專利名稱：利用免疫玫瑰花結(jié)分離細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用免疫玫瑰花結(jié)(immunorosettes)分離細(xì)胞的方法。本發(fā)明包括在本發(fā)明的方法中使用的新型抗體組合物。
純化的免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞)群體是研究免疫功能所必需的，并在免疫治療中使用。對細(xì)胞、分子和生物化學(xué)過程的研究需要分析分離的某些細(xì)胞型。大量技術(shù)已經(jīng)用于分離T細(xì)胞亞組、B細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突細(xì)胞。
造血干細(xì)胞的分離也已經(jīng)是備受關(guān)注的領(lǐng)域。純干細(xì)胞群體將促進(jìn)對血細(xì)胞生成的研究，來自外周血和/或骨髓的造血細(xì)胞的移植越來越多地與高劑量化學(xué)治療和/或放射治療結(jié)合用于治療多種疾病，包括惡性、非惡性和遺傳疾病。這些移植物中的極少量細(xì)胞能長期造血重建，因此有一種強(qiáng)烈需求來發(fā)展造血干細(xì)胞的純化技術(shù)。此外，嚴(yán)重的并發(fā)癥和實際上移植方法的成功很大程度上依賴于用于去除移植物中對移植受體造成危險的細(xì)胞的方法的效果。這些細(xì)胞包括引起異體移植中移植物抗宿主疾病(GVHD)的T淋巴細(xì)胞，和可引起惡性生長復(fù)發(fā)的自體移植物中的腫瘤細(xì)胞。通過除去不必要的細(xì)胞，從而減少需輸入的細(xì)胞保藏劑的體積，縮減移植物也是重要的。
在某些情況中，從生物樣品如骨髓移植物中除去或排除腫瘤細(xì)胞是希望的。支氣管、乳房導(dǎo)管和胃腸道及泌尿生殖道的上皮癌代表了今天所能見到的主要的實體瘤類型。微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞遷移被認(rèn)為是上皮癌患者的一個重要的預(yù)后因素(Braun等人，2000；Vaughan等人，1990)。檢測這些轉(zhuǎn)移細(xì)胞的能力受組織或液體取樣的效率和腫瘤檢測方法靈敏度的限制。一種富集血樣中循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞的技術(shù)會提高檢測轉(zhuǎn)移疾病的能力，并將促進(jìn)對這些稀少細(xì)胞的研究和確定使疾病擴(kuò)散的生物學(xué)變化。
造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞已經(jīng)根據(jù)物理性質(zhì)(如密度)和對可殺傷循環(huán)細(xì)胞的某些藥理試劑的敏感性分離。抗細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體的出現(xiàn)已經(jīng)大大擴(kuò)展了區(qū)別和分離不同細(xì)胞型的能力。用單克隆抗體從血液和相關(guān)細(xì)胞懸液中分離細(xì)胞群體有兩種基本方法。它們的不同之外在于是用抗體區(qū)別、標(biāo)記希望的還是不希望的細(xì)胞。
在正選擇技術(shù)中，希望的細(xì)胞用抗體標(biāo)記，并從剩余的未標(biāo)記/不必要的細(xì)胞中移出。在負(fù)選擇中，標(biāo)記并移出不需要的細(xì)胞?？贵w/補(bǔ)體處理和免疫毒素的使用是負(fù)選擇技術(shù)，但是FACS分選和大多數(shù)分批免疫吸附技術(shù)能適用于正選擇和負(fù)選擇兩者。在免疫吸附技術(shù)中，細(xì)胞用單克隆抗體選擇，優(yōu)先結(jié)合到能從剩余細(xì)胞中去除的表面上，例如珠柱、燒瓶、磁性顆粒。免疫吸附技術(shù)在臨床上和研究中受到歡迎，因為它們保持了用單克隆抗體導(dǎo)向細(xì)胞的高特異性，但是不同于FACS分選，它們能被放大，以直接處理臨床收獲物中的大量細(xì)胞，它們避免了使用細(xì)胞毒性試劑(如免疫毒素)和補(bǔ)體的危險。然而，它們需要利用“裝置”或細(xì)胞分離表面，如珠柱、淘洗瓶或磁鐵。
分離造血干細(xì)胞、免疫細(xì)胞和循環(huán)上皮腫瘤細(xì)胞的現(xiàn)有技術(shù)全都包括一個初始步驟，來除去紅細(xì)胞，然后是對一種裝置或人工顆粒的抗體介導(dǎo)的粘附。(Firat等人，1988；de Wynter等人，1975；Shpall等人，1994；Thomas等人，1994；Miltenyi Biotec Inc.，Gladbach，德國)。在正選擇的情況中，還有另外一個步驟從該裝置或顆粒中去除細(xì)胞。所有這些多個步驟都需要時間并且導(dǎo)致細(xì)胞損失。Slaper-Cortenbach等人(1990)描述了一種利用形成免疫玫瑰花結(jié)凈化骨髓的普通急性白血病(cALL)細(xì)胞的方法。該方法需要首先從骨髓樣品中去除紅細(xì)胞，并用可結(jié)合cALL細(xì)胞的抗體標(biāo)記。標(biāo)記的紅細(xì)胞然后被加回cALL細(xì)胞已形成免疫玫瑰花結(jié)的樣品中。當(dāng)隨后還有一個補(bǔ)體介導(dǎo)的cALL細(xì)胞裂解步驟時，該排除方法效果最好。
密度分離通常用于將外周血單核細(xì)胞與粒細(xì)胞和紅細(xì)胞分離。Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典)是用于此用途的最常用的密度溶液。在Ficoll密度分離中，全血在Ficoll上分層，然后離心。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞位于細(xì)胞沉淀中，而單核細(xì)胞保持在Ficoll血漿界面。該技術(shù)的成功依賴于單核細(xì)胞和粒細(xì)胞密度的不同。如果全血貯存超過24小時，粒細(xì)胞密度改變，將與紅細(xì)胞一起沉淀。在一次密度分離中不能從細(xì)胞密度改變的貯存的血液或樣品中獲得純單核細(xì)胞懸液。
由上可見，在本領(lǐng)域中需要提供新型方法，用來從生物樣品中分離希望的細(xì)胞或去除不希望的細(xì)胞。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種從含有具核細(xì)胞和紅細(xì)胞的樣品中分離具核細(xì)胞的方法，其包括(1)在具核細(xì)胞與紅細(xì)胞可形成免疫玫瑰花結(jié)的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與將要分離的具核細(xì)胞上的抗原結(jié)合，該抗體與(b)至少一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體直接或間接地連接；和
(2)從樣品中去除免疫玫瑰花結(jié)。
該方法能在正選擇和負(fù)選擇方案中使用。該方法適用于含有紅細(xì)胞的任何樣品，包括全血、骨髓、胎肝、臍帶血、棕黃層懸液、胸膜和腹膜滲出液和胸腺細(xì)胞及脾細(xì)胞樣品。
發(fā)明詳述I.發(fā)明方法如上所述，本發(fā)明涉及一種通過細(xì)胞與紅細(xì)胞形成免疫玫瑰花結(jié)分離細(xì)胞的方法。
最廣義的來講，本發(fā)明提供一種從含有具核細(xì)胞和紅細(xì)胞的樣品中分離具核細(xì)胞的方法，其包括(1)在具核細(xì)胞與紅細(xì)胞可形成免疫玫瑰花結(jié)的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與將要分離的具核細(xì)胞上的抗原結(jié)合，該抗體與(b)至少一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體直接或間接地連接；和(2)從樣品中去除免疫玫瑰花結(jié)。
該方法能在正選擇和負(fù)選擇方案中使用。在正選擇中，希望的細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。在這種實施方案中，該方法進(jìn)一步包括裂解免疫玫瑰花結(jié)中的紅細(xì)胞和分離希望的細(xì)胞的步驟。因此在正選擇方法中，抗體組合物將含有(a)至少一種抗體，其對人們希望獲得或從樣品中分離的具核細(xì)胞特異。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法在負(fù)選擇方案中使用。在負(fù)選擇中，希望的細(xì)胞不形成免疫玫瑰花結(jié)，而是在去除免疫玫瑰花結(jié)后保留在樣品中。在負(fù)選擇方法中，抗體組合物將含有(a)至少一種抗體，其對人們希望從樣品中去除的細(xì)胞特異。因此，本發(fā)明提供一種負(fù)選擇方法，用于在含有希望的細(xì)胞、紅細(xì)胞和不希望的細(xì)胞的樣品中富集并回收希望的細(xì)胞，該方法包括(1)在不希望的細(xì)胞與紅細(xì)胞可形成免疫玫瑰花結(jié)的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與不希望的細(xì)胞上的抗原結(jié)合，該抗體與(b)至少一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體直接或間接地連接；和(2)從剩余樣品中分離免疫玫瑰花結(jié)，以獲得富含希望的細(xì)胞的樣品。
利用多種技術(shù)，能將在步驟(1)中紅細(xì)胞和不需要的細(xì)胞之間形成的免疫玫瑰花結(jié)與希望的細(xì)胞分離。在一個實施方案中，含有疫玫瑰花結(jié)的樣品在浮力密度溶液(如Ficoll-Hypaque)上分層并離心。免疫玫瑰花結(jié)沉淀，而希望的細(xì)胞保留在浮力密度溶液與樣品之間的界面上。然后從界面上移出希望的細(xì)胞供進(jìn)一步使用。在另外一個實施方案中，在步驟(1)中獲得的含有免疫玫瑰花結(jié)的樣品與一種沉淀試劑(如羥乙基淀粉/明膠或甲基纖維素)混合，并使玫瑰花結(jié)沉淀。需要的細(xì)胞保留在懸液中，移出用于進(jìn)一步用途。在另一個實施方案中，在步驟(1)中獲得的含有免疫玫瑰花結(jié)的樣品在借助或不借助離心或反向流動淘析的情況下沉淀。希望的細(xì)胞保留在懸液中，移出用于進(jìn)一步的用途。
下面更詳細(xì)地描述本發(fā)明使用的抗體組合物。
本發(fā)明的方法可在含有紅細(xì)胞的生物樣品(包括血液(特別是臍帶血和全血)、骨髓、胎肝、棕黃層懸液、胸膜和腹膜滲出液和胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液)的處理中使用。令人驚訝的是，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)該方法能用來直接從全血或全骨髓中除去細(xì)胞，而不需要預(yù)先處理。這使本發(fā)明的方法具有優(yōu)于現(xiàn)有方法的一個重要優(yōu)點。特別是，紅細(xì)胞中不須被去除、標(biāo)記和加回樣品中。
本發(fā)明的方法能用來制備富含任何細(xì)胞型的樣品，這些細(xì)胞型包括但不限于T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、先祖細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法能用來由骨髓樣品制備造血先祖和干細(xì)胞制品。例如，本發(fā)明的方法可在負(fù)選擇方案中用來從樣品中排除或凈化B和T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞，以制備造血先祖和干細(xì)胞制品，以在本領(lǐng)域技術(shù)人員明白的移植以及其他治療方法中使用。例如，在異體移植中能從供體中收集骨髓或血液，并用此處描述的方法富集先祖和干細(xì)胞。利用負(fù)選擇，制品中的人造血先祖和干細(xì)胞不被抗體覆蓋，或修飾，使其十分適用于移植和本領(lǐng)域技術(shù)人員明白的其他治療用途。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法能用來從血液中分離并回收成熟樹突細(xì)胞和它們的前體。樹突細(xì)胞有許多有用的用途，包括作為能在體外和體內(nèi)都激活T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞。一個例子是，樹突細(xì)胞能在體外裝載(脈沖)一種腫瘤抗原，并且體內(nèi)注射，誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法也可用來由樣品(如血液和骨髓)制備細(xì)胞懸液，其富含所選的分化細(xì)胞型，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞。這使得能研究細(xì)胞與細(xì)胞的特異相互作用，包括生長因子產(chǎn)生和對生長因子的反應(yīng)。這也允許對特異細(xì)胞型進(jìn)行分子和生物化學(xué)分析。富含NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞和T細(xì)胞的細(xì)胞制品也能在針對某些惡性疾病的免疫治療中使用。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法能用來從樣品中分離腫瘤細(xì)胞，例如非造血轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞。該方法在檢測來自患者的血液、骨髓、腹膜和胸膜滲出液的非造血腫瘤細(xì)胞中有用，以幫助轉(zhuǎn)移疾病的診斷和檢測，監(jiān)視轉(zhuǎn)移疾病的發(fā)展，監(jiān)視治療的效果。II.抗體組合物本發(fā)明包括在本發(fā)明的方法中使用的抗體組合物。該抗體組合物將包含(a)至少一種抗體，它能與具核細(xì)胞上的一種抗原結(jié)合，該抗體與(b)至少一種能與紅細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體直接或間接地連接。
術(shù)語“至少一種抗體”意指抗體組合物至少包含一種類型的抗體(與至少一個抗體分子不同)。一種類型的抗體是指一種可與特定抗原結(jié)合的抗體。例如，可與抗原CD2結(jié)合的抗體被認(rèn)為是一種類型的抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體組合物含有(a)一種以上的可與具核細(xì)胞結(jié)合的抗體類型。
兩種抗體(a)和(b)可通過制備的雙功能或雙特異性抗體直接連接。兩種抗體(a)和(b)也可通過例如制備的四聚抗體復(fù)合物間接連接。所有這些都在以下描述。
一方面，對具核細(xì)胞特異的抗體直接與紅細(xì)胞特異的抗體連接。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體組合物含有雙功能抗體，其包含至少一種對具核細(xì)胞特異的抗體，其與(b)至少一種紅細(xì)胞特異性抗體直接連接。雙功能抗體可通過將一種抗體與另一種抗體化學(xué)偶聯(lián)制備，例如，使用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)。
在另一個實施方案中，抗體組合物含有雙特異性抗體。雙特異性抗體含有紅細(xì)胞特異的抗體的可變區(qū)，和對于將要分離的具核細(xì)胞表面上的至少一種抗原特異的可變區(qū)。雙特異性抗體可通過形成雜種雜交瘤制備。雜種雜交瘤可以用本領(lǐng)域周知的方法制備，例如Staerz和Bevan(1986，PNAS(USA)831453)和Staerz和Bevan(1986，Immunology Today，7241)中所公開的。雙特異性抗體也可通過使用如Staerz等人(1985，Nature，314628)和Perez等人(1985，Nature316354)所述的方法通過化學(xué)方法構(gòu)建，或通過重組免疫球蛋白基因構(gòu)建體的表達(dá)構(gòu)建。
另一方面，本發(fā)明的抗體組合物含有(a)至少一種對具核細(xì)胞型特異的抗體，其與(b)至少一種紅細(xì)胞特異的抗體間接連接?！伴g接連接”意指抗體(a)和抗體(b)不是彼此直接共價連接，而是通過連接部分(如免疫復(fù)合物)連接。在一個優(yōu)選實施方案中，通過制備四聚抗體復(fù)合物將具核細(xì)胞型的抗體與紅細(xì)胞特異的抗體間接連接?？梢酝ㄟ^將能與紅細(xì)胞結(jié)合的第一種單克隆抗體與能與將要分離的具核細(xì)胞結(jié)合的第二種單克隆抗體混合制備四聚抗體復(fù)合物。第一種和第二種單克隆抗體來自第一種動物種。第一種和第二種抗體與大約等摩爾量的第二種動物種的單克隆抗體反應(yīng)，后者抗第一種動物種的抗體的Fc-片段。第一種和第二種抗體也可與大約等摩爾數(shù)量的第二種動物種的單克隆抗體的F(ab′)2片段反應(yīng)，后者抗第一種動物種的抗體的Fc-片段。(參見授予Lansdorp的美國專利號4,868,109，關(guān)于四聚抗體復(fù)合物及其制備方法的描述在此引用作為參考)。
優(yōu)選地，紅細(xì)胞特異的抗體是抗-血型糖蛋白A。本發(fā)明的抗體組合物中含有的抗-血型糖蛋白A用來結(jié)合紅細(xì)胞。血型糖蛋白A特異的單克隆抗體的例子有10F7MN(美國專利號4,752,582，細(xì)胞系A(chǔ)TCC保藏號HB-8162)和D2.10(Immunotech，馬賽，法國)。
優(yōu)選地，具核細(xì)胞特異的抗體是一種抗體組合。抗體組合可以對許多細(xì)胞型特異，使得可以從樣品中去除許多細(xì)胞型。當(dāng)使用抗體組合時，每種抗體將與一種紅細(xì)胞特異的抗體連接(直接或間接地)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體組合物是一種四聚復(fù)合物，其含有(a)可結(jié)合紅細(xì)胞的抗-血型糖蛋白A抗體，(b)一種可與人們希望形成免疫玫瑰花結(jié)的具核細(xì)胞型結(jié)合的抗體，和(c)可與(a)和(b)兩者的Fc部分(任選的F(ab’)2抗體片段)結(jié)合的抗體。(a)∶(b)∶(c)的摩爾比可能約為1∶3∶4。當(dāng)要分離幾種類型的細(xì)胞時，可用幾種抗-具核細(xì)胞抗體(b)制備復(fù)合物。然后可將復(fù)合物一起混合，形成一種抗體組合物，供本發(fā)明的方法使用。

圖1是通過四聚抗體復(fù)合物形成的玫瑰花結(jié)的示意圖。
在本

發(fā)明內(nèi)容
中，抗體被理解為包括單克隆抗體和多克隆抗體、抗體片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab′)2)、嵌合抗體、雙功能或雙特異性抗體和四聚抗體復(fù)合物。如果以適當(dāng)?shù)挠H和力(結(jié)合常數(shù))結(jié)合，例如大于或等于107M-1，則認(rèn)為抗體對具核細(xì)胞或紅細(xì)胞表面上的選擇抗原有反應(yīng)性。
單克隆抗體優(yōu)選地在本發(fā)明的抗體組合物中使用。對于具核細(xì)胞表面上的選擇抗原特異的單克隆抗體可以利用常規(guī)技術(shù)容易地產(chǎn)生。例如，單克隆抗體可以通過Kohler和Milstein 1975發(fā)展的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生(Nature 256，495-497；參見美國專利號RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993，在此引用作為參考；參見《單克隆抗體，雜種瘤生物學(xué)分析的一個新方面》，Plenum Press，Kennett，McKearn，Bechtol(編)1980，和《抗體實驗室手冊》，Harlow和Lane(編)，冷泉港實驗室出版社，1988)。也可利用其他技術(shù)構(gòu)建單克隆抗體(例如，參見William D.Huse等人，1989，“在λ噬菌體中產(chǎn)生免疫球蛋白組成成分大組合文庫”，Science 2461275-1281，L.Sastry等人，1989，“為了產(chǎn)生單克隆催化抗體，免疫學(xué)組成成分在大腸桿菌中的克隆重鏈可變區(qū)特異cDNA文庫的構(gòu)建”，Proc Natl.Acad.Sci.USA865728-5732；Kozbor等人，1983 Immunol.Today 4,72，關(guān)于人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)；Cole等人，1985，《癌癥治療中的單克隆抗體》，AllenR.Bliss，Inc.，77-96頁，關(guān)于生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)；參見Michelle Alting-Mees等人，1990，“單克隆抗體表達(dá)文庫雜交瘤的一種快速替代” Strategies in Molecular Biology 31-9)。為了生產(chǎn)對抗原有特異反應(yīng)性的抗體，能免疫化學(xué)篩選雜交瘤細(xì)胞，并可分離單克隆抗體。
抗體可以用常規(guī)技術(shù)切成片段，并用與以上對于完整抗體相同的方法依用途篩選這些片段。例如，F(xiàn)(ab′)2片段能通過用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生?？商幚懋a(chǎn)生的F(ab′)2片段，還原二硫橋，產(chǎn)生Fab’片段。
本發(fā)明也涉及嵌合抗體衍生物，即結(jié)合了非人動物可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體分子。嵌合抗體分子可包括，例如，來自小鼠、大鼠或其他種的抗體的抗原結(jié)合域，及人恒定區(qū)。已經(jīng)描述了多種制備嵌合抗體的方法，它們能用來制備含有可識別分化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面上的選擇抗原的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體。參見，例如，Morrison等人，1985；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Takeda等人，1985，Nature 314452；Cabilly等人，美國專利號4,816,567；Boss等人，美國專利號4,816,397；Tanaguchi等人，歐洲專利公開文本EP171496；歐洲專利公開文本0173494，英國專利2177096B。
雙功能抗體可通過化學(xué)偶聯(lián)、體細(xì)胞雜交或遺傳工程技術(shù)制備。
化學(xué)偶聯(lián)是基于含有ε-氨基或絞鏈區(qū)硫醇基的同型和異型雙功能試劑的使用。同型雙功能試劑如5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB)在兩個Fab之間產(chǎn)生二硫鍵，O-次苯基二馬來酰亞胺(O-PDM)在兩個Fab之間產(chǎn)生硫醚鍵(Brenner等人，1985，Glennie等人，1987)。異型雙功能試劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)結(jié)合抗體的暴露氨基和Fab片段，而無論類型或同種型如何(Van Dijk等人，1989)。
體細(xì)胞雜交包括兩種建立的雜種瘤的融合，產(chǎn)生四合瘤(quadroma)(Milstein和Cuello，1983)，或一種建立的雜交瘤與來自用第二種抗原免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞的融合，產(chǎn)生三合瘤(trioma)(Nolan和Kennedy，1990)。使每種雜交瘤細(xì)胞系對特異抗藥性標(biāo)記有抗性(De Lau等人，1989)，或用不同熒光染料標(biāo)記每種雜交瘤并分選出異源熒光細(xì)胞(Karawajew等人，1987)，選擇雜種雜交瘤。
遺傳工程包括基于重組DNA的技術(shù)的使用，以將編碼抗體特異片段的DNA序列連接于質(zhì)粒中，并表達(dá)重組蛋白。雙特異性抗體也能使用接頭通過結(jié)合兩種單鏈Fv(scFv)片段制備為單一共價結(jié)構(gòu)(Winter和Milstein，1991)；作為共表達(dá)來自轉(zhuǎn)錄因子fos和jun的序列的亮氨酸拉鏈(Kostelny等人，1992)；共表達(dá)p53作用域的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(Rheinnecker等人，1996)，或diabodies(Holliger等人，1993)。
表1提供針對具核細(xì)胞上特定人抗原的抗體的例子，它們可在本發(fā)明的方法中使用。本發(fā)明的方法也可用于其他物種。針對具核細(xì)胞的一種或多種抗體的選擇將取決于樣品的性質(zhì)、將要富集或排除的細(xì)胞的選擇，和該方法是正選擇還是負(fù)選擇方法。在所有情況中，當(dāng)在本發(fā)明的方法中使用時，針對將要形成免疫玫瑰花結(jié)的具核細(xì)胞的抗體將與紅細(xì)胞特異的抗體直接或間接連接。
本發(fā)明的方法和抗體組合物優(yōu)選地在負(fù)選擇方案中，用來制備一種富含特定細(xì)胞型的細(xì)胞制品。這通過使用缺乏針對希望分離的特定細(xì)胞型的抗體的抗體組合物實現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供一種抗體組合物，用于在含有希望的細(xì)胞、紅細(xì)胞和不希望的細(xì)胞的樣品中富集和回收希望的細(xì)胞，該抗體組合物含有(a)至少一種可與不希望的細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體，其與(b)至少一種可結(jié)合紅細(xì)胞的抗體連接。表2列出了可在本發(fā)明的負(fù)選擇方案中用于人體細(xì)胞的抗體組合物的具體實施方案。該表提供了能在上述方法中用作抗體(a)富集特定細(xì)胞型的抗特定抗原抗體的列表和混合配方(雞尾酒)。在大多數(shù)情況中，提供了必需抗體的幾種選擇，以及幾種任選的抗體。例如，為了富集T細(xì)胞，抗體(a)可以是抗下列成分的抗體的雞尾酒(1)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(3)CD36和/或CD14。雞尾酒可任選地含有抗CD33和/或CD56和/或IgE和/或CD41的抗體。除了表2列出的抗體組合外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，也可用其他抗體組合富集特定細(xì)胞型，如美國專利號5,877,299所述，在此引用作為參考。由于本發(fā)明涉及制備富集細(xì)胞制品的免疫玫瑰花結(jié)的制備，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，也可使用其他抗體和抗體組合。
本發(fā)明的方法和抗體組合物可在正選擇方案中，用來制備一種細(xì)胞制品，其中希望的細(xì)胞形成免疫玫瑰花結(jié)。下面列出了在正選擇方案中有用的抗體組合的一些例子。
為了用正選擇方法分離非造血腫瘤細(xì)胞，抗體組合物包含對腫瘤細(xì)胞表達(dá)的非造血抗原特異的抗體，如抗乳癌和肺癌和成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原的抗體。上皮腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的非造血抗原的抗體可從商業(yè)來源獲得(如表3所示)，或可用本領(lǐng)域周知的技術(shù)制備。
為了用正選擇方法分離B細(xì)胞，抗體組合物含有抗CD24和/或CD19和/或CD20和/或CD22的抗體。
為了用正選擇方法分離T細(xì)胞，抗體組合物含有抗CD3和/或CD2和/或CD5和/或CD4和CD8兩者的抗體。
為了用正選擇方法分離NK細(xì)胞，抗體組合物含有抗CD56的抗體。
為了用正選擇方法分離粒細(xì)胞，抗體組合物含有抗CD16和/或CD66e和/或CD66b的抗體。
為了用正選擇方法分離單核細(xì)胞，抗體組合物含有抗CD14的抗體。
下列非限制性實施例說明本發(fā)明實施例抗體組合物根據(jù)人們希望排除哪些細(xì)胞通過結(jié)合不同的四聚抗體復(fù)合物制備。不同的四聚抗體復(fù)合物的濃度不同抗具核細(xì)胞上表達(dá)的抗原的抗體一般在四聚復(fù)合物中為10-30μg/mL。該組合物然后向細(xì)胞中1/10稀釋，使細(xì)胞懸液中每種抗具核細(xì)胞抗體的終濃度為1.0-3.0μg/mL。
1.每mL全外周血加入100μL抗體組合物。
2.在室溫下溫育20分鐘。
3.用等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)+2％胎牛血清(FCS)稀釋樣品，并輕輕混合。
4.將被稀釋的樣品在Ficoll Hypaque上分層，或使Ficoll在被稀釋的樣品之下分層。
5.在關(guān)閉剎車的情況下，在室溫下以1200×g離心20分鐘。
6.從Ficoll血漿界面移出富集的細(xì)胞。
7.用5-10×體積的PBS+2％FBS洗滌富集的細(xì)胞。
注意為了富集單核細(xì)胞和其他粘附細(xì)胞，向全血樣品和所有洗滌/稀釋溶液中加入1mM EDTA。
1.每5mL血液和混合物加入1mL 6％羥乙基淀粉鹽水溶液。
2.向全血中加入實施例1中描述的抗體組合物，使得每種抗-具核細(xì)胞抗體的終濃度為1.0-2.0μg/mL。
3.在室溫下溫育10分鐘。
4.在室溫下以50×g離心5分鐘。
5.取出上清液。該級分中含有富集的細(xì)胞。
6.用2-5×體積的PBS+2％胎牛血清(FBS)洗滌富集的細(xì)胞級分。
1.每5mL血液和混合物中加入1mL 6％羥乙基淀粉鹽水溶液。
2.加入0.6mL的60％w/v碘克沙醇和混合物。碘克沙醇是許多可略微增加水溶液密度的化合物之一。
3.向全血中加入實施例1中描述的抗體組合物，使每種抗-具核細(xì)胞抗體的終濃度為1.0-2.0μg/mL。
4.在室溫下溫育10分鐘。
5.在室溫下以50×g離心5分鐘。
6.移出上清液。該級分中含有富集的細(xì)胞。
7.用2-5×體積的PBS+2％FBS洗滌富集的細(xì)胞級分。
1.留出1mL血液。
2.將10mL血液在Ficoll-Paque上分層，并在室溫和關(guān)閉剎車的情況下，以1200×g離心20分鐘。
3.回收Ficoll血漿界面上的MNC層，用PBS+2％FBS洗滌。
4.計數(shù)細(xì)胞，并以1×108/mL重懸浮。
5.測量樣品體積，稱為體積A。
6.加入0.2mL來自步驟1的保留血液。
7.用PBS+2％FBS使總體積達(dá)到體積A的兩倍。
8.以1.0μg/mL的終濃度加入對特定抗原特異的四聚抗體復(fù)合物，其合成在實施例1中描述。
9.在室溫下溫育20分鐘。
10.用PBS+2％FBS稀釋兩倍，并在以1.085g/mL的密度和280mOsm摩爾滲透壓濃度制備的Percoll上分層。
11.如步驟2以1200×g離心20分鐘。
12.棄去上清液，重懸浮包含富集細(xì)胞的沉淀。
13.用氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，并用PBS+2％FBS洗滌。實施例6T細(xì)胞的富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成該實施例說明利用實施例2中描述的方法從全外周血中富集T細(xì)胞。制備了含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復(fù)合物的T細(xì)胞富集雞尾酒。結(jié)果(顯示在表4中)證明本發(fā)明的方法可產(chǎn)生95％的T細(xì)胞純度，回收率接近50％。
該實施例說明利用實施例2中描述的方法從全外周血中富集B細(xì)胞。制備了四聚抗體復(fù)合物的兩種B細(xì)胞富集雞尾酒。一種雞尾酒含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56的抗體。另一種雞尾酒含有抗CD2、CD3、CD16、CD36、CD56和IgE的抗體。結(jié)果(顯示在表7中)證明，本發(fā)明的方法導(dǎo)致88％的B細(xì)胞純度和43％的回收率，向富集雞尾酒中加入抗-IgE可提高B細(xì)胞的純度。
結(jié)果(顯示在表9中)證明，對于廣泛先祖富集雞尾酒，本發(fā)明的方法導(dǎo)致29％的CD34+細(xì)胞純度和53％的回收率，而對于四種抗體減量雞尾酒只導(dǎo)致5％的純度和45％的回收率。
制備含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復(fù)合物的T細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致95％以上的T細(xì)胞純度和60％回收率。
制備含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗體的四聚抗體復(fù)合物的B細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致75％的B細(xì)胞純度和39％的回收率。
制備含有抗CD3、CD4、CD19、CD36和CD66b抗體的四聚抗體復(fù)合物的NK細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致65％的NK細(xì)胞純度和27％的回收率。
制備含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復(fù)合物的T細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致95％的T細(xì)胞純度和61％的回收率。
制備含有抗CD8、CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復(fù)合物的CD4+T細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致89％的CD4+細(xì)胞純度和64％的回收率。
制備含有抗CD4、CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復(fù)合物的CD8+T細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致80％的CD8+T細(xì)胞純度和43％的回收率。
制備含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗體的四聚抗體復(fù)合物的B細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致84％的B細(xì)胞純度和58％的回收率。
制備含有抗CD3、CD4、CD19、CD36和CD66b抗體的四聚抗體復(fù)合物的NK細(xì)胞富集雞尾酒。本發(fā)明的方法導(dǎo)致80％的NK細(xì)胞純度和50％的回收率。
該實施例證明，用不同基質(zhì)代替步驟4中的Ficoll-Hypaque能改進(jìn)實施例2的方法。Ficoll的密度是1.077g/mL，而摩爾滲透壓濃度約為300mOsm。Percoll和碘克沙醇溶液制備為1.085g/mL密度和280mOsm的摩爾滲透壓濃度。制備含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗體復(fù)合物的A B細(xì)胞富集雞尾酒。
兩種不同樣品的B細(xì)胞富集結(jié)果(顯示在表15中)證明，以較高密度使用不同的分層基質(zhì)能提高B細(xì)胞的回收率而不降低B細(xì)胞純度。
該實施例說明利用實施例2中描述的方法從貯存(48小時)的全外周血中去除粒細(xì)胞。制備含有抗CD66b的四聚抗體復(fù)合物的粒細(xì)胞排除雞尾酒。表17顯示的結(jié)果證明，本發(fā)明的方法導(dǎo)致1.8-2.6log的粒細(xì)胞排除。
雖然參照目前認(rèn)為是優(yōu)選的實施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于所公開的實施例。相反，本發(fā)明旨在覆蓋在附加權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)包括的多種修改和相當(dāng)?shù)陌才拧?br> 所有公開文本、專利和專利申請書在此完整引用作為參考，每個公開文本、專利和專利申請書特別、分別地引用作為參考。
表1在細(xì)胞分離中使用的抗體



表2免疫玫瑰花結(jié)用于人細(xì)胞負(fù)選擇的抗體雞尾酒T細(xì)胞富集抗-CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41靜息T細(xì)胞富集抗-HLA-DR和/或CD25、CD69CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41γδT細(xì)胞富集抗-αβTCRCD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41αβT細(xì)胞富集抗-γδTCRCD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD4+T細(xì)胞富集抗-CD8CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41幼稚CD4+T細(xì)胞富集抗-CD8CD45RO和/或CD29CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41記憶CD4+T細(xì)胞富集抗-CD8CD45RACD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41靜息CD4+T細(xì)胞富集抗-CD8HLA-DR和/或CD25、CD69CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD4+αβT細(xì)胞富集抗-γδTCRCD8CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41TH1 CD4+T細(xì)胞富集抗-CD8CD124CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41TH2 CD4+T細(xì)胞富集抗-CD8CCR5CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20，CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD8+T細(xì)胞富集抗-CD4CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41幼稚CD8+T細(xì)胞富集抗-CD4CD45RO和/或CD29CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41記憶CD8+T細(xì)胞富集抗-CD4CD45RACD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41靜息CD8+T細(xì)胞富集抗-CD4HLA-DR和/或CD25、CD69、CD27CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD8+αβT細(xì)胞富集抗-γδTCRCD4CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41B細(xì)胞富集抗-CD2和/或CD3、CD4和CD8兩者CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、CD41NK細(xì)胞富集抗-CD3CD66b和/或CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24CD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD4、IgE、CD41單核細(xì)胞富集抗-CD2和/或CD3、CD5CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24CD66b和/或CD16和任選的抗-CD8、CD56樹突細(xì)胞富集抗-CD3CD14CD16CD19CD34CD56CD66b嗜堿性粒細(xì)胞富集抗-CD2CD3CD14CD15CD16CD19CD24CD34CD36CD56CD45RA先祖細(xì)胞富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14和任選的抗-CD56、CD10、CD45RA、CD38、CD36、CD33、CD71紅系先祖細(xì)胞富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14CD45RACD33CD10和任選的抗-CD56髓祖細(xì)胞富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14CD71CD10和任選的抗-CD56巨核細(xì)胞先祖富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14CD45RACD10和任選的抗-CD56上皮腫瘤細(xì)胞富集抗-CD45CD66b和任選的CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD56、CD66e表3可識別在上皮腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的非造血抗原的抗體



表4T細(xì)胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差純度＝％CD3+細(xì)胞回收率＝CD3+細(xì)胞的回收率表5CD8+T細(xì)胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差純度＝％CD8+細(xì)胞回收率＝CD8+細(xì)胞的％回收率*n＝4表6CD4+T細(xì)胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差純度＝％CD4+細(xì)胞回收率＝CD4+細(xì)胞的％回收率*n＝5表7B細(xì)胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差純度＝％CD19+細(xì)胞回收率＝CD19+細(xì)胞的％回收率表8NK細(xì)胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差純度＝％CD56+細(xì)胞回收率＝CD56+細(xì)胞的％回收率表9CD34+細(xì)胞從全臍帶血的富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

純度＝％CD34+細(xì)胞回收率＝CD34+細(xì)胞的％回收率SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差表10單核細(xì)胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

純度＝CD14+細(xì)胞的％純度回收率＝CD14+細(xì)胞的％回收率表11腫瘤富集雞尾酒的抗體組成

表12CAMA乳癌細(xì)胞從全血中的富集

表13T細(xì)胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結(jié)形成

SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差純度＝CD3+細(xì)胞的％純度回收率＝CD3+細(xì)胞的％回收率表14利用羥乙基淀粉/碘克沙醇混合物的免疫玫瑰花結(jié)形成

SD＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)差純度＝希望的細(xì)胞型的％純度(T細(xì)胞＝CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞，B細(xì)胞＝CD19+細(xì)胞，NK細(xì)胞＝CD56+細(xì)胞)回收率＝希望的細(xì)胞之％回收率表15利用不同分層基質(zhì)的免疫玫瑰花結(jié)形成B細(xì)胞富集

SE＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤純度＝CD19+細(xì)胞的％純度回收率＝CD19+細(xì)胞的％回收率表16利用免疫玫瑰花結(jié)形成對乳癌細(xì)胞的凈化

表17從貯存的全外周血中去除粒細(xì)胞

免疫玫瑰花結(jié)形成＝實施例2中概述的方法，使用含有抗-CD66b的排除雞尾酒單獨的Ficoll＝不使用免疫玫瑰花結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)Ficoll密度分離本說明書中引用參考文獻(xiàn)的全部引文1.Braun等人，N.Engl.J.Med.342525533.2.Brenner，M.B.，Trowbridge，I.S.，Strominger，J.L.，1985，Cell40183-190.3.De Lau，W.B.，Van Loon，A.E，Heije，K.，Valerio，D.，Bast，B.J，1989，J.Immunol. Methods，1171-8.4.deWynter， E.A.等人，1975，Stem Cells，Vol.13524-532.5.Firat等人，1988，Bone Marrow Transplantation，Vol.21933-938.6.Glennie，M.J.，McBride，H.M.，Worth，A.T.，Stevenson，G.T.，1987，J.Immunol.，1392367-2375.7.Holliger，P.，Prospero，T.，Winter，G.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448.8.Horrocks，C，M.Fairhurst和T.Thomas，1998.Blood.Vol.92，p.25A.9.Karawajew，L.，Micheel，B.，Behrsing，O.，Gaestel，M.，1987，J.Immunol.Methods 96265-270.10.Kostelny，S.A.，Cole，M.S.，Tso，J.Y.，1992，J.Immunol.1481547-1553.11.Kohler和Milstein，1975，Nature 256，495-497.12.Milstein，C.，Cuello，A.C.，1983，Nature，305537-540.13.Nolan，O.，Kennedy，O.R.，1990，Biochem.Biophys.Acta，10401-11.14.Perez等人，1985，Nature 316354.15.Rheinnecker等人，1996，J.Immunol.1572989-2997.16.Shpall，E.J.等人，1994，J.of Clinical Oncology 1228-36.17.Slaper-Cortenbach，Ineke C.M.，等人，1990，Exp.Hematol.1849-54.18.Staerz和Bevan，1986，PNAS(USA)831453.19.Staerz和Bevan，1986，Immunology Today，7241.20.Staerz等人，1985，Nature，314628.21.Thomas，T.E.，1994，Cancer Research，Therapy and Control 4(2)119-128.22.Van Dijk，J.et al，1989，Int.J.Cancer 44738-743.23.Vaughan等人，1990，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.99.24.Winter，G.，Milstein，C.，1991，Nature，349293-299.
權(quán)利要求
1.一種負(fù)選擇方法，用于從含有希望的細(xì)胞、紅細(xì)胞和不希望的細(xì)胞之樣品中富集并回收希望的細(xì)胞，其包括(1)在允許不希望的細(xì)胞與紅細(xì)胞可形成免疫玫瑰花結(jié)的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與不希望的細(xì)胞上的抗原結(jié)合，該抗體與(b)至少一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體直接或間接地連接；和(2)從樣品中分離免疫玫瑰花結(jié)，獲得富含希望的細(xì)胞的樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(2)中通過密度分離法分離免疫玫瑰花結(jié)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(2)中通過沉淀法分離免疫玫瑰花結(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于單核細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD5；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(3)CD66b和/或CD16結(jié)合的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中抗體(a)還包含CD56和/或CD8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于B細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD4和CD8兩者；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；和(3)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于T細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(3)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于CD4+T細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD8；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于CD8+T細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD4；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于NK細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD66b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(4)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中抗體(a)還包含CD4。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于嗜堿性粒細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD2；(3)CD14；(4)CD15；(5)CD16；(6)CD19；(7)CD24；(8)CD34；(9)CD36；(10)CD56和(11)CD45RA結(jié)合的抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于樹突細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD14；(3)CD16；(4)CD19；(5)CD34；(6)CD56和(7)CD66b結(jié)合的抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于造血先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14結(jié)合的抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于類紅細(xì)胞先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；(6)CD33和(7)CD10結(jié)合的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于髓先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD71；和(6)CD10結(jié)合的抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于巨核細(xì)胞先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；(6)CD10結(jié)合的抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于非造血腫瘤細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結(jié)合的抗體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于上皮腫瘤細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結(jié)合的抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，用于從包含粒細(xì)胞的樣品中富集和回收單核細(xì)胞，其中抗體(a)包含能與抗原CD66b或CD66abce結(jié)合的抗體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中樣品是貯存的全血或臍帶血。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中樣品中粒細(xì)胞的密度低于新鮮全血的粒細(xì)胞密度。
33.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗體組合物含有四聚抗體復(fù)合物，其中含有(a)一種可與不希望的細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體；和(b)一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體；和(c)可與(a)和(b)所述抗體的Fc片段結(jié)合的兩種抗體，其中(a)和(b)中的抗體來自相同動物種，(c)中的抗體與(a)和(b)中的抗體來自不同動物種。
34.一種抗體組合物，用于從含有希望的細(xì)胞、紅細(xì)胞和不希望的細(xì)胞之樣品中富集和回收希望的細(xì)胞，其中含有(a)至少一種抗體，其可與不希望的細(xì)胞上的抗原結(jié)合，該抗體與(b)至少一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體直接或間接地連接。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于單核細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD5；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(3)CD66b和/或CD16結(jié)合的抗體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的組合物，其中抗體(a)還包含CD56和/或CD8。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于B細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD4和CD8兩者；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；和(3)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
39.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于T細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(3)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
41.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于CD4+T細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD8；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
43.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于CD8+T細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD4；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
45.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于NK細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD66b和/或CD15； (3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(4)CD36和/或CD14結(jié)合的抗體。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的組合物，其中抗體(a)還包含CD4。
47.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于嗜堿性粒細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD2；(3)CD14；(4)CD15；(5)CD16；(6)CD19；(7)CD24；(8)CD34；(9)CD36；(10)CD56和(11)CD45RA結(jié)合的抗體。
48.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于樹突細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD14；(3)CD16；(4)CD19；(5)CD34；(6)CD56和(7)CD66b結(jié)合的抗體。
49.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于造血先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14結(jié)合的抗體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
51.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于類紅細(xì)胞先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；(6)CD33；和(7)CD10結(jié)合的抗體。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
53.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于髓先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；(4)CD14；(5)CD71；(6)CD10結(jié)合的抗體。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
55.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于巨核先祖細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；和(6)CD10結(jié)合的抗體。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
57.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于非造血腫瘤細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結(jié)合的抗體。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的組合物，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
59.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于上皮腫瘤細(xì)胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結(jié)合的抗體。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的組合物，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
61.根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，用于從含有粒細(xì)胞的樣品中富集和回收單核細(xì)胞，其中抗體(a)含有能與抗原CD66b或CD66abce結(jié)合的抗體。
62.一種從含有具核細(xì)胞和紅細(xì)胞的樣品中分離具核細(xì)胞的方法，包括(1)在允許具核細(xì)胞與紅細(xì)胞形成免疫玫瑰花結(jié)的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與待分離的具核細(xì)胞上的抗原結(jié)合，該抗體與(b)至少一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體直接或間接地連接；和(2)將免疫玫瑰花結(jié)與剩余樣品分離。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中抗體組合物含有一種雙功能抗體，其中可與具核細(xì)胞結(jié)合的抗體與可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體直接連接。
64.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中抗體組合物含有四聚抗體復(fù)合物，其中含有(a)一種可與具核細(xì)胞上的抗原結(jié)合的抗體；和(b)一種可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體；和(c)可與(a)和(b)所述抗體的Fc片段結(jié)合的兩種抗體，其中(a)和(b)中的抗體來自相同動物種，(c)中的抗體與(a)和(b)中的抗體來自不同動物種。
65.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中具核細(xì)胞選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、造血先祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、先祖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
66.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中可與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體是抗血型糖蛋白A。
67.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其還包括(3)裂解免疫玫瑰花結(jié)中的紅細(xì)胞，以分離細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用免疫玫瑰花結(jié)分離細(xì)胞的方法。該方法包括使含有具核細(xì)胞和紅細(xì)胞的樣品接觸一種可使具核細(xì)胞與紅細(xì)胞形成免疫玫瑰花結(jié)的抗體組合物。該抗體組合物優(yōu)選地含有雙功能抗體或四聚抗體復(fù)合物。
文檔編號C07K16/28GK1367876SQ00809750
公開日2002年9月4日 申請日期2000年5月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月28日
發(fā)明者T·E·托馬斯, C·皮特斯, P·蘭斯卓普 申請人:干細(xì)胞技術(shù)公司