專利名稱：制備活性炭－gm1絡(luò)合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活性炭-GM1絡(luò)合物的制備方法和設(shè)計用來通過高效液相色譜法(HPLC)測定在水溶液中未衍生的GM1的分析方法。
該絡(luò)合物可以用作霍亂治療中的輔助劑，它中和相應的毒素[STOLL等《柳葉刀》(Lancet)，p.888-891，1980]。而且，體外試驗證明它可能作為亞鐵離子中毒的解毒劑。
為了評定制備活性炭-GM1絡(luò)合物的方法的效率，已經(jīng)發(fā)展了使用分析未衍生形式的神經(jīng)節(jié)苷脂的新的溶劑系統(tǒng)，通過HPLC測定GM1的分析方法。
該等濃度系統(tǒng)可有利地對實施文獻所述的方法進行分析。
得到本申請公開的活性炭-GM1絡(luò)合物的方法被開發(fā)用于尋求在胃腸道pH條件下得到的產(chǎn)品的穩(wěn)定性，由此促進它的安全性。
背景技術(shù)：
領(lǐng)域?qū)е履c道感染的細菌，導致腹瀉，痢疾和傷寒，是引起嚴重的健康問題的原因[BLACK.，R.E.，BROWN，K.H.，BECKER，S.，ALIM，A.R.M.A..HUQ，I.《美國流行病學雜志》(Am.J.Epidemiol.)，v.115，p.315-324，1982]。
這類最重要的病理當中，我們使用霍亂，由來自革蘭氏陰性細菌霍亂弧菌01的腸毒素作用產(chǎn)生的病理癥狀。與小腸近端部分的粘液良好結(jié)合的微生物生產(chǎn)了這些毒素[LEVINE，R.，KAPER，J.B，BLACK，R.E.，CLEMENTS，M.L.，《微生物學研究》(Microbiol.Rev.)，v.47，n.4，p.510-550，1983]。
這些毒素呈現(xiàn)為由相同的5個較小的亞單位(亞單位B)形成的環(huán)平面分離的亞單位A。它的分子量大約為84,000，各亞單位B分子量當量為11,000，亞單位A被分成A1(PM＝24,000)和A2(PM＝5,000)[LEVINE，R.，KAPER，J.B.，BLACK，R.E.，CLEMENTS.M.L.《微生物學研究》(Microbiol.Rev.)，v.47，n.4，p.510-550，1983]。
B五聚體與腸上皮細胞膜中的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂有關(guān)[SUREWICZ，W.K.，LEDDY，J.J.，MANTSCH，H.H.《生物化學》(Biochemistry)，v.29，p.8106-8111，1990]。亞單位A被插入細胞質(zhì)中，從而釋放A1片斷，激活潛在的腺苷酸-環(huán)化酶。結(jié)果迅速增加環(huán)-AMP的產(chǎn)生[LEVINE，R.，KAPER，JB.，BLACK，R.E.，CEMENTS，M.L.Microbiol.Rev.，v.47，n.4，p.510-550，1983]。這些及其他因素的結(jié)果為腸腔中鹽和水過度積聚以及細胞死亡[FIELD，M.，RAO，M.C.，CHANG，E.B.，N.Engl.J.Med.，v.321，p.800-806，1989].
神經(jīng)節(jié)苷脂-GM1為霍亂毒素的特異受體[WU，G.，LEDDEN，Anal R.《生物化學》(Biochem.)，v.173，p.368-375.1988]。GM1亦稱單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂，屬于glicosphingolipids類，由于唾液酸的存在而與該類其他組分區(qū)別(與其他神經(jīng)節(jié)苷脂一起)[HADJICONSTANTIONOU.M.，NEFF，N.H.《神經(jīng)化學雜志》(J.Neurochem.)，v.70，n.4，p.1335-1342，1998]。
如下文所示，它的結(jié)構(gòu)顯示疏水和親水區(qū)域。第一部分由鞘氨醇和硬脂酸構(gòu)成的神經(jīng)酰胺組成以及親水部分由唾液酸寡糖鏈表示。這些特征可以提供膠粒的構(gòu)造，人們相信唾液酸(sialic)片段與具有毒素的神經(jīng)節(jié)苷脂的活性有關(guān)。
神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 鑒于它的霍亂毒素特性，GM1能通過中和腸腔中的毒素用于治療毒性感染。這已由STOLL等在開發(fā)活性炭-GM1吸附性絡(luò)合物時試驗[STOLL等《柳葉刀》，p.888-891，1980]。盡管這樣，應當指出，該作者引用的得到該絡(luò)合物的方法并未公開，并且該絡(luò)合物的流程的穩(wěn)定性的研究也未公開。因此，在該文獻中未公開獲得該絡(luò)合物的方法，上述工作集中于通過該絡(luò)合物產(chǎn)生有益的治療的分析或霍亂常規(guī)治療的分析上。
目前，霍亂治療包括抗菌治療的消毒，疫苗的應用，以及減輕由感染所引起的癥狀的不同方法。在這方面，絡(luò)合物的使用是該治療的重要的補充。
針對該化合物應用的安全性，開發(fā)使用它的在類似于胃腸道中的pH值的環(huán)境下同樣穩(wěn)定的方法是必不可少的。這特別是由于在腸細胞膜中摻入GM1通過增加受體的數(shù)目而增加了對霍亂毒素的生物反應[HOLMGREN，J，LONNROTH，J，SVENNERHOLM，L.《美國國家科學院報》(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)72，p.2520-2524，1975]。
為了實施制備活性炭-GM1絡(luò)合物的方法，顯然人們應該分別確定該絡(luò)合物、活性炭和GM1的基本組分的數(shù)量和純度。
因此本發(fā)明也包含測定水溶液中的GM1的新方法。
上述的技術(shù)已經(jīng)使用梯度洗脫系統(tǒng)的HPLC，有時將受設(shè)備產(chǎn)生的限制。
下列表1概括了文獻中公開的方法。
表1-非衍生的神經(jīng)節(jié)苷脂的色譜分析參數(shù)。文獻中公開的分析方法(HPLC)的比較表。
柱 溶劑系統(tǒng) λ(探測) 平均分析 參考文獻(compr.XD.l.x D.part.)(等濃度的/梯度的) 時間胺柱乙腈-緩沖液215nm80min GAZZOT等3(LiChrosorb-NH2) 磷酸鹽5mM，pH(25cm×4mm×7μm) 5，6(梯度)硅(aquasil SS-正已醇-異 208nm25minANDO等1542N)丙醇-氯化鉀(20cm×6mm×5μm) 5mM(梯度)硅(aquasil SS- 乙腈-異丙醇 208min 30minANDO等2542N) -氯化鉀(20cm×6mm×5μm) 50mM梯度胺柱 乙腈-dissodic 215nm1h 20min PREVITI等4(LiChrosorb-NH2) 磷丙鹽，磷酸緩沖液(25cm×4mm×5μm) Ph5，6梯度1-ANDO，S.，WAKI，H.，K.ON，High-performance liquidchromatography of undenvatized gangliosides(未衍生的神經(jīng)節(jié)苷脂的高效液相層析).《色層學雜志》J.Chromatogr.，Amsterdam，v.408，p.285-290，1987。
2-ANDO，S.，WAKI，H.，KON，K..New solvent system for high-performance thin-layer chromatography and hagh-performance liquidchromatography of gangliosides(神經(jīng)節(jié)苷脂的高效薄層層析和高效液相層析).《色層學雜志》(J.Chromacogr.)，Amsterdam，v.405，p.125-134，1987。
3-GAZZOTI，G.，SONNINO，S.，GHIDONI，R.Normal-phase high-performance liquid chromatography separation of non-derivatizedganglioside mixtures(非衍生的神經(jīng)節(jié)苷脂的正常相位高效液相層析分離).《色層學雜志》(J.Chromatogr.)，Amsterdam，v.348，p.371-378，19854-PREVITI，M.，DOTTA，M，PONT1ERI，G.M.，DiMAR1O，U.，LENTI，L.，Determination of gangliosides by high-performance liquidchromatography with photodiode-array-detection(通過光電二極管矩陣檢測的高效液相層析測定神經(jīng)節(jié)苷脂).《色層學雜志》(J Chromatogr.)，Amsterdam，v.605，p.221-225，1992。
可以證實上表中顯示的技術(shù)中的分析時間的差異在20分鐘到1小時20分鐘內(nèi)變化。上述方法的保留時間大約為8分鐘。
此外，可以從文獻公開的新方法看見，下文中本發(fā)明提供的無梯度展開方法，即利用單一流動相(單一組合物)，具有相應的技術(shù)優(yōu)勢。
活性炭是一種醫(yī)療實踐，特別是毒理學領(lǐng)域人們經(jīng)常使用的吸附劑。
在其效率中pH是一個重要因素[ROIVAS，L.，NEUVONEN，P.J，《藥物科學雜志》(J.Pharm.Sci.)，v.81，n.9，p.917-919，1992]，這加強了證實絡(luò)合物對pH值的反應和尋找GM1吸附中具有最大效率的條件的重要性。
盡管通過利用活性炭可以引導預防藥理學試劑和毒素的選擇[BYERLY，W.G，Am.Pharm，V.NS32，n.7，p.36，1992]，但是其解毒活性的主要的限制在于對陽離子，例如亞鐵離子的吸附無效。
包含鐵的制劑的偶然的攝取是常見的，這在兒科學中是嚴重的問題。按照ENGLE等的研究[ENGLE，J.P.，等，Drug Intell.Clin.Pharm.，v.21，p.153-159，1987]，每年報到大約2,000例鐵離子中毒的兒童，因此鐵攝取在小兒科是最常見的攝取問題。按照上述文獻，盡管頻繁發(fā)生鐵中毒，但還沒有普遍接受的方案用于攝取中毒量鐵的患者。
在這方面，通過建議方法得到的絡(luò)合物的解毒潛能，如通過體外試驗證明的，是可以被選擇用于亞鐵離子中毒的重要的原因。
發(fā)明概要本發(fā)明的目的是提供用于制備活性炭GM1絡(luò)合物的新方法，該方法的特征包含下列步驟(a)制備由0到0.9％氯化鈉，0到0.03％磷酸二氫鈉-2H2O，和0到0.4％磷酸氫二鈉-12H2O，溶于蒸餾水，組成的稀釋溶液(A)；(b)用一部分溶液(A)溶解足夠量的GM1，使神經(jīng)節(jié)苷脂的濃度范圍為0.2到4.0％，得到新溶液(B)；(c)將活化的活性炭懸浮在另一部分溶液(A)中，比率為1∶3到1∶7w/v，開始并且維持5到15分鐘的適度的攪動；(d)在攪動下，慢慢地加入足夠量的溶液(B)，以獲得范圍在1∶100到1∶10之間變化的比例(GM1∶活性炭)，維持攪動10到20分鐘；(e)過濾該懸浮液，用溶液(A)漂洗該絡(luò)合物并且干燥；以及，(f)使干燥的絡(luò)合物通過40“目”篩，將產(chǎn)品在密封的容器中放置。
在優(yōu)選方案中，本發(fā)明的特征為在步驟(a)的稀釋溶液(A)中，氯化鈉的濃度是0.800％，磷酸二氫鈉的濃度是0.025％，磷酸氫二鈉的濃度是0.300％；步驟(b)的溶液(B)中，溶液(A)中的GM1的濃度為2.000％；在步驟(c)中，懸浮在溶液(A)中的活性炭比率為1∶5w/v，開始并且維持15分鐘的適度攪動；在步驟(d)中，攪動的同時慢慢地加入比率相當于1∶100(GM1∶活性炭)的溶液“B”，繼續(xù)攪動20分鐘；以及，步驟(e)中的干燥在40℃的溫度下進行24小時。
本發(fā)明的目的也在于提供一種通過HPLC測定水溶液中未衍生的GM1的新的分析方法，其特征為使用由氯化鉀/乙腈組成的流動相的等濃度的溶劑系統(tǒng)。
在優(yōu)選的本發(fā)明方法中，流動相由0.1M氯化鉀/乙腈(65∶35)組成。
最后，本發(fā)明也包括以數(shù)個體外試驗為基準的，該絡(luò)合物作為亞鐵離子中毒解毒劑的應用遠景的研究。
發(fā)明的詳細說明測定GM1的分析方法利用配備具有250°L“環(huán)形(looping)”的Rheodyne計量器，以及與收集系統(tǒng)結(jié)合在一起的，具有控制和數(shù)據(jù)效果的“二極管陣列”檢波器的Hewlett-Packard色譜儀，型號HP 1090M series 2，使用HPLC技術(shù)測定GM1容量(溶液(B))。流動相由0.1M(65/35，v/v)氯化鉀/乙腈組成，使用LiChrosorb柱NH2HPLC(250mm×4.6mm×5μm)。流速選擇為1mL/分鐘，檢測波長相當于210nm。在分析條件下，設(shè)備穩(wěn)定周期為60分鐘。
該方法被證實和已經(jīng)證明在1.50μg和6.04μg GM1之間具有完全可接受的線性(r＝0.9997)，顯示相對標準偏差低于0.700％的復制性，精確度和準確度分別在0.230-1.280％和97.930-103.440％之間變化(一天內(nèi)或兩天之間的測定(assays infra and inter-days))。
檢測極限和量化適于建議的目的，計算值分別為0.2518μg和0.4689±0.0265μg GM1。
通過使用高效液相層析技術(shù)，使用用于未衍生GM1測定的非常用的溶劑系統(tǒng)開發(fā)的方法顯示比文獻中現(xiàn)有技術(shù)多數(shù)個優(yōu)點。這樣的方法使用梯度洗脫系統(tǒng)，分析時間在25到80分鐘之間(表1)，建議的方法使用等濃度的系統(tǒng)，保留時間大約8分鐘，它的實施簡單化，顯著地降低分析成本。
活性炭-GM1絡(luò)合物制備方法作為本發(fā)明目的的方法，包括下列步驟開始，制備稀釋溶液(A)，由至多0.900％氯化鈉，至多0.030％磷酸二氫鈉-2H2O，至多0.400％磷酸氫二鈉-12H2O組成，以及用蒸餾水加到溶液的100.000％。
將GM1(TRB Pharma)溶于溶液(A)，使?jié)舛仍?.200％到4.000％之間變化，產(chǎn)生新的溶液(B)。
在適當?shù)娜萜髦校瑢⒒钚蕴堪?∶3-1∶7w/v的比例懸浮在溶液(A)中，以及維持適度的攪動5-15分鐘。該步驟后，在攪動下慢慢地加入溶液“B”。攪動維持10-20分鐘。
使用What nan紙濾器42過濾該懸浮液，用大約25％體積的溶液(A)洗滌該絡(luò)合物。
然后干燥(40℃/24h)該絡(luò)合物，干燥時，使它通過40“目”篩，以及裝入密封的容器。
吸附方法效率的研究活性炭吸附GM1的方法的效率可通過分析濾液中的神經(jīng)節(jié)苷脂的含量校驗。濾液中GM1的量與該方法的效率成反比。
按照上述公開的方法測定，濾液中無GM1，顯示該絡(luò)合物的最低效率為98％。
該絡(luò)合物在不同pH水平的穩(wěn)定性的研究絡(luò)合物穩(wěn)定性試驗在1.3；7.0以及8.3的pH水平進行。將絡(luò)合物在各溶液中保持20分鐘，然后用紙過濾。測定進行三次，濾液中無GM1，顯示了該絡(luò)合物在這樣的條件下的穩(wěn)定性。
制備pH1.2的HCl溶液，在溶解裝置中的4個立方體加入300mL該溶液，攪拌開始。
使用的速度為100rpm，平均溫度為37℃，一旦系統(tǒng)建立平衡，即將該絡(luò)合物加入裝置的3個立方體中，第四個立方體留作用于對照組活性炭的加入。
在該實驗條件下，將該絡(luò)合物在酸性介質(zhì)中保持20分鐘，隨后將其通過紙過濾。
檢測濾液中的GM1。GM1的濃度與絡(luò)合物的穩(wěn)定性成反比。
在堿性介質(zhì)(O.18M NaHCO3溶液-pH＝8.2)和蒸餾水以及脫氣水中重復該測定。
本試驗產(chǎn)生的濾液中不存在GM1表明，在實驗條件下，該絡(luò)合物在所研究pH值下的穩(wěn)定性。
絡(luò)合物在其中具有最佳穩(wěn)定性的條件為稀釋溶液(A)氯化鈉0.800％磷酸二氫鈉-2H2O 0.025％磷酸氫二鈉-12H2O 0.300％蒸餾水q.s.p.100％GM1溶液(B)神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 2.000％稀釋溶液(A) q.s.p.100.0％活性炭必須按1∶5w/v的比例懸浮在溶液A中，開始以及維持適度的攪動5分鐘。在攪動下，按照選定的比例(見實施例)，慢慢地加入溶液(B)，攪動20分鐘。
過濾該懸浮液，使用大約25％體積的用于該方法的溶液(A)洗滌該絡(luò)合物，使其干燥(40℃/24hours)。將該絡(luò)合物通過40“目”篩，裝入密封的容器。
下列為實施本發(fā)明方法的實施例。這樣的實施例作為說明加入，但是它們不限制本發(fā)明的范圍。
實施例加入鹽可以防止膠粒形成。因此，如下面配方所列舉，它們可以存在可變的濃度實施例I溶液(A)氯化鈉 0.800％磷酸二氫鈉-2H2O 0.025％磷酸氫二鈉-12H2O 0.300％神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 0.020％活性炭-GM1絡(luò)合物活性炭 100份GM11份實施例II溶液(A)氯化鈉 0.800％磷酸二氫鈉-2H2O 0.025％磷酸氫二鈉-12H2O 0.300％神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 0.020％活性炭-GM1絡(luò)合物活性炭 50份GM11份實施例III
溶液(A)氯化鈉 0.800％磷酸二氫鈉-2H2O 0.025％磷酸氫二鈉-12H2O0.300％神經(jīng)節(jié)苷脂-GM1 0.020％活性炭-GM1絡(luò)合物活性炭 10份GM1 1份在鐵，純活性炭以及活性炭-GM1絡(luò)合物之間相互作用能力的鑒定我們注意到活性炭-GM1絡(luò)合物呈現(xiàn)用作亞鐵離子中毒解毒劑的可能性。
按照以下描述，這樣的結(jié)論來自體外試驗的結(jié)果。
采用的方法由FAVIN等的方法修改[FAVIN，F(xiàn).D.等，Clin.ToxicoL，NewYork.v.26，n.7，p.443-450，1988]，用硫酸亞鐵-7H2O制備的溶液，在容積為1L的測定容積的球形瓶中加入2.50g鹽，用蒸餾水補充至所需體積。
在3個250ml的燒杯中，加入100mL得到的溶液，加入1.00g活性炭-GM1絡(luò)合物。使用FANEM磁性攪拌器，將該懸浮液保持攪動15分鐘，隨后用紙過濾。使用純活性炭重復該步驟。
使用鹽酸溶液(pH＝1.2)重復上述步驟。不使用堿性介質(zhì)(碳酸氫鈉)，這是由于鐵在該媒介中不溶解。
對濾液進行鐵分析。
使用原子吸收分光光度測定技術(shù)測定濾液中的鐵。樣品被稀釋到2ppm到20ppm的濃度。事實上，樣品被精確稀釋100倍，最高濃度預見為5ppm。
注射鐵濃度為2.5ppm到15ppm變化的硝酸鐵-9H2O標準溶液，精心制作校準曲線。進行線性回歸分析，得到該直線的公式。同法測定三次。結(jié)果如下IRON(ppm(DPR))酸(pH＝1.2) 水0(對照) 554.00(1.990％)439.00(2.330％)活性炭562.00(0.890％)384.00(2.340％)活性炭GM1 450.00(0.670％)332.00(3.220％)
權(quán)利要求
1.制備活性炭-GM1絡(luò)合物的方法，其特征為包括下列步驟(a)制備由0到0.900％氯化鈉，0到0.030％磷酸二氫鈉-2H2O，和0到0.400％磷酸氫二鈉-12H2O，溶于蒸餾水，組成的稀釋溶液(A)；(b)將GM1溶解于一部分溶液(A)中，使?jié)舛葹?.200到4.000％，得到新溶液(B)；(c)將活性炭懸浮在另一部分溶液(A)中，比率為1∶3到1∶7w/v，開始并且維持5到15分鐘的適度的攪動；(d)在攪動下，慢慢地加入足夠量的溶液(B)，使比例范圍為1∶100和1∶10(GM1∶活性炭)，維持攪動10到20分鐘；(e)過濾該懸浮液，用溶液(A)洗滌該絡(luò)合物并且干燥；以及，(f)使干燥的絡(luò)合物通過40“目”篩，在密封的容器中存儲該產(chǎn)品。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征為在步驟(a)的稀釋溶液(A)中，氯化鈉的濃度是0.800％，磷酸二氫鈉的濃度是0.025％，磷酸氫二鈉的濃度是0.300％；在步驟(b)的溶液(B)中，溶液(A)中的GM1的濃度為2.000％；在步驟(c)中，將活性炭懸浮在溶液(A)中，比率為1∶5w/v，開始并且維持15分鐘的適度攪動；在步驟(d)中，在攪動下，慢慢地加入等于比例為1∶100(GM1∶活性炭)的溶液(B)，維持攪動20分鐘；以及在步驟(e)中，在40℃的溫度下干燥24小時。
3.使用高效液相層析測定水溶液中未衍生的GM1的分析方法，其特征為使用由乙腈/氯化鉀組成的流動相的等濃度溶劑系統(tǒng)。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征為由0.1M乙腈/氯化鉀(65∶35)組成流動相。
全文摘要
本發(fā)明提供制備在不同pH條件下穩(wěn)定的吸附活性炭－GM1絡(luò)合物的方法。該方法基于被例舉的懸浮液配制方法。本發(fā)明也公開了使用高效液相層析測定水溶液中的未衍生的GM1的分析方法。
文檔編號C07H1/06GK1365365SQ0081105
公開日2002年8月21日 申請日期2000年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月30日
發(fā)明者P·G·D·奧利維拉, S·斯特皮迪斯 申請人:Trb藥物化學和制藥工業(yè)有限公司