專利名稱：假單胞菌素前藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及假單胞菌素(pseudomycin)化合物，尤其是假單胞菌素化合物前藥。
背景技術(shù)：
假單胞菌素是從丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae，與植物有關(guān)的細(xì)菌)的液體培養(yǎng)物中分離的天然產(chǎn)物，并且已顯示具有抗真菌活性。(例如參見(jiàn)，Harrison，L.等，“假單孢菌素，一族得自丁香假單胞菌的具有廣譜抗真菌活性的新肽”，J.Gen.Microbiology，137(12)，2857-65(1991)以及美國(guó)專利US5,576,298和5,837,685)。與前面所述得自丁香假單胞菌的抗霉菌劑(例如丁香霉素、丁香假單胞菌毒素和丁香假單胞菌抑制素)不同，假單胞菌素A-C含有羥基天冬氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、脫氫氨基丁酸、賴氨酸和二氨基丁酸。假單胞菌素A、A’、B、B’、C、C’的肽部分相應(yīng)于具有末端羧基的L-Ser-D-DabL-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，該羧基在N-末端Ser的OH上將大環(huán)閉合。這些類似物是通過(guò)N-酰基側(cè)鏈加以區(qū)別的，即假單胞菌素A是被3，4-二羥基十四烷?；鵑-?；?，假單胞菌素A’是被3，4-二羥基十五烷?；鵑-?；模賳伟谺是被3-羥基十四烷?；鵑-?；模賳伟谺’是被3-羥基十二烷?；鵑-酰化的，假單胞菌素C是被3，4-二羥基十六烷酰基N-?；?，以及假單胞菌素C’是被3-羥基十六烷酰基N-?；?。(例如參見(jiàn)Ballio，A.，等人，“得自丁香假單胞菌的生物活性脂縮肽假單孢菌素，”FEBSLetters，355(1)，96-100，(1994)和Coiro，V.M.，等人，“使用得自NMR數(shù)據(jù)的幾何位距和分子動(dòng)力學(xué)通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬確定的丁香假單胞菌MSU 16H植物毒性脂縮肽假霉素A的溶液構(gòu)象，”Eur.J.Biochem.，257(2)，449-456(1998))。
已知假單胞菌素具有一定的生物副作用。例如，當(dāng)假單胞菌素經(jīng)靜脈內(nèi)給藥時(shí)，已觀察到靜脈內(nèi)皮破壞、組織破壞、發(fā)炎和宿主組織的局部毒性。因此，需要從這類化合物中鑒別出對(duì)治療真菌感染有用而沒(méi)有目前觀察到的副作用的化合物。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了一種用作抗真菌劑的下面結(jié)構(gòu)式所表示的假單胞菌素前藥、其可藥用的鹽及其溶劑化物， 其中R是 其中Ra和Ra′獨(dú)立地是H或甲基，或者Ra或Ra′是烷基氨基，與Rb或Rb′一起形成6-元環(huán)烷基環(huán)、6-元芳族環(huán)或雙鍵，或者與Rc一起形成6-元芳族環(huán)；Rb和Rb′獨(dú)立地是H、鹵素或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羥基；Rc是H、羥基、C1-C4烷氧基、羥基C1-C4烷氧基、或者與Re一起形成6-元芳族環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re是H，或者與Rf一起形成6-元芳族環(huán)、C5-C14烷氧基取代的6-元芳族環(huán)、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族環(huán)，和Rf是C8-C18烷基，或C5-C11烷氧基；R是 其中Rg是H或C1-C13烷基，而且Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6環(huán)烷基)，其中n＝1或2；或者R是 其中Ri是H、鹵素、或C5-C8烷氧基，而且m是1、2或3；R是 其中Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基并且p＝0、1或2；R是 其中Rk是C5-C14烷氧基，或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1獨(dú)立地是H、酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮(例如下面所述的化合物1(a))、或者酰氧基亞甲基羧酸酯(例如下述的化合物1(b)) 其中R1a是H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芐基、或芳基，而且R1b是H或甲基條件是至少一個(gè)R1是酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮或者酰氧基亞甲基羧酸酯；R2和R3獨(dú)立地是-OR2a、或者-N(R2b)(R2c)，其中R2a和R2b獨(dú)立地是H、C1-C10烷基(例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基等)、C3-C6環(huán)烷基(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊基亞甲基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基等)、羥基(C1-C10)烷基、烷氧基(C1-C10)烷基(例如甲氧基乙基)、或C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二-烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基(例如芐基)、雜芳基(C1-C10)烷基(例如3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基)、或環(huán)雜烷基(C1-C10)烷基(例如N-四氫-1，4-噁嗪基乙基和N-哌嗪基乙基)，或者R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基(例如-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(對(duì)羥基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-或5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH2CO2NH2等)，而且R2c是H或C1-C6烷基。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了一種藥用制劑，它包括上述的假單胞菌素前藥和可藥用的載體。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供了一種在需要治療的動(dòng)物中治療抗真菌感染的方法，該方法包括向所述動(dòng)物給藥上述的假單胞菌素前藥。本發(fā)明還提供了上述假單胞菌素前藥在生產(chǎn)用于治療動(dòng)物內(nèi)抗真菌感染的藥物的用途。
定義除非另有說(shuō)明，本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”指的是含有1-30個(gè)碳原子的通式CnH2n+1烴基。烷基可以是直鏈(例如甲基、乙基、丙基、丁基等)、支鏈(例如異丙基、異丁基、叔丁基、新戊基等)、環(huán)狀(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基等)、或者多環(huán)狀(例如二環(huán)[2.2.1]庚烷、螺[2.2]庚烷等)。所述烷基可以是被取代或者沒(méi)有取代的。類似地，烷氧基、烷酰基或鏈烷酸酯中的烷基部分具有上面的相同定義。
術(shù)語(yǔ)“烯基”指的是含有至少一個(gè)碳碳雙鍵的無(wú)環(huán)烴。所述烯基可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或多環(huán)狀。所述烯基可以是被取代或者未取代的。鏈烯氧基、鏈烯?；蜴溝┧狨ブ械南┗糠志哂猩厦娴南嗤x。
術(shù)語(yǔ)“芳基”指的是具有單環(huán)體系(例如苯基)或稠環(huán)體系(例如萘、蒽、菲等)的芳族部分。所述芳族可以是被取代或者沒(méi)有取代的。
在有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，特別是有機(jī)生化領(lǐng)域，應(yīng)廣泛地理解為，化合物的有效取代是允許的，或者甚至是有用的。例如，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)烷基允許包括典型的烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、己基、異辛基、十二烷基、硬脂基(stearyl)等。術(shù)語(yǔ)“基團(tuán)”特定假設(shè)并允許包括在本領(lǐng)域常規(guī)的烷基上取代，例如羥基、鹵素、烷氧基、羰基、酮基、酯基、氨基甲酸酯基(Carbamato)等，以及包括沒(méi)有取代的烷基部分。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解為，取代基應(yīng)經(jīng)選擇，以便對(duì)化合物的藥理特性沒(méi)有負(fù)面影響，或者對(duì)該藥物的使用沒(méi)有負(fù)面干擾。上面定義的任意基團(tuán)的合適取代基包括烷基、烯基、炔基、芳基、鹵素、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、一-和二-烷基氨基、季銨鹽、氨基烷氧基、羥基烷基氨基、氨基烷硫基、氨基甲?；?、羰基、羧基、羥乙?；⒏拾滨；?、肼基、脒基、及其組合。
術(shù)語(yǔ)“前藥”指的是一類藥物，它們?cè)隗w內(nèi)由于代謝過(guò)程轉(zhuǎn)化(即生物轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生藥理作用。在本發(fā)明中，假單胞菌素前藥化合物含有連接體，所述連接體在血漿中可以經(jīng)酯酶裂開(kāi)，從而產(chǎn)生所述活性藥。
術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”指的是人、寵物(例如狗、貓和馬)、食物源動(dòng)物(例如牛、豬、羊和家禽)、動(dòng)物園動(dòng)物、海洋動(dòng)物、鳥(niǎo)類和其它類似動(dòng)物種。
發(fā)明詳述申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)假單胞菌素天然或半合成產(chǎn)物的前藥衍生物的副作用比相應(yīng)天然產(chǎn)物的低并且在體內(nèi)保留了抗白色念珠菌(C.albican)、新型隱球酵母(C.neoformas)和煙曲霉(A.fumigatus)的功效。該前藥是通過(guò)將與假單胞菌素環(huán)肽環(huán)體系中的賴氨酸或2，4-二氨基丁酸肽單元相連的側(cè)氨基中至少一個(gè)酰化以形成?；〈a(chǎn)的。?；瘎?或連接體)通常是含有合適的離去基團(tuán)的酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮或酰氧基亞甲基羧酸酯?；衔?，以便可以形成與假單胞菌素結(jié)構(gòu)上的側(cè)氨基連接的氨基甲酸酯鍵。合適的離去基團(tuán)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知并包括例如對(duì)硝基苯氧基和N-氧基琥珀酰亞胺的基團(tuán)。
酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮?；衔锟梢允褂孟旅媛肪€I所示的合成路徑合成。為了說(shuō)明的目的，描述了一特定?；衔铩Ｈ欢?，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，人們可以使用相同的基本合成方法合成各種衍生物。 路線I對(duì)于這些合成步驟更詳細(xì)的描述，參見(jiàn)下面實(shí)施例的制備部分。
酰氧基亞甲基羧酸酯?；衔锟梢允褂孟旅媛肪€II所示的合成路徑合成。為了說(shuō)明的目的，描述了一特定的?；衔?。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，人們可以使用相同的基本合成方法合成各種衍生物。 路線II對(duì)于這些合成步驟更詳細(xì)的描述，參見(jiàn)下面實(shí)施例的制備部分。
正如早先所討論的，假單胞菌素是從丁香假單胞菌分離的天然產(chǎn)物，它被表征為酯縮肽(Lipodepsinonapetpides)，其含有通過(guò)內(nèi)酯鍵閉環(huán)的環(huán)肽部分并包括不尋常的氨基酸4-氯蘇氨酸(ClThr)、3-羥基天冬氨酸(HOAsp)、2，3-脫氫-2-氨基丁酸(Dhb)和2，4-二氨基丁酸(Dab)。生長(zhǎng)丁香假單胞菌的不同菌株從而生產(chǎn)不同假單胞菌素類似物(A、A’、B、B’、C和C’)的方法描述如下并且更詳細(xì)地描述在Hilton等人于2000年4月14日提交的題為“通過(guò)丁香假單胞菌生產(chǎn)假單胞菌素(Pseudomycin Production by Pseudomonas Syringae)”的PCT專利申請(qǐng)，其序列號(hào)為PCT/US00/08728、Kulanthaivel等人于2000年4月14日提交的題為“假單胞菌素天然產(chǎn)物(Pseudomycin NaturalProducts)”的PCT專利申請(qǐng)，其序列號(hào)為PCT/US00/08727、以及US5,576,298和5,837,685中，在此將它們都引入作為參考。
產(chǎn)生一種或多種假單胞菌素的丁香假單胞菌分離菌株在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?。野生型菌株MSU 174和通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變產(chǎn)生的該菌株突變體MSU16H，描述在US 5,576,298和5,837,685；Harrison等人的“Pseudomycins，a family of novel peptides from Pseudomonassyringae possessing broad-spectrum antifungal activity，”J.Gen.Microbiology，137，2857-2865(1991)；以及Lamb等人的“Transposonmutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonasAntimycoticproduction is necessary for control of Dutch elm disease，”P(pán)roc.Natl.Acad.Sci.USA，84，6447-6451(1987)中。
適合生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素的丁香假單胞菌菌株可以從包括植物(例如大麥植物、柑橘植物和丁香植物)的環(huán)境源以及，例如土壤、水、空氣和灰塵的源分離。優(yōu)選菌株是從植物分離的。從環(huán)境源分離的丁香假單胞菌菌株可以稱之為野生型。正如本文所用的，“野生型”是指天然存在于丁香假單胞菌正常菌群中的顯性基因型(例如在自然界中發(fā)現(xiàn)且不是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室操作生產(chǎn)的丁香假單胞菌菌株或分離物)。與大多數(shù)生物體相同，所用的產(chǎn)假單胞菌素(丁香假單胞菌菌株如MSU174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、7H9-1)的培養(yǎng)物的特性易于變化。因此，這些菌株的后代(例如重組體、突變體和變種)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得。
丁香假單胞菌MSU 16H從the American Type CultureCollection，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA是公眾可得的，其保藏號(hào)為ATCC 67028。丁香假單胞菌菌株25-B1、7H9-1和67 H1于2000年3月23日保藏在the American Type Culture Collection并且分別具有以下保藏號(hào)25-B1保藏號(hào)PTA-16227H9-1保藏號(hào)PTA-162367 H1保藏號(hào)PTA-1621丁香假單胞菌的突變體菌株也適合生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素。正如本文所用的，“突變體”是指在菌株表型中突然可遺傳的變化，它可以是自發(fā)的或者通過(guò)已知誘變劑誘導(dǎo)的，例如輻射(例如紫外線輻射或x-射線)、化學(xué)誘變劑(例如甲基磺酸乙酯(EMS)、二環(huán)氧辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-硝基鳥(niǎo)嘌呤(NTG)和亞硝酸)、位置特異性誘變和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)誘變。產(chǎn)假單胞菌素的丁香假單胞菌突變體可以通過(guò)用有效地產(chǎn)生突變體的量的誘變劑處理該細(xì)菌來(lái)生產(chǎn)，所示突變體過(guò)量地生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素、生產(chǎn)一種超過(guò)其它假單胞菌素的假單胞菌素(例如假單胞菌素B)、或者在有利的生長(zhǎng)條件下生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素。盡管所用誘變劑的類型和數(shù)量可以變化，但是優(yōu)選方法是可系列地將NTG稀釋到1-100μg/ml的水平。優(yōu)選突變體是過(guò)量地產(chǎn)生假單胞菌素B并在最小限定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的那些。
為了以下所需特性生長(zhǎng)習(xí)性、生長(zhǎng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)源、碳源、生長(zhǎng)條件、氨基酸需要等，可以對(duì)丁香假單胞菌的環(huán)境分離物、突變體菌株和其它所需的丁香假單孢菌菌株經(jīng)過(guò)選擇。優(yōu)選選擇在最小限定的培養(yǎng)基例如N21培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和/或產(chǎn)生一種或多種量大于約10μg/ml的假單胞菌素的產(chǎn)假單胞菌素的丁香假單胞菌菌株。優(yōu)選菌株當(dāng)在含有三種或更少氨基酸，任選含有脂類、馬鈴薯產(chǎn)品或其組合的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，呈現(xiàn)產(chǎn)生一種或多種假單胞菌素的特性。
使用本領(lǐng)域中已知的方法，通過(guò)轉(zhuǎn)化丁香假單胞菌菌株，可以培育重組菌株。除了這些菌株產(chǎn)生的抗生素之外，通過(guò)使用重組DNA技術(shù)，可將丁香假單胞菌菌株轉(zhuǎn)化而表達(dá)不同的基因產(chǎn)物。例如，人們可以修飾這些菌株，從而引入多重拷貝的內(nèi)源假單胞菌素生物合成基因，以獲得更大的假單胞菌素產(chǎn)量。
為了從丁香假單胞菌野生型或突變體菌株生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素，該生物體在含有有效量的三種或更少氨基酸，優(yōu)選谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或其組合的水性營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)?；蛘撸瑢⒏拾彼崤c一種或多種的馬鈴薯產(chǎn)品和脂類組合。在丁香假單胞菌能夠有效生長(zhǎng)并產(chǎn)生所需假單胞菌素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。有效條件包括溫度為約22℃-約27℃，時(shí)間為約36小時(shí)-約96小時(shí)。在丁香假單胞菌的培養(yǎng)過(guò)程中控制培養(yǎng)基中的氧濃度對(duì)假單胞菌素的生產(chǎn)是有益的。優(yōu)選氧水平保持在約5-50％飽和度，更優(yōu)選約30％飽和度。用空氣、純氧或含有氧的氣體混合物噴射可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的氧濃度。
在丁香假單胞菌的培養(yǎng)過(guò)程中控制培養(yǎng)基的pH也是有益的。假單胞菌素在堿性pH下不穩(wěn)定，并且如果培養(yǎng)基的pH在約6以上持續(xù)約12小時(shí)以上的時(shí)間，能夠產(chǎn)生明顯的降解。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH保持在6-4之間。丁香假單胞菌當(dāng)在分批培養(yǎng)物中生長(zhǎng)時(shí)可以產(chǎn)生一種或多種假單胞菌素。然而，分批補(bǔ)加(fed-bath)或半連續(xù)加入葡萄糖和任選，加入酸或堿(例如氫氧化銨)控制pH可以提高產(chǎn)量。假單胞菌素產(chǎn)量還可以使用自動(dòng)加入葡萄糖和氫氧化銨的連續(xù)培養(yǎng)法來(lái)提高。
丁香假單胞菌菌株的選擇可以影響產(chǎn)生的假單胞菌素的量和分布。例如，菌株MSU 16H和67 H1各自主要產(chǎn)生假單胞菌素A，但是還產(chǎn)生假單胞菌素B和C，其比例典型地為4∶2∶1。菌株67 H1典型地產(chǎn)生的假單胞菌素的量要比菌株MSU 16H所產(chǎn)生的高約3-5倍。與菌株MSU16H和67 H1相比，菌株25-B1產(chǎn)生更多的假單胞菌素B和更少的假單胞菌素C。菌株7H9-1的特點(diǎn)是主要產(chǎn)生假單胞菌素B，并且假單胞菌素B的產(chǎn)量比其它菌株的高。例如，該菌株可以產(chǎn)生的假單胞菌素B是假單胞菌素A或C的至少10。
另外，該前藥可以由N-?；牒铣苫衔镄纬?。半合成假單胞菌素化合物可以通過(guò)交換L-絲氨酸單元上的N-?；鶊F(tuán)來(lái)合成。各種N-?；苌锏睦用枋鲈贐elvo等人于同期申請(qǐng)的題為“假單胞菌素N-酰基側(cè)鏈類似物(Pseudomycin N-Acyl Side-Chain Analogs)”的PCT專利申請(qǐng)序列號(hào)＿＿＿＿中，將其引入本文作為參考。一般說(shuō)來(lái)，使用以下的四個(gè)合成步驟將天然存在的假單胞菌素化合物生產(chǎn)為其半合成化合物(1)選擇性氨基保護(hù)；(2)所述N-酰基側(cè)鏈的化學(xué)或酶促脫?；?；(3)用不同側(cè)鏈再酰化；和(4)所述氨基去保護(hù)。
位置2、4和5的側(cè)氨基可以使用氨基保護(hù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任意標(biāo)準(zhǔn)方法加以保護(hù)。所用氨基保護(hù)基團(tuán)的精確種類不關(guān)鍵，只要衍生化的氨基在中間體分子的其它位置上相對(duì)接下來(lái)的反應(yīng)條件穩(wěn)定并且所述保護(hù)基團(tuán)可以在適宜時(shí)候選擇性地除去，而對(duì)包括任意其它氨基保護(hù)基團(tuán)的分子剩余部分沒(méi)有破壞即可。適合的氨基保護(hù)基團(tuán)包括芐氧基羰基、對(duì)硝基芐氧基羰基、對(duì)溴芐氧基羰基、對(duì)甲氧基芐氧基羰基、對(duì)甲氧基苯基偶氮芐氧基羰基、對(duì)苯基偶氮芐氧基羰基、叔丁氧基羰基、環(huán)戊氧基羰基和鄰苯二甲酰亞氨基。優(yōu)選的氨基保護(hù)基團(tuán)是叔丁氧基羰基(t-Boc)、烯丙氧基羰基(Alloc)、鄰苯二甲酰亞氨基和芐氧基羰基(CbZ或CBZ)。適合的保護(hù)基團(tuán)的進(jìn)一步的例子描述在T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis，”JohnWiley and Sons，New York，N.Y.，(2nd ed.，1991)，at chapter 7。
具有γ或δ羥基化側(cè)鏈(例如3，4-二羥基十四碳酸酯)的N-酰基的脫酰作用可以用含水溶劑中的酸處理氨基保護(hù)的假單胞菌素化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。適合的酸包括乙酸和三氟乙酸。優(yōu)選的酸是三氟乙酸。如果使用三氟乙酸的話，可以在室溫或接近室溫下進(jìn)行該反應(yīng)。然而，當(dāng)使用乙酸時(shí)，反應(yīng)通常在約40℃下進(jìn)行。適合的含水溶劑體系包括乙腈、水、及其混合物。有機(jī)溶劑加大該反應(yīng)速度；然而，加入有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致其它副產(chǎn)物。在側(cè)鏈上缺少δ或γ羥基的假單胞菌素化合物(例如假單胞菌素B和C’)可以經(jīng)酶促脫酰。適合的脫酰酶包括多粘菌素酰基轉(zhuǎn)移酶(164-16081脂酰轉(zhuǎn)移酶(粗品)或161-16091脂酰轉(zhuǎn)移酶(純品)，可從Wako Pure Chemical Industries，Ltd.獲得)、或者ECB脫酰酶。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)脫酰步驟進(jìn)行該酶促脫酰作用。例如，使用多粘菌素?；D(zhuǎn)移酶的常規(guī)步驟可以在如下文獻(xiàn)中找到Y(jié)asuda，N.等，Agric.Biol.Chem.，53，3245(1989)和Kimura，Y.等，Agric.Biol.Chem.，53，497(1989)。
脫酰產(chǎn)物(也稱作假單孢菌素核)在有羰基活化劑的情況下使用所需?；南鄳?yīng)酸再?；?。“羰基活化基團(tuán)”是指在該羰基處促進(jìn)親核加成反應(yīng)的羰基取代基。適合的活化取代基是在所述羰基上具有凈吸電子效果的那些。這些基團(tuán)包括，但不限于，烷氧基、芳氧基、含氮芳族雜環(huán)、或者氨基(例如氧基苯并三唑、咪唑基、硝基苯氧基、五氯苯氧基、N-氧基琥珀酰亞胺、N，N’-二環(huán)己基異脲-O-基和N-羥基-N-甲氧基氨基)；乙酸酯、甲酸酯、磺酸酯(例如甲基磺酸酯、乙基磺酸酯基、苯磺酸酯和對(duì)甲苯磺酸酯)；和鹵化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)。
可以將各種酸用于該?；椒ㄖ小＿m合的酸包括含有一個(gè)或多個(gè)側(cè)芳基、烷基、氨基(包括伯、仲和叔胺)、羥基、烷氧基和酰氨基的脂肪酸；在脂肪鏈內(nèi)含有氮或氧的脂肪酸；用烷基、羥基、烷氧基和/或烷基氨基取代的芳族酸；和用烷基、羥基、烷氧基和/或烷基氨基取代的雜芳族酸。
或者，可以使用固相合成法，其中將羥基苯并三唑樹(shù)脂(HOBt-樹(shù)脂)用作酰化反應(yīng)的偶合劑。
一旦氨基脫酰并再?；?如上所述)之后，可以在有氫化催化劑(例如10％Pd/C)的情況下通過(guò)氫化除去氨基保護(hù)基團(tuán)(2、4和5位的)。當(dāng)氨基保護(hù)基團(tuán)是烯丙氧基羰基時(shí)，可以使用氫化三丁基錫和二氯化三苯基膦鈀除去所述保護(hù)基團(tuán)。該特定的保護(hù)/去保護(hù)方案的優(yōu)點(diǎn)是降低了該假單胞菌素結(jié)構(gòu)中Z-Dhb單元的乙烯基氫化潛能。
然后通過(guò)以下生產(chǎn)前藥?；嚢彼峄蚺cN-?；男缘陌牒铣杉賳伟鼗衔镏?，4-二氨基丁酸肽單元相連的側(cè)氨基中的至少一個(gè)，以形成所需氨基甲酸酯鍵。
通過(guò)酰胺化或酯化假單胞菌素環(huán)中天冬氨酸和/或羥基天冬氨酸單元的側(cè)羧酸基團(tuán)，可以合成其它改性的前藥假單胞菌素化合物。各種酸改性的衍生物的例子描述在Chen等人于同期申請(qǐng)的題為“Pseudomycin Amide & Ester Analogs”的PCT專利申請(qǐng)序列號(hào)＿＿＿＿中，并將其引入本文作為參考。這些酸改性的衍生物可以通過(guò)將前述的任意前藥與適宜醇或胺縮合產(chǎn)生相應(yīng)的酯或酰胺來(lái)形成。
這些酯基團(tuán)的形成可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)酯化步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。在酸性條件下的酯化典型地包括在有質(zhì)子酸(例如HCl、TFA等)的情況下將所述假單胞菌素化合物溶于或懸浮于適宜醇中。在堿性條件下，在有弱堿(例如碳酸氫鈉和碳酸鉀)的情況下所述假單胞菌素化合物通常與適宜的烷基鹵反應(yīng)。
酰胺基團(tuán)的形成可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)酰胺化步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，偶合劑的選擇提供了所述酸基團(tuán)的選擇性修飾。例如，使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)作為偶合劑，使得人們同時(shí)能夠分離純的在殘基8位上的一酰胺和(某些情況下)純二酰胺。然而，使用鄰苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)作為偶合劑偏向形成殘基3位上的一酰胺。
可以將該假單胞菌素前藥分離出并且以本身或以其可藥用鹽或溶劑化物的形式使用。如上所述，該前藥是通過(guò)形成至少一個(gè)酰氧基烷基氨基甲酸酯鍵制備的。術(shù)語(yǔ)“可藥用鹽”是指由無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸獲得的非毒性酸加成鹽。適合的鹽衍生物包括鹵化物、硫氰酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、芳基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鏈烷酸鹽、環(huán)烷基鏈烷酸鹽、芳基鏈烷酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、富馬酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酯酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、三氟乙酸鹽等。
術(shù)語(yǔ)“溶劑化物”是指含有一個(gè)或多個(gè)溶質(zhì)分子(即假單胞菌素前藥化合物)和一個(gè)或多個(gè)藥用溶劑分子如水、乙醇等的聚集體。當(dāng)溶劑為水時(shí)，該聚集體稱之為水合物。溶劑化物通常是通過(guò)將前藥加熱溶解于適宜溶劑中并慢慢冷卻產(chǎn)生非晶形或結(jié)晶溶劑化物形式來(lái)形成的。
可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意不同方法將每種假單胞菌素、半合成假單胞菌素、假單胞菌素前藥及其混合物檢測(cè)、確定、分離和/或提純。例如，肉湯培養(yǎng)基或分離物或提純的組合物中的假單胞菌素或假單胞菌素前藥的活性水平可以通過(guò)抗例如假絲酵母屬的真菌的抗真菌活性來(lái)確定并且可以通過(guò)高效液相色譜法分離和提純。
典型地將活性成分(即假單胞菌素前藥)配制成提供易于控制的藥物劑量且給患者、醫(yī)師或獸醫(yī)一種高雅且易于操作的產(chǎn)品的藥用劑量形式。制品可以含有0.1％-99.9％wt的活性成分，更常規(guī)的是約10％-約30％wt。
正如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“單位劑量”或“劑量單位”是指含有經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量活性成分的物理離散單位。當(dāng)單位劑量經(jīng)口服或非腸道給藥時(shí)，典型地以片劑、膠囊、丸劑、粉末包、局部組合物、栓劑、糯米紙囊劑、安瓿或多劑量容器中的測(cè)定單元等的形式提供?；蛘?，單位劑量可以可吸入或噴霧的干燥或液體氣溶膠的形式給藥。
給藥劑量可以根據(jù)動(dòng)物的身體特性、動(dòng)物病癥的嚴(yán)重程度、用于給藥的方式和動(dòng)物種類而變化。給定動(dòng)物的具體劑量經(jīng)常由醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷來(lái)確定。
適合的載體、稀釋劑和賦形劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知并包括如下物料碳水化合物、蠟、水溶性和/或水膨脹性聚合物、親水或疏水材料、明膠、油、溶劑、水等。所用的特定載體、稀釋劑或賦形劑將取決于活性成分的使用方式和目的。制品還可以包括潤(rùn)濕劑、潤(rùn)化劑、表面活性劑、緩沖劑、增強(qiáng)劑、填充劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑、香味劑、調(diào)味劑及其組合。
藥用組合物可以使用各種方法給藥。適合的方法包括局部(例如軟膏或噴霧)、口服、注射和吸入。所用的具體處理方法將取決于進(jìn)行注射的類型。
當(dāng)非腸道靜脈應(yīng)用時(shí)，在給藥之前，這些制品典型地經(jīng)過(guò)稀釋或重新配制(如果經(jīng)過(guò)凍干的話)，如果需要的話進(jìn)一步稀釋。凍干產(chǎn)品的重新配制說(shuō)明的例子是將10ml注射用水(WFI)加入到小瓶中并輕輕攪拌溶解。典型重新配制時(shí)間低于1分鐘。然后在給藥之前，將所得溶液進(jìn)一步稀釋于輸液如5％葡萄糖的水(D5W)中。
假單胞菌素化合物已顯示具有抗真菌活性，例如包括抑制以下的傳染性真菌的生長(zhǎng)假絲酵母屬各種(即白色念珠菌(C.albicans)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)、克魯絲氏假絲酵母(C.krusei)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)或葡萄牙假絲酵母(C.lusitania))；球擬酵母屬各種(即光滑球擬酵母(T.glabrata)；曲霉屬各種(即煙曲霉(A.fumigatus))；組織胞漿菌屬各種(即莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum))；隱球酵母屬各種(即新型隱球酵母(C.neoformans))；芽生菌屬各種(即皮炎芽生菌(B.dermatitidis))；鐮孢屬各種；發(fā)癬菌屬各種、Pseudallescheriaboydii、粗球孢子菌、申克氏孢子絲菌等。
所以，本發(fā)明的化合物和制劑在制備用于對(duì)抗全身性真菌感染或者真菌皮膚感染的藥物中有用。因此，提供了一種抑制真菌活性的方法，該方法包括將本發(fā)明的假單胞菌素前藥與真菌接觸。優(yōu)選方法包括抑制白色念珠菌或煙曲霉活性。術(shù)語(yǔ)“接觸”包括本發(fā)明化合物與真菌結(jié)合或接合，或者表面接觸或相互接觸。該術(shù)語(yǔ)對(duì)該方法沒(méi)有賦予任何其它限制，例如通過(guò)抑制機(jī)理。這些方法定義為包含通過(guò)這些化合物的作用及其內(nèi)在抗真菌性能抑制寄生物和真菌的活性。
還提供了一種治療真菌感染的方法，包括對(duì)需要這種治療的宿主動(dòng)物給藥有效量的本發(fā)明藥物制劑。優(yōu)選方法包括治療白色念珠菌、新型隱球酵母或煙曲霉感染。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指能夠抑制真菌活性的活性化合物的量。給藥劑量隨例如以下因素而變化感染的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、宿主的年齡和總體健康狀況、宿主對(duì)抗真菌劑的耐受性和宿主的種類。具體劑量方案同樣可以根據(jù)這些因素而變化。藥物可以單一日劑量或在一天期間的多次劑量的方式施用。該方案可以從約2-3天延續(xù)至約2-3周或更長(zhǎng)。典型的日劑量(以單一或均分劑量給藥)含有約0.01mg/kg-100mg/kg體重的活性化合物的劑量水平。優(yōu)選日劑量通常為約0.1mg/kg-60mg/kg，更優(yōu)選為約2.5mg/kg-40mg/kg。宿主通常是包括以下的動(dòng)物人、寵物(例如狗、貓和馬)、食物源動(dòng)物(例如牛、豬、羊和家禽)、動(dòng)物園動(dòng)物、海洋動(dòng)物、鳥(niǎo)類和其它類似的動(dòng)物種類。
實(shí)施例在整個(gè)實(shí)施例中使用以下縮寫(xiě)代表各自所列的物料ACN-乙腈TFA-三氟乙酸DMF-二甲基甲酰胺EDCI-1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽BOC＝叔丁氧基羰基，(CH3)3C-O-C(O)-CBZ＝芐氧基羰基，C6H5CH2-O-C(O)-
PyBOP＝苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽TBTU＝鄰苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽DIEA＝N，N-二異丙基乙胺使用以下結(jié)構(gòu)II描述實(shí)施例1-7中得到的產(chǎn)品。 抗真菌活性的檢測(cè)和定量通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋試驗(yàn)或圓盤(pán)擴(kuò)散試驗(yàn)獲得化合物的最小抑制濃度(MIC)在體外測(cè)定抗真菌活性。在測(cè)定抗真菌活性中所用的典型真菌是白色念珠菌。當(dāng)測(cè)定樣品(50μl)在白色念珠菌x657接種的瓊脂平皿上產(chǎn)生10-12mm直徑區(qū)域的抑制時(shí)，認(rèn)為抗真菌活性顯著。尾靜脈毒性在0、24、48和72小時(shí)通過(guò)側(cè)部尾靜脈用0.1ml的測(cè)定化合物(20mg/kg)經(jīng)靜脈(IV)處理小鼠。每一組中有2只小鼠。化合物配制于5.0％葡萄糖和注射用無(wú)菌水中。在第一次處理之后對(duì)小鼠監(jiān)控7天并密切觀察包括以下的刺激信號(hào)紅斑、腫脹、變色、壞死、尾失掉和任何其它的顯示毒性副作用的信號(hào)。
本研究所用的小鼠是均重為18-20g的遠(yuǎn)系繁殖的雄性ICR小鼠(可從Harlan Sprangue Dawley，Indianapolis，IN獲得)。制備制備4-溴甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮(1a-1) 回流加熱0.1mol 4，5-二甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮、0.1molN-溴琥珀酰亞胺和0.1g 2，2-偶氮二(2-甲基丙腈)的70ml四氯化碳(CCl4)混合物。6小時(shí)之后，該混合物用冰冷卻并過(guò)濾。濾液用2×50ml水、2×50ml氯化鈉溶液和另一50ml水洗滌。溶液用硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干，在真空下干燥獲得16.5g(85％產(chǎn)率)的油，它具有與結(jié)構(gòu)1a-1一致的1H-NMR數(shù)據(jù)。
制備化合物(1a-2) 化合物1a-2是使用Synthetic Communication，22(9)，1297(1992)中所述的方法合成的，獲得11.5g(78％產(chǎn)率)的粗品油。
制備化合物1a-3 在4℃下將11.5g化合物1a-2(粗品油)、500ml 37％HCl和300ml甲醇的混合物攪拌過(guò)夜。然后將該混合物濃縮形成油。通過(guò)柱色譜(1∶1乙酸乙酯/己烷)提純獲得5.27g(33.8％)產(chǎn)品，它具有與結(jié)構(gòu)1a-3一致的1H-NMR數(shù)據(jù)。
制備化合物1a-4 將3.0g化合物1a-3和2.02g吡啶的30ml氯仿混合物冷卻至0-4℃。將5.08g氯甲酸對(duì)硝基苯酯的30ml氯仿溶液加入到該混合物中并攪拌約4.5小時(shí)。該混合物用冷1％氫氧化鈉(3×30ml)、1NHCl(2×30ml)、水(2×30ml)和鹽水(2×30ml)洗滌。該溶液用硫酸鈉干燥、過(guò)濾并用二氯甲烷洗滌。除去溶劑得到靜置固化的油。將該固體放入10ml二氯甲烷中并加入己烷形成沉淀。將混合物過(guò)濾，用己烷洗滌，并在真空下干燥過(guò)夜，獲得6.39g(94％產(chǎn)率)的產(chǎn)物，其1H-NMR數(shù)據(jù)與1a-4的結(jié)構(gòu)一致。
制備化合物1b-1 化合物1b-1可以使用Synthesis，1159(1990)中所述的方法合成。制備化合物b-2 在0℃下將4.57g(30mmol)粗品1b-1的40ml二氯甲烷溶液加入到3.91g(34mmol)N-羥基琥珀酰亞胺和2.7g(34mmol)吡啶的100ml二氯甲烷溶液中。0℃下攪拌30分鐘之后，在室溫下將該混合物靜置過(guò)夜?；旌衔锶缓笥盟礈焖拇尾⒂袡C(jī)相用硫酸鈉干燥。過(guò)濾之后，蒸發(fā)掉溶劑，獲得4.0g(58％產(chǎn)率)的油狀粗品，其1H-NMR數(shù)據(jù)與1b-2的結(jié)構(gòu)一致。制備CBZ-保護(hù)的假單胞菌素B(2a-1)將假單胞菌素B溶解/懸浮于DMF(20mg/ml，Aldrich Sure Seal)中。在室溫下攪拌的同時(shí)加入N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(6eq)。室溫下攪拌32小時(shí)。通過(guò)HPLC(4.6×50mm，3.5μm，300-SB，C8，Zorbax柱)監(jiān)控反應(yīng)。在室溫下于高真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將反應(yīng)物濃縮至10ml。將物料放入冷凍器中直到準(zhǔn)備好制備色譜。在逆相制備HPLC純化并冷凍干燥之后獲得一非晶形白色固體(化合物2a-1)。制備化合物2b-1
R1′、R1″和R1＝HR2＝-NH(環(huán)丙基)R3＝-OH2b-1將CBZ-保護(hù)的假單胞菌素B(2a-1)(400mg，0.25mmo1)溶于4ml無(wú)水DMF中。依次加入TBTU(79mg，0.25mmol)、DIEA(200μl，6當(dāng)量)和環(huán)丙胺(14.2mg，0.25mmol)。在室溫、氮?dú)庀聰嚢璺磻?yīng)，同時(shí)通過(guò)HPLC監(jiān)控。結(jié)束之后于真空下將反應(yīng)物濃縮。粗品通過(guò)制備HPLC提純。冷凍干燥獲得209.2mg(51.1％)無(wú)色粉末。
在氫氣囊下用10％Pd/C于1％HOAc/MeOH中催化氫化所述3-酰氨基化合物(279.1mg，0.169mmo1)45分鐘。將反應(yīng)物過(guò)濾并在真空下濃縮。將殘余物用1∶1水∶ACN混合物處理，然后冷凍干燥獲得208.3mg(98.6％)無(wú)色粉末(2b-1)。該結(jié)構(gòu)通過(guò)H1-NMR證實(shí)。制備化合物3a-1R1′、R1″和R1＝HR2＝-OCH3R3＝-OCH33a-1向50ml圓底燒瓶中加入10ml絕對(duì)乙醇和251.7mg CBZ-保護(hù)的假單胞菌素B(2a-1)(0.156mmol)。向該混合物中加入約1ml酸化乙醇(使用HCl氣提前酸化)并在室溫下將反應(yīng)物攪拌過(guò)夜。然后在真空下將溶劑除去并將殘余物在沒(méi)有進(jìn)一步提純的情況下通過(guò)將其溶于10ml MeOH/1.5ml冰AcOH溶液中進(jìn)行下一步。使用249.7mg 10％Pd/C標(biāo)準(zhǔn)氫解30分鐘，過(guò)濾除去催化劑并經(jīng)過(guò)制備HPLC提純，冷凍干燥之后得到120.9mg的化合物3a-1。C55H96ClN12O19(M+H)+的MS(Ionspray)計(jì)算值是1264.89，實(shí)驗(yàn)值是1264.3。制備C-18側(cè)鏈(4a-1) -78℃下向手性縮醛4a-1(6.22g，19.1mmol)的二氯甲烷溶液(190mL)中加入三甲基烯丙基甲硅烷(10.9mL，68.69mmol)，接著加入純TiCl4(2.94mL，26.71mmol)。反應(yīng)物在-78℃下攪拌1小時(shí)，然后在-40℃下攪拌2小時(shí)。此時(shí)，反應(yīng)用甲醇(15mL)終止并用二氯甲烷(200mL)稀釋。所得反應(yīng)混合物用1N HCl(2×50mL)、水和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)過(guò)干燥并在真空下濃縮得到一殘余物，將其通過(guò)硅膠色譜(10％EtOAc/己烷)提純，得到5.51g(78％)的目的產(chǎn)品4b-1。
向4b-1(8.56g，23.3mmol)的二氯甲烷(155mL)溶液中加入PCC(10.0g，46.5mmol)。反應(yīng)物在室溫下攪拌18小時(shí)，然后通過(guò)一Celite墊過(guò)濾。濾液在真空下濃縮得到一微紅色殘余物，將其通過(guò)硅膠色譜(10％EtOAc/己烷)提純，得到8.36g(80％)甲基酮中間體(結(jié)構(gòu)未顯示)。將這里獲得的中間體(8.36g，22.8mmol)溶于THF(60mL)和MeOH(30mL)中。向該溶液中加入7.5M KOH(15mL)。室溫下攪拌3小時(shí)之后，除去部分溶劑。剩余反應(yīng)混合物用EtOAc/Et2O(3∶1比，350mL)稀釋。有機(jī)層用水(3×50mL)和鹽水洗滌。所得有機(jī)層經(jīng)過(guò)干燥并在真空下濃縮得到殘余物，將其通過(guò)硅膠色譜(10％EtOAc/己烷)提純，得到6.22g(96％)的目的白色固體產(chǎn)品4c-1。
將甲醇4c-1(6.22g，22.0mmol)溶于THF水溶液(5.5mL水和55mL THF)。向該溶液中加入NMO(4.42g，33.0mmol)，接著加入OsO4(280mg溶于THF，1.10mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜。此時(shí)加入二硫化鈉(4g)。攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后用EtOAc(300mL)稀釋。整個(gè)混合物用水(2×40mL)和鹽水洗滌。所得有機(jī)層經(jīng)過(guò)干燥并在真空下濃縮得到相應(yīng)的三醇中間體。將該物料溶于MeOH(200mL)和水(40mL)中。向該溶液中加入NaIO4(10.6g，49.5mmol)。室溫下攪拌1小時(shí)之后，反應(yīng)物通過(guò)Celite過(guò)濾并通過(guò)短柱硅膠色譜(30％EtOAc/己烷)提純，得到約10g(＞100％)粗品β-羥基醛。將由此獲得的不純?nèi)┤苡谑宥〈?100mL)和環(huán)己烯(14mL)中。室溫下向該溶液中加入NaClO2(15.97g，176mmol)和KH2PO4(17.8g，132mmol)的水溶液(50mL)。反應(yīng)物在室溫下攪拌6小時(shí)，然后在0℃下用5N HCl終止反應(yīng)至pH＝4。反應(yīng)物用3∶1 EtOAc/Et2O(3×250mL)混合溶劑萃取。有機(jī)層用鹽水洗滌并干燥和濃縮，得到7.3g(＞100％)粗品酸4d-1，將其直接用于偶合反應(yīng)。制備假單胞菌素C-18(化合物4b-2) 4a-2R＝Cbz4b-2R＝H將粗品酸4d-1(2.1g，6.99mmol)溶于無(wú)水THF(20mL)和DMF(20mL)中。向該溶液中加入HOBt(1.23g，9.08mmol)和EDCI(1.74g，9.08mmol)。室溫下攪拌8小時(shí)之后，加入CBZ-保護(hù)的假單胞菌素核(3.87g，2.80mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)2天。此時(shí)部分地除去溶劑。將反應(yīng)混合物加樣到制備逆相HPLC系統(tǒng)上提純(注射4次)。冷凍干燥之后，分離出550mg(12％)的CBZ-保護(hù)的C18?；苌?a-2與HOBt活化的側(cè)鏈酯(1g)?；厥盏膫?cè)鏈酯(1.0g，2.40mmol)接下來(lái)與CBZ-保護(hù)的假單胞菌素核(1.33g，0.96mmol)在無(wú)水THF和DMF(各10mL)中反應(yīng)。接著進(jìn)行上述相同的提純步驟之后，獲得另外量的CBZ-保護(hù)的C18衍生物4a-2(606mg，38％)。
-78℃下向CBZ-保護(hù)的C18衍生物4a-2(550mg，0.33mmol)的10％HOAc/MeOH溶液(55mL)中加入Pd/C(550mg，10％鈀含量)。反應(yīng)物在1.5大氣壓下氫化40分鐘。通過(guò)分析HPLC監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程。結(jié)束之后，過(guò)濾出催化劑并在真空下將濾液于30℃濃縮。所得殘余物再次溶于1∶1含水乙腈中并冷凍干燥，得到250mg(60％)的目的產(chǎn)品4b-2。
在以下每個(gè)實(shí)施例中，使用特定的假單胞菌素化合物作為原料；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，除了使用具有不同N-酰基的假單胞菌素化合物開(kāi)始之外，使用相同步驟就可以合成其它N-酰基衍生物。
實(shí)施例1以下實(shí)施例舉例說(shuō)明假單胞菌素C’(n＝12，R2和R3＝-OH)的一取代、二取代或三取代的酰氧基烷基氨基甲酸酯前藥的制備。
向含有假單胞菌素C’(1.5g，1當(dāng)量)的DMF溶液(1升)中加入1.5當(dāng)量的化合物1a-4并在室溫下攪拌混合物約3天。部分地除去溶劑并將殘余物通過(guò)逆相HPLC(WatersTM，Delta Pak C18柱)提純獲得以下產(chǎn)物和產(chǎn)物的混合物86mg純一取代的假單胞菌素C’(1-1)；87mg一取代的假單胞菌素C’的混合物(1-2)；177mg二取代的假單胞菌素C’的混合物(1-3)；132mg純二取代的假單胞菌素C’(1-4)；和248mg三取代的假單胞菌素C’(1-5)。就三取代的前藥或二取代的前藥混合物而言，沒(méi)有觀察到尾靜脈的刺激。用純一取代、一取代的混合物和純二取代的前藥樣品觀察到一定的刺激。與之比較，未取代的假單胞菌素C’和未取代的假單胞菌素B清楚地顯示了尾靜脈的刺激。除了純二取代的前藥樣品之外(ED50＞20mg/kgx4)，所有樣品都顯示了顯著的體內(nèi)功效。
使用上述的相同方法還制備了上面結(jié)構(gòu)II的一取代、二取代或三取代的前藥樣品，其中R1′、R1″和/或R1是 并且n＝10、12和14。
化合物1-1和1-5呈現(xiàn)出與母體化合物假單胞菌素C’相似的體內(nèi)功效。沒(méi)有觀察到化合物1-5的尾靜脈刺激的跡象，并且觀察到化合物1-1的提高的尾靜脈毒性。出人意料地，沒(méi)有觀察到化合物1-4的體內(nèi)功效。
實(shí)施例2以下實(shí)施例舉例說(shuō)明假單胞菌素B(n＝10，R2和R3＝-OH)的一取代、二取代或三取代的酰氧基烷基氨基甲酸酯前藥的制備。
向溶于500ml二甲基甲酰胺的假單胞菌素B(2.0g，1.65mmol)溶液中加入574mg(2.47mmol)化合物1b-2。在室溫下攪拌混合物過(guò)夜。然后將溶液濃縮至約50ml并且產(chǎn)品通過(guò)HPLC使用以下梯度洗脫方案提純0-30％0.1％TFA/ACN 5分鐘和30-70％TFA/ACN 40分鐘?？偸章?9％。
對(duì)三個(gè)分離產(chǎn)物(一取代前藥(化合物2-1)，其中R1′和R1″＝H且R1＝-C(O)OCH2OAc，二取代前藥(化合物2-2)，其中R1′和R1″＝-C(O)OCH2OAc且R1＝H和三取代前藥(化合物2-3)，其中R1′、R1″和R1＝-C(O)OCH2OAc)都進(jìn)行測(cè)定并證實(shí)抗鼠全身性假絲酵母屬的體內(nèi)功效。然而，尾靜脈毒性為陽(yáng)性。
實(shí)施例3使用與上述實(shí)施例2中相同的通用方法制備假單胞菌素B(n＝10，R2和R3＝-OH)的一取代、二取代和三取代前藥，其中R1′、R1″和/或R1＝-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3。分離出下面5個(gè)樣品
3-1一取代R13-2混合一取代的R1′和R1″3-3混合二取代的R1+R1′和R1+R1″3-4二取代的R1′+R1″3-5三取代的R1′+R1″+R1樣品3-1、3-3和3-5各自表明尾靜脈毒性為陰性。所有5個(gè)樣品都顯示出抗鼠全身性假絲酵母屬的體內(nèi)功效。
實(shí)施例4使用與上述實(shí)施例2中相同的通用方法制備假單胞菌素C’(n＝12，R2和R3＝-OH)的一取代、二取代和三取代的前藥，其中R1′、R1″和/或R1＝-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3。分離出下面5個(gè)樣品4-1一取代的R14-2混合一取代的R1′和R1″4-3混合二取代的R1+R1′和R1+R1″4-4二取代的R1′+R1″4-5三取代的R1′+R1″+R1沒(méi)有測(cè)定樣品4-1。樣品4-3、4-4和4-5表明都是尾靜脈毒性陰性。樣品4-2、4-3、4-4和4-5都顯示出抗鼠全身性假絲酵母屬的體內(nèi)功效。
實(shí)施例5使用與上述實(shí)施例2中相同的通用方法制備假單胞菌素B(n＝10)的一取代、二取代和三取代的前藥，其中R1′、R1″和/或R1＝-C(O)OCH(CH3)OC(O)CH3。僅測(cè)定了三取代的衍生物(化合物5-1)。所述三取代的化合物顯示尾靜脈毒性為陰性。
實(shí)施例6使用與上述實(shí)施例2中相同的通用方法制備假單胞菌素B(n＝10，R2和R3＝-OH)的一取代、二取代和三取代的前藥，其中R1′、R1″和/或R1＝-C(O)OCH2OC(O)CH2CH3。僅測(cè)定了三取代的衍生物(化合物6-1)。所述三取代的化合物顯示了良好的抗鼠全身性假絲酵母屬的體內(nèi)功效，而沒(méi)有尾靜脈刺激。
實(shí)施例7使用與上述實(shí)施例2中相同的通用方法制備假單胞菌素B(n＝10，R2和R3＝-OH)的一取代、二取代和三取代的前藥，其中R1′、R1″和/或R1＝-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)CH3。僅測(cè)定了三取代的衍生物(化合物7-1)。所述三取代的化合物顯示了良好的抗鼠全身性假絲酵母屬的體內(nèi)功效，而沒(méi)有尾靜脈刺激。
實(shí)施例8實(shí)施例8和9描述了由半合成的假單胞菌素化合物合成前藥，其中對(duì)假單胞菌素結(jié)構(gòu)中的L-絲氨酸單元的N-?；M(jìn)行改變。
使用與上述實(shí)施例2中相同的通用方法制備假單胞菌素C-18(n＝14，R2和R3＝-OH)(4b-2)的一取代、二取代和三取代的前藥，其中R1′、R1″和/或R1＝-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3。僅測(cè)定了三取代的衍生物(化合物8-1)。所述三取代的化合物顯示尾靜脈毒性為陰性。
實(shí)施例9使用與上述實(shí)施例2中相同的通用方法制備假單胞菌素C-18(n＝14，R2和R3＝-OH)(4b-2)的一取代、二取代和三取代的前藥，其中R1′、R1″和/或R1＝-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)CH3。僅測(cè)定了三取代的衍生物(化合物9-1)。所述三取代的化合物顯示了陰性的尾靜脈毒性。
實(shí)施例10實(shí)施例10描述了上述前藥的進(jìn)一步修飾，其中將假單胞菌素環(huán)的天冬氨酸單元的羧酸基團(tuán)經(jīng)修飾形成一3-單酰氨基衍生物?；衔?0-1、10-2、10-3、10-4和10-5的合成R1′、R1″、R1＝-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3R2＝-NHCH2CH2N(CH3)2R3＝-OH10-1
向前藥3-5(864mg，0.52mmol)的DMF溶液(9ml)中加入1-二甲基氨基-2-氨基乙烷(57.9μl，0.52mmol)和TBTU(168.6mg，0.52mmol)，接著加入二異丙基乙胺(423μl)。室溫下攪拌20分鐘之后，反應(yīng)混合物通過(guò)反相HPLC(ACN0.1％TFA/水)提純。冷凍干燥獲得295mg(34％)的化合物10-1。
R1′、R1″、R1＝-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3R2＝-NH(環(huán)丙基)R3＝-OH10-2化合物10-2是使用與上面的相同方法合成的，但使用0.052mmol環(huán)丙基胺代替1-二甲基氨基-2-氨基乙烷。
R1′、R1″、R1＝-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3R2＝-NHCH2(CO2CH3)R3＝OH10-3化合物10-3是使用與上面的相同方法合成的，但使用甘氨酸甲酯代替1-二甲基氨基-2-氨基乙烷。
R1′、R1″、R1＝-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)2R2＝-NHCH2CH2N(CH3)2R3＝-OH10-4化合物10-4是使用與上面的相同方法合成的，但使用0.052mmol前藥7-1代替前藥3-5。
R1′、R1″、R1＝-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)2R2＝-NH(環(huán)丙基)R3＝-OH10-5化合物10-5是使用與上面的相同方法合成的，但使用0.052mmol前藥7-1代替前藥3-5并使用0.052mmol環(huán)丙基胺代替1-二甲基氨基-2-氨基乙烷。
實(shí)施例11實(shí)施例11描述了假單胞菌素化合物前藥的合成，其中對(duì)假單胞菌素環(huán)的天冬氨酸單元的羧酸基團(tuán)進(jìn)行修飾從而生成3-酰氨基衍生物。合成3-單酰氨基衍生物11-1R1′、R1″和 R2＝-NH(環(huán)丙基)R3＝-OH11-1向含有化合物2b-1(1當(dāng)量)的DMF溶液(1升)中加入1.5當(dāng)量的化合物1a-4并在室溫下攪拌混合物約3天。部分地除去溶劑并將殘余物通過(guò)反相HPLC(WatersTM，Delta Pak C18柱)提純，獲得化合物11-1以及其它一取代和二取代的產(chǎn)物。
實(shí)施例12實(shí)施例12描述了前藥的合成，其中對(duì)天冬氨酸和羥基天冬氨酸上的羧酸基團(tuán)進(jìn)行修飾生成雙酯衍生物。雙酯12-1的合成R1′、R1″和 R2＝-OCH3R3＝-OCH312-1
向含有化合物3a-1(1當(dāng)量)的DMF溶液(1升)中加入1.5當(dāng)量的化合物1a-4并在室溫下攪拌混合物約3天。部分地除去溶劑并將殘余物通過(guò)反相HPLC(WatersTM，Delta Pak C18柱)提純，獲得化合物12-1以及其它一取代和二取代的產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種具有以下結(jié)構(gòu)的假單胞菌素前藥、其可藥用鹽及其溶劑化物， 其中R是 其中Ra和Ra′獨(dú)立地是H或甲基，或者Ra或Ra′是烷基氨基，與Rb或Rb′一起形成6-元環(huán)烷基環(huán)、6-元芳族環(huán)或雙鍵，或者與Rc一起形成6-元芳族環(huán)；Rb和Rb′獨(dú)立地是H、鹵素或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羥基；Rc是H、羥基、C1-C4烷氧基、羥基烷氧基、或者與Re一起形成6-元芳族環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re是H，或者與Rf一起是6-元芳族環(huán)、C5-C14烷氧基取代的6-元芳族環(huán)、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族環(huán)，和Rf是C8-C18烷基，C5-C11烷氧基或聯(lián)苯基；R是 其中Rg是H或C1-C13烷基，而且Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6環(huán)烷基)，其中n＝1或2；或者R是 其中Ri是H、鹵素、或C5-C8烷氧基，而且m是1、2或3；R是 其中Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，并且p＝0、1或2；R是 其中Rk是C5-C14烷氧基，或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1獨(dú)立地是H、酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮、或者酰氧基亞甲基羧酸酯，條件是至少一個(gè)R1是酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮或者酰氧基亞甲基羧酸酯；R2和R3獨(dú)立地是-OR2a、或者-N(R2b)(R2c)，其中R2a和R2b獨(dú)立地是H、C1-C10烷基、C3-C6環(huán)烷基、羥基(C1-C10)烷基、烷氧基(C1-C10)烷基、C2-C10鏈烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二-烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基、雜芳基(C1-C10)烷基、環(huán)雜烷基(C1-C10)烷基，或者R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基并且R2c是H或C1-C6烷基。
2.權(quán)利要求1的前藥，其中所述酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮是由下式1(a)所表示的 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芐基、或芳基，而且R1b是H或甲基。
3.權(quán)利要求1的前藥，其中所述酰氧基亞甲基羧酸酯是由下式1(b)所表示的 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芐基、或芳基，而且R1b是H或甲基。
4.權(quán)利要求2的前藥，其中R由下面結(jié)構(gòu)所表示 其中Rb′是羥基，Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H，并且Rf是正辛基。
5.權(quán)利要求3的前藥，其中R由下面結(jié)構(gòu)所表示 其中Rb′是羥基，Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H，并且Rf是正辛基。
6.權(quán)利要求1的前藥，其中所述氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基是由以下表示的-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(對(duì)羥基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2(5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、或者-CH(CO2CH3)CH2CO2NH2。
7.一種具有以下結(jié)構(gòu)的假單胞菌素前藥、其可藥用鹽及其溶劑化物， 其中R是 其中Ra和Ra′獨(dú)立地是H或甲基，或者Ra或Ra′是烷基氨基，與Rb或Rb′一起形成6-元環(huán)烷基環(huán)、6-元芳族環(huán)或雙鍵，或者與Rc一起形成6-元芳族環(huán)；Rb和Rb′獨(dú)立地是H、鹵素或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羥基；Rc是H、羥基、C1-C4烷氧基、羥基烷氧基、或者與Re一起形成6-元芳族環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re是H，或者與Rf一起是6-元芳族環(huán)、C5-C14烷氧基取代的6-元芳族環(huán)、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族環(huán)，和Rf是C8-C18烷基，C5-C11烷氧基或聯(lián)苯基；R是 其中Rg是H或C1-C13烷基，且Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6環(huán)烷基)，其中n＝1或2；或者R是 其中Ri是H、鹵素、或C5-C8烷氧基，而且m是1、2或3；R是 其中Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，并且p＝0、1或2；R是 其中Rk是C5-C14烷氧基，或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3；R1獨(dú)立地是H、酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮、或者酰氧基亞甲基羧酸酯，條件是至少一個(gè)R1是酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮或者酰氧基亞甲基羧酸酯；R2和R3獨(dú)立地是-OR2a、或者-N(R2b)(R2c)，其中R2a和R2b獨(dú)立地是H、C1-C10烷基、C3-C6環(huán)烷基、羥基(C1-C10)烷基、烷氧基(C1-C10)烷基、C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二-烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基、雜芳基(C1-C10)烷基、環(huán)雜烷基(C1-C10)烷基，或者R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基并且R2c是H或C1-C6烷基。
8.權(quán)利要求7的前藥，其中所述酰氧基亞甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮是由下式1(a)所表示的 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芐基、或芳基，而且R1b是H或甲基。
9.權(quán)利要求7的前藥，其中所述酰氧基亞甲基羧酸酯是由下式1(b)所表示的 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芐基、或芳基，而且R1b是H或甲基。
10.權(quán)利要求8的前藥，其中R由下面結(jié)構(gòu)所表示 其中Rb′是羥基，Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H，并且Rf是正辛基。
11.權(quán)利要求9的前藥，其中R由下面結(jié)構(gòu)所表示 其中Rb′是羥基，Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H，并且Rf是正辛基。
12.權(quán)利要求7的前藥，其中所述氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯殘基是由以下表示的-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(對(duì)羥基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2(5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、或者-CH(CO2CH3)CH2CO2NH2。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的化合物在制備用于對(duì)抗全身性真菌感染或者真菌皮膚感染的藥物中的用途。
14.一種藥用制劑，含有權(quán)利要求1或7的假單胞菌素前藥和可藥用載體。
15.一種治療動(dòng)物抗真菌感染的藥物，其中所述藥物含有權(quán)利要求1或7的化合物。
16.一種治療需要治療的動(dòng)物抗真菌感染的方法，包括向所述動(dòng)物給藥權(quán)利要求7、8、9、10或11的假單胞菌素前藥。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種結(jié)構(gòu)(A)所代表的假單胞菌素前藥,其中R
文檔編號(hào)C07K7/00GK1373770SQ00810331
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月15日
發(fā)明者S·H·陳, M·J·羅德里格茨, 孫. X 申請(qǐng)人:伊萊利利公司