專利名稱：用于免疫治療和診斷乳腺癌的化合物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地，本發(fā)明涉及用于治療和診斷乳腺癌的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及含有優(yōu)選在乳腺腫瘤組織中表達(dá)的蛋白質(zhì)的至少一部分的多肽，和編碼這些多肽的多核苷酸。可以在治療乳腺癌的疫苗和藥物組合物中使用這些多肽和多核苷酸。此外，還可以在乳腺癌的免疫診斷中應(yīng)用這些多肽和多核苷酸。
目前還沒有預(yù)防或治療乳腺癌的疫苗或其它普遍成功的方法。該疾病的治療目前依賴于早期診斷(通過常規(guī)的乳腺篩檢方法)和侵入治療的結(jié)合，其中該侵入治療可以包括手術(shù)、放療、化療和激素治療等各種治療方法中的一或多種。具體乳腺癌的治療療程通?；诟鞣N預(yù)后參數(shù)進(jìn)行選擇，這些參數(shù)包括對特異腫瘤標(biāo)志的分析。見例如Porter-Jordan和Lippman，乳腺癌(Breast Cancer)873-100(1994)。然而，已確立的標(biāo)志的使用經(jīng)常導(dǎo)致難于解釋的結(jié)果，而且在乳腺癌患者中觀察到的高死亡率說明在該疾病的治療、診斷和預(yù)防方面需要改進(jìn)。
因此，本領(lǐng)域需要治療和診斷乳腺癌的改良方法。本發(fā)明不僅滿足了這些需要，而且提供了其它的相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供編碼上述多肽的分離的多核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，這些多核苷酸含有SEQ ID NOS3、10、17、24、45-52和55-67、72、73、89-97、102和107所示序列。本發(fā)明還提供含有以上多核苷酸的表達(dá)載體和這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞選自大腸桿菌(E.coli)、酵母和哺乳動物細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供含有第一和第二本發(fā)明多肽，或者是含有一個(gè)本發(fā)明多肽和一個(gè)已知乳腺抗原的融合多肽。
本發(fā)明還提供含有至少一種上述多肽，或編碼該多肽的多核苷酸，及生理上可接受載體的藥物組合物，和含有至少一種或多種該多肽或多核苷酸及非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的疫苗。本發(fā)明還提供含有一種或多種上述融合蛋白的藥物組合物和疫苗。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供含有至少一種多肽和生理上可接受載體、用于治療乳腺癌的藥物組合物，其中該多肽含有乳腺腫瘤蛋白或其變體的免疫原性部分，該乳腺腫瘤蛋白由含有選自下組的序列的多核苷酸編碼(a)SEQ ID NOS1、2、4-9、11-16、18-23、25-44、53、54、68-71、74-88和103-106所示核苷酸序列，(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列，及(c)在中等嚴(yán)緊條件下與(a)或(b)的序列雜交的序列。本發(fā)明還提供含有所述多肽和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑用于治療乳腺癌的疫苗，以及含有至少一種包含了SEQ ID NOS1、2、4-9、11-16、18-23、25-44、53、54、68-71、74-88和103-106所示序列的多核苷酸的藥物組合物和疫苗。
再一方面，本發(fā)明提供用于抑制患者乳腺癌發(fā)展的方法，包括施用有效量的至少一種上述藥物組合物和/或疫苗。
本發(fā)明還提供用于免疫診斷乳腺癌的方法，以及用于該方法的試劑盒。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面中，提供了用于檢測患者乳腺癌的方法，包括(a)用能夠與上述多肽之一結(jié)合的結(jié)合劑接觸獲自患者的生物樣品；和(b)檢測樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該結(jié)合劑是抗體、最優(yōu)選是單克隆抗體。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供監(jiān)測患者乳腺癌進(jìn)展趨勢的方法，包括(a)用能夠與上述多肽之一結(jié)合的結(jié)合劑接觸獲自患者的生物樣品；(b)確定樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽的量；(c)重復(fù)步驟(a)和(b)；和比較步驟(b)和(c)中檢測到的多肽的量。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體、優(yōu)選單克隆抗體，以及含有這種抗體的診斷試劑盒，和應(yīng)用這些抗體抑制乳腺癌發(fā)展的方法。
本發(fā)明還提供檢測乳腺癌的方法，包括(a)從患者獲得生物樣品；(b)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中用第一和第二寡核苷酸引物接觸該樣品，這些寡核苷酸引物的至少一個(gè)對編碼以上多肽之一的多核苷酸是特異的；和(c)檢測樣品中當(dāng)存在該第一和第二多核苷酸引物時(shí)擴(kuò)增的DNA序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)該寡核苷酸引物含有包含選自SEQ ID NOS1-97、100和102-107的序列的多核苷酸中至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸。
再一方面，本發(fā)明提供用于檢測患者中乳腺癌的方法，包括(a)從患者獲得生物學(xué)樣品；(b)用編碼以上多肽之一的多核苷酸所特異的寡核苷酸探針接觸該樣品；和(c)檢測樣品中與該寡核苷酸探針雜交的多核苷酸序列。優(yōu)選地，該寡核苷酸探針含有包含選自SEQ ID NOS1-97、100和102-107的序列的多核苷酸中至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸。
在相關(guān)方面，提供含有以上寡核苷酸探針或引物的診斷試劑盒。
參照以下詳述，本發(fā)明的這些和其它方面將是明了的。本文所公開的所有文獻(xiàn)在此以參考文獻(xiàn)方式完整地并入本文，就象每篇文獻(xiàn)單獨(dú)并入一樣。
附圖和序列名稱簡述

圖1A和B分別顯示了在B511s(填充方塊)或HLA-A3(空白方塊)轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體LCL上測量的第一個(gè)和第二個(gè)B511S特異性CTL克隆的特異裂解活性。SEQ ID NO1是1T-5120的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO2是1T-5122的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO3是1T-5123的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO4是1T-5125的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO5是1T-5126的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO6是1T-5127的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO7是1T-5129的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO8是1T-5130的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO9是1T-5133的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO10是1T-5136的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO11是1T-5137的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO12是1T-5139的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO13是1T-5142的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO14是1T-5143的測定的3’cDNA序列SEQ ID NO15是1T-5120的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO16是1T-5122的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO17是1T-5123的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO18是1T-5125的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO19是1T-5126的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO20是1T-5127的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO21是1T-5129的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO22是1T-5130的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO23是1T-5133的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO24是1T-5136的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO25是1T-5137的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO26是1T-5139的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO27是1T-5142的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO28是1T-5143的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO29是1D-4315的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO30是1D-4311的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO31是1E-4440的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO32是1E-4443的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO33是1D-4321的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO34是1D-4310的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO35是1D-4320的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO36是1E-4448的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO37是1S-5105的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO38是1S-5110的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO39是1S-5111的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO40是1S-5116的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO41是1S-5114的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO42是1S-5115的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO43是1S-5118的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO44是1T-5134的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO45是1E-4441的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO46是1E-4444的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO47是1E-4322的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO48是1S-5103的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO49是1S-5107的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO50是1S-5113的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO51是1S-5117的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO52是1S-5112的測定的5’cDNA序列SEQ ID NO53是1013E11的測定的cDNA序列SEQ ID NO54是1013H10的測定的cDNA序列SEQ ID NO55是1017C2的測定的cDNA序列SEQ ID NO56是1016F8的測定的cDNA序列SEQ ID NO57是1015F5的測定的cDNA序列SEQ ID NO58是1017A11的測定的cDNA序列SEQ ID NO59是1013A11的測定的cDNA序列SEQ ID NO60是1016D8的測定的cDNA序列SEQ ID NO61是1016D12的測定的cDNA序列SEQ ID NO62是1015E8的測定的cDNA序列SEQ ID NO63是1015D11的測定的cDNA序列SEQ ID NO64是1012H8的測定的cDNA序列SEQ ID NO65是1013C8的測定的cDNA序列SEQ ID NO66是1014B3的測定的cDNA序列SEQ ID NO67是1015B2的測定的cDNA序列SEQ ID NO68-71是先前鑒定抗原的測定的cDNA序列SEQ ID NO72是JJ9434的測定的cDNA序列SEQ ID NO73是B535S的測定的cDNA序列SEQ ID NO74-88是先前鑒定抗原的測定的cDNA序列SEQ ID NO89是B534S的測定的cDNA序列SEQ ID NO90是B538S的測定的cDNA序列SEQ ID NO91是B542S的測定的cDNA序列SEQ ID NO92是B543S的測定的cDNA序列SEQ ID NO93是B501S的測定的cDNA序列SEQ ID NO94是B541S的測定的cDNA序列SEQ ID NO95是1016F8(又稱B511S)的延伸cDNA序列SEQ ID NO96是1016D12(又稱B532S)的延伸cDNA序列SEQ ID NO97是1012H8(又稱B533S)的延伸cDNA序列SEQ ID NO98是B511S的預(yù)測氨基酸序列SEQ ID NO99是B532S的預(yù)測氨基酸序列SEQ ID NO100是P501S的測定的全長cDNA序列SEQ ID NO101是P501S的預(yù)測氨基酸序列SEQ ID NO102是克隆#19605(又稱1017C2)的測定的cDNA序列，表現(xiàn)出與任何已知基因均無顯著同源性SEQ ID NO103是克隆#19599的測定的3’末端cDNA序列，表現(xiàn)出與腫瘤表達(dá)增強(qiáng)基因(Tumor Expression Enhanced gene)的同源性SEQ ID NO104是克隆#19599的測定的5’末端cDNA序列，表現(xiàn)出與腫瘤表達(dá)增強(qiáng)基因的同源性SEQ ID NO105是克隆#19607的測定的cDNA序列，表現(xiàn)出與基質(zhì)溶素3的同源性SEQ ID NO106是克隆#19601的測定的cDNA序列，表現(xiàn)出與膠原蛋白的同源性SEQ ID NO107是克隆#19606(又稱B546S)的測定的cDNA序列，表現(xiàn)出與任何已知基因均無顯著同源性發(fā)明詳述正如以上指出的，一般地，本發(fā)明指向用于免疫治療和診斷乳腺癌的組合物和方法。本發(fā)明組合物一般是含有乳腺腫瘤蛋白的至少一個(gè)部分的分離多肽。本發(fā)明還包括與本發(fā)明多肽結(jié)合的分子(例如抗體或其片段)。這些分子在本文中被稱作“結(jié)合劑”。
具體地，本發(fā)明公開了含有人乳腺腫瘤蛋白或其變體的至少一個(gè)部分的分離多肽，其中該乳腺腫瘤蛋白包括由含有選自下組的序列的多核苷酸分子編碼的氨基酸序列SEQ ID NOS1-97、100和102-107所示核苷酸，所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列，和它們的變體。在某些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽含有選自SEQ ID NO98、99和101中所提供的序列和其變體的氨基酸序列。本文所用術(shù)語“多肽”是指包括全長蛋白質(zhì)在內(nèi)的任何長度氨基酸鏈，其中這些氨基酸殘基通過共價(jià)肽鍵連接。因此，含有以上乳腺蛋白質(zhì)之一的一部分的多肽可以完全由該部分組成，或該部分可以存在于一個(gè)含有其它序列的更大多肽中。該其它序列可以來自自身蛋白質(zhì)或可以是異源的，而且這些序列可以具有免疫反應(yīng)性和/或抗原性。
本文所用人乳腺腫瘤蛋白的“免疫原性部分”是指能夠在乳腺癌患者中引起免疫應(yīng)答并從而與乳腺癌患者血清中存在的抗體結(jié)合的部分。該免疫原性部分一般含有至少約5個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選至少約10個(gè)、最優(yōu)選至少約20個(gè)氨基酸殘基。可以在抗體結(jié)合測定中確定本文所述蛋白質(zhì)的免疫原性部分。這些測定一般可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法中的任何一種來進(jìn)行，例如描述于Harlow和Lane的《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1988)中的方法。例如，可以將多肽固定在固相支持物上(見下述)，并與患者血清接觸以使該血清中的抗體可以和該固定化多肽結(jié)合。然后除去未結(jié)合的血清，并采用例如125I標(biāo)記的A蛋白檢測結(jié)合的抗體?；蛘?，可以采用多肽制備單克隆和多克隆抗體，以用于檢測乳腺癌患者血液或其它體液中的該多肽。制備和鑒定已知序列抗原的免疫原性部分的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括那些總結(jié)在Paul，基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，第3版，Raven Press，1993，第243-247頁中的方法。
本文所用術(shù)語“多核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物，包括DNA以及包括HnRNA和mRNA分子在內(nèi)的相應(yīng)RNA分子，既包括有義鏈，也包括反義鏈，還包括cDNA、基因組DNA和重組DNA，以及完全或部分合成的多核苷酸。HnRNA分子含有內(nèi)含子，以廣義的一對一方式和DNA分子對應(yīng)。mRNA分子相應(yīng)于從中切除內(nèi)含子后的HnRNA和DNA分子。多核苷酸可以由完整的基因或其任何部分組成?？刹僮鞯姆戳x多核苷酸可以含有該相應(yīng)多核苷酸的片段，因此“多核苷酸”的定義包括所有這些可操作的反義片段。
本發(fā)明的組合物和方法還包括以上多肽和多核苷酸的變體。本文所用多肽“變體”是指僅由于保守性替代和/或修飾而與所述多肽不同的多肽，以致保留了所述多肽的治療性質(zhì)、抗原性質(zhì)和/或免疫原性性質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽變體與指定的序列之間相差5個(gè)或更少氨基酸的替代、缺失或添加。這些變體一般可以通過對以上多肽序列之一進(jìn)行修飾，然后采用例如本文所述的代表性程序評價(jià)該修飾多肽的抗原性質(zhì)來鑒定。多肽變體優(yōu)選表現(xiàn)出與該指定多肽有至少約70％、更優(yōu)選至少約90％、最優(yōu)選至少約95％的一致性(按以下方法確定的)本文所用“保守替代”是指用一個(gè)氨基酸替代另一個(gè)具有相似性質(zhì)的氨基酸，以致肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)期該多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)基本沒有改變。一般地，以下各組氨基酸代表了保守改變(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。
變體還可以，或者作為一種替代方案可以，含有其它修飾，包括對該多肽的抗原性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)產(chǎn)生最小影響的氨基酸缺失或添加。例如，多肽可以在其N末端偶聯(lián)在翻譯同時(shí)或在翻譯后指導(dǎo)該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的信號(或前導(dǎo))序列。該多肽還可以和接頭或其它序列偶聯(lián)，以便于該多肽的合成、純化或鑒定(例如聚His)，或增強(qiáng)該多肽與固相支持物的結(jié)合。例如，多肽可以和免疫球蛋白的Fc區(qū)偶聯(lián)。
核苷酸“變體”是指由于一或多個(gè)核苷酸缺失、替代或插入而與所述核苷酸序列不同的序列。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如Adelman等(DNA，2183，1983)講授的寡核苷酸指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變，可以容易地引入這些修飾。核苷酸變體可以是天然存在的等位變體、或非天然存在的變體。核苷酸變體的序列優(yōu)選表現(xiàn)出與該所述序列有至少約70％、更優(yōu)選至少約80％、最優(yōu)選至少約90％的一致性(確定方法見下)。
本發(fā)明提供的抗原包括由與本文具體列舉的一個(gè)或多個(gè)DNA序列基本同源的DNA序列編碼的變體。本文所用“基本同源”是指DNA序列能夠在中等嚴(yán)緊條件下雜交。適合的中等嚴(yán)緊條件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中預(yù)洗滌；在5×SSC中50℃-65℃雜交過夜，或?qū)τ诮徊娣N同源，用0.5×SSC于45℃雜交；之后用含有0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC于65℃ 20分鐘各進(jìn)行2次洗滌。這些雜交的DNA序列也屬于本發(fā)明的范疇，同樣由于密碼的簡并性編碼雜交DNA序列所編碼的免疫原性多肽的核苷酸序列也屬于本發(fā)明的范疇。
如果在按下述方法進(jìn)行最大匹配比對后，兩個(gè)核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸殘基序列相同，則這兩個(gè)序列被認(rèn)為是“一致的”。兩個(gè)序列間比較的典型方式是在比較窗中對序列進(jìn)行比較以確定和比較局部區(qū)域的序列相似性。本文所用“比較窗”是指具有至少約20個(gè)連續(xù)位置、通常30-約75個(gè)、更優(yōu)選40-約50個(gè)連續(xù)位置的區(qū)段，在該區(qū)段中可以在這兩個(gè)序列最佳比對后比較一個(gè)序列和具有相同數(shù)目連續(xù)位置的參考序列。
為了序列比較，可以采用Lasergene生物信息軟件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列的最佳比對。該程序體現(xiàn)了以下文獻(xiàn)中所述的幾個(gè)比對策略Dayhoff，M.O.(1978)蛋白質(zhì)的進(jìn)化改變模型-檢測遠(yuǎn)緣關(guān)系的矩陣，見Dayhoff，M.O.(編)《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，國立生物化學(xué)研究基金會，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358頁；Hein J.(1990)比對和系統(tǒng)發(fā)生的統(tǒng)一方法，第626-645頁，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)第183卷，Academic Press公司，SanDiego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P，M.(1989)在微機(jī)上進(jìn)行快速靈敏的多序列比對，CABIOS 5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)線性空間中的最佳比對CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)鄰近連接法，一種重建系統(tǒng)發(fā)生樹的新方法，Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《數(shù)值分類學(xué)-數(shù)值分類學(xué)的原理和實(shí)踐》(Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of NumericalTaxonomy)，F(xiàn)reeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的快速相似性查詢，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80726-730。
優(yōu)選地，“序列一致性百分?jǐn)?shù)”通過在至少有20個(gè)位置的比較窗中比較兩個(gè)最佳比對的序列來確定，其中與參考序列(不含有插入或缺失)相比，該比較窗中的多核苷酸序列部分可以含有20％或更少，通常5-15％，或10-12％的插入或缺失(即間隔區(qū))，以實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)序列的最佳比對。該百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法是確定這兩個(gè)序列中出現(xiàn)一致核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以獲得匹配位置數(shù)，用該匹配位置數(shù)除以該參考序列的總位置數(shù)(即該窗的大小)，然后將所獲結(jié)果乘以100以產(chǎn)生該序列一致性百分?jǐn)?shù)。
編碼本文所述核苷酸序列的基因的等位基因也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文所用“等位基因”或“等位序列”是可以由該核酸序列中的至少一個(gè)突變產(chǎn)生的基因的另一種形式。等位基因可以導(dǎo)致改變的mRNA，或其結(jié)構(gòu)或功能可能發(fā)生改變或不改變的多肽。任何指定基因都可以沒有、或有一種或多種等位形式。一般地，產(chǎn)生等位基因的常見突變可以歸為核苷酸的天然缺失、插入或替代。這些改變類型的每一種均可以單獨(dú)地或聯(lián)合其它的改變一起，在指定序列中一次或多次出現(xiàn)。
對于具有免疫反應(yīng)性的乳腺腫瘤多肽，變體還可以通過對以上多肽之一的氨基酸序列進(jìn)行修飾，然后評價(jià)該修飾多肽的免疫反應(yīng)性來鑒定。對于用于制備診斷結(jié)合劑的乳腺腫瘤多肽，可以通過評價(jià)修飾多肽在制備用于檢測乳腺癌存在與否的抗體方面的能力來鑒定變體。這種修飾序列可以采用例如本文所述的代表程序來制備和測試。
本發(fā)明的乳腺腫瘤蛋白，和編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸分子，可以采用本領(lǐng)域熟知的各種方法之任一種從乳腺腫瘤組織中分離得到。編碼本發(fā)明乳腺腫瘤蛋白之一的基因(或其部分)的相應(yīng)多核苷酸序列可以采用扣除技術(shù)(Subtraction technique)按以下詳細(xì)描述的方法從乳腺腫瘤cDNA文庫中分離。SEQ ID NOS1-97、100和102-107中提供了這些DNA序列的例子?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域的熟知技術(shù)(見例如Mullis等，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.，51263，1987；Erlich編，PCR技術(shù)(PCRTechnology)，Stockton Press，NY，1989)，利用由此獲得的部分多核苷酸序列，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中擴(kuò)增全長多核苷酸序列。一旦獲得編碼多肽的多核苷酸序列，可以采用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)，例如Adelman等(DNA，2183，1983)所述的寡核苷酸指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變，容易地引入以上任一種修飾。
本文公開的乳腺腫瘤多肽還可以通過合成或重組的方式制備。具有少于約100個(gè)氨基酸，一般少于約50個(gè)氨基酸的合成多肽，可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備。例如，可以采用任意一種商業(yè)可獲得的固相技術(shù)，例如將氨基酸順序地添加到生長的氨基酸鏈上的Merrifield固相合成法(見例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963)，合成這些多肽。多肽自動合成的裝置可從供應(yīng)商例如PerkinElmer/Applied BioSystems Division(Foster City，CA)購買，并可以根據(jù)廠家說明書進(jìn)行操作。
或者，可以通過將編碼以上任一種多肽的多核苷酸序列插入表達(dá)載體中，然后在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)該蛋白質(zhì)，重組產(chǎn)生該多肽。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種表達(dá)載體均可以用于表達(dá)本發(fā)明的重組多肽?？梢栽诤芯幋a重組多肽的多核苷酸分子的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何適當(dāng)宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。適合的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母和高等真核細(xì)胞。優(yōu)選地，所用宿主細(xì)胞是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞。以此方式表達(dá)的多核苷酸序列可以編碼天然存在的多肽、天然存在多肽的部分、或它們的其它變體。
一般地，無論采用何種制備方法，本文公開的多肽以分離的基本純的形式被制備出來(即通過氨基酸組成和一級序列分析確定該多肽是均質(zhì)的)。優(yōu)選地，該多肽有至少約90％的純度，更優(yōu)選至少約95％的純度，最優(yōu)選至少約99％的純度。在以下將作更為詳細(xì)描述的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，將這些基本純的多肽摻入在本文公開的一或多個(gè)方法中使用的藥物組合物或疫苗中。
在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供含有第一和第二本發(fā)明多肽、或者是一個(gè)本發(fā)明多肽和一個(gè)已知乳腺腫瘤抗原的融合蛋白質(zhì)，以及這些融合蛋白的變體。
采用已知的重組DNA技術(shù)，通過將編碼所述第一和第二多肽的單個(gè)多核苷酸序列組裝在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，可以構(gòu)建編碼本發(fā)明融合蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。編碼第一多肽的多核苷酸序列的3’末端與編碼第二多肽的多核苷酸序列的5’末端，在有或無肽接頭時(shí)，連接在一起，使得這些序列的閱讀框相符合，以允許這兩個(gè)DNA序列的mRNA翻譯成保留了該第一和第二多肽的生物學(xué)活性的單個(gè)融合蛋白質(zhì)。
可以采用肽接頭序列將該第一多肽和第二多肽分開足夠長的距離，以保證多肽折疊成其二級和三級結(jié)構(gòu)。采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將該多肽接頭序列并入該融合蛋白中?？梢曰谝韵乱蛩剡x擇適合的肽接頭序列(1)能夠采取柔性伸展構(gòu)象；(2)不能采取與該第一和第二多肽的功能性表位發(fā)生相互作用的二級結(jié)構(gòu)；和(3)缺乏可能與該多肽功能性表位反應(yīng)的疏水或帶電荷殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于該接頭序列中?？梢杂米鹘宇^的有用氨基酸序列包括那些公開于如下文獻(xiàn)中的序列Maratea等，基因(Gene)4039-46，1985；Murphy等，美國國家科學(xué)院院刊838258-8262，1986；美國專利4,935,233和美國專利4,751,180。該接頭序列可以長1-約50個(gè)氨基酸。當(dāng)該第一和第二多肽具有能夠用以分開這些功能域并防止空間干擾的非必需N端氨基酸區(qū)域時(shí)，則無需這些肽序列。
將這些連接在一起的多核苷酸序列可操作地與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件連接起來。將負(fù)責(zé)多核苷酸表達(dá)的調(diào)節(jié)元件僅定位在編碼該第一多肽的多核苷酸序列的5’端。同樣，終止翻譯所必需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號僅存在于編碼該第二多肽的多核苷酸序列的3’端。
本發(fā)明還提供含有本發(fā)明多肽及無關(guān)免疫原蛋白質(zhì)的融合蛋白。優(yōu)選地該免疫原蛋白質(zhì)能夠引起回憶應(yīng)答。這些蛋白質(zhì)的實(shí)例包括破傷風(fēng)、結(jié)核和肝炎蛋白(見例如Stoute等，New Engl.J.Med.，33686-91(1997))。
一般說來，含有乳腺腫瘤蛋白免疫原性部分的本發(fā)明多肽可以用于免疫治療乳腺癌，其中該多肽激起患者自身對乳腺腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在其它方面，本發(fā)明提供了采用由具有SEQ ID NOS1-97、100和102-107所示序列的多核苷酸分子編碼的一或多種免疫反應(yīng)性多肽(或含有一或多種該多肽的融合蛋白和/或編碼這些多肽的多核苷酸)，免疫治療患者乳腺癌的方法。本文所用“患者”是指任何恒溫動物，優(yōu)選人類?；颊呖梢员患膊∷腥?，或可以不帶有可檢測疾病。因此，可以采用以上免疫反應(yīng)性多肽(或融合蛋白或編碼這些多肽的多核苷酸分子)治療乳腺癌或抑制乳腺癌的發(fā)展。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些多肽在手術(shù)去除原發(fā)性腫瘤和/或通過施用放療和常規(guī)化療藥物進(jìn)行治療之前或之后施用。
在這些方面，該多肽或融合蛋白一般存在于藥物組合物和/或疫苗中。藥物組合物可以含有一或多種多肽及生理上可接受的載體，而其中的每一種多肽可以含有一或多個(gè)上述序列(或其變體)。該疫苗可以含有一或多種該多肽和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑，其中該非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑能夠引起或增強(qiáng)針對外源抗原的免疫應(yīng)答。非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的實(shí)例包括佐劑、(其中摻入了該多肽的)生物可降解微球體(microsphere)(例如polylactic galactide)和脂質(zhì)體。藥物組合物和疫苗還可以含有其它乳腺腫瘤抗原表位，這些表位或可以并入組合多肽(即含有多個(gè)表位的單一多肽)中，或可以存在于單獨(dú)的多肽中。
或者，藥物組合物或疫苗可以含有編碼以上一個(gè)或多個(gè)多肽的多核苷酸，以致可原位產(chǎn)生該多肽。在這些藥物組合物和疫苗中，該多核苷酸可以存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種遞送系統(tǒng)之任一種中，這些系統(tǒng)包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。適合的核酸表達(dá)系統(tǒng)含有在患者中進(jìn)行表達(dá)所必需的多核苷酸序列(例如適合的啟動子)。細(xì)菌遞送系統(tǒng)包括施用在其表面表達(dá)乳腺腫瘤細(xì)胞抗原表位的細(xì)菌(例如卡介菌(Bacillus-Calmette-Guerrin))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以采用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如痘苗病毒或其它痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或腺病毒)引入該多核苷酸分子，該系統(tǒng)可能涉及到非致病性(缺陷型)可復(fù)制病毒的使用。適合的系統(tǒng)公開于例如Fisher-Hoch等，PNAS86317-321，1989；Flexner等，Ann，N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等，疫苗(Vaccine)817-21，1990；美國專利4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國專利4,777,127；GB2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，生物技術(shù)(Biotechniques)6616-627，1988；Rosenfeld等，科學(xué)(Sciene)252431-434，1991；Kolls等，PNAS 91215-219，1994；Kass-Eisler等，PNAS 9011498-11502，1993；Guzman等，血液循環(huán)(Circulation)882838-2848，1993；和Guzman等，Cir.Res.731202-1207，1993。用于將多核苷酸引入這些表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。
這些多核苷酸也可以是“裸露的”，參見例如公開的PCT申請WO90/11092，和Ulmer等，科學(xué)2591745-1749，1993，綜述參見Cohen，科學(xué)2591691-1692，1993?？梢酝ㄟ^將這些裸露的多核苷酸包被在可以有效地運(yùn)送入細(xì)胞的生物可降解小珠上，增加該多核苷酸的攝取。
給藥的途徑和頻率，及劑量將隨各患者而不同，可以參照目前用于其它疾病的免疫治療的給藥。一般地，該藥物組合物和疫苗可以通過注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻內(nèi)(例如通過吸入)或口服施用?？梢栽?-24周的時(shí)期中施用1-10個(gè)劑量。優(yōu)選地，每隔3個(gè)月施用4個(gè)劑量，而且之后可以定期給予加強(qiáng)用藥。其它用藥方案可能對于個(gè)別患者是適合的。適合的劑量是在被治療患者中有效引起針對乳腺腫瘤細(xì)胞的(細(xì)胞和/或體液)免疫應(yīng)答的多肽或多核苷酸量。適合的免疫應(yīng)答高于基礎(chǔ)(即未治療)水平至少10-50％。一般地，在一個(gè)劑量中存在的(或由一個(gè)劑量中的多核苷酸原位產(chǎn)生的)多肽量的范圍是每kg宿主約1pg-約100mg之間，典型的在約10pg-約1mg之間，優(yōu)選在約100pg-約1μg之間。適合的劑量體積將隨患者的體積大小不同，但典型的是約0.01ml-約5ml之間。
盡管在本發(fā)明的藥物組合物中可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適合載體，但載體的類型將隨給藥方式的改變而改變。對于非胃腸道用藥，例如皮下注射，該載體優(yōu)選含有水、鹽水、乙醇、脂質(zhì)、蠟和/或緩沖液。對于口服用藥，可以采用以上任一種載體或固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、和/或碳酸鎂。還可采用生物可降解微球體(例如polylactic glycolide)作為用于本發(fā)明藥物組合物的載體。適合的生物可降解微球體公開于例如美國專利4,897,268和5,075,109。
在本發(fā)明疫苗中可以采用多種非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑中之任一種。例如，可以將佐劑包括在內(nèi)。大多數(shù)佐劑含有設(shè)計(jì)用以防止抗原快速代謝的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或礦物油，和免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑，例如脂質(zhì)A、Bordella pertussis或結(jié)核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。這些佐劑可從商業(yè)途徑獲得，例如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，MI)和Merck佐劑65(Merckand Company，Inc.，Rahway，NJ)。
本文公開的多肽還可以用于癌癥的過繼免疫治療。過繼免疫治療可以大致分為主動或被動免疫治療。在主動免疫治療中，治療方案在于通過施用免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(例如腫瘤疫苗、細(xì)菌佐劑和/或細(xì)胞因子)體內(nèi)刺激內(nèi)源性宿主免疫系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)。
在被動免疫治療中，治療方案涉及遞送具有確定腫瘤免疫反應(yīng)性的能夠直接或間接地介導(dǎo)抗腫瘤作用的生物試劑(例如效應(yīng)細(xì)胞或抗體)，而無需依賴于完整的宿主免疫系統(tǒng)。效應(yīng)細(xì)胞的例子包括T淋巴細(xì)胞(例如CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、CD4+T輔助細(xì)胞、γ/δT淋巴細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞)、殺傷細(xì)胞(例如自然殺傷細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)、B細(xì)胞、或表達(dá)本公開抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。還可以采用本文公開的多肽產(chǎn)生抗體或抗獨(dú)特型抗體(參見美國專利4,918,164)，用于被動免疫治療。
獲得用于過繼免疫治療的足夠數(shù)量T細(xì)胞的主要方法是在體外培養(yǎng)免疫T細(xì)胞。用于將單個(gè)抗原特異性T細(xì)胞擴(kuò)大至數(shù)十億個(gè)并保留其體內(nèi)抗原識別性質(zhì)的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域熟知的。典型地，這些體外培養(yǎng)條件是，通常在細(xì)胞因子(例如IL-2)和非分裂飼喂細(xì)胞時(shí)，利用抗原進(jìn)行間歇性刺激。正如以下指出的，本文所述免疫反應(yīng)性多肽可以用于快速擴(kuò)大抗原特異性T細(xì)胞培養(yǎng)物，以產(chǎn)生足夠用于免疫治療的細(xì)胞數(shù)目。具體地，采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以用免疫反應(yīng)性多肽脈沖(pulse)抗原呈遞細(xì)胞例如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或B細(xì)胞，也可以將一或多個(gè)多核苷酸序列引入抗原呈遞細(xì)胞中。例如，可以用多核苷酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，其中所述序列含有適于誘導(dǎo)表達(dá)的啟動子區(qū)，而且能夠作為重組病毒或其它表達(dá)系統(tǒng)的部分來表達(dá)。有幾種病毒載體可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，它們包括痘病毒、痘苗病毒和腺病毒?？梢酝ㄟ^各種方式包括基因槍技術(shù)、脂介導(dǎo)的遞送、電穿孔、滲透壓休克、和微粒遞送機(jī)制，用本文公開的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染抗原呈遞細(xì)胞，獲得有效的可接受表達(dá)水平，該水平可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。為了使培養(yǎng)細(xì)胞在治療中有效，該培養(yǎng)T細(xì)胞必需能夠在體內(nèi)生長和廣泛分布，并且能夠長期存活。研究表明，通過用補(bǔ)加IL-2的抗原進(jìn)行重復(fù)刺激能夠誘導(dǎo)相當(dāng)大數(shù)量的培養(yǎng)T細(xì)胞在體內(nèi)生長并長期存活(見例如Cheever，M.等，“用培養(yǎng)T細(xì)胞進(jìn)行的治療再論原理(Therapy With Cultured T CellsPrinciples Revisited)”，免疫學(xué)綜述(Immunological Reviews)，157177，1997)。
本文公開的多肽還可以用于產(chǎn)生和/或分離腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，然后可給患者施用這些細(xì)胞。一個(gè)方法是，可以通過用相應(yīng)于本公開多肽免疫原性部分的短肽進(jìn)行體內(nèi)免疫，產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞系。所獲的抗原特異性CD8+CTL克隆可以從該患者中分離，并采用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增，然后又返回給該患者。
或者，可以按例如Chang等(Crit.Rev.Oncol.Hematol.，22(3)，213，1996)所述的方法，采用相應(yīng)于這些多肽免疫原性部分的肽通過自體T細(xì)胞的選擇性體外刺激和擴(kuò)增以提供隨后可以用于轉(zhuǎn)移給患者的抗原特異性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞亞型。采用商業(yè)可獲得的細(xì)胞分離系統(tǒng)，可以從患者的外周血分離免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，例如T細(xì)胞。用包含在遞送載體例如微球體中的一或多種該免疫反應(yīng)性多肽刺激該分離細(xì)胞，以提供抗原特異性細(xì)胞。然后采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增該腫瘤抗原特異性T細(xì)胞，并將這些細(xì)胞返回施用給該患者。
在其它實(shí)施方案中，可以克隆這些多肽特異的T細(xì)胞和/或抗體的受體，擴(kuò)增并將其轉(zhuǎn)移至其它載體或效應(yīng)細(xì)胞中用于過繼免疫治療。具體地，可以用適合的基因轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，以將腫瘤特異性單克隆抗體可變區(qū)表達(dá)成細(xì)胞外識別元件并與T細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)鏈連接，從而導(dǎo)致T細(xì)胞激活、特異性裂解和細(xì)胞因子的釋放。這使得該T細(xì)胞能夠以獨(dú)立于MHC的方式重新定向其特異性。見例如Eshhar，Z.，癌癥免疫學(xué)免疫治療(Cancer Immunol Immunother)，45(3-4)131-6，1997和Hwu，P.等，癌癥研究(Cancer Res)，55(15)3369-73，1995。另一個(gè)實(shí)施方案可以包括腫瘤抗原特異性α和βT細(xì)胞受體鏈向其它T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，參見Cole，DJ等，癌癥研究55(4)748-52，1995。
在其它實(shí)施方案中，可以用相應(yīng)于本文所公開多肽的至少免疫原性部分的肽脈沖同基因或自體樹突細(xì)胞。所獲的抗原特異性樹突細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移至患者體內(nèi)，或用于刺激T細(xì)胞以提供抗原特異性T細(xì)胞再施用給患者。Cheever等(免疫學(xué)綜述，157177，1997)闡述了肽脈沖樹突細(xì)胞在產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞中的應(yīng)用，以及隨后這些抗原特異性T細(xì)胞在小鼠模型中消除腫瘤的應(yīng)用。
此外，還可以將表達(dá)本公開多核苷酸的載體引入從患者采獲的干細(xì)胞中，并體外克隆增殖用于自體移植返回同一患者體內(nèi)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以采用商業(yè)可獲得的細(xì)胞分離系統(tǒng)，例如CellPro公司(Bothell，WA)的CEPRATETM系統(tǒng)(見美國專利5,240,856；美國專利5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)，從患者外周血分離該免疫系統(tǒng)的細(xì)胞例如T細(xì)胞。用包含在遞送載體例如微球體中的一或多種該免疫反應(yīng)性多肽刺激該分離細(xì)胞，以提供抗原特異性T細(xì)胞。然后采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增該腫瘤抗原特異性T細(xì)胞群體，并將這些細(xì)胞返回施用給該患者。
本發(fā)明的多肽還可以，或者作為可供選擇的替代方式，用于產(chǎn)生能夠檢測轉(zhuǎn)移性人乳腺腫瘤的結(jié)合劑，例如抗體或其片段。本發(fā)明的結(jié)合劑一般可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備，包括采用本文所述的代表性方法。采用本文所述的代表性測定方法，結(jié)合劑能夠區(qū)分患有乳腺癌的患者和未患該病的患者。換言之，產(chǎn)生的抗乳腺腫瘤蛋白或其適合部分的抗體或其它結(jié)合劑，可以在至少約20％患有該病的患者中產(chǎn)生指示原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的信號，并在至少大約90％未患原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的個(gè)體中產(chǎn)生指示無該疾病的陰性信號。這些乳腺腫瘤蛋白的適合部分是能夠產(chǎn)生在采用全長蛋白質(zhì)所指示的基本上所有(即至少約80％、優(yōu)選至少約90％)乳腺癌患者中指示原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌存在、而在采用全長蛋白質(zhì)檢測時(shí)為陰性的基本上所有樣品中指示無乳腺癌的結(jié)合劑的乳腺腫瘤蛋白部分。一般地，可以采用下述的代表性測定方法，例如雙抗體三明治測定方法，評價(jià)結(jié)合劑檢測轉(zhuǎn)移性人乳腺腫瘤的能力。
一般地，可以通過制備抗按本文所制備多肽的一或多種抗體(采用例如本文所述的代表性方法)，然后測定這些抗體在患者中檢測原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性人乳腺腫瘤的能力，來評價(jià)該多肽產(chǎn)生能夠檢測該腫瘤的抗體的能力。可以通過分析來自患有和未患原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者的生物樣品中是否存在與所制備的這些抗體結(jié)合的多肽，實(shí)現(xiàn)該測定。這些測試試驗(yàn)可以采用例如下述的代表性方法來進(jìn)行。產(chǎn)生通過這些方法能夠檢測到至少20％原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的抗體的多肽被認(rèn)為在用于檢測原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性人乳腺腫瘤的測定中是有用的。多肽特異性抗體可以單獨(dú)使用或聯(lián)合使用以提高靈敏度。
能夠檢測原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性人乳腺腫瘤的多肽可以用作在患者中診斷乳腺癌或監(jiān)測疾病進(jìn)展趨勢的標(biāo)志。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過相對于預(yù)確定的截?cái)嘀翟u價(jià)從患者獲得的生物學(xué)樣品中以上一或多種多肽的水平，對該患者進(jìn)行乳腺癌診斷。本文所用適合的“生物學(xué)樣品”包括血液、血清和尿。
一或多種以上多肽的水平可以采用對該多肽特異的任何結(jié)合劑來評價(jià)?！敖Y(jié)合劑”在本發(fā)明的上下文中是指與上述多肽結(jié)合的任何物質(zhì)(例如化合物或細(xì)胞)。本文所用“結(jié)合”是指兩個(gè)獨(dú)立的分子(每一個(gè)均可以是游離的(即在溶液中)，或存在于細(xì)胞或固相支持物表面)之間的非共價(jià)連接，以致形成“復(fù)合物”。該復(fù)合物可以是游離的或(以共價(jià)或非共價(jià)形式)固定在固體材料上。一般地，可以通過測定形成該復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來評價(jià)結(jié)合的能力。該結(jié)合常數(shù)是用復(fù)合物各成分濃度的乘積除該復(fù)合物的濃度時(shí)獲得的值。一般地，當(dāng)復(fù)合物形成的結(jié)合常數(shù)超過約103L/mol時(shí)，在本發(fā)明的上下文中兩個(gè)化合物被稱為是相“結(jié)合”的。該結(jié)合常數(shù)可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法來測定。
滿足以上要求的任何物質(zhì)均可以是結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是含有或不含有肽成分的核糖體、RNA分子或肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該結(jié)合伴侶是抗體或其片段。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。此外，該抗體還可以是單鏈、嵌合、CDR嫁接的、或人源化的抗體?？梢圆捎帽疚乃龇椒ê捅绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法制備抗體。
有多種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的測定方式可以用于結(jié)合伴侶對樣品中多肽標(biāo)志的檢測。見例如Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該測定涉及用固定在固相支持物上的結(jié)合伴侶結(jié)合樣品中的該多肽并將其與樣品其余部分分離。然后可以采用含有報(bào)道基團(tuán)的第二結(jié)合伴侶檢測該結(jié)合的多肽。適合的第二結(jié)合伴侶包括與該結(jié)合伴侶/多肽復(fù)合物結(jié)合的抗體?；蛘?，可以利用競爭實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)中將該結(jié)合伴侶與樣品一起孵育之后，用報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記多肽并使之能與該固定的結(jié)合伴侶結(jié)合。該樣品成分對該標(biāo)記多肽與該結(jié)合伴侶結(jié)合的抑制程度指示了該樣品與該固定的結(jié)合伴侶的反應(yīng)性。
所述固體支持物可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的可以附著該抗原的任何材料。例如該固體支持物可以是微量滴定板中的測試孔或硝酸纖維素膜或其它適合的膜?；蛘?，該支持物可以時(shí)小珠或圓盤，例如玻璃、玻璃纖維、膠乳、或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。該支持物還可以是磁性顆粒或光導(dǎo)纖維傳感器，例如公開于美國專利5,359,681中的那些。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的、在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中有充分描述的各種技術(shù)，可以將該結(jié)合劑固定在固相支持物上。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“固定”是指非共價(jià)連接例如吸附，和共價(jià)結(jié)合(其可以是抗原和固相上官能團(tuán)之間的直接連接，或可以是通過交聯(lián)劑形成的連接)。優(yōu)選通過吸附于微量滴定板孔中或膜上進(jìn)行固定。在這些情況下，可以通過在適合緩沖液中使結(jié)合劑與該固體支持物接觸適當(dāng)長的時(shí)間來實(shí)現(xiàn)吸附。該接觸時(shí)間隨溫度而改變，但典型地在約1小時(shí)和約1天之間。一般地，用約10ng-約10μg量、優(yōu)選約100ng-約1μg量的結(jié)合劑接觸一個(gè)塑料微量滴定板孔(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)，足以固定足夠量的結(jié)合劑。
一般可以通過首先用既可與支持物又可與結(jié)合劑上的官能團(tuán)(如羥基或氨基)反應(yīng)的雙功能試劑與該支持物反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)該結(jié)合劑與該固體支持物的共價(jià)結(jié)合。例如，可以采用苯醌或通過支持物上的醛基和結(jié)合伴侶上的胺及活性氫縮合，將該結(jié)合劑與具有適當(dāng)聚合物包衣的支持物共價(jià)結(jié)合(見例如Pierce免疫技術(shù)產(chǎn)品目錄和手冊(PierceImmunotechnology Catalog and Handbook)，1991，A12-A13)。
在某些實(shí)施方案中，所述測定方法是雙抗體三明治實(shí)驗(yàn)?？梢酝ㄟ^首先使固定在固體支持物上(通常是微量滴定板的孔中)的抗體與樣品接觸，使得該樣品中的多肽可以與該固定的抗體結(jié)合，以進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。從該固定的多肽-抗體復(fù)合物中除去未結(jié)合的樣品，并加入能夠與該多肽上的不同部位結(jié)合的第二抗體(含有報(bào)道基團(tuán))。然后采用適于該具體報(bào)道基團(tuán)的方法，確定與該固體支持物保持結(jié)合的二抗的量。
更具體地，一旦該抗體按以上所述被固定在該支持物上后，典型地封閉該支持物上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適合的封閉劑，例如牛血清白蛋白或Tween 20TM(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)。然后將該固定化抗體與樣品一起孵育，并使多肽可以和該抗體結(jié)合。在孵育前可用適合的稀釋劑例如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋該樣品。一般地，適合的接觸時(shí)間(即孵育時(shí)間)為足以檢測到獲自患有乳腺癌個(gè)體的樣品中多肽存在的時(shí)間。優(yōu)選地，該接觸時(shí)間足以使結(jié)合水平達(dá)到結(jié)合和未結(jié)合多肽之間到達(dá)平衡時(shí)所獲結(jié)合水平的至少大約95％。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將明了，可以通過測定一段時(shí)間內(nèi)達(dá)到的結(jié)合水平容易地確定實(shí)現(xiàn)平衡所必需的時(shí)間。在室溫，一般約30分鐘的孵育時(shí)間是足夠的。
然后通過用適當(dāng)緩沖液，例如含有0.1％Tween 20TM的PBS，洗滌該固體支持物，除去未結(jié)合的樣品。然后向該固體支持物加入含有報(bào)道基團(tuán)的二抗。優(yōu)選的報(bào)道基團(tuán)包括酶(例如辣根過氧化物酶)、底物、輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團(tuán)、熒光基團(tuán)和生物素?？贵w與報(bào)道基團(tuán)的偶聯(lián)可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來實(shí)現(xiàn)。
然后使該二抗與該固定的抗體-多肽復(fù)合物一起孵育，孵育時(shí)間將足以檢測該結(jié)合多肽。一般可以通過測定一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的結(jié)合水平確定適合的時(shí)間長度。然后除去未結(jié)合的二抗，并利用該報(bào)道基團(tuán)檢測結(jié)合的二抗。用于檢測報(bào)道基團(tuán)的方法取決于該報(bào)道基團(tuán)的性質(zhì)。對于放射性基團(tuán)，通常液閃計(jì)數(shù)或放射自顯影法是適合的?？梢圆捎梅止夤舛确z測染料、發(fā)光基團(tuán)和熒光基團(tuán)?？梢圆捎门悸?lián)了一個(gè)不同的報(bào)道基團(tuán)(通常是放射性或熒光基團(tuán)或酶)的抗生物素蛋白檢測生物素。一般可以通過加入底物(一般持續(xù)一定時(shí)間段)，隨后采用分光光度法或其它分析方法分析反應(yīng)產(chǎn)物，以檢測酶報(bào)道基團(tuán)。
為了確定乳腺癌存在與否，一般將從與該固體支持物保持結(jié)合的報(bào)道基團(tuán)檢測到的信號和相應(yīng)于預(yù)先確定的截?cái)嘀档男盘栕鞅容^。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該截?cái)嘀禐楫?dāng)該固定化抗體與從未患乳腺癌的患者得到的樣品一起孵育時(shí)所獲得的信號平均值。一般地，如果樣品產(chǎn)生的信號高于該預(yù)確定截?cái)嘀?個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，則該樣品被認(rèn)為是乳腺癌陽性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該截?cái)嘀挡捎肦eceiver Operator Curve，根據(jù)Sackett等，臨床流行病學(xué)臨床醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)科學(xué)(Clinical EpidemiologyA Basic Science for Clinical Medicine)，Little Brown and Co.，1985，第106-7頁的方法來確定。簡而言之，在該實(shí)施方案中，將相應(yīng)于診斷測試結(jié)果每一個(gè)可能截?cái)嘀档某蓪φ骊栃月?即靈敏度)和假陽性率(100％特異性)作圖，然后可以從該圖確定截?cái)嘀?。圖上最接近上左側(cè)角的截?cái)嘀?即包括了最大面積的值)是最準(zhǔn)確的截?cái)嘀担a(chǎn)生的信號高于該方法所確定的截?cái)嘀档臉悠房梢员徽J(rèn)為是陽性的?；蛘撸梢匝刂搱D向左移動該截?cái)嘀?，以最小化假陽性率，或向右移動以最小化假陰性率。一般地，產(chǎn)生的信號高于該方法所確定的截?cái)嘀档臉悠繁徽J(rèn)為是乳腺癌陽性。
在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，該測定方法以流過或長條測試形式進(jìn)行，其中該抗體被固定在硝酸纖維素等膜上。在該流過測試中，當(dāng)樣品經(jīng)過該膜時(shí)，樣品中的多肽與固定化抗體結(jié)合。然后在含有標(biāo)記的二抗的溶液流經(jīng)該膜時(shí)，該二抗與該抗體-多肽復(fù)合物結(jié)合。接著可以按以上方法檢測結(jié)合的二抗。在該長條測試形式中，將結(jié)合了抗體的膜的一端浸入含有樣品的溶液中。該樣品沿該膜遷移通過含有二抗的區(qū)域并到達(dá)固定化抗體的區(qū)域。固定化抗體區(qū)域中二抗的濃縮指示了乳腺癌的存在。典型地，在該位置的二抗?jié)饪s產(chǎn)生能夠通過肉眼觀察的圖形，例如線。無該圖形，則指示陰性結(jié)果。一般地，對固定在該膜上的抗體量進(jìn)行選擇，使得在生物樣品含有的多肽水平足以在以上討論形式的雙抗體三明治測定中產(chǎn)生陽性信號時(shí)，能產(chǎn)生肉眼可識別的圖形。優(yōu)選地，固定在該膜上的抗體量在約25ng-約1μg之間，更優(yōu)選在約50ng-約500ng之間。典型地，用極少量的生物樣品即能夠進(jìn)行這些測試。
當(dāng)然，有許多其它的測定方法適于本發(fā)明抗原或抗體的應(yīng)用。以上描述僅旨在作為示例。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，以上多肽可以用作乳腺癌進(jìn)展趨勢的標(biāo)志。在該實(shí)施方案中，可以在不同時(shí)間進(jìn)行以上所述的用于診斷乳腺癌的測定，然后評價(jià)反應(yīng)性多肽水平的改變。例如，可以在6個(gè)月至1年的時(shí)間內(nèi)每24-72小時(shí)進(jìn)行一次該測定，之后按需要進(jìn)行。一般地，如果在患者中隨著時(shí)間的過去該結(jié)合劑檢測到的多肽水平增加，則該患者的乳腺癌處于發(fā)展?fàn)顟B(tài)。相反，如果反應(yīng)性多肽的水平保持不變或隨時(shí)間過去而減少，則乳腺癌沒有發(fā)展。
可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種技術(shù)中的任一種，制備用于以上方法的抗體。見例如Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold SpringHarbor Laboratory，1988。在一個(gè)這樣的技術(shù)中，最初給多種哺乳動物之任意一種(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊和山羊)注射含有該抗原性多肽的免疫原。在該步驟中，本發(fā)明的多肽未經(jīng)修飾充當(dāng)免疫原?；蛘?，尤其是對于相對短的多肽，如果將該多肽與載體蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白)相連接，則可以引起優(yōu)良的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地根據(jù)預(yù)先確定的方案聯(lián)合一或多次加強(qiáng)免疫，給該動物宿主注射該免疫原，然后定期采取該動物的血液。然后可以從該血清中，通過例如采用與適當(dāng)固相支持物偶聯(lián)的該多肽所進(jìn)行的親和層析，純化對該多肽特異的多克隆抗體。
可以采用例如Kohler和Milstein的技術(shù)(歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976)及其改進(jìn)方法，制備對目的抗原性多肽特異的單克隆抗體。簡而言之，這些方法涉及制備能夠產(chǎn)生具有期望特異性(即與目的多肽的反應(yīng)性)的抗體的永生化細(xì)胞系。這些細(xì)胞系可以從獲自例如按以上所述免疫的動物的脾細(xì)胞制備。然后通過例如與骨髓瘤細(xì)胞的融合使該脾細(xì)胞永生化，其中該骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選與該免疫動物同源。有多種融合技術(shù)可以采用。例如，可以將該脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞與非離子去污劑混合幾分鐘，然后將它們以低密度鋪在支持雜種細(xì)胞生長，但不支持骨髓瘤細(xì)胞生長的選擇培養(yǎng)基上。一個(gè)優(yōu)選的篩選技術(shù)采用了HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)篩選。在足夠長的時(shí)間之后，通常為約1-2周，可觀察到雜種集落。選擇單集落，并測試其與該多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
可以從生長的雜交瘤菌落的上清中分離單克隆抗體。此外，還可以采用各種技術(shù)增加產(chǎn)量，例如將該雜交瘤細(xì)胞系注射至適合脊椎動物宿主例如小鼠的腹腔內(nèi)。然后可以從腹水或血液中收獲單克隆抗體。雜質(zhì)可以通過常規(guī)技術(shù)例如層析、凝膠過濾、沉淀和抽提從這些抗體中除去。本發(fā)明多肽可以用于純化方法中的例如親和層析步驟中。
本發(fā)明的單克隆抗體還可以用作治療劑，以減小或清除乳腺腫瘤。這些抗體可以單獨(dú)使用(例如用于抑制轉(zhuǎn)移)，或與一或多種治療劑偶聯(lián)使用。在此方面適合的治療劑包括放射性核素、分化誘導(dǎo)劑、藥物、毒素和它們的衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲蝶呤、及嘧啶和嘌呤的類似物。優(yōu)選的分化誘導(dǎo)劑包括佛波酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、假單孢菌外毒素、志賀氏菌毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
治療劑可以與適合的單克隆抗體直接或間接地(即通過接頭基團(tuán))偶聯(lián)(例如共價(jià)鍵合)。當(dāng)試劑和抗體每一個(gè)均有能夠與另一個(gè)反應(yīng)的取代基時(shí)，它們之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，一個(gè)上的親核基團(tuán)，例如氨基或巰基可以和另一個(gè)上的含有羰基的基團(tuán)例如酐或?；u，或含有容易離去基團(tuán)(例如鹵素)的烷基反應(yīng)。
或者，可能期望將治療劑和抗體通過接頭基團(tuán)偶聯(lián)。接頭基團(tuán)能夠作為間隔起作用使抗體和藥劑分隔開，以避免干擾結(jié)合能力。接頭基團(tuán)還可以用于增強(qiáng)藥劑或抗體上取代基的化學(xué)反應(yīng)性，由此增加偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的增強(qiáng)還可以利于藥劑或藥劑上官能基團(tuán)的應(yīng)用，否則這種應(yīng)用將是不可能的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，有多種功能相同和相異的雙功能或多功能試劑(例如描述于Pierce化學(xué)制品公司(Rockford，IL)的產(chǎn)品目錄中的那些)可以用作接頭基團(tuán)。例如，可通過氨基、羧基、巰基或氧化的糖殘基實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。有許多文獻(xiàn)描述過該方法學(xué)，例如Rodwell等的美國專利4,671,958。
當(dāng)治療劑游離于本發(fā)明免疫偶聯(lián)物的抗體部分更為有效時(shí)，可能期望采用在內(nèi)化至細(xì)胞的過程中或之后可切割的接頭基團(tuán)。有許多不同的可切割接頭基團(tuán)已被描述過。在細(xì)胞內(nèi)從這些接頭基團(tuán)釋放藥劑的機(jī)制包括由二硫鍵還原(例如Spitler的美國專利4,489,710)、光不穩(wěn)定鍵的輻射(例如Senter等的美國專利4,625,014)、衍生的氨基酸側(cè)鏈的水解(例如Kohn等的美國專利4,638,045)、血清補(bǔ)體介導(dǎo)的水解(例如Rodwell等的美國專利4,671,958)、和酸催化的水解(例如Blattler等的美國專利4,569,789)引起的斷裂。
可能期望將一個(gè)以上的藥劑與一個(gè)抗體偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)藥劑分子與一個(gè)抗體分子偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種以上類型的藥劑可以和一個(gè)抗體偶聯(lián)。無論具體的實(shí)施方案如何，可以有多種途徑制備帶有一個(gè)以上藥劑的免疫偶聯(lián)物。例如，可以將一個(gè)以上藥劑直接與一個(gè)抗體分子偶聯(lián)，或可以采用提供多個(gè)連接位點(diǎn)的接頭?；蛘?，可以采用載體。
載體可以以多種方式攜帶藥劑，包括直接或通過接頭基團(tuán)共價(jià)鍵合。適合的載體包括蛋白質(zhì)例如白蛋白(例如Kato等的美國專利4,507,234)、肽和多糖例如氨基葡聚糖(例如Shih等的美國專利4,699,784)。載體還可以通過非共價(jià)結(jié)合或通過包入例如脂質(zhì)體囊中(例如美國專利4,429,008和4,873,088)攜帶藥劑。特異用于放射性核素藥劑的載體包括放射性鹵化小分子和螯合化合物。例如美國專利4,735,792公開了代表性的放射性鹵化小分子和它們的合成方法?？梢詮尿匣衔镄纬煞派湫院怂仳衔?，這些螯合化合物包括含有氮和硫原子作為結(jié)合金屬、或金屬氧、放射性核酸的供體原子的那些螯合化合物。例如，Davison等的美國專利4,673,562公開了代表性的螯合化合物和它們的合成方法。
可以采用多種途徑施用這些抗體和免疫偶聯(lián)物。典型地，可以靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或在切除的腫瘤的基底(bed)中進(jìn)行施用。很明顯，該抗體/免疫偶聯(lián)物的精確劑量將隨所用的抗體、腫瘤上的抗原密度、和抗體的清除率而改變。
本發(fā)明的診斷試劑還可以含有本文公開的多核苷酸的至少一個(gè)部分。例如，在基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的測定中可以使用至少兩個(gè)寡核苷酸引物，以擴(kuò)增來源于生物樣品的乳腺腫瘤特異性cDNA，其中至少一個(gè)寡核苷酸引物是編碼本發(fā)明乳腺腫瘤蛋白的多核苷酸所特異的。然后采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，例如凝膠電泳，檢測該擴(kuò)增cDNA的存在。同樣，可以將對編碼本發(fā)明乳腺腫瘤蛋白的多核苷酸特異的寡核苷酸探針用于雜交分析中，以檢測生物樣品中本發(fā)明多肽的存在。
本文所用術(shù)語“對多核苷酸特異的寡核苷酸引物/探針”是指與所述多核苷酸有至少約60％、優(yōu)選至少約75％、最優(yōu)選至少約90％一致性的寡核苷酸序列，或和與所述多核苷酸有至少約60％、優(yōu)選至少約75％、最優(yōu)選至少約90％一致性的序列反義的寡核苷酸序列。通常可以用于本發(fā)明的診斷方法中的寡核苷酸引物和/或探針優(yōu)選具有至少約10-40個(gè)核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該寡核苷酸引物含有本文公開的多核苷酸或與本文公開多核苷酸序列反義的多核苷酸中的至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，用于本發(fā)明診斷方法的寡核苷酸探針含有編碼本文公開多肽之一的多核苷酸，或與編碼本文所公開多肽之一的序列反義的多核苷酸的至少約15個(gè)連續(xù)寡核苷酸。用于基于PCR的測定方法和雜交測定方法的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(見例如Mullis等，同上；Ehrlich，同上)。因此可以采用引物或探針檢測生物樣品，包括血液、尿和/或乳腺腫瘤組織中的乳腺腫瘤特異性序列。
提供以下實(shí)施例作為舉例說明，而非進(jìn)行限制。
實(shí)施例實(shí)施例1分離和表征乳腺腫瘤多肽該實(shí)施例描述了從乳腺腫瘤cDNA文庫中分離乳腺腫瘤多肽。
采用cDNA合成的Superscript質(zhì)粒系統(tǒng)和質(zhì)?？寺≡噭┖?BRL LifeTechnologies，Gaithersburg，MD 20897)，根據(jù)廠家說明書，從來自三名患者的乳腺腫瘤poly A+RNA庫，構(gòu)建人乳腺腫瘤cDNA表達(dá)文庫。具體地，用polytron(Kinematica，瑞士)勻漿乳腺腫瘤組織，然后采用Trizol試劑(BRL Life Technologies)按廠家指導(dǎo)提取總RNA。然后采用Qiagen oligotex離心柱mRNA純化試劑盒(Qiagen，Santa Clarita，CA 91355)根據(jù)廠家說明書純化該poly A+RNA。采用NotI/Oligo-dTl8引物合成第一鏈cDNA。合成雙鏈cDNA，將其與EcoRI/BstX I連接子(Invitrogen，Carlsbad，CA)連接，然后用NotI消化。在用ChromaSpin-1000柱(Clontech，Palo Alto，CA 94303)進(jìn)行大小分級分離后，將該cDNA連接到pCDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)的EcoRI/NotI位點(diǎn)中，并通過電穿孔轉(zhuǎn)化ElectroMax大腸桿菌DH10B細(xì)胞(BRL LifeTechnologies)。
采用同樣的程序，從4名正常乳腺組織樣品庫中制備正常的人乳腺cDNA表達(dá)文庫。通過確定獨(dú)立菌落的數(shù)量、帶有插入片段的克隆的百分?jǐn)?shù)、插入片段的平均大小，并通過序列分析，對這些cDNA文庫進(jìn)行表征。該乳腺腫瘤文庫含有1.14×107個(gè)獨(dú)立菌落、90％以上的克隆含有可見的插入片段而且插入片段的平均大小為936個(gè)堿基對。該正常乳腺cDNA文庫含有6×106個(gè)獨(dú)立菌落、83％的克隆含有插入片段而且插入片段的平均大小為1015個(gè)堿基對。序列分析顯示，兩個(gè)文庫均含有從mRNA合成的良好復(fù)雜cDNA克隆，以及最小的rRNA和線粒體DNA污染。
采用以上乳腺腫瘤和正常乳腺cDNA文庫，按稍作修飾的Hara等所述的方法(血液(Blood)，84189-199，1994)，進(jìn)行cDNA文庫扣除。具體地，按下述產(chǎn)生乳腺腫瘤特異的扣除cDNA文庫。用EcoRI、NotI和SfuI消化正常乳腺cDNA文庫(70μg)，之后用DNA聚合酶Klenow片段進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)。酚-氯仿抽提和乙醇沉淀后，將該DNA溶解在100μl H2O中，熱變性后與100μl(100μg)Photoprobe生物素(Vector Laboratories，Burlingame，CA)混合，用270W的太陽燈照射置于冰上的所獲混合物20分鐘。再加入50μl Photoprobe生物素，重復(fù)該生物素化反應(yīng)。用丁醇抽提5次后，乙醇沉淀該DNA，并將其溶解在23μl H2O中形成驅(qū)動DNA(driver DNA)。
為了形成示蹤DNA(tracer DNA)，用BamHI和XhoI消化10μg乳腺腫瘤cDNA文庫，酚氯仿抽提后通過Chroma spin-400柱(Clontech)。乙醇沉淀后，將該示蹤DNA溶解在5μl H2O。將示蹤DNA與15μl驅(qū)動DNA和20μl 2×雜交緩沖液(1.5M NaCl/10mM EDTA/50mM HEPES pH7.5/0.2％十二烷基硫酸鈉)混合，用礦物油覆蓋，然后進(jìn)行完全熱變性。將該樣品立即轉(zhuǎn)移到68℃的水浴中，并孵育20個(gè)小時(shí)(長雜交[LH])。然后用鏈霉親和素處理該反應(yīng)化合物，之后進(jìn)行酚/氯仿抽提。重復(fù)該過程3次以上。沉淀扣除DNA，將其溶解在12μl H2O中，與8μl驅(qū)動DNA和20μl 2×雜交緩沖液混合，然后68℃雜交2小時(shí)(短雜交[SH])。除去生物素化的雙鏈DNA后，將扣除DNA連接至氯霉素抗性pBCSK+(Stratagene，La Jolla，CA 92037)的BamHI/XhoI位點(diǎn)中，然后通過電穿孔轉(zhuǎn)化ElecroMax大腸桿菌DH10B細(xì)胞，產(chǎn)生乳腺腫瘤特異性扣除cDNA文庫。
為了分析該扣除cDNA文庫，從該扣除乳腺腫瘤特異性文庫中隨機(jī)挑取100個(gè)獨(dú)立克隆，制備質(zhì)粒DNA，并在Perkin Elmer/Applied BiosystemsDivision 373A型自動測序儀(Foster City，CA)上通過DNA測序進(jìn)行分析。在該扣除乳腺腫瘤特異性cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)38個(gè)不同cDNA克隆。分別在SEQ ID NO1-14中提供了14個(gè)這些克隆的測定3’cDNA序列，在SEQ ID NO15-28中提供了相應(yīng)的5’cDNA序列。SEQ ID NO29-52中提供了剩余克隆的一條cDNA鏈(5’或3’)的測定序列。采用EMBL和GenBank數(shù)據(jù)庫(Release 97)將這些cDNA序列與基因庫中的已知序列進(jìn)行比較，揭示出與SEQ ID NO3、10、17、24和45-52中所提供的序列無顯著同源性。發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1、2、4-9、11-16、18-23、25-41、43和44中所提供的這些序列表現(xiàn)出與已知的人基因有至少某種程度的同源性。發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO42的序列表現(xiàn)出與一個(gè)已知的酵母基因有一些同源性。
對在以上所述的乳腺扣除中分離的cDNA克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，并采用微陣列技術(shù)(Synteni，F(xiàn)remont，CA)測定乳腺腫瘤、正常乳腺和各種其它正常組織中這些cDNA克隆的mRNA表達(dá)水平。簡而言之，將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物按陣列格式點(diǎn)在載玻片上，每個(gè)產(chǎn)物在該陣列中占據(jù)唯一的一個(gè)位置。從待測定的組織樣品中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄，并制備熒光標(biāo)記cDNA探針。用這些標(biāo)記的cDNA探針探測該微陣列，掃描這些載玻片，并測量熒光強(qiáng)度。該強(qiáng)度與雜交強(qiáng)度相關(guān)。
采用GEMTOOLS軟件分析數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)21個(gè)不同的cDNA克隆在乳腺腫瘤中超量表達(dá)，而在所有測試的正常組織中均以低水平表達(dá)。SEQ ID NO53-73中提供了這些克隆的部分確定cDNA序列。按上述方法將SEQ ID NO53、54和68-71的序列與基因庫中的序列進(jìn)行比較，揭示了與以前所鑒定的人基因有一定同源性。對于SEQ ID NO55-67、72(稱作JJ 9434)和73(稱作B535S)，未發(fā)現(xiàn)顯著同源性。在進(jìn)一步的研究中，獲得了克隆1016F8(SEQ ID NO56；又稱B511S)和1016D12(SEQ ID NO61；又稱B532S)的全長cDNA序列，并獲得了1012H8(SEQ ID NO64；又稱B533S)的延長cDNA序列。在SEQ ID NO95-97中分別提供了這些cDNA序列。SEQ ID NO98和99分別提供了B511S和B532S的預(yù)測氨基酸序列。
通過微陣列、northern分析和實(shí)時(shí)PCR，分析乳腺腫瘤組織中以及各種正常組織(皮膚、PBMC、腸、乳腺、胃、肝、腎、胎兒組織、腎上腺、唾液腺、脊髓、大腸、小腸、骨髓、腦、心臟、結(jié)腸和胰臟)中的B511S表達(dá)，結(jié)果說明B511S在乳腺腫瘤，和正常乳腺、皮膚及唾液腺中超量表達(dá)，而在測試的所有其它組織中表達(dá)低或不能檢測到。
通過微陣列、northern分析和實(shí)時(shí)PCR，分析乳腺腫瘤組織中以及各種正常組織(乳腺、PBMC、食道、HMEC、脊髓、骨骼、胸腺、腦、膀胱、結(jié)腸、肝、肺、皮膚、小腸、胃、骨骼肌、胰臟、主動脈、心臟、脾、腎、唾液腺、骨髓、和腎上腺)中的B532S表達(dá)，結(jié)果顯示B532S在20-30％的乳腺腫瘤中超量表達(dá)，而在測試的所有其它組織中表達(dá)低或不能檢測到。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，按以上所述從由常規(guī)扣除獲得的兩個(gè)扣除文庫中獲得cDNA片段，并通過DNA微陣列進(jìn)行分析。在一種情況中，該測試品來源于原發(fā)性乳腺腫瘤，稱作乳腺扣除2或BS2。在第二種情況中，采用轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤作為測試品，稱作乳腺扣除3或BS3。驅(qū)動物由正常乳腺組成。
按以上所述，將來自這兩個(gè)文庫的cDNA片段作為模板用于DNA微陣列分析。通過與來源于腫瘤和正常組織mRNA的熒光探針雜交，分析DNA芯片。從這些探針產(chǎn)生3個(gè)組，稱作乳腺腫瘤/mets、正常非乳腺組織和轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤，以進(jìn)行這些數(shù)據(jù)的分析。采用修飾的Gemtools分析進(jìn)行兩個(gè)比較。第一個(gè)比較用以鑒定在乳腺腫瘤中表達(dá)升高的模板。第二個(gè)用以鑒定在第一個(gè)比較中未回收的在轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)升高的模板。表達(dá)增加的水平(腫瘤表達(dá)的平均值相對正常組織表達(dá)的平均值)自定在約2.2處。
在用于鑒定乳腺腫瘤中超量表達(dá)的第一輪比較中，鑒定了兩個(gè)新基因序列，下文稱作B534S和B538S(分別是SEQ ID NO89和90)，以及6個(gè)表現(xiàn)出與以前鑒定的基因有一定程度同源性的序列(SEQ ID NO74-79)。隨后SEQ ID NO75和76的序列被確定為B535S(SEQ ID NO73)的部分。在鑒定轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中表達(dá)升高的第二輪比較中，鑒定了5個(gè)新序列，下文稱作B535S、B542S、B543S、P501S和B541S(分別是SEQID NO73和91-94)，以及9個(gè)表現(xiàn)出與已知基因有某種同源性的基因序列(SEQ ID NO80-88)?？寺534S和B538S(SEQ ID NO89和90)表現(xiàn)出在乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中均呈超量表達(dá)。
在隨后的一系列研究中，通過微陣列在乳腺芯片3上分析了來自乳腺扣除2的457個(gè)克隆。按以上所述，進(jìn)行第一輪比較，以鑒定與正常非乳腺組織相比乳腺腫瘤中的超量表達(dá)。該分析產(chǎn)生了在乳腺腫瘤中比正常非乳腺組織中表現(xiàn)出表達(dá)提高的6個(gè)cDNA克隆。這些克隆中的兩個(gè)，稱作1017C2(SEQ ID NO102)和B546S(SEQ ID NO107)，與任何已知的基因都無顯著同源性?？寺511S也表現(xiàn)出在乳腺腫瘤中有超量表達(dá)，之前該克隆被稱作1016F8，SEQ ID NO95中提供了其測定的cDNA序列，而SEQ ID NO98中提供了預(yù)測的氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)剩余的4個(gè)在乳腺腫瘤中超量表達(dá)的克隆與腫瘤表達(dá)增強(qiáng)基因(SEQ ID NO103和104)、溶基質(zhì)素3(SEQ ID NO105)或膠原蛋白(SEQ ID NO106)有一定程度的同源性。
在用于確定在轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中比在非乳腺正常組織中表達(dá)升高的基因的第二輪比較中，獲得了類似第一輪比較的基因分布情況。兩個(gè)推測的新克隆，1017C2和B546S，即分別為SEQ ID NO102和107，在轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中超量表達(dá)。此外，腫瘤表達(dá)增強(qiáng)基因和B511S也表現(xiàn)出在轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中表達(dá)提高。
按1997年2月25日提交的美國專利申請08/806,099中所述的方法，通過用正常胰臟cDNA文庫扣除去前列腺腫瘤cDNA文庫分離抗原P501S，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因在先前扣除的前列腺腫瘤特異性cDNA文庫中豐富人腺激肽釋放酶、前列腺特異性抗原(PSA)、和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基II。SEQ ID NO100中提供了P501S的確定全長cDNA序列，SEQ ID NO101中提供了相應(yīng)的預(yù)測氨基酸序列。通過微陣列分析檢查乳腺腫瘤中P501的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在前列腺腫瘤、乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤中有超量表達(dá)，在正常組織中觀察到可以忽略的到低的表達(dá)量。該數(shù)據(jù)提示，P501S可能在各種乳腺腫瘤和在前列腺腫瘤中均超量表達(dá)。
實(shí)施例2制備識別表達(dá)乳腺腫瘤抗原的抗原呈遞細(xì)胞的人CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞本實(shí)施例描述了識別表達(dá)抗原B511S(又稱1016-F8)(SEQ ID NO56)的靶細(xì)胞的T細(xì)胞的制備。采用經(jīng)改造表達(dá)B511S的重組痘苗病毒感染的樹突細(xì)胞，按以下方法使人CD8+T細(xì)胞體外接觸抗原B511S基因產(chǎn)物(也參見Yee等，免疫學(xué)雜志(Journal of Immunology)(1996)157(9)4079-86)。通過在50μg/ml GMCSF和30μg/ml IL-4存在的情況下將從外周血來源的單核細(xì)胞分化5天制備樹突細(xì)胞(DC)。收獲DC，將其以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在24孔板的孔中，并用表達(dá)B511S的痘苗病毒以5的感染復(fù)數(shù)感染12個(gè)小時(shí)。然后通過加入3μg/ml CD40-配體并以100μW的UV輻射10分鐘，過夜使DC成熟。采用磁珠分離CD8+T細(xì)胞，并在各個(gè)孔中(典型的是24孔板的24個(gè)孔中)用7×105個(gè)CD8+T細(xì)胞和1×106個(gè)輻射過的無CD8 PBMC，開始培養(yǎng)物致敏。第1天向培養(yǎng)物中加入10ng/ml IL-7。每7-10天用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)了B511S的自體原代成纖維細(xì)胞和共刺激分子B7.1重復(fù)刺激培養(yǎng)物。第1天在培養(yǎng)物中補(bǔ)加15 I.U.的IL-2。4個(gè)這樣的刺激周期后，采用γ干擾素Elispot分析(見Lalvani等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Experimental Medicine)(1997)186859-965)，測試CD8+培養(yǎng)物特異性識別B511S轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體成纖維細(xì)胞的能力。簡而言之，將來自各微培養(yǎng)物的T細(xì)胞加入96孔Elispot板中，在該板中含有經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)B511S或陰性對照抗原EGFP的自體成纖維細(xì)胞，然后37℃孵育過夜；孔中還含有10ng/ml IL-12。鑒定僅在應(yīng)答B(yǎng)511S轉(zhuǎn)導(dǎo)的成纖維細(xì)胞時(shí)才特異產(chǎn)生γ干擾素的培養(yǎng)物；將這些細(xì)胞系進(jìn)一步擴(kuò)增，而且通過有限稀釋在經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)B511S的自體B-LCL上進(jìn)行克隆。鑒定能夠特異識別B511S轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體B-LCL、而非對照抗原EGFP或HLA-A3轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體B-LCL的細(xì)胞系和克隆。圖1給出了一個(gè)例子，用于闡明來源于這些實(shí)驗(yàn)的人CTL細(xì)胞系特異識別和裂解表達(dá)B511S的靶標(biāo)的能力。
實(shí)施例3多肽的合成可以在Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A肽合成儀上，采用FMOC化學(xué)和HPTU(O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷酸)活化，合成多肽?？梢栽谠撾牡陌被诉B接一個(gè)Gly-Cys-Gly序列，以提供偶聯(lián)、結(jié)合固定化表面、或標(biāo)記該肽的方法。從固相支持物上將該肽切割下來可以采用如下切割混合物來進(jìn)行三氟乙酸∶乙二硫醇∶苯甲硫醚∶水∶苯酚(40∶1∶2∶2∶3)。切割2小時(shí)后，可以在冷甲基叔丁基醚中沉淀該多肽。然后可以將該肽沉淀溶解在含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水中，并將其凍干，再用C18反相HPLC純化?？梢圆捎?％-60％梯度乙腈(含0.1％TFA)的水(含0.1％TFA)溶液洗脫該肽。將該純化組分凍干后，可以采用電霧化或其它類型的質(zhì)譜測定以及氨基酸分析，對該肽進(jìn)行定性分析。
從以上所述可以理解，盡管為了舉例說明的目的本文中描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但可以對其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
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Ala Glu Thr Thr Ala35 40 45Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Pro Thr Thr Ala Thr Thr Ala50 55 60Ala Ser Thr Thr Ala Arg Lys Asp Ile Pro Val Leu Pro Lys Trp Val65 70 75 80Gly Asp Leu Pro Asn Gly Arg Val Cys Pro85 90<210>99<211>197<212>PRT<213>人<400>99Met Ala Lys Asn Gly Leu Val Ile Cys Ile Leu Val Ile Thr Leu Leu1 5 10 15Leu Asp Gln Thr Thr Ser His Thr Ser Arg Leu Lys Ala Arg Lys His20 25 30Ser Lys Arg Arg Val Arg Asp Lys Asp Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile35 40 45Glu Lys Leu Trp Thr Glu Val Asn Ala Leu Lys Glu Ile Gln Ala Leu50 55 60Gln Thr Val Cys Leu Arg Gly Thr Lys Val His Lys Lys Cys Tyr Leu65 70 75 80Ala Ser Glu Gly Leu Lys His Phe His Glu Ala Asn Glu Asp Cys Ile85 90 95Ser Lys Gly Gly Ile Leu Val Ile Pro Arg Asn Ser Asp Glu Ile Asn100 105 110Ala Leu Gln Asp Tyr Gly Lys Arg Ser Leu Pro Gly Val Asn Asp Phe
115 120 125Trp Leu Gly Ile Asn Asp Met Val Thr Glu Gly Lys Phe Val Asp Val130 135 140Asn Gly Ile Ala Ile Ser Phe Leu Asn Trp Asp Arg Ala Gln Pro Asn145 150 155 160Gly Gly Lys Arg Glu Asn Cys Val Leu Phe Ser Gln Ser Ala Gln Gly165 170 175Lys Trp Ser Asp Glu Ala Cys Arg Ser Ser Lys Arg Tyr Ile Cys Glu180 185 190Phe Thr Ile Pro Gln195<210>100<211>3410<212>DNA<213>人<400>100gggaaccagc ctgcacgcgc tggctccggg tgacagccgc gcgcctcggc caggatctga 60gtgatgagac gtgtccccac tgaggtgccc cacagcagca ggtgttgagc atgggctgag 120aagctggacc ggcaccaaag ggctggcaga aatgggcgcc tggctgattc ctaggcagtt 180ggcggcagca aggaggagag gccgcagctt ctggagcaga gccgagacga agcagttctg 240gagtgcctga acggccccct gagccctacc cgcctggccc actatggtcc agaggctgtg 300ggtgagccgc ctgctgcggc accggaaagc ccagctcttg ctggtcaacc tgctaacctt 360tggcctggag gtgtgtttgg ccgcaggcat cacctatgtg ccgcctctgc tgctggaagt 420gggggtagag gagaagttca tgaccatggt gctgggcatt ggtccagtgc tgggcctggt 480ctgtgtcccg ctcctaggct cagccagtga ccactggcgt ggacgctatg gccgccgccg 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gattacccag gctcagggtt aacagctagc 2280ctcctagttg agacacacct agagaagggt ttttgggagc tgaataaact cagtcacctg 2340gtttcccatc tctaagcccc ttaacctgca gcttcgttta atgtagctct tgcatgggag 2400tttctaggat gaaacactcc tccatgggat ttgaacatat gacttatttg taggggaaga 2460gtcctgaggg gcaacacaca agaaccaggt cccctcagcc cacagcactg tctttttgct 2520gatccacccc cctcttacct tttatcagga tgtggcctgt tggtccttct gttgccatca 2580cagagacaca ggcatttaaa tatttaactt atttatttaa caaagtagaa gggaatccat 2640tgctagcttt tctgtgttgg tgtctaatat ttgggtaggg tgggggatcc ccaacaatca 2700ggtcccctga gatagctggt cattgggctg atcattgcca gaatcttctt ctcctggggt 2760ctggcccccc aaaatgccta acccaggacc ttggaaattc tactcatccc aaatgataat 2820tccaaatgct gttacccaag gttagggtgt tgaaggaagg tagagggtgg ggcttcaggt 2880ctcaacggct tccctaacca cccctcttct cttggcccag cctggttccc cccacttcca 2940ctcccctcta ctctctctag gactgggctg atgaaggcac tgcccaaaat ttcccctacc 3000cccaactttc ccctaccccc aactttcccc accagctcca caaccctgtt tggagctact 3060gcaggaccag aagcacaaag tgcggtttcc caagcctttg 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Phe Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu130 135 140Ala Leu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala145 150 155 160Tyr Ser Val Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr165 170 175Lau Leu Pro Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu180 185 190Gly Thr Gln Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu195 200 205Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly210 215 220Pro Thr Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His225 230 235 240Cys Cys Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu245 250 255Leu Pro Arg Leu His Gln Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg260 265 270Arg Leu Phe Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe275 280 285Thr Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val290 295 300Pro Arg Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly305 310 315 320Val Arg Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu325 330 335Val Phe Ser Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gln 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權(quán)利要求
1.含有乳腺蛋白質(zhì)或其變體的免疫原性部分的分離的多肽，其中所述蛋白質(zhì)含有由這樣一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有選自如下組的序列(a)SEQ ID NOS3、10、17、24、45-52、55-67、72、73、89-97、102和107中所示的核苷酸序列；(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和(c)在中等嚴(yán)緊條件下與(a)或(b)的序列雜交的序列。
2.權(quán)利要求1的分離多肽，其中該多肽含有選自SEQ ID NO98、99和101的氨基酸序列。
3.分離的多核苷酸，其含有編碼權(quán)利要求1和2之任意一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
4.含有SEQ ID NOS3、10、17、24、45-52、55-67、72、73、89-97、102和107中所提供的序列的分離多核苷酸。
5.含有根據(jù)權(quán)利要求3和4之任意一項(xiàng)的多核苷酸的表達(dá)載體。
6.用權(quán)利要求5的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求1的多肽和生理上可接受的載體的藥物組合物。
9.含有權(quán)利要求1的多肽和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的疫苗。
10.權(quán)利要求9的疫苗，其中該非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
11.含有權(quán)利要求3和4之任意一項(xiàng)的分離多核苷酸和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的疫苗。
12.權(quán)利要求11的疫苗，其中該非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
13.含有多肽和生理上可接受載體的用于治療乳腺癌的藥物組合物，該多肽含有乳腺蛋白的免疫原性部分，其中所述蛋白含有由這樣一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有選自下組的序列(a)SEQ IDNOS1、2、4-9、11-16、18-23、25-44、53、54、68-71、74-88和103-106中所示的核苷酸序列；(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和(c)在中等嚴(yán)緊條件下與(a)或(b)的序列雜交的序列。
14.含有多肽和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的用于治療乳腺癌的疫苗，所述多肽含有乳腺蛋白的免疫原性部分，其中所述蛋白含有由這樣一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有選自下組的序列(a)SEQID NOS1、2、4-9、11-16、18-23、25-44、53、54、68-71、74-88和103-106中所示的核苷酸序列；(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和(c)在中等嚴(yán)緊條件下與(a)或(b)的序列雜交的序列。
15.權(quán)利要求14的疫苗，其中該非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
16.含有多核苷酸和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的用于治療乳腺癌的疫苗，該多核苷酸含有選自下組的序列(a)SEQ ID NOS1、2、4-9、11-16、18-23、25-44、53、54、68-71、74-88和103-106中所示的核苷酸序列；(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和(c)在中等嚴(yán)緊條件下與(a)或(b)的序列雜交的序列。
17.權(quán)利要求16的疫苗，其中該非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求8和13之任意一項(xiàng)的藥物組合物，用于制備抑制患者乳腺癌發(fā)展的藥物。
19.根據(jù)權(quán)利要求9、11、14或16之任意一項(xiàng)的疫苗，用于制備抑制患者乳腺癌發(fā)展的藥物。
20.含有至少一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的融合蛋白。
21.含有根據(jù)權(quán)利要求20的融合蛋白和生理上可接受的載體的藥物組合物。
22.含有根據(jù)權(quán)利要求20的融合蛋白和非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑的疫苗。
23.權(quán)利要求22的疫苗，其中該非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑是佐劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，用于制備抑制患者乳腺癌發(fā)展的藥物。
25.根據(jù)權(quán)利要求22的疫苗，用于制備抑制患者乳腺癌發(fā)展的藥物。
26.檢測患者體內(nèi)乳腺癌的方法，包括(a)用能夠與多肽結(jié)合的結(jié)合劑接觸來自患者的生物樣品，該多肽含有乳腺蛋白的免疫原性部分，其中所述蛋白含有由這樣一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有選自如下組的序列SEQ ID NOS1-97、100和102-107中所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和在中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NOS1-97、100和102-107中所提供的序列雜交的序列；和(b)檢測樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽，籍此檢測患者中的乳腺癌。
27.權(quán)利要求26的方法，其中該結(jié)合劑是單克隆抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該結(jié)合劑時(shí)多克隆抗體。
29.監(jiān)測患者乳腺癌進(jìn)展趨勢的方法，包括(a)用能夠與多肽結(jié)合的結(jié)合劑接觸來自患者的生物樣品，該多肽含有乳腺蛋白的免疫原性部分，其中所述蛋白含有由這樣一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有選自如下組的序列SEQ ID NOS1-97、100和102-107中所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和在中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NOS1-97、100和102-107中所提供的序列雜交的序列；和(b)確定樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽的量；(c)重復(fù)步驟(a)和(b)；和(d)比較步驟(b)和(c)所檢測到的多肽的量，以監(jiān)測患者中乳腺癌的進(jìn)展趨勢。
30.與多肽結(jié)合的單克隆抗體，該多肽含有乳腺蛋白或所述蛋白之變體的免疫原性部分，該變體僅因保守替代和/或修飾而與所述蛋白不同，其中所述蛋白含有由這樣一種多核苷酸編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸含有選自如下組的序列(a)SEQ ID NOS3、10、17、24、45-52、55-67、72、73、89-97、102和107中所示的核苷酸序列；(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和(c)在中等嚴(yán)緊條件下與(a)或(b)的序列雜交的序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的單克隆抗體，用于制備抑制患者乳腺癌發(fā)展的藥物。
32.權(quán)利要求31的單克隆抗體，其中該單克隆抗體與治療劑偶聯(lián)。
33.檢測患者中乳腺癌的方法，包括(a)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中用至少兩個(gè)寡核苷酸引物接觸來自患者的生物樣品，其中至少一個(gè)寡核苷酸對編碼含有乳腺蛋白免疫原性部分的多肽的多核苷酸是特異的，所述蛋白含有由包含選自如下組的序列的多核苷酸編碼的氨基酸序列SEQ ID NO1-97、100和102-107中所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和在中等嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO1-97、100和102-107的序列雜交的序列；和(b)檢測樣品中在這些寡核苷酸引物存在時(shí)擴(kuò)增的多核苷酸序列，籍此檢測乳腺癌。
34.權(quán)利要求33的方法，其中至少一個(gè)該寡核苷酸引物含有包含選自SEQ ID NOS1-97、100和102-107的序列的多核苷酸中至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸。
35.診斷試劑盒，其含有(a)權(quán)利要求30的一種或多種單克隆抗體；和(b)檢測試劑。
36.診斷試劑盒，其含有(a)可與由多核苷酸編碼的多肽結(jié)合的一種或多種單克隆抗體，該多核苷酸含有選自下組的核苷酸序列SEQ ID NOS1、2、4-9、11-16、18-23、25-44、53、54、68-71、74-88和103-106；所述序列的互補(bǔ)序列；和在中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1、2、4-9、11-16、18-23、25-44、53、54、68-71、74-88或103-106的序列雜交的序列。(b)檢測試劑。
37.權(quán)利要求35或36的試劑盒，其中該單克隆抗體被固定在固相支持物上。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中該固相支持物含有硝酸纖維素、膠乳或塑料材料。
39.權(quán)利要求35或36的試劑盒，其中該檢測試劑含有與結(jié)合劑偶聯(lián)的報(bào)道基團(tuán)。
40.權(quán)利要求39的試劑盒，其中該結(jié)合劑選自抗免疫球蛋白、G蛋白、A蛋白和凝集素。
41.權(quán)利要求39的試劑盒，其中該報(bào)道基團(tuán)選自放射性同位素、熒光基團(tuán)、發(fā)光基團(tuán)、酶、生物素和染料顆粒。
42.含有至少兩個(gè)寡核苷酸引物的診斷試劑盒，該寡核苷酸引物的至少一個(gè)對編碼含有乳腺蛋白免疫原性部分的多肽的多核苷酸是特異的，所述蛋白含有由包含選自如下組的序列的多核苷酸編碼的氨基酸序列SEQ ID NO1-97、100和102-107中所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和在中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1-97、100和102-107的序列雜交的序列。
43.權(quán)利要求42的診斷試劑盒，其中該寡核苷酸引物的至少一個(gè)含有包含選自SEQ ID NOS1-97、100和102-107的序列的多核苷酸中的至少約10個(gè)連續(xù)核苷酸。
44.檢測患者乳腺癌的方法，包括(a)從該患者獲得生物樣品；(b)用對編碼含有乳腺蛋白免疫原性部分的多肽的多核苷酸特異的寡核苷酸探針接觸該生物樣品，所述蛋白含有由包含選自如下組的序列的多核苷酸編碼的氨基酸序列SEQ ID NO1-97、100和102-107中所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和在中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1-97、100和102-107的序列雜交的序列；和(c)檢測該樣品中與該寡核苷酸探針雜交的多核苷酸序列，籍此檢測該患者中的乳腺癌。
45.權(quán)利要求44的方法，其中該寡核苷酸探針含有包含選自SEQ IDNOS1-97、100和102-107的序列的多核苷酸中的至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸。
46.診斷試劑盒，其包括對編碼含有乳腺蛋白免疫原性部分的多肽的多核苷酸特異的寡核苷酸探針，所述蛋白含有由包含選自如下組的序列的多核苷酸編碼的氨基酸序列SEQ ID NO1-97、100和102-107中所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列；和在中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1-97、100和102-107的序列雜交的序列。
47.權(quán)利要求46的診斷試劑盒，其中該寡核苷酸探針含有包含選自SEQ ID NOS1-97、100和102-107的序列的多核苷酸中的至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸。
48.治療患者的乳腺癌的方法，包括步驟(a)從該患者獲得外周血細(xì)胞；(b)在至少一種權(quán)利要求1和2之任意一項(xiàng)的多肽存在時(shí)孵育該細(xì)胞，使得T細(xì)胞增殖；和給該患者施用該增殖的T細(xì)胞。
49.治療患者的乳腺癌的方法，包括步驟(a)從該患者獲得外周血細(xì)胞；(b)在至少一種權(quán)利要求3和4之任意一項(xiàng)的多核苷酸存在時(shí)孵育該細(xì)胞，使得T細(xì)胞增殖；和(c)給該患者施用該增殖的T細(xì)胞。
50.權(quán)利要求48和49之任意一項(xiàng)的方法，其中將細(xì)胞孵育步驟重復(fù)一或多次。
51.權(quán)利要求48和49之任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)還包括從該外周血細(xì)胞中分離T細(xì)胞，并且在步驟(b)中孵育的細(xì)胞是該T細(xì)胞。
52.權(quán)利要求48和49之任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)還包括從該外周血細(xì)胞中分離CD4+細(xì)胞或CD8+細(xì)胞，并且在步驟(b)中增殖的細(xì)胞是該CD4+細(xì)胞或CD8+細(xì)胞。
53.權(quán)利要求48和49之任意一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)還包括對在該多肽存在時(shí)增殖的至少一種T細(xì)胞進(jìn)行克隆。
54.治療患者乳腺癌的組合物，其含有在權(quán)利要求1和2之任意一項(xiàng)的多肽存在時(shí)增殖的T細(xì)胞，以及可藥用載體。
55.治療患者乳腺癌的組合物，其含有在權(quán)利要求3和4之任意一項(xiàng)的多核苷酸存在時(shí)增殖的T細(xì)胞，以及可藥用載體。
56.治療患者乳腺癌的方法，包括步驟(a)在至少一種權(quán)利要求1和2之任意一項(xiàng)的多肽存在時(shí)孵育抗原呈遞細(xì)胞；和(b)給患者施用該孵育過的抗原呈遞細(xì)胞。
57.治療患者乳腺癌的方法，包括步驟(a)在至少一種權(quán)利要求3和4之任意一項(xiàng)的多核苷酸存在時(shí)孵育抗原呈遞細(xì)胞；和(b)給患者施用該孵育過的抗原呈遞細(xì)胞。
58.權(quán)利要求56或57的方法，其中該抗原呈遞細(xì)胞選自樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B細(xì)胞或它們的組合。
59.治療患者乳腺癌的組合物，其含有在權(quán)利要求1和2之任意一項(xiàng)的多肽存在時(shí)孵育過的抗原呈遞細(xì)胞，以及可藥用載體。
60.治療患者乳腺癌的組合物，其含有在權(quán)利要求3和4之任意一項(xiàng)的多核苷酸存在時(shí)孵育過的抗原呈遞細(xì)胞，以及可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療和診斷乳腺癌的化合物和方法。本發(fā)明化合物包括含有乳腺腫瘤蛋白的至少一個(gè)部分的多肽。本發(fā)明還提供含有這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸、用于免疫治療乳腺癌的疫苗和藥物組合物,以及用于制備本發(fā)明多肽的多核苷酸。
文檔編號C07K19/00GK1355844SQ00807046
公開日2002年6月26日 申請日期2000年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月9日
發(fā)明者S·G·瑞德, J·許, D·C·狄隆 申請人:科里克薩有限公司