該轉移膜和5ml在含有10%的阻斷溶液中稀釋至1/2500的用過氧化酶標記的抗小鼠IgG抗體(抗小鼠免疫球蛋白,Amersham)封裝于乙烯袋中并在室溫下?lián)u晃1小時。
在搖晃后,將該轉移膜兩次浸泡在PBS-0.1%Tween 20中5分鐘,并在洗滌后將其浸泡在PBS中5分鐘以進行洗滌。
采用發(fā)光法(ECL Western印跡法檢測試劑,Amersham)檢測與抗VSV-G抗體交叉反應的膜上的蛋白。結果表示為圖33。三種克隆表現(xiàn)出AxCANCre感染特異性VSV-G表達,確認了可以引入VSV-G基因產物的LLC-MK2細胞的形成。
采用抗VSV抗體對所獲得的克隆中一種稱為LLCG-L1的克隆進行流式血細胞計斷分析(圖34)。結果是,在LLCG-L1中檢測到具有對VSV-G基因引入的抗體特異性的反應活性,確認在該細胞表面表達VSV-G蛋白。
<2>采用輔助細胞制備含有F基因缺陷的假型仙型病毒將含有F基因缺陷的基因組的仙臺病毒感染表達VSV-G基因的細胞,并采用上述實施例中所述的含有GFP基因的F缺陷仙臺病毒來檢查是否可觀觀察到具有VSV-G的假型的病毒的產物。結果是,在沒有感染含有Cre重組酶的重組腺病毒AxCANCre的LLCG-L1中,通過F缺陷仙臺病毒的感染引入了病毒基因并檢測到了表達GFP的細胞,雖然表達細胞的數(shù)量沒有增加。在VSV-G引入的細胞中,發(fā)現(xiàn)表達GFP的細胞的按時間順序增加。當進一步向最新的VSV-G引入的細胞中加入1/5的上清液時,在前一上清液中中沒觀察到引入,而在后一上清液中發(fā)現(xiàn)表達GFP的細胞的增加和基因的引入。而且在往沒有引入VSV-G的LLCG-L1細胞中加入后一上清液的情況下,引入了基因,但沒有觀察到表達GFP的細胞增加。綜上所述,已發(fā)現(xiàn)對表達VSV-G的細胞具有特異性的病毒的繁殖,并發(fā)現(xiàn)具有VSV-G的假型F缺陷的病毒的形成。
<評價用于產生具有F基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒>
改變AxCANCre感染(MOI=0、1.25、2.5、5和10)的數(shù)量而感染某一數(shù)量的具有F缺陷基因組的假性類型仙臺病毒,并在第7或第8天回收培養(yǎng)上清液。然后在引入VSV-G之前或之后將該上清液感染這些細胞,并在5天后比較表達GFP細胞的數(shù)量以觀察VSV-G基因表達數(shù)量的效果。結果是,在MOI=0處沒有發(fā)現(xiàn)病毒產物并在MOI=10處發(fā)現(xiàn)最大產物(圖35)。此外,在分析病毒生產的時間過程時,從第5天起或之后,該生產水平開始增加,持續(xù)到第8天(圖36)。在用連續(xù)稀釋(每次10倍)的病毒溶液感染仍未用VSV-G引入的細胞5天后通過計算表達GFP的細胞,計算在該病毒溶液(CIU)中感染病毒的顆粒的數(shù)量,從而完成對病毒滴定度的測定。結果是,發(fā)現(xiàn)最大的病毒產量為5×105CIU/ml。
<抗-VSV抗體對具有F基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒的傳染性的影響>
關于采用表達VSV-G的細胞的而獲得的F基因缺陷的基因組的假型仙臺病毒在該殼體中是否含有VSV-G蛋白,采用抗-VSV抗體評價是否影響傳染性的中和活性?;旌喜《救芤汉涂贵w并至少在室溫下靜置30分鐘,然后感染沒有引入VSV-G的細胞。在第5天,采用表達GFP的細胞的存在檢查基因引入能力。結果,采用抗-VSV抗體觀察到了極佳的傳染性抑制作用,而在具有原始殼體的F基因缺陷的基因組的仙臺病毒中,沒有觀察到該抑制作用(圖37)。因此,它清楚地表明所得的病毒為在其殼體中含有VSV-G蛋白的假型仙臺病毒,其中可以采用抗體特殊地抑制該病毒的傳染性。
<5>確認假型仙臺病毒含有F缺陷基因組對受感染的細胞提取進行Western印跡法分析以檢查在表達VSV-G基因的細胞中繁殖的病毒是否是F缺陷類型。采用上述的方法完成Western分析。作為基本抗體,采用由兔制備的抗-仙臺病毒多克隆抗體、由小鼠制備的抗-F蛋白單克隆抗體和由小鼠制備的抗-HN蛋白單克隆抗體。作為第二抗體,在抗仙臺病毒多克隆抗體的情況下采用過氧化酶標記的抗-兔IgG抗體,而在抗-F蛋白單克抗體和抗-HN蛋白單克隆抗體的情況下采用過氧化酶標記的抗-小鼠IgG抗體。結果是,沒有檢測到F蛋白,而檢測到來自仙臺病毒的蛋白的HN蛋白,確認它是F缺陷的類型。
<6>利用輔助細胞由F和HN基因缺陷的基因組制備假型仙臺病毒采用與以上述實施例類的方法,在采用GFP基因表達作為指示劑和含有在以上實施例中所述的GFP基因的F和HN基因缺陷的仙臺病毒分析具有F和HN基因缺陷的基因組的仙臺病毒對表達VSV-G基因的LLCG-L1細胞的感染之后,觀察在其衣殼中具有VSV-G的假型病毒的產生。結果是,觀察到對表達VSV-G的細胞特異性的病毒繁殖,而并觀察到具有VSV-G的假型F和HN缺陷的仙臺病毒的的產生(圖38)。通過在用連續(xù)(每次10倍)稀釋的病毒溶液感染未引入VSV-G的細胞以后計算表達GFP的細胞,計算感染病毒溶液中的細胞(CIU)的顆粒數(shù)量,從而完成對病毒滴定度的測定。結果是,最大病毒產量為1×106CIU/ml。
<7>確認假型仙臺病毒含有F和HN缺陷的基因組對受感染的細胞提取進行Western印跡法以分析在表達VSV-G基因的細胞中繁殖的病毒是否是F和HN缺陷的類型。結果是,沒有檢測到F和HN蛋白,而檢測到來自仙臺病毒的蛋白的HN蛋白,確認它是的F和HN缺陷的類型(圖39)。
分析病毒重建的方法<常規(guī)方法>
將LLC-MK2細胞以5×106細胞/皿播種到100mm的培養(yǎng)皿中。24小時培養(yǎng)后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌一次,然后在室溫下用表達T7 RNA聚合酶的重組牛痘病毒感染(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126 1986)(vTF7-3)1小時(moi=2)(moi=2-3,優(yōu)選采用moi=2)。用3μg/ml的補骨脂素和長波紫外光線(365nm)預處理這里所用的病毒5分鐘。將質體pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato,A.et al.,Genes cells 1,569-579(1996))分別懸浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培養(yǎng)液(GIBCO)中。然后,加入SuperFect轉染試劑(1μgDNA/5μl,QIAGEN),并將其在室溫下靜置15分鐘,加入3ml含有3%FBS的opti-MEM培養(yǎng)液。然后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌該細胞兩次,并加入DNA-SuperFect混合物。在3小時的培養(yǎng)之后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌兩次,并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC,Sigma)的MEM中培養(yǎng)70小時。收集細胞和培養(yǎng)上清液作為P0-d3試樣。將P0-d3顆粒懸浮在opti-MEM培養(yǎng)液(107細胞/ml)。將它們冷凍-融解三次,然后與脂轉染試劑DOSPER(Boehringer Mannheim)(106細胞/25μl DOSPER)混合,并使其在室溫下靜置15分鐘。然后轉染表達F的LLC-MK2/F細胞(在24孔平板為106細胞/孔),用不含血清的MEM培養(yǎng)液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)培養(yǎng)該細胞。在第3和第7天回收培養(yǎng)上清液,并將它們指定為P1-d3和P1-d7試樣。
<覆蓋表達包膜質體+F的細胞的方法>
與如述進行類似的轉染,除了加入4μg/皿的包膜質體pGEM/FHN。在3小時的培養(yǎng)之后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌細胞兩次,并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC;Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶的MEM中培養(yǎng)48小時。在除去培養(yǎng)上清液以后,往細胞覆蓋用不含血清的MEM懸浮的表達F的LLC-MK2/F7細胞的100mm皿中的5ml細胞懸浮液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)。在48小時培養(yǎng)之后,回收細胞和上清液并將其指示為P0-d4試樣。將P0-d4顆粒懸浮在opti-MEM培養(yǎng)液(2×107細胞/ml)并冷凍-融解三次。然后用該懸浮液(2×106細胞/孔,24-孔平析)并在不含血清的MEM培養(yǎng)液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第3天和第7天回收培養(yǎng)上清液,將其指示為P1-d3和Pa-d7試樣。作為對照,采用上述相同的方法進行實驗,但不進行覆蓋,且僅加入該包膜質體。
<通過計算表達GFP的細胞(GFP-CIU)來測定CIU(細胞感染單元)>
將LLC-MK2細胞以5×106細胞/皿播種到12孔平板上。在24小時培養(yǎng)后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌一次。然后用100μl/孔的適宜稀釋的上述試樣(P0-d3或P0-d4,P1-d3和P1-d7)感染該細胞,其中該試樣被稀釋至在10cm2上含有10-100陽性細胞。15分鐘以后,加入1ml/孔的不含血清的MEM培養(yǎng)液,并在進一步的24小時以后,在熒光顯微鏡下觀測細胞以計算表達GFP的細胞。
<測定CIU(細胞感染單元)>
將LLC-MK2細胞以5×106細胞/皿播種到12孔平板上。在24小時培養(yǎng)后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌一次。然后用100μl/孔的上述試樣感染該細胞,其中將所含的病毒載體指示為SeV/ΔF-GFP。15分鐘以后,加入1ml/孔的不含血清的MEM培養(yǎng)液,并進一步培養(yǎng)24小時。在該培養(yǎng)后,用PBS(-)洗滌該細胞3次并在室溫下靜置大約10分鐘至15分鐘而將其干燥。為固定細胞,加入1ml/孔的乙酮并立即除去乙酮,然后再次通過將細胞于室溫下靜置大約10分鐘至15分鐘而將其干燥。往細胞中加入300μl/孔的由兔制得并由PBS(-)作100倍稀釋的抗-SeV多克隆抗體(DN-1),并在37℃培養(yǎng)45分鐘。在用PBS(-)洗滌三次以后,在熒光顯微鏡下觀測該細胞(發(fā)射560nm,吸收645nm濾光器,Leica)以發(fā)現(xiàn)熒光細胞(圖40)。
作為對照,以100μl/孔感染上述的試樣(SeV/ΔF-GFP),并在15分鐘之后加入1ml/孔的不含血清的MEM,在24小時的培養(yǎng)之后,在熒光顯微鏡下觀測細胞(發(fā)射360nm,吸收470nm濾光器,Leica)以培養(yǎng)之后不進行處理而發(fā)現(xiàn)表達GFP的細胞。
評價用于提高缺陷類型的仙臺病毒受體的重建效率的最適宜的牛痘病毒(vTF7-3)PLWUV(補骨脂素和長波UV光線)處理條件將LLC-MK2細胞以5×106細胞/皿播種到100mm的培養(yǎng)皿中。24小時培養(yǎng)后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌一次,然后在室溫下用表達T7 RNA聚合酶的重組牛痘病毒(vTF-3)(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126(1986)感染該細胞1小時(moi=2)(moi=2-3,優(yōu)選采用moi=2)。用0.3-3μg/ml的補骨脂素和長波紫外光線(365nm)預處理該病毒2-20分鐘。將質體pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato,A.et al.,Genes cells 1,569-579(1996))分別懸浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培養(yǎng)液(GIBCO)中。然后,加入SuperFect轉染試劑(1μgDNA/5μl,QIAGEN),并將其在室溫下靜置15分鐘,加入3ml含有3%FBS的opti-MEM培養(yǎng)液。然后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌該細胞兩次,接著加入DNA-SuperFect混合物。在3小時的培養(yǎng)之后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌兩次,并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC,Sigma)的MEM中培養(yǎng)48小時。用熒光顯微鏡觀測100mm培養(yǎng)皿中的大約1/20的視場并計算表達GFP的細胞。為了測試牛痘病毒(vTF-3)的滅活,采用噬斑形成(Yoshiyuki Nagai et al.,virus experimentprotocols,p291-296,1995)進行滴定測試。
進一步地,將轉染后的回收時機固定在第3天,檢查補骨脂素和UV照射的時間。采用用各個PLWUV處理的牛痘病毒(vTF7-3)檢查仙臺病毒重建的效率。采用修正的上述的Kato等人的方法,即下述的方法進行重建。將LLC-MK2細胞以5×105細胞/孔的濃度播種到6-孔微板上,并在培養(yǎng)過夜后(認為細胞生長至1×106細胞/孔),在PLWUV處理之前用稀釋的計算滴定度為2×106pfu/100μl的牛痘病毒(vTF-3)感染用PBS洗滌的細胞。在感染1小時以后,分別加入50μl的OPTI-MEM和1、0.5、1和4μg的質體pGEM-NP、P、L和cDNA,進一步加入10μlSuperfect(QIAGEN),并在室溫下放置15分鐘。然后加入1ml的Opti-MEM(含40μg/ml的AraC)并將其覆蓋到這些細胞上。
在轉染三天之后回收細胞,然后將其離心并懸浮在100μl/孔的PBS上。將懸浮液稀釋到10、100箅1000倍,并將100μl含有所得細胞溶液接種到飼養(yǎng)10天后的含胚雞蛋中,有3個雞蛋用于各種稀釋(分別為1×105、1×104和1×103細胞)。3天后,從蛋中回收尿囊液并通過HA試驗檢查病毒的重建(表1)。為了計算重建效率,對于分別用1×105、1×104和1×103細胞接種的具有HA活性的蛋分別計算為1點、10點和100點。
<結果>
實施例12和13的結果如在圖40-43和表2所示。表達質體的包膜和細胞覆蓋的組合提高了SeV/ΔF-GFP的重建效率。在P0的d3-d4(第3天到第4天)(在傳代培養(yǎng)之前)獲得明顯的改進。在表2,在轉染3天后用細胞培養(yǎng)雞蛋。在用0.3μg/ml的補骨脂素處理20分時,在第3天獲得了最高的重建效率。因此,認為這些條件是最佳條件(表2)。
表2牛痘病毒的PLWUV處理對仙臺病毒重建的影響
重建打分=(a1+a2+a3)×b[實施例14]制備含有LacZ、F缺陷、不含GFP的仙臺病毒載體<F缺陷型、含LacZ基因的SeV載體的cDNA的構建>
為了在存在于實施例1(pSeV(+18LacZ))/ΔF)中所述的pSeV18+/ΔF的基因上游區(qū)域存在的NotI限制位點中構建帶有LacZ基因的cDNA,采用PCR擴增LacZ基因。通過以下途徑進行PCR調整LacZ基因至達到6的倍的數(shù)(Hausman,S et al.,RNA 2,1033-1045(1996),并使用帶有NotI限制位點的引物(5’-GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTTACTTTGACCAA-3’/SEQ ID NO17)作為5’端,采用帶有轉錄終止信號SeV(E)、間插序列(I)、轉錄起始信號(S)和NotI限制位點的引物(5’-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGCTATTACTTCTGACACCAGACCAACTGGTA-3’/SEQ IDNO18)作為3’末端,采用PCMV-β(Clontech)作為模板。反應條件如下取50ng的PCMV-β、200μM的dNTP(Pharmacia Biotech)、100pM的引物、4U Vent聚合酶(New England Biolab)與伴隨的緩沖液混合。循環(huán)25次的反應溫度94℃30秒、50℃2分鐘、72℃2分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳產物。純化后切割3.2kb片斷并用NotI消化。通過NotI消化的pSeV18+/ΔF片段連接就得到pSeV(+18=LacZ//ΔF)。
<常規(guī)方法>
將LLC-MK2細胞以5×106細胞/皿播種到100mm的培養(yǎng)皿中。24小時培養(yǎng)后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌一次,然后在室溫下用表達T7 RNA聚合酶的重組牛痘病毒感染(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126 1986)(vTF7-3)1小時(moi=2)(moi=2-3,優(yōu)選采用moi=2)。用3μg/ml的補骨脂素和長波紫外光線(365nm)預處理這里所用的病毒5分鐘。將含有LacZ、F缺陷型仙臺病毒載體cDNA(pSeV(+18=LacZ//ΔF)、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato,A.etal.,Genes cells 1,569-579(1996))分別懸浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培養(yǎng)液(GIBCO)中。再加入4μg/皿的pGEM/FHN包被的質粒和SuperFect轉染試劑(1μg DNA/5μl,QIAGEN),并將其在室溫下靜置15分鐘,加入3ml含有3%FBS的opti-MEM培養(yǎng)液。然后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌該細胞兩次,并加入DNA-SuperFect混合物。在3小時的培養(yǎng)之后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌兩次,并在含有40μg/ml的胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC,Sigma)和7.5μg/ml的MEM中培養(yǎng)24小時。
在除去培養(yǎng)上清液以后,往細胞覆蓋用不含血清的MEM懸浮的表達F的LLC-MK2/F7細胞的100mm皿中的5ml細胞懸浮液(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)。在48小時培養(yǎng)之后,回收細胞和上清液并將其指示為P0-d4試樣。將P0-d4顆粒懸浮在opti-MEM培養(yǎng)液(2×107細胞/ml)并冷凍-融解三次。用脂轉染試劑DOSPER(BoehringerMannheim)(106細胞/25μl DOSPER)混合這些細胞,并使其在室溫下靜置15分鐘。然后轉染表達F的LLC-MK2/F細胞系(在12孔平板為106細胞/孔),在不含血清的MEM(含40μg/ml的AraC和7.5μg/ml的胰蛋白酶)中培養(yǎng)該細胞。在第7天回收培養(yǎng)上清液,并將其指示為Pa-d7試樣,并且用所有上清液在37℃、1小時的條件下感染播種在12孔板平板上的表達F的LLC-MK2/F7細胞系。然后用MEM培養(yǎng)液洗滌一次,用不帶血清的MEM培養(yǎng)液(含40μg/ml的Arac和7.5μg/ml的胰蛋白酶)培養(yǎng)該細胞。第七天收集上清培養(yǎng)液,并將其指示P2-d7細胞系,然后用MEM培養(yǎng)液洗滌一次,用不帶血清的MEM培養(yǎng)液(含7.5μg/ml的胰蛋白酶)培養(yǎng)該細胞,七天收集上清液,將其指示為P3-d7試樣。繼續(xù)用所有上清液在37℃、1小時的條件下感染播種在12孔板平板上的表達F的LLC-MK2/F7細胞系。用MEM培養(yǎng)液洗滌一次,用不帶血清的MEM培養(yǎng)液(含7.5μg/ml的胰蛋白酶)培養(yǎng)該細胞,七天收集上清液,將其指示為P4-d7試樣。
<計算LacZ-表達細胞以沉淀CIU(LacZ-CIU)>
將LLC-MK2細胞以2.5×106細胞/皿播種到100mm的培養(yǎng)皿中。用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌一次,然后用每次10倍的連續(xù)稀釋的P3-d7溶液37℃感染該細胞1小時,再用MEM培養(yǎng)液洗滌細胞一次,加入含有10%血清的MEM培養(yǎng)液1.5ml。37℃下培養(yǎng)3天后,用β-半乳糖染色試劑盒(Invitrogen)染色細胞,平行三次實驗結果顯示在圖44。計算LacZ顯然細胞的結果顯示在任何情況下,P3-d7試樣均得到1×106CIU/ml病毒量。
利用仙臺病毒的極性作用調節(jié)基因表達水平<SeV基因組cDNA的構建>
在仙臺病毒的全部基因組cDNA長度中加入額外的NotI倍點,即pSeV(+)(Kato,A.et al,Genes to cells569-579,1996),夾在起始信號和各個基因的ATG轉錄起始信號之間。特別地,用SPHI/SalI(2645bp),ClaI/ECoRI(5146bp)消化過的pSEV(+)的各片斷經瓊脂糖凝膠電泳分離,各相應電泳帶被挑出,利用QIAEXII凝膠提取系統(tǒng)(QIAGEN)收集、純化各片斷,如圖45A所示。用ClaI/ECoRI消化的片斷、ClaI消化的片斷和ClaI/ECoRI消化的片斷分別與LITMUS38(NEW ENGLANDBIOLABS)、pBluescriptII KS+(STRATAGENE)和pBluescriptKSt(STRATAGENE)相連,用于亞克隆,用Quickchange site-DirectedMutagenesis試劑盒(STRATAGENE)來連續(xù)導入NotI位點,每次導入所用的引物分別為對于NP-P是反義鏈5′-ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3′(SEQ ID NO;19),反義鏈5′-ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3′(SEQ ID NO20);對于P-M是反義鏈5′-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcagatatctatag-3′(SEQ ID NO21),反義鏈5′-ctatagatatctgccattgcggccgcttaggtgaaatttc-3′(SEQ ID NO22),對于M-F是反義鏈5′-gggataaagtcccttgcggccgcttggttgcaaaactctcccc-3′(SEQ ID NO23),反義鏈5′-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3′(SEQ ID NO24);對于F-HN是反義鏈5′-ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3′(SEQ ID NO25),反義鏈5′-ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3′(SEQ IDNO26);對于HN-L是反義鏈5′-cctgcccatccatgacctagcggccgcttcccattcaccctggg-3′(SEQ ID NO27)和5′-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3′(SEQ ID NO28)。
至于模板分別為NP-P的SalI/SphI片斷,RM和PF的ClaI片斷、FHN和HN-L的Clai/FCoRI片斷,如上所述被亞克隆。采用QuickchangeSite-Directed Mutagenesis試劑盒方案進行導入。用亞克隆所用的酶再一次消化產物,收集純化,然后被組裝入仙臺病毒基因組cDNA。于是,在每個基因之間導入了NotI位點的五種仙臺病毒基因組cDNA(pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FHN和pSeV(+)HNL)構建完成,如圖45B所示。
人類分泌型堿性磷酸酶(SEAP)通過PCR亞克隆作為報道基因來檢測基因表達水科。引物為5’引物5′-gcggcgcgccatgctgctgctgctgct9ctgctgggcctg-3′(SEQ ID NO29)和3’引物5′-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagcggccggccg-3′(SEQ ID NO30)。加入ASCI限制位點共同合成,再進行PCR。使用PSEAP Basic(LONTECH)作為模板,Pfu Eurbo DNA聚合酶(STRATAGENE)作為酶。PCR后,產物經過ASCI消化,再通過電泳回收純化。在pBluescriptIIKS+的NotI位點摻入合成的雙鏈DNA(反義鏈5′-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3′(SEQ ID NO31),反義鏈5′-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggatttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3′(SEQ ID NO32),該雙鏈DNA含有多克隆位點)PmeI-ASCI-SwaI)和終止信號-間插序列-起始信號,這樣就構建完成要亞克隆的質粒(圖46)。PCR產物收集、純化后,連接并克隆得到質粒AscI位點。產物經過NotI消化,并且SEAP基因片斷通過電泳回收、純化,分別連接到5種類型的仙臺病毒基因組cDNA和pSeV18+的NotI位點上。得到的病毒載體分別指示為pSeV(+)NPP/SEAP、pSeV(+)PM/SEAP、pSeV(+)MF/SEAP、pSeV(+)FHN/SEAP、pSeV(+)HNL/SEAP和pSeV(+)/SEAP。
將LLC-MK2細胞以5×106細胞/皿播種到100mm的培養(yǎng)皿中。24小時培養(yǎng)后,在室溫下用表達T7 RNA聚合酶的重組牛痘病毒(PLWUV-VacT7)感染(Fuerst,T.R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-81261986,Kato A.et al.,Genes cells1569-579,1996)1小時(moi=2)。用補骨脂素和紫外光線預處理所用的病毒,將摻入了SEAP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L的每種仙臺病毒分別分別懸浮在12μg、4μg、2μg和4μg/皿的比率的opti-MEM培養(yǎng)液(GIBCO)中。然后加入110μl的SuperFect轉染試劑(QIAGEN),并將其在室下靜置15分鐘,加入3ml含有3%FBS的opti-MEM培養(yǎng)液。然后洗滌細胞,加入DNA-SuperFect混合物,經3-5小時培養(yǎng)后,用不含血清的MEM培養(yǎng)液洗滌細胞2兩次,然后在含有胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC;Sigma)的MEM中培養(yǎng)72小時。收集細胞,顆粒懸浮于1ml的PBS中,冷凍融化三次。取100μl產物接種于已預溫育10天的雞蛋中,再繼續(xù)在35℃下溫育3天后,從蛋中回收尿囊液,將回收的尿囊液稀釋至10-5-10-7,再重新接種于雞蛋以使其不含有牛痘疫苗。然后同樣地回收并分別分成小份貯存在-80℃下。病毒載體被指示為SeVNPP/SEAP、SeVPM/SEAP、SeVMF/SEAP、SeVFHN/SEAP、SeVHNL/SEAP和SeV18/SEAP。
<噬菌斑分析測定滴定>
CV-1細胞以5×106細胞/孔播種于6孔平板并培養(yǎng)24小時,用PBS洗滌細胞,然后將由BSA/PBS(含1%BSA的PBS)稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的重組SeV與細胞溫育小時,再用PBS洗滌,然后覆蓋以3ml/孔的BSA/MEM瓊脂糖(0.2%BSA+2×MEM,與等體積的2%的瓊脂糖混勻,在37℃,0.5%的CO2條件下培養(yǎng)6天,然后加入3ml乙醇/乙酸(乙醇∶乙酸=1∶5),再靜置3小時,然后去除瓊脂糖,用PBS洗滌3次后,與稀釋100倍的兔抗仙臺病毒抗體在室溫下溫育1小時,然后用PBS洗滌三次,細胞與稀釋200倍的Alexa Flour TM標記的羊抗兔Ig(G+H)(分子探針)室溫下溫育1小時,再用PBS洗滌三次,通過魯米諾-顯像分析儀LAS1000(FujiFilm)可以看到熒光影像,計算噬菌斑。結果如圖47。此外,滴定實驗結果顯示在表3中。
表3噬菌斑分析每種重組仙臺病毒的滴度結果重組病毒滴定(pfu/ml)SeV18/SEAP 3.9×109SeVNPP/SEAP4.7×108SeVPM/SEAP 3.8×109SeVMF/SEAP 1.5×1010SeVFHN/SEAP7.0×109SeVHNL/SEAP7.1×109<報道基因表達的對比>
將LLC-MK2細胞以5×105細胞/孔播種于6孔板并培養(yǎng)24小時,每種病毒載體以moi=2進行感染,24小時后回收100μl培養(yǎng)上清,采用SEAP分析法,使用報道基因測定試劑盒(Reporter Assay Kit)-SEAP-(Toyobo),并利用魯米諾圖像分析儀LAS1000(Fuji Film)進行測定。
通過缺陷ΔF-HN雙覆蓋的方法提高缺陷SeV的繁殖效率由于目前應用的SeV病毒重建方法采用表達T7RNA聚合酶(Vtf-3)的重組牛痘病毒,通過牛痘病毒的細胞毒性殺死部分感染細胞。而且,病毒只可能在部分細胞中繁殖,優(yōu)選更多的細胞中高效、持久地進行病毒繁殖。但對于副粘病毒,當同種病毒的F和HN蛋白在細胞表面同時存在時發(fā)生細胞融合,形成合胞體(Lamb和Kolakofsky,1996,F(xiàn)ieldsVirology,p1189)。因此,共表達FHN的細胞難以傳代培養(yǎng)。鑒于此,本發(fā)明人認為,可通過將表達被檢測蛋白(F和HN)輔助細胞覆蓋到重建細胞上來提高缺陷病毒的回收率。通過檢查具有不FHN表達時間的覆蓋細胞,顯著得提高共FHN缺陷的病毒的回收率。
室溫條件下,在moi=2處用牛痘病毒處理的PLMUV感染已在10cm培養(yǎng)皿中生長至100%融合的LLC-MK2細胞(1×107細胞/皿)1小時。然后混合12μg/10cm培養(yǎng)皿,4μg/10cm培養(yǎng)皿,2μg/10cm培養(yǎng)皿,4μg/10cm培養(yǎng)皿,4μg/10cm培養(yǎng)皿的分別含有d2EGFP(pSeV18+/ΔFHN-d2GFP(實施例8))、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L,和pGEM/FHN的FHN缺陷的的cDNA(終體積為3ml//10cm培養(yǎng)皿)。用基因導入試劑SuperFect(QIAGEN),以與上述F缺陷細胞重建相類似的方法,將基因引入LLC-MK2細胞,3小時后用無血清的培養(yǎng)基洗滌細胞3次,然后低速離心(1000rpm/2min)回收分離出的細胞,用無血清,但含40μg/mlAraC(Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培養(yǎng)基懸浮細胞,加入細胞中過夜培養(yǎng)。在moi=10處用腺病毒感染單獨制備的在10cm的培養(yǎng)皿中的100%融合FHN共表達細胞,并分別在4小時,6小時,8小時,2天,3天時,用5ml的PBS(-)洗一次,然后用細胞分離試劑(Sigma)分離細胞,低速離心(1000rpm/2min)收集細胞后,懸浮于無血清,但添加了40μg/ml AraC(Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培養(yǎng)基中。將其加入細胞中,F(xiàn)HN共缺陷病毒在所述細胞中重建(P0)培養(yǎng)過夜。覆蓋細胞兩天后,用熒光顯微鏡觀察細胞,以確認細胞中通過GFP表達的病毒的擴散。結果如表49所示。與沒有覆蓋細胞的常規(guī)情況相比(左欄),覆蓋細胞的細胞中觀察到的GFP表達細胞明顯增多(右欄)。回收這些細胞,用每ml Opti-MEM培養(yǎng)基107個細胞的濃度懸浮細胞,反復凍融3次,制備溶胞產物,然后,用106細胞/100μl/孔的溶胞產物感染引入2天后的FHN共表達細胞。在無血清,但添加了40μg/mlAraC(Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培養(yǎng)基,在含5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)兩天。用CIU-GFP檢測P1細胞懸浮培養(yǎng)物中的病毒效價(表4),結果在FHN引入4小時后,未檢測到病毒擴增效應。在引入6小時或6小時以上由于細胞覆蓋,檢測到了明顯的病毒擴增效應,尤其是6小時以上,與未經細胞覆蓋的對照相比,經細胞覆蓋后,釋放到P1細胞懸浮培養(yǎng)物中的病毒數(shù)量可增加10倍以上。
表4通過ΔFHN雙缺陷細胞覆蓋方法擴增缺陷SeVGFP-CIU x103/mlFHN cell+ad/creFHN cell- 4h 6h 8h 2d 3d8-10 6-980-100 70-100 60-100 20-50[實施例17]擁有F缺陷基因組的假型仙臺病毒的確證對感染細胞抽提物中的蛋白進行Western分析以確證由上述VSV-G基因表達增殖的病毒F-缺陷型。結果,檢測到了仙臺病毒的蛋白,未發(fā)現(xiàn)F蛋白,說明該病毒為F缺陷病毒(圖50)。
抗VSV抗體對含有F和HN基因缺陷基因組的假型仙臺病毒感染性的影響為了發(fā)現(xiàn)采用VSV-G表達系所獲得的包含F(xiàn)和HN缺陷基因組的假型仙臺病毒的衣殼是否包含VSV-G蛋白,用抗VSV抗體檢測感染性是否受到影響的中和活性,將病毒溶液與抗體混合,室溫放置30min,然后,用該混合物感染尚未引入抗VSV抗體表達的LLCG-L1細胞。第4天,由GFP表達細胞的存在分析所引入基因的能力。結果,在F和HN缺陷基因組的假型仙臺病毒(圖中VSV-G)中,抗VSV抗體很好地抑制了病毒感染,而包含正常衣殼(圖中F、HN)(圖51)的仙臺病毒中未檢測到抑制現(xiàn)象。從而證明了,本實施例中所獲得的病毒是包含以VSV-G蛋白為其衣殼的仙臺病毒,該抗體可特異地抑制其感染。
由密度梯度超離心法純化含有F-HN基因缺陷基因組的假型仙臺病毒用病毒感染細胞培養(yǎng)物的上清液進行蔗糖密度梯度離心,分級分離并純化包含F(xiàn)基因缺陷及F和HN基因缺陷基因組的假型仙臺病毒,將病毒溶液加到20%-60%梯度的蔗糖溶液中,用SW41轉頭(Beckman)超離心15到16小時,超離心結束后,在管底開一個孔,用分級收集器,收集300μl的分離物,對每一分離物均進行Western分析以驗證所得病毒是以VSV-G蛋白為衣殼,帶有F基因缺陷及F和HN基因缺陷基因組的假型仙臺病毒。Western分析依上述方法進行。結果,對F缺陷的假型仙臺病毒在同一分離物中檢測到了仙臺病毒衍生蛋白,HN蛋白和VSV-G蛋白而未檢測到F蛋白,確證了其是一種F缺陷的假型仙臺病毒。另一方面,對F和HN缺陷的假型仙臺病毒在同一分離物中檢測到了仙臺病毒衍生蛋白,和VSV-G蛋白而未檢測到HN蛋白和F蛋白,確證了其是一種F和HN缺陷的假型仙臺病毒。
帶有F缺陷或F和HN缺陷的假型仙臺病毒的血紅素凝集弱化實驗分別用帶有帶有F缺陷或F和HN缺陷的假型仙臺病毒和帶有正常衣殼的仙臺病毒感染LLC-MK2細胞,第三天,加入1%禽紅細胞懸浮液,4℃放置30min。此后,觀察到感染細胞表面表達了GFP。結果對帶有F基因缺陷基因組的病毒和F缺陷假型仙臺病毒(SeV/ΔF,and pseudotypeSeV/ΔF(VSV-G)by VSV-G)在經感染的細胞表面觀察到了凝集反應。另一方面,在包含F(xiàn)和HN基因缺陷基因組的假型仙臺病毒感染的細胞表面未發(fā)現(xiàn)凝集現(xiàn)象。(SeV/ΔF-HN(VSV-G))(圖53)。
包含F(xiàn)基因缺陷基因組的假型仙臺病毒對培養(yǎng)細胞的感染特異性用流式細胞光度法檢驗病毒感染3天后存活細胞中GFP的表達程度,來測定包含F(xiàn)基因缺陷基因組的VSV-G假型仙臺病毒的感染效率。包含F(xiàn)基因缺陷基因組的假型仙臺病毒對LLC-MK2細胞的感染效率與作為對照的帶有正常衣殼的仙臺病毒對LLC-MK2細胞的感染效率幾乎相同。結果對人卵巢癌HRA細胞上述病毒的感染效率沒有區(qū)別,而對于Jurkat細胞系包含F(xiàn)基因缺陷基因組的假型仙臺病毒的感染效率比對照高出約2倍。(圖54)[實施例22]包含NGF的F缺陷型仙臺病毒載體的構建HGF/SeV/ΔF的構建HGF/SeV/ΔF的構建依上述“包膜質粒+F表達細胞覆蓋方法”完成。利用抗SeV多克隆抗體的方法進行效價的測定。
HGF/SeV/ΔF(RT-PCR)病毒基因組的確認為確證HGF/SeV/ΔF病毒基因組(圖55上欄),將LLC-MK2/F細胞回收的培養(yǎng)物上清液離心,依制造商提供的方法用QIAamp Viral RNAminikit,抽提RNA,以RNA為模板,合成,并用SUPERSCRIPTTMONE-STEPTM RT-PCR系統(tǒng)(GIBCO BRL)進行RT-PCR,用附加類型的SeVCdna(pSeV18+b(+))(Hasan,M.K.等,普通病毒學雜志782813-2820,1997)作為對照組,NGF-N和NGF-C用作PCR引物。NGF-N,正向ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG(序列號SEQ ID NO33),NGF-C,反向ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC(序列號SEQ ID NO34)。結果,室溫條件下,在NGF/SeV/ΔF中檢測到NGF特異的帶。而對照組中沒有檢測到帶。(圖55底欄)[實施例23]NGF蛋白的定量和包含NGF基因的F-缺陷型SeV感染后體外活性表達的測定用在直徑為10cm或6cm的培養(yǎng)皿中長到幾乎融合的LLC-MK2細胞或LLC-MK2/F細胞完成感染和NGF蛋白的表達。NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染LLC-MK2/F細胞,NGF/SeV和GFP/SeV感染LLC-MK2,感染復數(shù)為0.01,在含有7.5μg/ml胰蛋白酶(GIBCO)無血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。3天后,幾乎100%的細胞被感染,更換成無胰蛋白酶和血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天,然后,回收每一培養(yǎng)物的上清液,以48,000xg離心60min。然后進行NGF蛋白的定量和上清液體外活性檢測,盡管本實施例中F-缺陷型SeV(NGF/SeV/ΔF,NGF/SeV/ΔF-GFP)(見圖55)感染LLC-MK2/F細胞,若感染高感染復數(shù)(例如1或3),即,所感染細胞自始即接近100%融合,用F非表達細胞進行的實驗給出相似的結果。
用ELISAkit NGF Emax Immuno Assay System(Promega)和其輔助方法對NGF蛋白的定量。在NGF/SeV/ΔF-GFP,NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV感染的細胞培養(yǎng)物上清液中分別檢測到了32.4μg/ml,37.4μg/ml和10.5μg/ml的NGF蛋白。與NGF/SeV感染的細胞培養(yǎng)物的上清液相似,在NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染的細胞的培養(yǎng)物上清液中,存在高濃度的NGF蛋白,確證了F缺陷型SeV表達足夠量的NGF。
以殘存的活性為指標,(神經生長因子(Wiley,紐約),pp.95-109(1989))用原代雞卵背部根神經節(jié)(DRG;雞的感覺神經原)的分離培養(yǎng)物完成NGF蛋白體外活性的檢測。背部根神經節(jié)取自第10天的雞胚,用0.25%胰蛋白酶(GIBCO)37℃條件下處理20min后使其分散。用含100unit/ml青霉素(GIBCO)100unit/ml鏈霉素(GIBCO),250unit/ml,兩性霉素B(GIBCO)20μM2-脫氧]尿苷(Nakarai),2Mm L谷氨酸鹽(Sigma)和5%的血清的高葡萄糖D-MEM培養(yǎng)基,以5000細胞/孔,將細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。用聚賴氨酸預覆的96孔細胞培養(yǎng)板(Iwaki)在使用前再用昆布寧(Sigma)涂覆一次。在起始點,加入對照NGF蛋白或預先制備的經SeV感染的培養(yǎng)物上清液。3天后,用顯微鏡觀察或以線粒體的還原活性為指標,通過加入Alamer蘭對存活細胞進行定量,(530nm激發(fā),590nm熒光檢測)在對照(未添加NGF)中檢測到等價的熒光信號,其中加入了稀釋到1/1000的經附加型GFP(GFP/SeV)感染的細胞培養(yǎng)物上清液,反之,添加有稀釋到1/1000的經NGF/SeV/ΔF,NGF/SeV/ΔF-GFP,和NGF/SeV感染的細胞培養(yǎng)物上清液的對照,引起熒光強度的明顯增強,且經鑒定其中有相當高數(shù)量的存活細胞和殘余活性。(圖56)結果的值與由ELISA計算出的NGF蛋白添加量具有可比性。在顯微鏡下觀察證明了相似的結果。即添加經NGF/SeV/ΔF,NGF/SeV/ΔF-GFP,和NGF/SeV感染的細胞培養(yǎng)物上清液,可增加存活細胞,且可觀察到顯著的神經突延長(圖57)。從而證明在包含F(xiàn)-缺陷型的SeV感染表達的NGF是活性形式。
F-表達細胞的詳細分析經由Adeno-Cre的感染復數(shù)和引入時間通過使用不同的Adeno-Cre感染復數(shù)感染LLC-MK2細胞,F(xiàn)蛋白引入后,分析蛋白的表達量和細胞形狀的改變。
與感染復數(shù)為1(圖58)比較,感染復數(shù)為10時的表達水平稍有提高。在引入后的6小時,12小時,24小時和48小時分析表達量,在所有的檢測中引入后48小時的表達量最高。
另外,在感染復數(shù)為1,3,10,30和100時監(jiān)控一定時間段內受感染的細胞形狀的變化。盡管在感染復數(shù)達到10時已觀察到了明顯的不同,但在感染復數(shù)為30或更高時才觀察到細胞毒性。(圖59)細胞傳代數(shù)用Adeno-Cre將F蛋白引入LLC-MK2/F細胞后,細胞經傳代7次,再用顯微鏡的觀察對F蛋白表達水平和細胞形態(tài)進行分析。另一方面,用激光顯微鏡分析F蛋白引入細胞后,細胞傳代到第20代時F蛋白細胞間的定位。
根據(jù)激光顯微鏡觀察的結果,引入F蛋白表達的LLC-MK2/F細胞置于玻璃槽中,過夜培養(yǎng)后,去除培養(yǎng)基,用PBS洗細胞一次,用3.7%的.福爾馬林-PBS固定5min。洗細胞一次后,將細胞用0.1%Triton x100-PBS處理5min,然后依下述順序用抗F蛋白單克隆抗體(γ-236)(稀釋至1/100)和FITC標記的羊抗兔IgG抗體(稀釋至1/200)處理細胞,最后用PBS洗細胞后用激光顯微鏡觀察。
結果,在傳代7次后的細胞中,F(xiàn)蛋白的表達水平沒有變化。(圖60)在形態(tài)學變化,SeV的感染性和產率上也沒有觀察到明顯的不同。另一方面,細胞傳代20次,用免疫抗體的方法分析F蛋白在細胞間的定位,當傳代到15代時仍未發(fā)現(xiàn)大的差異,但在傳代15代以上即可觀察到F蛋白定位趨勢。
綜合上述,在傳代15代以前的細胞,可以認為是F缺陷SeV的生產所需。
GFP-CIU和抗-SeV-CIU之間的相互關系通過兩種方法分析了檢測感染細胞單元()的結果之間的相互關系。LLC-MK2細胞以2×105細胞/皿接種于12孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24小時后,用無血清的MEM培養(yǎng)基洗細胞一次,用100μl/孔SeV/ΔF-GFP感染細胞。15min后,每孔添加1ml無血清的MEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后用PBS(-)洗細胞3次,干燥(室溫下放置10min到15min),每孔添加1ml丙酮固定細胞,然后立即去除丙酮。重新干燥細胞(室溫下放置10min到15min)。然后每孔加入300μl用兔制備并用PBS(-)稀釋了100倍的抗SeV多克隆抗體(DN-1),在37℃條件下孵育45min,然后用PBS(-)洗3次。然后,每孔加入300μl用熒光標記的二抗,抗兔IgG(H+D)(AlexTM 568,分子探針)在37℃條件下孵育45min,然后用PBS(-)洗3次。然后在熒光顯微鏡下觀察帶有熒光的細胞。(發(fā)射560nm,吸收645nm,濾光器Leica)
作為對照,用100μl/孔的SeV/ΔF-GFP感染細胞,15min后,每孔添加1ml無血清的MEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后,無需進一步的操作即可在熒光顯微鏡下觀察到表達GFP的細胞。(發(fā)射360nm,吸收470nm,濾光器Leica)。
通過定量評估熒光強度得出了很好的相關性。(圖62)[實施例26]多克隆位點的構建應用下述的兩種方法,在SeV載體上添加多克隆位點。
破壞在全長的仙臺病毒(SeV)基因組cDNA和p SeV18+基因組cDNA中的幾個限制性酶切位點,將包含上述破壞了的酶切位點的另外的酶切位點,引入每個基因的起始信號和翻譯起始密碼ATG之間。
在已經構建好的SeV載體cDNA添加多克隆位點和轉錄起始信號,其間間隔有序列終止信號,并將插入序列整合到NotI位點。
在方法1中,下述為一種推薦方法用瓊脂糖電泳分離p SeV18+的EagI消化片段(2644kb),ClaI消化片段(3246kb),ClaI-EcoRI消化片段(5146kb)和EcoRI消化片段(5010kb),切下相應的帶,用QIAEXII凝膠提取系統(tǒng)(QIAGEN)回收并純化DNA片段。連接EagI消化片段,并傳代克隆到LITMUS38上(新英格蘭BIOLABS)。ClaI消化片段(3246kb),ClaI-EcoRI消化片段(5146kb)和EcoRI消化片段(5010kb)相互連接后,傳代克隆到pBluescriptIIKS+(STRATAGENE)。用Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit(STRATAGENE)進行連續(xù)的破壞和酶切位點的引入。
為破壞酶切位點合成下列序列用于反應Sal I(有義鏈)5’-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3’(序列號SEQ ID NO35)(反義鏈),5’-ctgactgattatcttgggtggacggtattgagacttctcc-3’(序列號SEQ IDNO36),Nhe I(有義鏈)5’-gtatatgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3’(序列號SEQ ID NO37)(反義鏈)5’-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3’(序列號SEQ ID NO38)Xho I(有義鏈)5’-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3’(序列號SEQ ID NO39)(反義鏈),5’-ccaggtaactctttagtgactccagcctctctagagagttcattg-3’(序列號SEQ ID NO40)為引入酶切位點合成下列序列用于反應NP-P(有義鏈)5’-gtgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3’(序列號SEQ ID NO41)(反義鏈)5’-cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3’’(序列號SEQID NO42)P-M(有義鏈)5’-cttagggtgaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3’(序列號SEQ ID NO43)(反義鏈)5’-gatatctgccattgcgccgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3’(序列號SEQ ID NO44),M-F(有義鏈)5’-cttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaaactctcccc-3’(序列號SEQ ID NO45)(反義鏈)5’-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3’(序列號SEQ ID NO46),F(xiàn)-HN(有義鏈)5’-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcacagatcatgg-3’(序列號SEQ ID NO47)(反義鏈)5’-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3’(序列號SEQ ID NO48),HN-L(有義鏈)5’-cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-3’(序列號SEQ ID NO49)(反義鏈)5’-ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3’(序列號SEQ ID NO50)。引入后每一DNA片段均依上述相似的方法進行回收和純化,并組建cDNA。
在方法2中,合成下列序列(有義鏈)5’-ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3’(序列號SEQ ID NO51)(反義鏈)5’-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactgttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3’(序列號SEQ ID NO52)。磷酸化后,85℃條件下2min,65℃條件下15min,37℃條件下15min進行退火,室溫條件下15min整合到SeV的cDNA上?;蛘撸冒K止信號-插入序列-起始信號的引物進行PCR擴增pUC 18或pBluescriptII或類似的多克隆位點進行傳代克隆,然后整合到SeV的cDNA上??衫蒙鲜龇椒ㄓ盟肈NA對病毒進行重建。
序列表<110>株式會社載體研究所(DNAVEC Research Inc.)<120>副粘病毒衍生的RNP<130>D3-102PCT<140><141><150>JP1999-200740<151>1999-05-18<160>52<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>1atgcatgccg gcagatga18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>2gttgagtact gcaagagc18<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>3tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>4atgcatgccg gcagatga 18<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>5tgggtgaatg agagaatcag c 21<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>6atgcatatgg tgatgcggtt ttggcagtac 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>7tgccggctat tattacttgt acagctcgtc 30<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>8atcagagacc tgcgacaatg c 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>9aagtcgtgct gcttcatgtg g 21<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>10acaaccacta cctgagcacc cagtc 25<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>11gcctaacaca tccagagatc g 21<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>12acattcatga gtcagctcgc20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>13atcagagacc tgcgacaatg c 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>14aagtcgtgct gcttcatgtg g 21<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>15gaaaaactta gggataaagt ccc23<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>16gttatctccg ggatggtgc 19<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>17gcgcggccgc cgtacggtgg caaccatgtc gtttactttg accaa45<210>18<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>18gcgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg ctattacttc 60tgacaccaga ccaactggta 80<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>19ccaccgacca cacccagcgg ccgcgacagc cacggcttcg g41<210>20<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>20ccgaagccgt ggctgtcgcg gccgctgggt gtggtcggtg g41<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>21gaaatttcac ctaagcggcc gcaatggcag atatctatag 40<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>22ctatagatat ctgccattgc ggccgcttag gtgaaatttc 40<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>23gggataaagt cccttgcggc cgcttggttg caaaactctc ccc 43<210>24<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>24ggggagagtt ttgcaaccaa gcggccgcaa gggactttat ccc 43<210>25<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>25ggtcgcgcgg tactttagcg gccgcctcaa acaagcacag atcatgg 47<210>26<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>26ccatgatctg tgcttgtttg aggcggccgc taaagtaccg cgcgacc 47<210>27<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>27cctgcccatc catgacctag cggccgcttc ccattcaccc tggg 44<210>28<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>28cccagggtga atgggaagcg gccgctaggt catggatggg cagg 44<210>29<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>29gcggcgcgcc atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg 40<210>30<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>30gcggcgcgcc cttatcatgt ctgctcgaag cggccggccg 40<210>31<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>31gcggccgcgt ttaaacggcg cgccatttaa atccgtagta agaaaaactt agggtgaaag 60ttcatcgcgg ccgc 74<210>32<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>32gcggccgcga tgaactttca ccctaagttt ttcttactac ggatttaaat ggcgcgccgt 60ttaaacgcgg ccgc 74<210>33<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>33acttgcggcc gccaaagttc agtaatgtcc atgttgttct acactctg 48<210>34<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>34atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag cctcttcttg 60tagccttcct gc 72<210>35<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>35ggagaagtct caacaccgtc cacccaagat aatcgatcag 40<210>36<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>36ctgatcgatt atcttgggtg gacggtgttg agacttctcc 40<210>37<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>37gtatatgtgt tcagttgagc ttgctgtcgg tctaaggc38<210>38<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>38gccttagacc gacagcaagc tcaactgaac acatatac38<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>39caatgaactc tctagagagg ctggagtcac taaagagtta cctgg 45<210>40<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>40ccaggtaact ctttagtgac tccagcctct ctagagagtt cattg 45<210>41<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>41gtgaaagttc atccaccgat cggctcactc gaggccacac ccaaccccac cg 52<210>42<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>42cggtggggtt gggtgtggcc tcgagtgagc cgatcggtgg atgaactttc ac 52<210>43<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>43cttagggtga aagaaatttc agctagcacg gcgcaatggc agatatc 47<210>44<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>44gatatctgcc attgcgccgt gctagctgaa atttctttca ccctaag 47<210>45<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>45cttagggata aagtcccttg tgcgcgcttg gttgcaaaac tctcccc 47<210>46<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>46ggggagagtt ttgcaaccaa gcgcgcacaa gggactttat ccctaag 47<210>47<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>47ggtcgcgcgg tactttagtc gacacctcaa acaagcacag atcatgg 47<210>48<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>48ccatgatctg tgcttgtttg aggtgtcgac taaagtaccg cgcgacc 47<210>49<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>49cccagggtga atgggaaggg ccggccaggt catggatggg caggagtcc49<210>50<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>50ggactcctgc ccatccatga cctggccggc ccttcccatt caccctggg49<210>51<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>51ggccgcttaa ttaacggttt aaacgcgcgc caacagtgtt gataagaaaa acttagggtg 60aaagttcatc ac 72<210>52<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>52ggccgtgatg aactttcacc ctaagttttt cttatcaaca ctgttggcgc gcgtttaaac 60cgttaattaa gc 7權利要求
1.一種復合體,包括(a)來自副粘病毒的負鏈單鏈RNA,其中該RNA被修飾為不表達副粘病毒科病毒的至少一種包膜蛋白,和(b)由該負鏈單鏈RNA編碼并與該RNA結合的蛋白。
2.根據(jù)權利要求1的復合體,其中該負鏈單鏈RNA被修飾為表達NP、P和L蛋白而不表達F、HN或M蛋白,或者它們的任意組合。
3.根據(jù)權利要求1或2的復合體,其中該負鏈單鏈RNA來自仙臺病毒。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項的復合體,其中該負鏈單鏈RNA還編碼一種外源基因。
5.一種用于基因轉移的組合物,其包括根據(jù)權利要求4的復合體以及一種陽離子脂質。
6.一種用于基因轉移的組合物,其包括根據(jù)權利要求4的復合體以及一種陽離子聚合物。
7.一種在細胞內表達外源基因的方法,包括往細胞內引入根據(jù)權利要求5或6的用于基因轉移的組合物的步驟。
全文摘要
已成功制備一種含有來自仙臺病毒的負鏈單鏈RNA的功能性RNP,該RNP已被修飾為不表達任何包膜蛋白。制備含有外源基因的RNP并使用陽離子脂質體將其插入到細胞內,借此成功地表達外源基因。
文檔編號C07K14/115GK1357044SQ00805672
公開日2002年7月3日 申請日期2000年5月18日 優(yōu)先權日1999年5月18日
發(fā)明者北里海雄, 朱亞峰, 上田泰次, 長谷川護, 飯?zhí)镎虏? 平田隆洋, 隈秀和, 淺川誠 申請人:株式會社載體研究所