專利名稱：寡核苷酸n3′→p5′硫代氨基磷酸酯,其合成及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有新的含核苷間3′-NHP(O)(S-)O-5′連鍵的糖-磷酸骨架的寡核苷酸，更具體地，本發(fā)明涉及硫代氨基磷酸酯(thiophosphoramidate)寡核苷酸組合物，其作為診斷劑或治療劑的用途，及合成硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的方法。
背景技術(shù)：
核酸聚合物化學(xué)在藥物、診斷和分析領(lǐng)域、更具體地在反義和反基因治療學(xué)、組合化學(xué)、分支DNA信號(hào)擴(kuò)增和基于陣列的DNA診斷學(xué)和分析亞領(lǐng)域的許多開發(fā)技術(shù)中起重要作用(例如Uhlmannand Peyman，化學(xué)綜述90543-584，1990；Milligan等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志361923-1937，1993；DeMesmaeker等，結(jié)構(gòu)生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)5343-355，1995；Roush，科學(xué)2761192-1193，1997；Thuong等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32666-690，1993；Brenner等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)895381-5383，1992；Gold等，生物化學(xué)年度綜述64763-797，1995；Gallop等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志371233-1258，1994；Gordon等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志371385-1401，1994；Gryaznov，國(guó)際申請(qǐng)PCT/US94/07557，Urdea等，美國(guó)專利5,124,246；Southern等，基因組131008-1017，1992；McGall等，美國(guó)專利5,412,087；Fodor等，美國(guó)專利5,424,186；Pirrung等，美國(guó)專利5,405,783)。
這一化學(xué)主要涉及改善天然核酸聚合物如DNA的結(jié)合強(qiáng)度，特異性和核酸酶抗性。不幸的是，一個(gè)性質(zhì)如核酸酶抗性的改善通常涉及其它性質(zhì)如結(jié)合強(qiáng)度的犧牲。這種犧牲的例子非常多肽核酸(PNA)展示良好的核酸酶抗性和結(jié)合強(qiáng)度，但是在測(cè)試培養(yǎng)物中細(xì)胞攝入降低(例如Hanvey等，科學(xué)2581481-1485，1992)；硫代磷酸展示良好的核酸酶抗性和可溶性，但是典型地是作為P-手性混合物合成并顯示若干非序列特異性生物學(xué)作用(例如Stein等，科學(xué)2611004-1012，1993)；甲基膦酸酯展示良好的核酸酶抗性和細(xì)胞攝入，但是也是典型地作為手性混合物合成并具有降低的雙螺旋穩(wěn)定性(例如Mesmaeker等，(如上所述))；等等。
最近，一類新的寡核苷酸類似物被開發(fā)出來，其具有所謂的N3′→P5′氨基磷酸酯核苷間連鍵，其展示有利的結(jié)合性質(zhì)、核酸酶抗性和可溶性(Gryaznov and Letsinger，核酸研究203403-3409，1992；Chen等，核酸研究232661-2668，1995；Gryaznov等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)925798-5802，1995；Gryaznov等，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志1163143-3144，1994)。氨基磷酸酯化合物在每個(gè)2′-脫氧呋喃糖核苷殘基含有3′氨基基團(tuán)代替3′-氧原子。寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成和性質(zhì)也在Gryanov等，美國(guó)專利5,591,607；5,599,922；5,726,297；和Hirschbein等，美國(guó)專利5,824,793中有描述。
寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯與互補(bǔ)DNA、特別是RNA鏈形成非常穩(wěn)定的雙螺旋，與DNA雙螺旋形成穩(wěn)定三螺旋，并且它們還抗核酸酶(Chen等，核酸研究232661-2668，1995；Gryaznov等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)925798-5802，1995)。另外，寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯在體外和體內(nèi)均是比硫代磷酸衍生物更強(qiáng)的反義制劑(Skorski等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)943966-3971，1997)。同時(shí)，相對(duì)于天然磷酸二酯相應(yīng)物，氨基磷酸酯表觀上對(duì)胞內(nèi)和胞外蛋白質(zhì)具有低親和性，和增加的酸不穩(wěn)定性(Gryaznov等，核酸研究241508-1514，1996)。寡核苷酸氨基磷酸酯的這些特征對(duì)于某些應(yīng)用潛在地負(fù)面影響其藥物學(xué)性質(zhì)。特別是，考慮到需要使用寡核苷酸制劑作為口服藥物，寡核苷酸的酸穩(wěn)定性更是重要的品質(zhì)。
為了克服與寡核苷酸類似物相關(guān)的上述問題，需要一類新的化合物，其能包括寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸的最佳特征。本發(fā)明描述了寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成、性質(zhì)和用途。
發(fā)明概述本發(fā)明的組合物和方法涉及具有由亞單位間連鍵結(jié)合的連續(xù)核苷亞單位的多核苷酸。在本發(fā)明的多核苷酸中，至少兩個(gè)連續(xù)亞單位通過N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵而結(jié)合，所述連鍵由式3′-[NH-P(＝O)(-SR)-O-]-5′啶義，其中R選自氫、烷基、芳基及其鹽組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R是氫或其鹽。本發(fā)明的多核苷酸的組成可以是使得所有亞單位間連鍵均是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯?；蛘撸景l(fā)明的多核苷酸可以含有第二類亞單位間連鍵如磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、p3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代磷酸酯連鍵。
一種舉例性的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵具有下式 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物，Z是OR，SR或甲基，其中R選自氫、烷基、芳基和其鹽組成的組；R1選自由氫、O-R2、S-R2和鹵素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當(dāng)Z是甲基或OMe時(shí)，R1不是H。組成多核苷酸的核苷亞單位可以選擇組成一確定序列如與單鏈核酸靶序列互補(bǔ)的堿基序列，或者能使多核苷酸和靶雙螺旋之間形成三螺旋結(jié)構(gòu)的序列。由至少一個(gè)如上所述N3′→P5 ′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵結(jié)合的核苷亞單位與具有氨基磷酸酯亞單位間連鍵的寡核苷酸相比具有優(yōu)異的酸水解抗性，同時(shí)仍保持相同的熱穩(wěn)定性。
本發(fā)明還包括合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的方法。在這一方法中，將第一個(gè)核苷5′-琥珀?；?3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脫氧核苷附著于固相支持物上。該第一個(gè)核苷還另外具有保護(hù)3′氨基基團(tuán)。該保護(hù)3′氨基基團(tuán)隨后脫保護(hù)以形成游離3′氨基基團(tuán)，向其加入第二個(gè)核苷。第一個(gè)核苷的游離3′氨基基團(tuán)與3′-保護(hù)氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二異丙基氨基亞磷酰胺單體反應(yīng)形成核苷間N3′→P5′亞磷酰胺連鍵。該核苷間N3′→P5′亞磷酰胺基團(tuán)隨后硫化形成第一個(gè)和第二個(gè)核苷之間的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯核苷間連鍵。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種將本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與DNA或RNA靶雜交的方法。該硫代氨基磷酸酯多核苷酸包含由至少一個(gè)下式定義的亞單位連接成的核苷亞單位序列，所述公式為 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物，Z是OR，SR或甲基，R1選自由氫、O-R2、S-R2和鹵素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當(dāng)Z是甲基或OMe時(shí)，R1不是H。將硫代氨基磷酸酯多核苷酸與RNA靶接觸以使該多核苷酸與RNA靶之間形成雜交復(fù)合物。
本發(fā)明還包括藥物組合物和試劑盒，其包括具有至少一個(gè)如上所述N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵的多核苷酸。本發(fā)明寡核苷酸特別適用于基于雜交作用的口服治療應(yīng)用，如反基因和反義應(yīng)用，包括抑制端粒酶活性。
附圖簡(jiǎn)述參照下述描述和附圖，本發(fā)明的上述方面和許多優(yōu)點(diǎn)將變得更易理解，其中

圖1A示出寡核苷酸硫代磷酸酯的核苷間連鍵結(jié)構(gòu)。
圖1B示出寡核苷酸氨基磷酸酯的核苷間連鍵結(jié)構(gòu)。
圖1C示出舉例性的本發(fā)明寡核苷酸硫代氨基磷酸酯的核苷間連鍵結(jié)構(gòu)。
圖2示出均勻修飾的寡核苷酸硫代氨基磷酸酯的逐步合成示意圖。
圖3示出將二核苷酸硫代氨基磷酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)槠浒被姿狨ハ鄳?yīng)物的示意圖，以及由二核苷酸硫代氨基磷酸酯水解得到的產(chǎn)物。
圖4示出用增加量的與端粒酶RNA互補(bǔ)的SEQ ID NO2的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸，或含有核苷酸錯(cuò)配的SEQ ID NO4進(jìn)行的體外端粒酶抑制分析結(jié)果。
圖5示出用增加量的與端粒酶RNA互補(bǔ)的SEQ ID NO10的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸進(jìn)行的體外端粒酶抑制分析結(jié)果。
圖6示出與端粒酶RNA互補(bǔ)的SEQ ID NOs2和10以及含有核苷酸錯(cuò)配的SEQ ID NO4對(duì)HME50-5E細(xì)胞生長(zhǎng)的作用結(jié)果。
圖7示出硫代氨基磷酸酯寡核苷酸對(duì)HME50-5E細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度的作用結(jié)果。
圖8示出測(cè)定的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2的IC50值。
詳細(xì)描述定義“烷基”是指具有1-20個(gè)碳原子的烷基或取代烷基，如甲基、乙基、丙基等。低級(jí)烷基典型是指C1-C5，中級(jí)烷基典型是指C6-C10。
“芳基”是指具有5-20個(gè)碳原子的芳香環(huán)基團(tuán)，如苯基、萘基、蒽基或取代芳基，如烷基或芳基取代如甲苯基、乙基苯基、聯(lián)苯基等。還包括環(huán)中具有一或多個(gè)氮、氧或硫原子的雜環(huán)芳香環(huán)基團(tuán)。
“寡核苷酸”典型地是指具有約3-50個(gè)連續(xù)亞單位的核苷亞單位聚合物。核苷亞單位可通過各種亞單位間連鍵而連接，所述連鍵包括但不限于圖1A-1C中所示的那些。另外，“寡核苷酸”包括本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的對(duì)糖骨架(例如核糖或脫氧核糖亞單位)、糖(例如2′取代)、堿基和3′和5′末端的修飾。本文所用術(shù)語“多核苷酸”具有相同含義，因?yàn)樾g(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文可互換地使用。
當(dāng)寡核苷酸由字母序列如“ATGUCCTG”表示時(shí)，應(yīng)理解核苷酸從左至右是5′→3′順序。
本文所用術(shù)語“核苷”包括天然核苷，如2′-脫氧和2′-羥基形式，例如如Komberg和Baker在《DNA復(fù)制》第2版(Freeman，舊金山，1992)所述，及其類似物。核苷“類似物”包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成核苷，例如，如Scheit在《核苷酸類似物》(John Wiley，紐約，1980)所述。這種類似物包括設(shè)計(jì)用于增強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)如穩(wěn)定性、特異性等的合成核苷，如Uhlmann和Peyman(化學(xué)綜述90543-584，1990)所揭示的那些。
“堿基”在本文中的定義包括(i)典型的DNA和RNA堿基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶)和(ii)修飾的堿基或堿基類似物(例如5-甲基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，或肌苷)。堿基類似物是一種化合物，其分子結(jié)構(gòu)模擬典型DNA或RNA堿基的分子結(jié)構(gòu)。
本文所用“嘧啶”是指在天然核苷中存在的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，及其常見類似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、氨基、硫代、鹵代等取代基的類似物。該術(shù)語進(jìn)一步包括附著有常見保護(hù)基的嘧啶，如N4-苯甲酰胞嘧啶。Beaucage和Iyer(Tetrahedron 48223-2311，1992)公開了其它常見嘧啶保護(hù)基。
本文所用“嘌呤”指在天然核苷中存在的嘌呤，包括腺嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤，及其常見類似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、氨基、硫代、鹵代等取代基的類似物。該術(shù)語進(jìn)一步包括附著有常見保護(hù)基的嘌呤，如N2-苯甲酰鳥嘌呤，N2-異丁酰鳥嘌呤，N6-苯甲酰腺嘌呤等。Beaucage和Iyer(Tetrahedron 48223-2311，1992)公開了其它常見嘌呤保護(hù)基。
本文所用的作為化合物名稱的組成部分的術(shù)語“保護(hù)”是指本領(lǐng)域熟知的對(duì)于一化合物的特定部分的保護(hù)基團(tuán)，例如核苷的“5′-保護(hù)羥基”包括三苯基甲基(即trityl)，對(duì)茴香基二苯基甲基(即單甲氧基三苯甲基或MMT)，二-對(duì)茴香基二苯基甲基(即二甲氧基三苯甲基或DMT)。本領(lǐng)域熟知的保護(hù)基團(tuán)包括下述參考文獻(xiàn)中描述的保護(hù)基團(tuán)Gait編輯的《寡核苷酸合成實(shí)用途徑》(IRL出版社，牛津，1984)；Amarnath and Broom，化學(xué)綜述77183-217，1977；Pon等，生物技術(shù)6768-775，1988；Ohtsuka等，核酸研究106553-6570，1982；Eckstein編輯的《寡核苷酸和類似物實(shí)用途徑》(IRL出版社，牛津，1991)，Greene and Wuts，《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》第2版(John Wiley & Sons，紐約，1991)，Narang編輯的《DNA和RNA合成及應(yīng)用》(學(xué)術(shù)出版社，紐約，1987)，Beaucage and Iyer(文獻(xiàn)同上)等。
術(shù)語“鹵素”或“鹵代”以其常規(guī)含義應(yīng)用，是指氯、溴、氟或碘取代基。在本文所述及所要求的化合物中，鹵素取代基通常是氟、溴或氯，優(yōu)選是氟或氯。
本發(fā)明的化合物可用于抑制或降低端粒酶活性和/或具有端粒酶活性的細(xì)胞的增殖。在這些前后關(guān)系上，抑制或降低酶活性或細(xì)胞增殖是指相對(duì)于酶或細(xì)胞未用測(cè)試化合物處理的對(duì)照實(shí)驗(yàn)所測(cè)活性水平降低。在特定的實(shí)施方案中，所測(cè)活性的抑制或降低為至少10％降低或抑制。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將會(huì)理解所測(cè)活性降低或抑制至少20％、50％、75％、90％或100％對(duì)于特定應(yīng)用可能是優(yōu)選的。
本發(fā)明一般地涉及含有至少一個(gè)硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的寡核苷酸，合成這種多核苷酸的方法，以及使用本發(fā)明寡核苷酸作為治療化合物及用于診斷的方法。
舉例性的寡核苷酸具有下式 其中每個(gè)B獨(dú)立地被選擇是嘌呤或嘧啶或其類似物，如尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶和肌苷，Z1是O或NH，Z2是OR，SR或甲基，其中R選自由氫、烷基、芳基和其鹽組成的組，R1選自由氫、O-R2、S-R2、NHR2和鹵素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，R3和R4選自由羥基、氨基和氫組成的組，m2是1-50之間的整數(shù)。
組成本發(fā)明的多核苷酸核苷酸的核苷亞單位可以選擇組成一確定序列如能特異地與單鏈核酸靶序列雜交的堿基序列，或者能使多核苷酸和靶雙螺旋之間形成三螺旋結(jié)構(gòu)的序列。優(yōu)選地，核苷亞單位序列通過至少一個(gè)是如下式定義的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亞單位連接 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物，Z是OR，SR或甲基，其中R選自由氫、烷基、芳基和其鹽組成的組，R1選自由氫、O-R2、S-R2、和鹵素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當(dāng)Z是甲基或OMe時(shí)，R1不是H。
例如，多核苷酸的所有亞單位間連鍵均可以是由下式定義的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵 本發(fā)明的寡核苷酸可以用于與靶核酸序列如RNA和DNA雜交。如果需要，本發(fā)明的寡核苷酸可以用報(bào)道基團(tuán)如放射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記、熒光標(biāo)記等標(biāo)記以促進(jìn)檢測(cè)多核苷酸本身，以及其在例如雜交復(fù)合物中的存在。
在本發(fā)明的另一方面，提供了用于分離或檢測(cè)樣品中的靶RNA的試劑盒，該試劑盒含有一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有由至少一個(gè)下式定義的亞單位間連鍵而連接的核苷亞單位確定序列 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物；Z是OR，SR或甲基；R1選自由氫、O-R2、S-R2、和鹵素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當(dāng)Z是甲基或OMe時(shí)，R1不是H，以及其中該寡核苷酸與靶RNA雜交。
所述寡核苷酸還可配制成在與靶基因的過表達(dá)相關(guān)的疾病情況中抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄或翻譯的藥物。
優(yōu)選地，核苷亞單位序列由至少一個(gè)是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亞單位間連鍵而連接?；蛘?，多核苷酸的所有亞單位間連鍵均是由下式定義的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵 在其它方面，本發(fā)明涉及用Nelson等(有機(jī)化學(xué)雜志627278-7287，1997)的亞磷酰胺轉(zhuǎn)移方法學(xué)的修改技術(shù)合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的固相方法。該合成策略采用購(gòu)自Cruachemand JBL Scientific，Inc.(Aston，PA和San Luis Obispo，CA)的3′-NH-三苯甲基保護(hù)3′-氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二異丙基氨基亞磷酰胺(Nelson等，文獻(xiàn)同上)。用下述化學(xué)程序進(jìn)行每一合成循環(huán)(見圖2)1)脫三苯甲基化，2)偶聯(lián)，3)加帽，4)硫化。對(duì)于在偶聯(lián)步驟后形成的核苷間亞磷酰胺基團(tuán)的逐步硫化，用硫化劑代替碘/水基氧化劑，可以使用元素硫S8或常用的Beaucage試劑3H-1，2-苯并二硫羥-3-酮(Iyer等，有機(jī)化學(xué)雜志554693-4699，1990)。用在無水乙腈中的1％Beaucage試劑溶液或在CS2/Et3N，99/1(vol/vol)中的15％S8作為硫化劑進(jìn)行寡核苷酸合成(1μmole合成規(guī)模)。
嵌合N3′→P5′氨基磷酸酯-硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的制備可采用偶聯(lián)步驟后的氧化步驟進(jìn)行，該步驟導(dǎo)致形成氨基磷酸酯核苷間基團(tuán)。類似地，磷酸二酯-硫代氨基磷酸酯可通過用5′-亞磷酰胺-3′-O-DMTr保護(hù)的核苷酸作為單體構(gòu)件制備。這些合成途徑均是本領(lǐng)域已知的。
用兩種硫化劑制備模型氨基磷酸酯胸腺嘧啶二核苷TnpsTn，其具有3′-NHP(O)(S-)O-5′核苷間基團(tuán)。分析反應(yīng)混合物并經(jīng)離子交換(IE)和反相(RP)HPLC以及31P NMR證實(shí)該化合物的結(jié)構(gòu)。分析揭示用Beaucage試劑對(duì)核苷間亞磷酰胺基團(tuán)的硫化導(dǎo)致形成約10-15％的具有3′-NHP(O)(O-)O-5′氨基磷酸酯連鍵的氧化二核苷(31PNMRδ，ppm7.0于D2O中)?；蛘?，用分子硫S8產(chǎn)生所需的含3′-NHP(O)(S-)O-5′核苷間基團(tuán)的二核苷，用31P NMR和IE HPLC分析判斷其具有有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)量(31P NMRδ，ppm 56.4，59.6于D2O中，Rp，Sp異構(gòu)體)。
合成模型寡核苷酸11聚體GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO1)也獲得類似的硫化效率結(jié)果，其中用Beaucage試劑硫化產(chǎn)生含有約15％氨基磷酸酯連鍵的全長(zhǎng)產(chǎn)物，這是用反應(yīng)混合物的31P NMR分析確定的。主峰的化學(xué)位移約為57和60ppm(寬雙峰)和7ppm(寬單峰)，其分別相應(yīng)于硫代氨基磷酸酯和氨基磷酸酯基團(tuán)。相反，根據(jù)31P NMR分析，用S8硫化僅在11聚體產(chǎn)物中產(chǎn)生約2％氨基磷酸酯連鍵。寡聚物的IE HPLC分析與31P NMR譜吻合很好。最終寡核苷酸產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和純度用MALDI-TOF質(zhì)譜分析、31P NMR及聚丙烯酰胺凝膠電泳分析證實(shí)。硫代氨基磷酸酯寡聚物GT2AG3T2AG(SEQID NO1)和TAG3T2AGACA2(SEQ ID NO2)的分子量分別計(jì)算為3577.11和4202.69。經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)確定的硫代氨基磷酸酯寡聚物GT2AG3T2AG(SEQ ID NO1)和TAG3T2AGACA2(SEQID NO2)的分子量分別為3577和4203；在15％PAGE中相對(duì)于等序列(isosequential)氨基磷酸酯的遷移率分別為0.95和0.97。
如IE HPLC和31P NMR(31P NMRδppm7.0)(見圖3)所鑒定的，通過用在吡啶/THF/H2O 1/4/0.1(vol/vol)中的0.1M碘溶液在55°C處理15分鐘，模型氨基磷酸酯核苷TnpsTn被定量轉(zhuǎn)變?yōu)榘被姿狨ハ鄳?yīng)物TnpTn。將TnpsTn二核苷用10％乙酸在55℃處理48小時(shí)出人意料地僅導(dǎo)致核苷間氨基磷酸酯連鍵的部分水解(約10％)。為在這些條件下進(jìn)行比較，將親本氨基磷酸酯二聚體TnpTn完全水解。該二核苷硫代磷酸酯中的N-P鍵的裂解同時(shí)伴有脫硫過程(約15％)，隨后是所得氨基磷酸酯-NHP(O)(O-)O-基團(tuán)的快速水解，如IE HPLC和31P NMR所揭示(圖3)。
2′-R3N3′→P5′硫代氨基磷酸酯可如上所述從相應(yīng)的氨基磷酸酯獲得。2′-R3N3′→P5′氨基磷酸酯是通過設(shè)計(jì)用于合成寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的亞磷酰胺轉(zhuǎn)移方法學(xué)獲得。2-O-烷基N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的合成作為這一方法學(xué)的舉例而詳細(xì)描述。
根據(jù)下述方案1-3所示的一系列化學(xué)轉(zhuǎn)化制備合適保護(hù)的2′-O-烷基-3′氨基核苷-5′-亞磷酰胺構(gòu)件4，6，11和15。制備這些化合物的一創(chuàng)造性步驟是在嘧啶的亞氨基官能性或嘌呤的N-7原子存在下對(duì)2′-羥基選擇性甲基化。兩個(gè)嘧啶基單體得自己知的3-疊氮-2′-O-乙?；?5′-O-甲苯?；?3′-脫氧-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶1。典型地，1的N-3/O-4亞氨基氮首先用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，如通過在二甲基氨基吡啶存在下甲基propyolate的反應(yīng)而進(jìn)行(方案1)。粗反應(yīng)產(chǎn)物隨后選擇性地2′-O-去乙?；?，然后得到的游離2′-羥基被烷基化，如通過用碘甲烷和氧化銀進(jìn)行甲基化。N-3保護(hù)基團(tuán)被除去，3′-疊氮基被還原成胺，隨后其被立即保護(hù)，如與4-單甲氧基三苯甲基氯反應(yīng)，得到前體3。隨后用堿性溶液裂解5′-甲苯?；ィ又靡阎桨高M(jìn)行phosphitylation，得到所需的2′-O-甲基尿苷亞磷酰胺單體4。通過將尿苷中間體3轉(zhuǎn)化為3′-氨基胞苷類似物5而獲得2′-O-甲基胞嘧啶亞磷酰胺。 2′-O-烷基腺苷類似物的合成需要使用大保護(hù)基團(tuán)，主要用于環(huán)外氨基以防止在2′-羥基甲基化期間N-7的烷基化(方案2)。3′-疊氮-2′-O-乙?；?5′-O-N6-苯甲酰-3′-脫氧腺苷7首先被脫保護(hù)，如與NH3/MeOH(1/1，v/v)反應(yīng)，以提供3′-疊氮-3′-脫氧腺苷。然后，用大保護(hù)基團(tuán)如叔丁基二苯基甲硅烷基或4-單甲氧基三苯甲基對(duì)5′-羥基和N-6部分選擇性再保護(hù)。在5′-O和N-6位置的兩個(gè)大取代基的組合立體封閉N-7，由此使得在2′-位置選擇性導(dǎo)入甲基，以產(chǎn)生中間體8。然后如通過用在有機(jī)溶劑如二氯甲烷中的3％三氯乙酸處理除去N-6 4-單甲氧基三苯甲基基團(tuán)，接著進(jìn)行N-6的再保護(hù)。使用苯甲酰氯再保護(hù)N-6獲得兩個(gè)苯甲?；鶊F(tuán)的加成。第二個(gè)苯甲?；鶊F(tuán)隨后通過堿處理除去，產(chǎn)生中間體9。然后還原疊氮基團(tuán)，并用4-單甲氧基三苯甲基保護(hù)所得3′-氨基而形成10。最后，裂解5′-甲硅烷基保護(hù)基團(tuán)，phosphitylation得到2′-O-甲基亞磷酰胺單體11。方案2 鳥苷基2′-O-烷基亞磷酰胺15的合成如方案3所示。用堿處理使3′-疊氮基-2′-O-乙?；?5′-O-甲苯酰基-N2-異丁?；?O6-二苯基氨甲?；?3′-脫氧鳥苷12去封閉。通過與叔丁基二苯基甲硅烷基氯反應(yīng)再保護(hù)5′O-和O-6。該雙甲硅烷基化中間體隨后被2′-O-烷基化。O-6甲硅烷基被選擇性脫保護(hù)，得到化合物13。N-2基團(tuán)被再保護(hù)，3′-疊氮基團(tuán)被還原，得到的3′-氨基基團(tuán)被保護(hù)以產(chǎn)生核苷14。最后，通過除去5′-保護(hù)基團(tuán)，隨后將暴露的5′-羥基phosphitylation而得到2′-O-烷基鳥苷亞磷酰胺單體15。方案3 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，寡核苷酸的酸穩(wěn)定性通過將由N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵連接的亞單位置于寡核苷酸中而增強(qiáng)。相對(duì)于具有磷酸二酯或氨基磷酸酯亞單位間連鍵的互補(bǔ)DNA或RNA鏈，評(píng)價(jià)硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的雜交性質(zhì)。從氨基磷酸酯寡核苷酸和磷酸二酯寡聚物產(chǎn)生的雙螺旋的熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)總結(jié)于表1中(實(shí)施例3)。
硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與互補(bǔ)核酸的雜交是序列特異性的并由合適的Watson-Crick堿基配對(duì)決定。由具有一單堿基錯(cuò)配的氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO3與端粒酶的RNA靶成分形成的雙螺旋(實(shí)施例6，表2，實(shí)驗(yàn)2)的穩(wěn)定性比由完全互補(bǔ)于端粒酶RNA成分的寡核苷酸SEQ ID NO1形成的雙螺旋差許多(實(shí)施例6，表2，實(shí)驗(yàn)1)。含有核苷間3′-NHP(O)(S-)O-5′硫代氨基磷酸酯連鍵的寡核苷酸的應(yīng)用合成寡核苷酸SEQ ID NO2 3′-NHP(O)(S-)O-5′硫代氨基磷酸酯，這一化合物令人驚奇地具有酸穩(wěn)定性并與互補(bǔ)RNA靶形成穩(wěn)定的復(fù)合物。本發(fā)明的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯多核苷酸具有反義和反基因診斷/治療應(yīng)用的巨大潛力。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是寡脫氧核糖核苷酸。A.端粒酶抑制應(yīng)用最近出現(xiàn)了對(duì)正常細(xì)胞達(dá)到衰老狀態(tài)的機(jī)制的了解，該狀態(tài)即細(xì)胞在正常經(jīng)歷細(xì)胞老化過程中的增殖能力的喪失。真核生物染色體末端或稱端粒處的DNA通常由串聯(lián)重復(fù)的簡(jiǎn)單序列組成?？茖W(xué)家長(zhǎng)久以來已知道端粒在保持染色體結(jié)構(gòu)和功能方面有重要的生物學(xué)作用。近來科學(xué)家推測(cè)在重復(fù)細(xì)胞分裂中端粒DNA的累積喪失可能引發(fā)細(xì)胞衰老和老化，而參與保持端粒長(zhǎng)度的酶即端粒酶的調(diào)節(jié)可能具有重要的生物學(xué)應(yīng)用。參見Harley，1991，突變研究256271-282。Bodnar等的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)端粒和端粒酶在控制培養(yǎng)的正常人細(xì)胞的復(fù)制壽命中的重要性，參見Bodnar等，1998，科學(xué)279349-352。
端粒酶是一種核糖核蛋白酶，其合成端粒DNA的一條鏈以用作該酶的RNA成分中所含的序列的模板。參見Blackburn，1992，生物化學(xué)年度綜述61113-129。人端粒酶的RNA成分已被測(cè)序，其長(zhǎng)度為460個(gè)核苷酸并含有一系列11個(gè)堿基的序列重復(fù)，該序列重復(fù)互補(bǔ)于端粒重復(fù)。人端粒酶活性可被各種互補(bǔ)于端粒酶的RNA成分的寡核苷酸抑制。參見Norton等，自然生物技術(shù)14615，1996；Pitts等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)9511549-11554，1998；Glukhov等，生物化學(xué)生物物理研究通訊248368-371，1999。本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與端粒酶RNA的10-50個(gè)核苷酸互補(bǔ)。優(yōu)選地，本發(fā)明的端粒酶抑制劑硫代氨基磷酸酯寡核苷酸具有與端粒酶RNA互補(bǔ)的10-20個(gè)連續(xù)堿基序列。
已經(jīng)描述了用于檢測(cè)端粒酶活性以及鑒別調(diào)節(jié)或影響端粒酶活性的化合物的方法，還描述了通過控制端粒長(zhǎng)度和端粒酶活性而治療或診斷細(xì)胞衰老和永生化的方法。見Feng等，1995，科學(xué)2691236-1241；Kim等，1994，科學(xué)2662011-2014；PCT專利出版物93/23572，1993年11月25日公開；美國(guó)專利5,656,638，5,760,062，5,767,278，5,770,613和5,863,936。
抑制端粒酶活性的化合物的鑒別對(duì)治療人類疾病的努力提供了重要有利之處。抑制端粒酶活性的化合物可用于治療端粒酶介導(dǎo)的疾病如癌癥，因?yàn)榘┌Y細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性，而正常人體細(xì)胞不具備生物學(xué)相關(guān)水平(即足以在許多次細(xì)胞分裂中保持端粒長(zhǎng)度的水平)的端粒酶活性。不幸的是，僅鑒別和鑒定的非常少的這種化合物，特別是具有高效力或活性的化合物，以及在口服投藥后具有生物利用性的化合物。因此，目前仍有需要獲得具有相對(duì)高效力或活性并且是口服可生物利用的作為端粒酶抑制劑的化合物，以及治療癌癥和異常存在端粒酶活性的其它疾病的組合物和方法。
本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸化合物是酸穩(wěn)定的，因此作為有害的端粒酶活性的抑制劑有許多有價(jià)值的用途，如治療人類癌癥。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的藥物組合物可用于治療方案中，以體內(nèi)抑制癌細(xì)胞，或者可用于來自體內(nèi)(ex vivo)癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了治療癌癥的治療化合物和組合物，以及治療哺乳動(dòng)物(例如牛、馬、綿羊、小公牛、豬和獸醫(yī)動(dòng)物如貓及狗)的癌癥。另外，本發(fā)明的氨基磷酸酯寡核苷酸也可用于治療其它端粒酶介導(dǎo)的狀態(tài)或疾病，如其它過度增生或自身免疫疾病。
如上所述，細(xì)胞的永生化特別涉及端粒酶的活化。更具體地，端粒酶活性與許多腫瘤細(xì)胞系保持永生的能力之間的聯(lián)系已通過端粒酶活性分析被證實(shí)(Kim等，文獻(xiàn)同上)。這一分析，連同表明端粒長(zhǎng)度的縮短在正常細(xì)胞中可提供復(fù)制衰老信號(hào)的數(shù)據(jù)(見PCT申請(qǐng)93/23572)證實(shí)抑制端粒酶活性可以是有效的抗癌療法。因此，端粒酶活性可通過防止端粒長(zhǎng)度的正常縮短以及在許多次細(xì)胞分裂后在正常體細(xì)胞中發(fā)生的細(xì)胞復(fù)制的同時(shí)停止而防止正常復(fù)制衰老的開始。在癌細(xì)胞中，當(dāng)惡性表型是由于細(xì)胞周期的喪失或生長(zhǎng)控制或其它遺傳損傷所致時(shí)，端粒酶活性的缺失使得細(xì)胞分裂期間端粒DNA喪失，導(dǎo)致染色體重排和異常，由此最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但是，在具有端粒酶活性的癌細(xì)胞中，在細(xì)胞分裂期間端粒DNA不喪失，由此使癌細(xì)胞變得永生化，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。能抑制腫瘤細(xì)胞中的端粒酶活性的制劑對(duì)于各種癌癥和其中具有端粒酶活性的永生細(xì)胞是疾病進(jìn)程的因素或者其中端粒酶活性的抑制是治療目的所需的其它病癥(如真菌感染)提供了治療益處。本發(fā)明的端粒酶抑制劑也可用于在種系細(xì)胞中抑制端粒酶活性，其可用作避孕目的。
另外，應(yīng)理解的是治療癌癥的治療益處可通過將本發(fā)明的端粒酶抑制劑與其它抗癌劑結(jié)合而實(shí)現(xiàn)，所述其它抗癌劑包括端粒酶的其它抑制劑，如美國(guó)專利5,656,638，5,760,062，5,767,278，5,770,613和5,863,936所述。這種結(jié)合的選擇基于各種因素，包括但不限于疾病類型、患者年齡和總的健康狀況、疾病進(jìn)程的攻擊性、待治療的疾病細(xì)胞的TRF長(zhǎng)度和端粒酶活性以及患者對(duì)包含該結(jié)合的制劑的耐受能力。例如，如果腫瘤進(jìn)程已到達(dá)高度狀態(tài)，推薦將本發(fā)明的端粒酶抑制化合物與有效降低腫瘤大小的其它制劑和治療方案(例如放射、手術(shù)、化療和/或激素治療)結(jié)合。另外，在某些情況下推薦將本發(fā)明的端粒酶抑制劑與一或多種治療疾病的副作用的制劑如止痛劑結(jié)合，或者與有效刺激患者自身免疫應(yīng)答的制劑(例如集落刺激因子)結(jié)合。
如下所述，本發(fā)明的化合物證實(shí)具有體內(nèi)針對(duì)端粒酶活性的抑制活性。本發(fā)明的體外活性已用本文所述方法證實(shí)。本文所用術(shù)語“體外”是指用組織培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行的試驗(yàn)。這種程序也已知為“來自體內(nèi)(ex vivo)”。
本部分描述的寡核苷酸端粒酶抑制劑典型地包括與端粒酶RNA成分互補(bǔ)的序列。人端粒酶RNA成分的序列見美國(guó)專利5,776,679。其它物種的端粒酶RNA成分也可使用，這取決于意欲治療的個(gè)體。
通常，寡核苷酸包括10-100個(gè)特異于端粒酶的核苷酸(即它們與端粒酶RNA成分在低濃度或更高嚴(yán)格性條件下雜交，所述更高嚴(yán)格條件是相對(duì)于其與其它RNA酶成分或預(yù)計(jì)在靶細(xì)胞或治療旁觀者細(xì)胞中存在并有功能活性的其它RNA分子的雜交條件而言)。所述寡核苷酸包括約10-25個(gè)核苷酸，實(shí)施例中舉例示出了12-15個(gè)核苷酸的寡核苷酸。在許多情況下，寡核苷酸應(yīng)精確與端粒酶RNA中相同長(zhǎng)度的連續(xù)序列互補(bǔ)。但是，應(yīng)理解的是即使當(dāng)寡核苷酸中有錯(cuò)配殘基或間隙或添加時(shí)，特別是當(dāng)RNA中的相應(yīng)互補(bǔ)序列長(zhǎng)度超過15個(gè)核苷酸時(shí)，雜交仍可以是特異性的。
用于鑒別具有抑制端粒酶活性的特異序列的本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸的一種方法涉及將細(xì)胞、組織或優(yōu)選地含有端粒酶的細(xì)胞提取物或其它制備物與幾種已知濃度的與端粒酶的RNA成分互補(bǔ)的硫代磷酸酯寡核苷酸在端粒酶活性相容的緩沖液中接觸，測(cè)定每一濃度的硫代氨基磷酸酯多核苷酸的端粒酶活性。在給予端粒酶抑制劑之前或之后，可用標(biāo)準(zhǔn)試劑和方法確定端粒酶活性。例如，培養(yǎng)細(xì)胞中的端粒酶活性可用TRAP活性分析測(cè)定(Kim等，科學(xué)2662011，1997；Weinrich等，自然遺傳學(xué)17498，1997)。下述分析試劑盒可商購(gòu)用于研究目的TRAPezeXK端粒酶檢測(cè)試劑盒(目錄s7707；Intergen公司，NY)；TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAplus(目錄2，013，89；Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)。
所述多核苷酸的IC50(即樣品制備物的觀察活性降低至其原始或?qū)φ罩档囊话霑r(shí)的多核苷酸濃度)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定?；诒疚乃鰞?nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是可以采用確定本發(fā)明的化合物針對(duì)端粒酶的抑制濃度的其它方法。
使用上述方法，測(cè)定本發(fā)明的幾種硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的IC50值，發(fā)現(xiàn)其低于10nM(見表2，實(shí)施例6)。
預(yù)計(jì)用互補(bǔ)于端粒酶的RNA成分的硫代氨基磷酸酯多核苷酸治療惡性疾病能誘導(dǎo)端粒酶陽性細(xì)胞系發(fā)生轉(zhuǎn)變。用硫代磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2處理自發(fā)永生化的HME50-5E人乳腺上皮細(xì)胞導(dǎo)致對(duì)端粒酶活性的抑制，如通過端粒長(zhǎng)度降低所證實(shí)(見實(shí)施例6和圖4)。用互補(bǔ)于端粒酶的RNA序列成分的本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸處理其它端粒酶陽性細(xì)胞系如HEK-293和HeLa細(xì)胞也預(yù)計(jì)誘導(dǎo)處理的細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度的降低。
本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也預(yù)計(jì)在人腫瘤細(xì)胞系如卵巢腫瘤細(xì)胞系OVCAR-5和SK-OV-3中在細(xì)胞分裂期間誘導(dǎo)端?？s短。但是重要的是，在用作對(duì)照的正常人細(xì)胞如成纖維細(xì)胞來源的BJ細(xì)胞中，觀察到的端粒長(zhǎng)度的降低預(yù)期與用對(duì)照物質(zhì)例如與互補(bǔ)端粒酶RNA靶有至少一個(gè)單堿基錯(cuò)配的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸處理的細(xì)胞沒有不同。本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸還預(yù)期能證實(shí)在低于20μM濃度在正常細(xì)胞中沒有明顯的細(xì)胞毒性作用。
另外，本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸對(duì)端粒酶RNA的特異性可通過進(jìn)行雜交試驗(yàn)并將其針對(duì)端粒酶和其它已知具有重要RNA成分的酶如ribonucleoase P的活性(IC50)進(jìn)行比較。具有與所篩選的其它酶的IC50值相比較低的針對(duì)端粒酶的IC50值的化合物據(jù)認(rèn)為具有對(duì)端粒酶的特異性。
也可用小鼠異種移植模型例如將OVCAR-5腫瘤細(xì)胞移植至裸鼠上的模型進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試，其中用本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸治療的小鼠預(yù)期具有的腫瘤質(zhì)量在起始劑量后的一段時(shí)間平均會(huì)增加，但隨著持續(xù)治療質(zhì)量會(huì)開始下降。相反，用對(duì)照(例如與互補(bǔ)端粒酶RNA靶具有至少一個(gè)單堿基錯(cuò)配的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸)治療的小鼠預(yù)期其腫瘤質(zhì)量持續(xù)增加。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員從上述描述應(yīng)理解本發(fā)明還提供了選擇涉及給予本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的治療方案的方法。對(duì)于這種目的，可能有利的是進(jìn)行一末端限制片段(TRF)分析，該分析中通過用特異于非端粒(T2AG3)N序列的序列的限制酶消化而分析來自腫瘤細(xì)胞的DNA。消化DNA后，進(jìn)行凝膠電泳以根據(jù)大小分離限制片段。隨后用特異于端粒序列的核酸探針探查分離的片段，以確定含有樣品細(xì)胞的端粒DNA的末端片段的長(zhǎng)度。通過測(cè)量端粒DNA的長(zhǎng)度，可以估計(jì)端粒酶抑制劑應(yīng)給予多長(zhǎng)時(shí)間，以及是否還應(yīng)該采用其它治療方法(例如手術(shù)、化療和/或放療)。另外，在治療期間，可以測(cè)試細(xì)胞以確定是否隨著漸進(jìn)細(xì)胞分裂發(fā)生端粒長(zhǎng)度降低，以證實(shí)治療效果。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可作為抗癌斗爭(zhēng)中重要武器以抗表達(dá)端粒酶的惡性，腫瘤如皮膚、結(jié)締組織、脂肪、乳腺、肺、胃、胰腺、卵巢、宮頸、子宮、腎、睪丸、結(jié)腸、前列腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、視網(wǎng)膜和循環(huán)系統(tǒng)腫瘤(如白血病和淋巴癌)的化合物。特別是，本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸可提供治療許多(如果不是大多數(shù))惡性的高度通用方法，如用具有端粒酶活性的高變?nèi)四[瘤細(xì)胞系和腫瘤所證實(shí)的那樣。更重要地，本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可提供高度有效區(qū)分惡性和正常細(xì)胞的療法，從而避免大多數(shù)目前通用的化療方案所存在的危害性副作用，目前通用的化療方案基于無區(qū)別性殺死分裂細(xì)胞的藥劑。B.其它反義應(yīng)用反義治療涉及給予結(jié)合位于細(xì)胞內(nèi)的靶核酸(典型地為RNA分子)的外源寡核苷酸。用反義這一術(shù)語是因?yàn)樗龉押塑账岬湫偷赜诰幋a細(xì)胞產(chǎn)物的mRNA分子(“有義鏈“)互補(bǔ)。
本文所述硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用于反義抑制基因表達(dá)(Matsukura等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)864244-4248，1989；Agrawal等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)867790-7794，1989；Zamecnik等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)834143-4146，1986；Rittner and Sczakiel，核酸研究191421-1426，1991；Stein and Cheng，科學(xué)2611004-1012，1993)。含有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵的寡核苷酸對(duì)于大量醫(yī)學(xué)顯著的靶均有治療應(yīng)用，包括但不限于抑制癌細(xì)胞增殖和干擾傳染性病毒。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用于獸醫(yī)和人的應(yīng)用。本發(fā)明的寡核苷酸的高度酸穩(wěn)定性及其在低濃度有效作為反義分子的能力(見下述)使得這些寡核苷酸作為治療反義劑是高度希望的。
反義劑典型地需要持續(xù)結(jié)合所有靶RNA從而失活這些靶RNA分子或者提供內(nèi)源性核糖核酸酶H(Rnase H)活性的底物。由本發(fā)明方法產(chǎn)生的RNA/寡核苷酸復(fù)合物對(duì)Rnase H消化的敏感性可通過標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)價(jià)(Donia等，生物化學(xué)雜志26814514-14522，1993；Kawasaki等，醫(yī)用化學(xué)雜志36831-841，1993)。
本發(fā)明的化合物和方法相對(duì)于更傳統(tǒng)的反義劑有若干優(yōu)點(diǎn)。首先，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與相應(yīng)磷酸二酯寡核苷酸能更強(qiáng)地結(jié)合RNA靶。第二，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸抗酸性條件的降解的能力更強(qiáng)。第三，在化合物的細(xì)胞攝入中，不帶電的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸骨架比帶電的寡核苷酸能更有效地使氨基磷酸酯寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞。
另外，當(dāng)RNA由雙螺旋靶序列的大部分為嘌呤的鏈編碼時(shí)，靶向該雙螺旋的氨基磷酸酯類似物寡核苷酸還具有失活DNA的潛力，即失活單鏈和雙鏈形式的病原體的能力(見下述反基因治療的討論)。
序列特異性硫代氨基磷酸酯寡核苷酸分子對(duì)于以某種方式涉及RNA的幾乎任何疾病或癥狀均是潛在的強(qiáng)治療劑。這種序列可被靶向而進(jìn)行治療應(yīng)用的舉例模式包括a)靶向表達(dá)參與感染因子如細(xì)菌、病毒、酵母和其它真菌的繁殖和/或保持的產(chǎn)物的RNA序列，例如由感染因子編碼的特異mRNA；b)形成雙螺旋分子，從而誘導(dǎo)RNA的裂解(例如，RNA/DNA
雜合雙螺旋分子的Rnase H裂解)；c)阻斷蛋白質(zhì)與RNA序列的相互作用(例如，TAT和TAR的相互作用，見下述)；和d)靶向?qū)е录?xì)胞基因的不適當(dāng)表達(dá)或增殖的序列例如，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)；炎性過程；平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖、遷移和基質(zhì)形成(Liu等，循環(huán)791374-1387，1989)；某些遺傳病和癌癥相關(guān)的基因(原癌基因)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，不適當(dāng)表達(dá)的細(xì)胞基因的翻譯或RNA加工被阻斷。舉例性的潛在靶序列是原癌基因，例如包括但不限于下述基因c-myc，c-myb，c-fos，c-kit，ras，和BCR/ABL(例如，Wickstrom編輯的《癌癥和AIDS的反義核酸治療的前景》，Wiley-Liss，紐約，1991；Zalewski等，循環(huán)研究，881190-1195，1993；Calabretta等，癌癥生物學(xué)研討會(huì)3391-398，1992；Calabretta等，癌癥治療綜述19169-179，1993)，原癌基因(例如，p53，Bayever等，反義研究和發(fā)育3383-390，1993)和病毒基因(例如，乳多空病毒，Cowsert等，Antimicrob.Agents and Chemo 37171-177，1993；單純皰疹病毒，Kulka等，抗病毒研究20115-130，1993)。增生反義治療的另一種合適靶是端粒酶的蛋白質(zhì)成分(見WO99/50279)，其是端粒酶表達(dá)中的限制成分。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的序列在美國(guó)專利6,093,809，WO98/14592和pGRN121(ATCC登錄號(hào)209016)中提供。進(jìn)一步的舉例是，可被本發(fā)明方法靶向的HIV-1蛋白的兩個(gè)RNA區(qū)是REV-蛋白應(yīng)答元件(RRE)和TAT-蛋白反式激活應(yīng)答元件(TAR)。REV活性需要存在位于HIV包膜基因中的REV應(yīng)答元件(RRE)(Malim等，自然338254-257，1989；Malim等，細(xì)胞58205-214，1989)。
RRE已被定位于一個(gè)據(jù)信形成4個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)和1個(gè)分支莖環(huán)結(jié)構(gòu)的234個(gè)核苷酸的區(qū)域(Malim等，自然338254-257，1989)。得自足跡研究的數(shù)據(jù)(Holland等，病毒學(xué)雜志645966-5975，1990；Kjems等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)88683-687，1991)提示REV與RRE的一個(gè)莖結(jié)構(gòu)中的6個(gè)堿基對(duì)結(jié)合，并與一相鄰莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3個(gè)核苷酸結(jié)合。莖-環(huán)II中的約40個(gè)核苷酸的最小REV結(jié)合區(qū)已由Cook等鑒別(核酸研究，191577-1583)。這一結(jié)合區(qū)可以是根據(jù)本發(fā)明方法使用一或多個(gè)硫代氨基磷酸酯寡核苷酸而產(chǎn)生RNA/DNA雙螺旋的靶(例如，Li等，病毒學(xué)雜志676882-6888，1993)。
HIV-1 TAT對(duì)于病毒復(fù)制是重要的，并且是長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)介導(dǎo)的病毒基因表達(dá)的強(qiáng)反式激活物(Dayton等，細(xì)胞44941-947，1986；Fisher等，自然320367-371，1986)。由TAT蛋白誘導(dǎo)的反式激活需要存在TAR元件(見美國(guó)專利5,837,835)，該元件位于病毒mRNA元件的非翻譯5′末端。
TAR元件能形成穩(wěn)定的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(Muesing等，細(xì)胞48691-701，1987)。TAR莖上的莖和3核苷酸(nt)凸起的完整性已被證實(shí)是TAT蛋白與TAR元件的特異和高親和性結(jié)合所需的(Roy等，基因發(fā)育41365-1373，1990；Cordingley等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)878985-8989，1990；Dingwall等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)866925-6929，1989；Weeks等，科學(xué)2491281-1285，1990)。這一區(qū)域可以根據(jù)本發(fā)明方法而被靶向進(jìn)行反義治療。
除了導(dǎo)向REV，RRE和TAT蛋白的RNA結(jié)合位點(diǎn)，REV和TAT蛋白本身的RNA編碼序列可以被靶向以阻斷蛋白質(zhì)的表達(dá)。
指導(dǎo)結(jié)合潛在反義靶位點(diǎn)的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的起始篩選典型地包括測(cè)試所得RNA/DNA雙螺旋的熱穩(wěn)定性。當(dāng)鑒別了結(jié)合選定的RNA靶序列的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸時(shí)，進(jìn)一步測(cè)試該寡核苷酸在體外對(duì)RNA功能的抑制。使用細(xì)胞培養(yǎng)分析系統(tǒng)進(jìn)行這種體外分析(例如，單純皰疹病毒，Kulka等，抗病毒研究20115-130，1993；HIV-1，Li等，病毒學(xué)雜志676882-6888，1993，Vickers等，核酸研究193359-3368，1991；在再狹窄中的冠狀平滑肌細(xì)胞增殖，Zalewski等，核酸研究151699-1715，1987；IL-2R，Grigoriev等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)903501-3505，1993；c-myb，Baer等，血液791319-1326，1992；c-fos，Cutry等，生物化學(xué)雜志26419700-19705，1989；BCR/ABL，Szczylik等，科學(xué)253562-565，1991)。C.反基因應(yīng)用以前已證實(shí)經(jīng)三螺旋形成對(duì)基因表達(dá)的抑制(Cooney等，科學(xué)241456-459，1989；Orson等，核酸研究193435-3441，1991；Postel等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)888227-8231，1991)。當(dāng)采用第三條鏈硫代氨基磷酸酯類似物寡核苷酸時(shí)形成的三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增加提供了反基因應(yīng)用如獸醫(yī)和人類治療應(yīng)用的更強(qiáng)的工具。
靶區(qū)域的選擇基于已知序列用三螺旋形成的基本規(guī)則進(jìn)行選擇(Helene和Toulme，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)104999-125，1990)。典型地，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸序列定向于雙鏈基因序列，其中一條鏈主要含有嘌呤，另一條鏈主要含有嘧啶。
用條帶移位分析測(cè)試本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與選定的雙螺旋靶序列形成三螺旋形成的能力(例如參見美國(guó)專利5,726,297，實(shí)施例4)。典型地，用高百分比聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行條帶移位分析，并將變性條件的水平(Ausubel等，分子生物學(xué)當(dāng)前方案，John Wileyand Sons，Inc.，Media Pa.；Sauer等編輯，酶學(xué)方法蛋白質(zhì)/DNA相互作用，學(xué)術(shù)出版社，1991；Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港出版社，第2卷，1989)被調(diào)節(jié)以降低任何非特異背景結(jié)合。
雙螺旋靶被標(biāo)記(例如，用放射性核苷酸標(biāo)記)并與第三條鏈寡核苷酸混合，以測(cè)試該寡核苷酸與靶雙螺旋形成三螺旋結(jié)構(gòu)的能力。標(biāo)記的雙螺旋寡核苷酸遷移率的移位指示該寡核苷酸形成三螺旋結(jié)構(gòu)的能力。
在條帶移位分析中三螺旋形成以標(biāo)記的三螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)于標(biāo)記的雙螺旋結(jié)構(gòu)在凝膠中的降低的遷移率指示。
通過這一方法可評(píng)價(jià)許多潛在靶位點(diǎn)，包括選自長(zhǎng)度和復(fù)雜性變化的全范圍DNA序列的靶位點(diǎn)。序列特異性硫代氨基磷酸酯類似物結(jié)合分子是用于以某種方式涉及DNA的幾乎任何疾病或癥狀的潛在強(qiáng)治療劑。這種治療劑的舉例性靶序列包括a)參與感染因子如細(xì)菌、病毒、酵母和其它真菌的繁殖和/或保持的DNA序列，例如，破壞感染因子的代謝；和b)導(dǎo)致細(xì)胞基因如癌基因的不合適表達(dá)或增殖的序列，例如阻斷或降低不合適表達(dá)的細(xì)胞基因(如與某些遺傳病相關(guān)的基因)的轉(zhuǎn)錄。
基因表達(dá)或復(fù)制可以通過在所需的調(diào)控蛋白(或分子)已知結(jié)合的區(qū)域產(chǎn)生三螺旋結(jié)構(gòu)而被阻斷(例如，HIV轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子如啟動(dòng)子起始位點(diǎn)和SP1結(jié)合位點(diǎn)，McShan等，生物化學(xué)雜志2675712-5721，1992)?；蛘?，基因(如癌基因)的蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)的特異序列也可以被靶向。
當(dāng)通過上述凝膠條帶移位遷移率分析鑒別與選定的雙螺旋靶序列測(cè)試結(jié)合的硫代氨基磷酸酯類似物寡核苷酸時(shí)，進(jìn)一步測(cè)試該類似物體外形成穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的能力。使用如美國(guó)專利5,631,135所述的細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)分析系統(tǒng)。
靶位點(diǎn)可以在基因的控制區(qū)，例如在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或調(diào)控蛋白的結(jié)合區(qū)中選擇(Helene and Toulme，1990；Birg等，1990；Postel等，1991；Cooney等，1988)。另外，可以選擇靶位點(diǎn)以使靶也存在于mRNA序列(即轉(zhuǎn)錄的序列)中，使得針對(duì)該位點(diǎn)的寡核苷酸也作為反義介導(dǎo)物起作用(見上述)。
另外，硫代氨基磷酸酯修飾的DNA分子可以用于與第三條鏈靶(即單鏈核酸)產(chǎn)生三螺旋分子。例如，具有能與選定的第三條鏈靶分子形成三螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)區(qū)域的DNA分子可以被合成。典型地這兩個(gè)區(qū)域通過柔性區(qū)連接，該柔性區(qū)使得這兩個(gè)區(qū)域與第三條鏈結(jié)合形成三螺旋。
絞鏈區(qū)可包括任何柔性連鍵以保持兩個(gè)三螺旋形成區(qū)在一起并使得它們與第三條鏈結(jié)合形成三螺旋。第三條鏈靶選擇具有合適的嘌呤/嘧啶含量以使得三螺旋分子形成。
柔性連鍵可以根據(jù)靶的堿基序列以任何選定的方向連接兩個(gè)三螺旋形成區(qū)(典型地，互補(bǔ)DNA鏈)。例如，兩個(gè)三螺旋形成區(qū)每個(gè)均具有5′和3′末端，這些末端可通過柔性絞鏈區(qū)以下述方向連接5′-3′，3′-5′，3′-3′，5′-5′。
另外，在每條鏈含有至少一個(gè)硫代氨基磷酸酯連鍵的雙螺旋DNA分子可用作轉(zhuǎn)錄因子或DNA結(jié)合蛋白(例如，c-myb)的引誘分子。
單鏈DNA也可用作本發(fā)明的寡核苷酸的靶核酸，使用例如含硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩個(gè)硫代氨基磷酸酯類似物寡核苷酸可選擇用于單鏈DNA靶介導(dǎo)結(jié)合。兩個(gè)氨基磷酸酯類似物鏈與單鏈DNA靶的結(jié)合導(dǎo)致形成三螺旋。D.藥物組合物本發(fā)明包括用于反義和反基因治療的藥物組合物。該組合物包括有效量的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與藥物可接受載體的組合。一或多個(gè)N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(具有不同的堿基序列或連鍵)可包括在任何給定的配方中。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸當(dāng)用于治療應(yīng)用時(shí)，可以單獨(dú)配制或添加藥物載體而配制。藥物載體可以是固體或液體。隨后該配方以治療有效劑量給予需要其的個(gè)體。
液體載體可用于制備溶液、乳液、懸液和加壓組合物。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸溶解或懸浮于藥物可接受液體賦形劑中。用于腸道外給予N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸制劑的合適的液體載體的例子包括水(部分含有添加劑，例如纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，和油(例如分級(jí)分離的椰子油和花生油)。液體載體可以含有其它合適的藥物添加劑，包括但不限于下述加溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩沖劑、增稠劑、色素、粘度調(diào)節(jié)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和滲透壓調(diào)節(jié)劑。
為了N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的腸道外給藥，載體可以是油狀酯如油酸乙酯和豆蔻酸異丙酯。無菌載體可用于無菌液體形式腸道外給藥組合物。
無菌液體藥物組合物、溶液或懸液可通過例如腹膜內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)或局部而應(yīng)用。例如，抗視網(wǎng)膜巨細(xì)胞病毒感染的反義寡核苷酸可通過眼藥水局部給藥。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也可以血管內(nèi)給予或者例如，在氣囊導(dǎo)管插入術(shù)期間通過用霉酚酸浸漬的血管stent給藥以在損傷后立即提供局部抗再狹窄作用。
用于加壓組合物的液體載體可以是鹵代烴或其它藥物可接受推進(jìn)劑。這種加壓組合物也可以壓縮為液體以經(jīng)吸入輸送。對(duì)于鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)吸入或吹入給藥，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可被配制成水溶液或部分水溶液，然后可以氣霧劑形式使用，例如用于治療肺部感染如Pneumocystis carnii。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以作為與含有活性化合物的藥物可接受載體配制成的溶液、膏劑或洗劑而局部給藥。例如，用于治療生殖器疣。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以在脂質(zhì)體載體中給予。例如在美國(guó)專利4,897,355和美國(guó)專利4,394,448中描述了使用脂質(zhì)體促進(jìn)細(xì)胞吸收。許多出版物描述了脂質(zhì)體配方和制劑。
用N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸進(jìn)行治療的劑量要求根據(jù)所采用的特定組合物、給藥途徑、表現(xiàn)的癥狀的嚴(yán)重性、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的形式以及待治療的特定個(gè)體而變化。
為用作藥物制劑中的活性成分，本發(fā)明的寡核苷酸通常從制備其的混合物中存在的其它反應(yīng)性或潛在免疫原性成分中純化出來。典型地，每種活性成分以至少約90％均質(zhì)性、更優(yōu)選95％或99％均質(zhì)性提供，所述均質(zhì)性百分比通過功能分析、色譜或凝膠電泳測(cè)定。隨后活性成分根據(jù)制備藥物制劑通用程序復(fù)合成藥。
本發(fā)明的藥物組合物可以作為配方以有效實(shí)現(xiàn)任何臨床所需結(jié)果的量給予個(gè)體。對(duì)于治療癌癥，所需結(jié)果包括降低腫瘤質(zhì)量(如通過觸診或成象，例如通過放射照相、CAT掃描或MRI)，降低腫瘤生長(zhǎng)速率、降低轉(zhuǎn)移形成速率(例如通過生物活檢標(biāo)本的組織化學(xué)分析)，降低生化標(biāo)記(包括一般標(biāo)記如ESR和腫瘤特異標(biāo)記如血清PSA)，以及改善生活質(zhì)量(如通過臨床評(píng)價(jià)確定，例如Kamofsky評(píng)分)。對(duì)于治療病毒感染，所需結(jié)果包括降低或消除感染、感染性顆粒形成或疾病相關(guān)癥狀的解除。
實(shí)現(xiàn)這些效果所需的每劑寡核苷酸量和劑量數(shù)可用體外測(cè)試和動(dòng)物模型而實(shí)驗(yàn)確定(見實(shí)施例9)。用于測(cè)試的合適范圍可以從用分離的端粒酶或培養(yǎng)細(xì)胞確定的50％抑制濃度估算。分離的端粒酶的制備物可通過美國(guó)專利5,968,506獲得。典型地，對(duì)于與酶特異性靶RNA序列100％相同的12-15個(gè)核苷酸的穩(wěn)定寡核苷酸而言，配方和給藥途徑將在疾病部位提供1μM-lnM之間的局部濃度。確定給藥方案的最終責(zé)任取決于主管臨床醫(yī)生。
總之，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸以提供有效結(jié)果同時(shí)不導(dǎo)致任何有害副作用的濃度(例如有效量)給藥。這種濃度可通過給予單一單位劑量或給予分成方便的亞單位的劑量在每日合適間隔而施用。E.診斷應(yīng)用本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也可用于診斷分析中以檢測(cè)具有給定靶序列的RNA或DNA。在一種一般應(yīng)用中，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸被標(biāo)記(例如同位素或其它可檢測(cè)報(bào)道基團(tuán))并用作結(jié)合于固體支持物(例如尼龍膜)的DNA或RNA樣品的探針。
或者，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可與固體支持物(例如磁珠)結(jié)合，樣品中的同源RNA或DNA分子與樣品中的其它成分基于其與固定化氨基磷酸酯類似物的雜交而分離。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與固體支持物的結(jié)合可通過常規(guī)方法進(jìn)行。結(jié)合的RNA和DNA的存在可通過標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)，例如用第二種標(biāo)記的報(bào)道分子或聚合酶鏈反應(yīng)(見美國(guó)專利4,683,195和4,683,202)。
診斷分析可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，需調(diào)整雜交條件以使硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與靶區(qū)域雜交。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸在升高的溫度結(jié)合的能力也有助于使硫代氨基磷酸酯寡核苷酸探針和診斷樣品中存在的任何相應(yīng)單鏈磷酸二酯寡核苷酸對(duì)靶序列的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)最小化。
設(shè)計(jì)用于雜交分析和本文描述的其它方案中的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以包裝成試劑盒形式。所述寡核苷酸提供在容器中，其典型地在適合長(zhǎng)期貯存的緩沖液中存在，并任選地與用于進(jìn)行反應(yīng)的其它試劑、標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ找黄鹛峁?。典型地，試劑盒也可包括將寡核苷酸用于雜交反應(yīng)或診斷分析的說明書，其或者包裝在產(chǎn)品中，或者在配送或出售試劑盒時(shí)提供文字材料。F.其它應(yīng)用在一個(gè)方面，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用于促進(jìn)從樣品中分離RNA或DNA的方法中。例如，如上所述，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可固定于固體支持物上并用于分離互補(bǔ)核酸序列，例如，從聚A級(jí)分純化特異mRNA(Goldberg等，酶學(xué)方法68206，1979)。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸在這類應(yīng)用中是有利的，因?yàn)樗鼈兛膳cRNA和雙螺旋DNA形成比標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯寡核苷酸所形成的更穩(wěn)定的相互作用。
報(bào)道分子標(biāo)記的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可在分子生物學(xué)中有大量應(yīng)用，特別是用于檢測(cè)樣品中的RNA。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用放射性報(bào)道分子(3H，14C，32P或35S核苷)、生物素或熒光標(biāo)記而標(biāo)記(Gryaznov等，核酸研究203403-3409，1992)。標(biāo)記的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用作例如RNA雜交反應(yīng)的有效探針(Ausubel等，分子生物學(xué)當(dāng)前方案，John Wiley and Sons，Inc.，Media，PA；Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第2卷，1989)。
另外，每一鏈含有至少一個(gè)硫代氨基磷酸酯連鍵的雙鏈DNA分子可用于分離DNA-雙螺旋結(jié)合蛋白。在這一實(shí)施方案中，含有硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的雙螺旋典型地固定于固體支持物上，隨后將含有懷疑的結(jié)合蛋白的樣品在促進(jìn)蛋白質(zhì)與其DNA靶結(jié)合的緩沖條件下通過該支持物。蛋白質(zhì)典型地通過改變緩沖條件從柱中洗脫。
上述含有硫代氨基磷酸酯修飾的連鍵的三螺旋形成DNA分子還可用作診斷試劑，以例如檢測(cè)樣品中DNA分子的存在。
另外，含有具有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的寡核苷酸的復(fù)合物可用于篩選有用的小分子或結(jié)合蛋白例如，具有雙螺旋DNA的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸復(fù)合物可用于篩選能進(jìn)一步穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的小分子。用與單鏈DNA和RNA分子形成的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸復(fù)合物可進(jìn)行類似篩選。G.改變本發(fā)明方法所用硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的改變包括修飾以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)寡核苷酸的吸收(例如，添加膽固醇基元(Letsinger，美國(guó)專利4,958,013))；用亞單位間連鍵產(chǎn)生嵌合寡核苷酸(Goodchild，生物綴合物化學(xué)1165-187，1990)；用嵌入劑修飾(例如，穩(wěn)定三螺旋的嵌入劑，Wilson等，生物化學(xué)3210614-10621，1993)；和使用核糖亞單位代替脫氧核糖亞單位。
進(jìn)一步的修飾包括寡核苷酸5′和3′末端修飾(例如，--OH，--OR，--NHR，--NH2和膽固醇)。另外，核糖2′位置可以是許多修飾的位點(diǎn)，包括但不限于鹵代(例如，--F)。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸還可以通過與被特異細(xì)胞吸收的一多肽綴合而修飾。這種有用的多肽包括肽激素、抗原和抗體，例如多肽可以選自被癌細(xì)胞特異吸收的多肽，導(dǎo)致N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸被特異輸送至該類型細(xì)胞。所述多肽和寡核苷酸可通過本領(lǐng)域已知方式偶聯(lián)(參見例如PCT國(guó)際申請(qǐng)出版物PCT/US89/02363，WO8912110，1989年12月14日公開，Ramachandr，K.等人)。
當(dāng)用于本發(fā)明方法時(shí)，這種修飾的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的性質(zhì)可通過本文所述方法確定。
實(shí)施例1 一般方法31P NMR譜在Varian 400Mhz分光計(jì)上獲得。將31P NMR譜與85％磷酸水溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。用Dionex DX 500色譜系統(tǒng)使用PharmaciaBiotech Mono Q HR 5/5或10/16離子交換柱進(jìn)行陰離子交換HPLC。質(zhì)譜分析由Mass Consortium，San Diego，CA進(jìn)行。寡核苷酸的MALDI-TOF分析用具有延遲提取的PerSpective Biosystems VoyagerElite質(zhì)譜儀獲得。熱解離實(shí)驗(yàn)在Cary Bio 100 UV-Vis分光計(jì)上進(jìn)行。
除非另有說明，所有反應(yīng)均在微波爐干燥的玻璃器皿中于氮?dú)夥障逻M(jìn)行。市售DNA合成試劑購(gòu)自Glen Research(Sterling，VA)。無水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二異丙基乙胺、三乙胺、乙酐、1，2-二氯乙烷和二惡烷購(gòu)自Aldrich(Milwaukee，WI)。
所有非硫代氨基磷酸酯寡核苷酸用基于亞磷酰胺的偶聯(lián)途徑標(biāo)準(zhǔn)方案(Caruthers，Acc.Chem.Res.，24278-284，1991)在ABI 392或394 DNA合成儀合成。寡核苷酸氨基磷酸酯合成的鏈組裝循環(huán)如下(i)脫三苯甲基化，3％三氯乙酸于二氯甲烷中，1分鐘；(ii)偶聯(lián)，0.1M亞磷酰胺和0.45M四唑于乙腈中，10分鐘；(iii)加帽，0.5M異丁酐于THF/二甲基吡啶中，1/1，v/v，15秒；和(iv)氧化，0.1M碘于THF/吡啶/水中，10/10/1，v/v/v，30秒。
該循環(huán)的化學(xué)步驟之后進(jìn)行乙腈洗滌，并用干態(tài)氬沖洗0.2-0.4分鐘。從支持物上裂解、除去堿及氨基磷酸酯保護(hù)基團(tuán)通過用氨水/EtOH，3/1，v/v，在55℃處理6個(gè)小時(shí)而實(shí)現(xiàn)。將寡核苷酸真空干燥濃縮，之后通過用1M TBAF于THF中在25℃處理4-16小時(shí)而除去2′-叔丁基二甲基甲硅烷基團(tuán)。用水稀釋反應(yīng)混合物，并通過0.45尼龍acrodisc(購(gòu)自Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)過濾。然后經(jīng)IE HPLC分析和純化寡核苷酸，并在Pharmacia NAP-5或NAP-25柱上用凝膠過濾最終脫鹽。IE HPLC的梯度條件為溶劑A(10mM NaOH)，溶劑B(10mM NaOH和1.5M NaCl)；溶劑A 3分鐘，然后線性梯度0-80％溶劑B 50分鐘。實(shí)施例2 阿拉伯糖-氟寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成寡聚-2′-阿拉伯糖-氟核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的固相合成基于亞磷酰胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)，采用單體構(gòu)件3′-MMT-保護(hù)的-3′-氨基-2′-阿拉伯糖-氟核苷酸的5′-(O-氰乙基-N，N′-二異丙基氨基)-亞磷酰胺。所述核苷單體的制備見方案4。 糖前體1(來自Pfanstiehl)轉(zhuǎn)化成保留糖C-1構(gòu)象的α-1-溴中間體2?；衔?隨后不經(jīng)分離而使用，與甲硅烷化尿嘧啶和胸腺嘧啶堿基一起進(jìn)行SN2型糖基化反應(yīng)，產(chǎn)生核苷3。糖基化反應(yīng)的立體選擇性非常高，超過90％形成的核苷3具有希望的β-端基異構(gòu)構(gòu)象，這是由反應(yīng)混合物的1H NMR分析判斷的。核苷3的純?chǔ)?異構(gòu)體通過從乙醇結(jié)晶而分離。隨后，3的5′-和3′-O-苯甲酰保護(hù)基團(tuán)通過用甲醇化氨水處理而以近定量產(chǎn)量除去。得到的含有5′-，3′-羥基基團(tuán)的核苷產(chǎn)物隨后在Mitsunobu反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)化成2，3′-無水核苷4。用疊氮化鋰處理2，3′-無水核苷得到關(guān)鍵的3′-疊氮基前體5。這一化合物通過將3′-疊氮基氫化還原成3′-氨基，隨后經(jīng)3′-三苯甲基化，5′-O-脫保護(hù)和5′-O-亞磷?；D(zhuǎn)化成亞磷酰胺7t，u。胞苷亞磷酰胺7c用尿嘧啶至胞嘧啶轉(zhuǎn)化方法得自所述3′-疊氮基前體?；谄鹗继乔绑w1，亞磷酰胺7c，t，u的總產(chǎn)量在8-12％范圍內(nèi)。單體的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H，31P，19F NMR和質(zhì)譜分析證實(shí)。使用2′-阿拉伯糖-氟核苷酸單體的寡核苷酸合成隨后如下所述在自動(dòng)化DNA/RNA ABI 394合成儀上進(jìn)行。實(shí)施例3 寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的合成在ABI 394合成儀上經(jīng)亞酰胺(amidite)轉(zhuǎn)移反應(yīng)制備寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。完全保護(hù)的單體構(gòu)件是3′-氨基三苯甲基核苷-5′-(2-氰乙基-N，N′-二異丙基)亞磷酰胺，其中核苷是3′-脫氧胸苷，2′，3′-二脫氧-N2-isobutyryl鳥苷，2′，3′-二脫氧-N6-苯甲酰腺苷或2′，3′-二脫氧-N4-苯甲酰胞苷。5′-琥珀酰基-3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脫氧核苷與含有氨基的長(zhǎng)鏈可控孔徑玻璃(LCAA-CPG)偶聯(lián)并用作固體支持物。合成以5′至3′方向進(jìn)行。使用下述方案組裝寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯(i)去三苯甲基化，3％三氯乙酸于二氯甲烷中；(ii)偶聯(lián)，0.1M亞磷酰胺和0.45M四唑于乙腈中，25秒；(iii)加帽，異丁酐/2，6-/二甲基吡啶/THF 1/1/8 v/v/v作為帽A，和標(biāo)準(zhǔn)帽B溶液；和(iv)硫化，15％ S8于含有1％三乙胺的二硫化碳中，1分鐘。在硫化步驟之前和之后，用純二硫化碳洗柱以防止元素硫沉淀。寡核苷酸硫代氨基磷酸酯用濃氨水從固體支持物上裂解并脫保護(hù)。經(jīng)HPLC分析和純化化合物。用pH12(10mM NaOH)的DIONEXDANPacTM離子交換柱使用10mM NaOH于1.5M NaCl中1％/分鐘線性梯度和1ml/min流速進(jìn)行離子交換(IE)HPLC。產(chǎn)物在SephadexNAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)上脫鹽并真空凍干。31P NMR實(shí)驗(yàn)在氧化氘中進(jìn)行以分析硫化分析程度(31P NMRδ，ppm 58，60寬信號(hào)Rp，Sp異構(gòu)體)。
寡核苷酸硫代氨基磷酸酯5′-GTTAGGGTTAG-3′(SEQ IDNO1)以下述方式合成用3′-三苯甲基氨基-2′，3′-二脫氧-N6-苯甲酰腺苷(N2-isobutyryl鳥苷和胸苷)5′-(2-氰乙基-N，N-二異丙基)亞磷酰胺的0.1M溶液起始ABI 394型合成儀。用純二硫化碳填充10號(hào)工作站的試劑瓶，并用在含1％三乙胺的二硫化碳中的15％S8溶液填充15號(hào)試劑瓶。用市售的在乙腈中的0.45M四唑溶液作為活化劑。帽A溶液(11號(hào)工作站)用四氫呋喃/異丁酐/2，6-二甲基吡啶8/1/1 v/v/v溶液替換，帽B也是市售試劑。創(chuàng)建一新功能以將二硫化碳從10號(hào)工作站輸送至柱中。默認(rèn)的硫合成循環(huán)以下述方式修改硫化時(shí)間設(shè)為1分鐘，在硫化之前和之后將二硫化碳送至柱20秒。合成柱用1μmole固體支持物N2-isobutyryl-3′-(三苯甲基)氨基-2′，3′-二脫氧鳥苷-5′-琥珀酰加載的CPG(可控孔徑玻璃)填充。化合物的序列計(jì)劃為GATTGGGATTG(5′→3′)(SEQ ID NO11)。在合成結(jié)束時(shí)除去三苯甲基基團(tuán)并用二硫化碳和乙腈手工洗柱。從柱中取出固體支持物并在一密封玻璃瓶中用1ml濃氨水在55℃處理6小時(shí)。過濾后，蒸發(fā)掉大部分氨水，并用Sephadex NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)脫鹽并真空凍干。如上所述分析和純化產(chǎn)物。表2中列出的所有其它硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(SEQ ID NO2-4)用上述方法合成。實(shí)施例4 寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的酸穩(wěn)定性和雙螺旋形成性質(zhì)寡核苷酸硫代氨基磷酸酯令人意外地證實(shí)相對(duì)于氨基磷酸酯相應(yīng)物具有增加的酸穩(wěn)定性。人們可能預(yù)期用硫取代核苷酸間連鎖基團(tuán)的非橋氧應(yīng)導(dǎo)致氨基磷酸酯的酸穩(wěn)定性下降，因?yàn)榱驅(qū)ρ醯碾娮咏o體性質(zhì)的差異應(yīng)使得3′-NH的質(zhì)子化更容易。但是，與這一預(yù)期相反，發(fā)現(xiàn)硫代氨基磷酸酯核苷酸間連鍵比其氧-氨基磷酸酯對(duì)應(yīng)物更加對(duì)酸穩(wěn)定。
根據(jù)IE HPLC分析(見表1)，硫代氨基磷酸酯TAG3T2AGACA2(SEQ ID NO2)及其氨基磷酸酯對(duì)應(yīng)物在40％乙酸水溶液中于室溫的半壽期分別約為6小時(shí)和0.5小時(shí)。另外，硫代氨基磷酸酯和其氨基磷酸酯對(duì)應(yīng)物之間水解產(chǎn)物的組成是不同的。硫代氨基磷酸酯的酸水解似乎最初導(dǎo)致脫硫化，而非在氨基磷酸酯中發(fā)生的核苷間N-P基團(tuán)的裂解。這些結(jié)果表明硫代氨基磷酸酯對(duì)酸性條件的抗性比氨基磷酸酯寡核苷酸高許多，因此說明這一類新硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與其它氨基磷酸酯寡核苷酸相比具有開發(fā)口服寡核苷酸治療劑的增加的潛力。
表1實(shí)驗(yàn) 寡聚物 類型2Tm，℃b-Tm，℃c酸穩(wěn)定性d1 GTTAGGGTTAGpo 44.2-SEQ ID NO12 TAGGGTTAGACAA po 45.2-SEQ ID NO23 同實(shí)驗(yàn)1np 72.1 27.94 同實(shí)驗(yàn)2np 71.7 26.5 0.5hr5 同實(shí)驗(yàn)1nps71.5 27.36 同實(shí)驗(yàn)2nps70.0 24.8 6hrapo，np，nps分別相應(yīng)于磷酸二酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯基團(tuán)；b在150mM NaCl，10mM磷酸鈉緩沖液pH7.4中與互補(bǔ)天然RNA寡聚物形成的雙螺旋的熔解溫度Tm(±0.5℃)；c相對(duì)于天然磷酸二酯對(duì)應(yīng)物的Tm的增加；d寡核苷酸在40％乙酸水溶液中于室溫的半壽期。
寡核苷酸氨基磷酸酯與互補(bǔ)RNA鏈形成雙螺旋的性質(zhì)用熱解離實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)示出寡核苷酸硫代氨基磷酸酯形成比等序列天然磷酸二酯寡聚物明顯更穩(wěn)定的復(fù)合物，其中每個(gè)寡聚物Tm差異在約25-27℃。另外，雙螺旋熱穩(wěn)定性的增加與在氨基磷酸酯寡聚物中觀察到的類似。這表明用硫原子取代在核苷間氨基磷酸酯基團(tuán)中的非橋氧不會(huì)明顯改變這些化合物的RNA結(jié)合性質(zhì)，這是用3′-氨基核苷的N-型糖折疊及糖-磷酸骨架水合增加而確定的。實(shí)施例5 具有端粒酶活性的親和純化的提取物的制備用于篩選端粒酶抑制劑的提取物從過表達(dá)端粒酶蛋白催化亞基(hTERT)的293細(xì)胞常規(guī)制備。發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有比親代293細(xì)胞多2-5倍的端粒酶活性。將200ml收集細(xì)胞(從100升培養(yǎng)物收獲)懸浮在等體積低滲緩沖液(10mM Hepes pH7.9，1mM MgCl2，1mMDTT，20mM KCl，1mM PMSF)中并用dounce勻漿器裂解。將甘油濃度調(diào)整至10％并緩慢加入NaCl使終濃度為0.3M。攪拌裂解的細(xì)胞30分鐘，然后在100000xg沉淀1小時(shí)。向S100上清中加入固體硫酸銨直至42％飽和度。離心該物質(zhì)；將沉淀重懸于1/5原始體積中并對(duì)含有50mM NaCl的緩沖液A透析。透析后，在25000xg離心提取物30分鐘。在親和層析之前，加入Triton X-100TM(0.5％)，KCl(0.3M)和tRNA(50μg/ml)。向提取物中加入親和寡聚物(5′生物素TEG-生物素TEG-生物素TEG-GTA GAC CTG TTA CCA guuagg guu ag 3′[SEQ ID NO5]；小寫字母表示2′O-甲基核糖核苷酸，大寫字母表示脫氧核苷酸)(每10ml提取物加入1nmol)。在30℃保溫10分鐘后，加入Neutravidin珠(Pierce；250μl 50％懸液)并將混合物在4℃旋轉(zhuǎn)過夜。沉淀珠并用含0.3M KCl的緩沖液B洗3次，用含有0.6M KCl的緩沖液B洗2次，用含有0.3M KCl的緩沖液B再洗2次。在含有0.3M KCl，0.15％ Triton X-100TM和2.5摩爾過量的置換寡聚物(每125μl收集的Neutravidin珠用0.5ml 5′-CTAACC CTA ACT GGT AAC AGG TCT AC-3′[SEQ ID NO6])的緩沖液B中在室溫洗脫端粒酶30分鐘。進(jìn)行第二次洗脫并與第一次合并。純化的提取物典型的比活為10fmol摻入的核苷酸/min/μl提取物，或200個(gè)核苷酸min/mg總蛋白。
實(shí)施例6 寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯對(duì)端粒酶的抑制用下述緩沖溶液建立3個(gè)獨(dú)立的100μl端粒酶分析50mM Tris乙酸，pH8.2，1mM DTT，1mM EGTA，1mM MgCl2，100mM乙酸鉀，500μM dATP，500μM TTP，10μM[32P]dGTP(25Ci/mmol)和100nMd(TTAGGG)3[SEQ ID NO7]。向各個(gè)反應(yīng)中加入2.5、5或10微升親和純化的端粒酶(見實(shí)施例4)并將反應(yīng)在37℃保溫。在45和90分鐘，從每個(gè)反應(yīng)中取40微升樣品并加入160微升終止緩沖液(100mM NaCl，10mM焦磷酸鈉，0.2％SDS，2mM EDTA，100μg/mltRNA)。加入10微升三氯乙酸(TCA)(100％)，并將樣品在冰上保溫30分鐘。樣品在微離心機(jī)中沉淀(12000xg離心力)15分鐘，沉淀用1ml 95％乙醇洗并在微離心機(jī)(12000xg離心力)中再次沉淀5分鐘。將沉淀重懸于50微升蒸餾水中并轉(zhuǎn)移至含有2.5ml 5％TCA和10mM焦磷酸鈉的冰冷溶液的12×75玻璃試管中。將樣品在冰上保溫30分鐘。將樣品在真空過濾歧管上經(jīng)2.5cm濕(蒸餾水)GFC膜(S&S)過濾。在真空下用5ml冰冷1％TCA洗濾膜3次并用5ml 95％乙醇洗1次。干燥濾膜并用閃爍液在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。摻入的fmol核苷酸是用放射性追蹤劑的比活確定的。基于摻入的dNTP計(jì)算提取物的活性并表示為fmol dNTP/min/μl提取物。
端粒酶活性分析Bio-Tel FlashPlate分析提供了一種檢測(cè)和/或測(cè)量端粒酶活性的分析法，其是通過測(cè)定由端粒酶催化的反應(yīng)即TTAGGG端粒重復(fù)添加至生物素化端粒酶底物引物上而進(jìn)行。生物素化產(chǎn)物在鏈親和素包被微滴板中捕獲。用33P標(biāo)記的互補(bǔ)于3.5個(gè)端粒重復(fù)的寡核苷酸探針被用于測(cè)量端粒酶產(chǎn)物，如下所述。通過洗滌除去未結(jié)合的探針并用閃爍計(jì)數(shù)確定與捕獲的端粒酶產(chǎn)物退火的量。方法I.硫代氨基磷酸酯寡核苷酸作為濃縮原料貯存并在PBS中溶解。II.為進(jìn)行測(cè)試，在PBS中將硫代氨基磷酸酯寡核苷酸稀釋成15X工作原液，并將2微升分配于96孔微滴皿的兩個(gè)孔中(雙份分析)。III.在端粒酶稀釋緩沖液中將端粒酶提取物稀釋至比活為0.04-0.09fmol摻入的dNTP/min/μl，將18微升加至每一樣品孔中以與化合物在室溫預(yù)保溫30分鐘。IV.通過向含有端粒酶提取物和待測(cè)寡核苷酸化合物的孔中加入10微升Master Mix而起始端粒酶反應(yīng)，將板密封并在37℃保溫90分鐘。V.通過加入10微升HCS終止反應(yīng)。VI.將25微升反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至96孔鏈親和素包被的FlashPlateTM(NEN)中，并溫和振蕩于室溫保溫2小時(shí)。VII.用180微升2×SSC不經(jīng)保溫洗孔3次。VIII.在閃爍計(jì)數(shù)器中檢測(cè)與生物素化端粒酶產(chǎn)物退火的探針量。緩沖液端粒酶稀釋緩沖液50mM Tris-乙酸，pH8.21mM DTT1mM EGTA1mM MgCl2
830nM BSAMaster Mix(MM)50mM Tris-乙酸，pH8.21mM DTT1mM EGTA1mM MgCl2150mM乙酸鉀10μM dATP20μM dGTP120μM dTTP100nM生物素化引物(5′-生物素-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)[SEQ ID NO8]5.4nM標(biāo)記的探針[5′-CCCTAACCCTAACCCTAACC-(33P)A1-50-3′][SEQ ID NO9]；比活約為109cpm/μg或更高雜交捕獲溶液(HCS)12×SSC(1×＝150mM NaCl/30mM檸檬酸三鈉)40mM EDTA40mM Tris-HCl，pH7.0用上述分析，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2代表的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸示出具有低于1.0nM的端粒酶IC50值(見表2，實(shí)驗(yàn)1和3)。
表2寡聚物作為端粒酶抑制劑與氨基磷酸酯的比較評(píng)價(jià)
寡核苷酸序列2(SEQ ID NO3)是實(shí)驗(yàn)1所用寡核苷酸(SEQ IDNO1)的錯(cuò)配對(duì)照。類似地，寡核苷酸序列4(SEQ ID NO4)是實(shí)驗(yàn)3所用寡核苷酸(SEQ ID NO2)的錯(cuò)配對(duì)照。
表2中的端粒酶抑制數(shù)據(jù)示出本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸相對(duì)于對(duì)應(yīng)的氨基磷酸酯寡核苷酸其抑制端粒酶活性高約2-3倍。因此，本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸不僅在端粒酶抑制分析中比其氨基磷酸酯對(duì)應(yīng)物更有活性，而且比其具有更高的抗酸性。這些特征的組合使本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸比氨基磷酸酯多核苷酸具有重要的優(yōu)越性。實(shí)施例7 硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的抗腫瘤活性來自體內(nèi)(exvivo)研究a.在腫瘤細(xì)胞中降低端粒長(zhǎng)度用標(biāo)準(zhǔn)方法和材料制備人乳腺上皮細(xì)胞的集落(自發(fā)永生化)。通過以每皿約106個(gè)細(xì)胞接種15厘米培養(yǎng)皿而制備集落，將培養(yǎng)皿保溫以使細(xì)胞集落生長(zhǎng)至約80％鋪滿，此時(shí)將每個(gè)集落分成2組。在分組后鋪板，之后一組與亞急性劑量的預(yù)定濃度(例如約100nM-20μM之間)的硫代氨基磷酸酯多核苷酸SEQ ID NO2接觸，第二組類似地與錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸SEQ ID NO4接觸。
使每組細(xì)胞繼續(xù)分裂，各組再次平均分割(接近鋪滿)。接種相同數(shù)目的細(xì)胞以繼續(xù)生長(zhǎng)。每四天將測(cè)試硫代氨基磷酸酯寡核苷酸或?qū)φ展押塑账嵋宰畛踺斔偷南嗤瑵舛燃又翗悠?。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞另外根據(jù)廠商指導(dǎo)用FuGENE6TM(Boehringer-Mannheim)處理。FuGENE6TM促進(jìn)細(xì)胞對(duì)寡核苷酸的吸收。
通過用特異于非人端粒重復(fù)T2AG3序列的序列的限制酶消化細(xì)胞樣品的DNA而確定端粒長(zhǎng)度(TRF分析)用凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)經(jīng)大小分離消化的DNA以確定端粒重復(fù)的長(zhǎng)度，其在用端粒DNA探針探查后在凝膠上呈高分子量DNA(約2Kb-15Kb)擴(kuò)散條帶。圖4和圖5示出這種實(shí)驗(yàn)的樣品。
圖4的結(jié)果示出硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2是端粒酶活性的強(qiáng)體外抑制劑。在不存在FuGENE6TM時(shí)，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2在1-20μM范圍與HME50-5E細(xì)胞保溫時(shí)誘導(dǎo)端粒長(zhǎng)度大大降低。當(dāng)細(xì)胞與FuGENE6和硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2共保溫時(shí)，甚至在最低的測(cè)試濃度(100nM)端粒大小與對(duì)照細(xì)胞相比也降低。
圖5結(jié)果示出具有序列CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO10)的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸是端粒酶活性的強(qiáng)體外抑制劑。當(dāng)細(xì)胞與硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO10共保溫時(shí)，甚至在最低的測(cè)試濃度(1nM)端粒大小與對(duì)照細(xì)胞相比也降低。因此，本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸是永生化人乳腺上皮細(xì)胞中端粒酶活性的強(qiáng)體外抑制劑。
在另一實(shí)驗(yàn)中，HME50-5E細(xì)胞與SEQ ID NO2和10的硫代氨基磷酸酯多核苷酸之一保溫。錯(cuò)配寡核苷酸SEQ ID NO4用作對(duì)照。所有多核苷酸采用上述方案以約0.1μM-20μM濃度使用。圖6所示對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的數(shù)據(jù)表明在給予所測(cè)試的本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸后約100天，細(xì)胞進(jìn)入衰老(即細(xì)胞功能停止)。
另外，用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)進(jìn)行的細(xì)胞的TRF分析(圖7)示出所測(cè)試的本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可有效降低端粒長(zhǎng)度。HME50-5E細(xì)胞與SEQ ID NO2和10的硫代氨基磷酸酯多核苷酸之一保溫。錯(cuò)配寡核苷酸SEQ ID NO4用作對(duì)照。所有多核苷酸采用上述方案以約0.5μM濃度使用。在10、20、40和80天測(cè)量端粒長(zhǎng)度。使用對(duì)照錯(cuò)配寡核苷酸的細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度在第90天測(cè)量，這一數(shù)據(jù)點(diǎn)作為終點(diǎn)。除了上述HME50-5E細(xì)胞外，這一分析可使用任何端粒酶陽性細(xì)胞系如HeLa細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞進(jìn)行。
b.特異性通過用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行雜交試驗(yàn)或酶抑制分析篩選本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸抗端粒酶和其它具有RNA成分的酶的活性(IC50)。針對(duì)端粒酶的IC50值低于針對(duì)所篩選的其它酶的IC50值的寡核苷酸被認(rèn)為具有端粒酶特異性。
c.胞毒性用HME50-5E、Caki-1、A431、ACHN和A549細(xì)胞類型進(jìn)行胞毒性細(xì)胞死亡(XTT)分析。分析中所用的細(xì)胞系在存在和不存在脂類的條件下與約1μM-100μM濃度的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2接觸72小時(shí)。在這一期間，在540nm測(cè)定樣品的光密度(OD)。針對(duì)各種細(xì)胞類型(如圖8所示)的IC50值通常低于1μM。因此，預(yù)計(jì)在低于約100μM濃度不能觀察到明顯胞毒性作用。應(yīng)理解的是，除了對(duì)照細(xì)胞系如正常人BJ細(xì)胞外，其它腫瘤細(xì)胞系如卵巢腫瘤細(xì)胞系OVCAR-5和SK-OV-3也可用于確定胞毒性。胞毒性的其它分析法如MTT分析(參見Berridge等，生物化學(xué)414-19，1996)和alamarBlueTM(美國(guó)專利5,501,959)也可使用。
優(yōu)選地，為觀察任何端粒酶抑制作用，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸應(yīng)以低于胞毒性的濃度投藥。但是，由于許多癌癥化療藥的有效性衍生自其胞毒性作用，因此，本發(fā)明的范圍包括本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸以觀察到化療作用的任何劑量投藥。體內(nèi)動(dòng)物研究用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和材料構(gòu)建人腫瘤異種移植物模型，該模型中OVCAR-5腫瘤細(xì)胞被移植到裸鼠中。將小鼠分成兩組，一組用本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸經(jīng)腹膜內(nèi)途徑處理，另一組用對(duì)照處理，該對(duì)照包括磷酸緩沖溶液(PBS)和與端粒酶RNA互補(bǔ)但與端粒酶RNA的序列有至少一個(gè)堿基錯(cuò)配的寡核苷酸的混合物。異種移植后用標(biāo)準(zhǔn)方法和材料定期測(cè)定每組小鼠平均腫瘤質(zhì)量。
在用本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸處理的組中，預(yù)計(jì)在初次處理后平均腫瘤質(zhì)量增加一段時(shí)間，之后預(yù)計(jì)腫瘤質(zhì)量保持穩(wěn)定，隨后開始降低。對(duì)照組腫瘤質(zhì)量預(yù)計(jì)在整個(gè)研究期間增加。因此，本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸預(yù)計(jì)顯著減慢腫瘤生長(zhǎng)速率，并最終誘導(dǎo)腫瘤大小的降低和腫瘤的消除。
因此，本發(fā)明提供了用于抑制端粒酶活性和治療其中端粒酶活性有有害作用的疾病狀態(tài)特別是癌癥的新的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸和方法。本發(fā)明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸提供了對(duì)需要端粒酶活性以保持永生化的惡性細(xì)胞的高度選擇性和有效的治療法，同時(shí)不影響非惡性細(xì)胞。
盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)理解的是可做出各種改變而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，其包含由至少一個(gè)是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亞單位間連鍵連接的核苷亞單位的非均聚序列。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵由下式定義3′-[-NH-P(＝O)(-SR)-O-]-5′其中R選自氫、烷基、芳基和其鹽。
3.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所有亞單位間連鍵均為N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，其中核苷亞單位的確定序列長(zhǎng)度為3-50。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸，包括選自磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代磷酸酯的第二種連鍵。
6.權(quán)利要求5的多核苷酸，其長(zhǎng)度為3-50個(gè)核苷亞單位。
7.一種多核苷酸，包括含有至少一個(gè)由下式定義的亞單位的核苷亞單位序列 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物；Z是OR，SR或甲基，其中R選自氫、烷基、芳基和其鹽；和R1選自氫、O-R2，S-R2和鹵素，而R2是H、烷基或(CH2)nW(CH2)mH，n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S或NH，條件是當(dāng)Z是甲基或OMe時(shí)，R1不是H。
8.權(quán)利要求7的多核苷酸，其中所有亞單位均由下式定義
9.權(quán)利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸進(jìn)一步包括至少一個(gè)選自磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代磷酸酯亞單位的亞單位。
10.權(quán)利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸中的每個(gè)B部分獨(dú)立地選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶和肌苷。
11.權(quán)利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸與靶核酸序列雜交。
12.權(quán)利要求11的多核苷酸，其中該靶核酸序列是端粒酶RNA成分的序列。
13.權(quán)利要求10的多核苷酸，其中該多核苷酸可與一RNA靶雜交。
14.權(quán)利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸包括一報(bào)道部分。
15.權(quán)利要求14的多核苷酸，其中該報(bào)道部分選自放射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記和熒光標(biāo)記。
16.一種合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的方法，該方法包括(a)提供附著于固相支持物的第一種5′-琥珀酰-3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脫氧核苷，該第一種核苷有一保護(hù)3′氨基基團(tuán)；(b)脫保護(hù)3′氨基基團(tuán)以形成游離3′氨基基團(tuán)；(c)將該游離3′氨基基團(tuán)與3′-保護(hù)氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二異丙基氨基亞磷酰胺單體反應(yīng)，形成核苷間N3′→P5′亞磷酰胺連鍵；和(d)硫化所述核苷間亞磷酰胺基團(tuán)形成N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。
17.權(quán)利要求16的方法，其中反應(yīng)和硫化步驟重復(fù)進(jìn)行。
18.將多核苷酸與DNA或RNA靶雜交的方法，包括將權(quán)利要求1的多核苷酸與靶在使得該多核苷酸與靶形成雜交復(fù)合物的條件下接觸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中該多核苷酸攜帶報(bào)道部分。
20.權(quán)利要求19的方法，其中報(bào)道部分選自放射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記和熒光標(biāo)記。
21.確定樣品中含有特異序列的核酸的方法，包括a)制備一反應(yīng)混合物，該混合物包括所述樣品和能特異與所述序列雜交的權(quán)利要求1的多核苷酸；b)確定反應(yīng)混合物中形成的雜交體；和c)將所形成的任何雜交體與樣品中含有該特異序列的核酸相關(guān)。
22.從樣品中分離含有特異序列的核酸的方法，包括a)將樣品與能特異與所述序列雜交的權(quán)利要求1的多核苷酸組合；b)從與所述多核苷酸形成的雜交體中回收所述核酸。
23.抑制細(xì)胞中RNA的功能的方法，包括將該細(xì)胞與能特異于所述RNA雜交的權(quán)利要求1的多核苷酸接觸。
24.權(quán)利要求23的方法，其是用于抑制mRNA的翻譯的方法，其中所述多核苷酸包括一序列，該序列含有至少10個(gè)與mRNA中所含的序列互補(bǔ)的堿基。
25.權(quán)利要求23的方法，其是用于抑制細(xì)胞中端粒酶的方法，其中所述多核苷酸包括一與端粒酶RNA成分互補(bǔ)的序列。
26.抑制細(xì)胞中端粒酶活性的方法，包括將該細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1的多核苷酸接觸。
27.確定或分離樣品中含有特異序列的核酸的試劑盒，包括能與該特異序列雜交的權(quán)利要求1的多核苷酸，以及使用該多核苷酸確定或分離所述核酸的書面指示。
28.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多核苷酸在制備用于治療人或動(dòng)物體的藥物中的應(yīng)用。
29.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多核苷酸在制備用于治療病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
30.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的多核苷酸在制備用于治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
31.權(quán)利要求28-30任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中該多核苷酸可與端粒酶RNA成分雜交。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有新的含至少一個(gè)核苷間3′－NHP(O)(S
文檔編號(hào)C07H21/04GK1373768SQ00812729
公開日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月10日
發(fā)明者謝爾蓋·格里亞茲諾夫, 克里斯廷納·蓬格拉茨, 特蕾西·馬特雷 申請(qǐng)人:杰龍公司