專(zhuān)利名稱(chēng)：新型速激肽、其前體肽及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有脊椎動(dòng)物腸道收縮活性的新型速激肽及其前體肽，具體地說(shuō)，涉及得自真蛸(章魚(yú)，Octopus vulgaris)的后部唾液腺、具有脊椎動(dòng)物腸道收縮活性的新型速激肽、其前體肽及其編碼基因。
此后，從青蛙皮膚中分離出具有同樣作用的肽，將其命名為泡蛙肽(Erspamer，V.等，Experientia，20，489，1964)。
由于這些肽具有使豚鼠回腸迅速收縮的作用，故與緩激肽(brady(緩慢地)kinin(動(dòng)作的物質(zhì)))相對(duì)，將這些肽命名為速激肽(tachy(＝快速)kinin，使快速收縮的物質(zhì))。此外，根據(jù)這些肽的結(jié)構(gòu)，P物質(zhì)的結(jié)構(gòu)也清楚了。
被分類(lèi)為速激肽的肽隨后相繼從兩棲類(lèi)(Yasuhara，T.等，Biomed.Res.，2，613，1981)和鳥(niǎo)類(lèi)(Conlon，J.M.等，Regulatory Peptides，20，171，1988)等的脊椎動(dòng)物中分離出來(lái)，但從無(wú)脊椎動(dòng)物中分離出來(lái)的除章魚(yú)唾腺精以外，僅從傳播黃熱病的蚊子中發(fā)現(xiàn)唾液激肽(sialokinin)(Champagne，D.E.&Ribeiro，J.M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，138，1994)。
目前，速激肽是對(duì)在肽的C末端具有下式所示通常的氨基酸序列-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH2(式中，Yaa是芳族氨基酸(Phe、Tyr)、支鏈氨基酸(Val、Ile))、表現(xiàn)出腸道收縮作用、降壓作用、促進(jìn)唾液分泌作用等的生理活性肽的總稱(chēng)。在這樣的速激肽中除了上述的P物質(zhì)、章魚(yú)唾腺精、泡蛙肽外，還包括神經(jīng)激肽A、神經(jīng)激肽B、肛褶蛙肽等(生物學(xué)辭典(第4版)，巖波書(shū)店，1997)。
這樣，期望可將速激肽用作新藥開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)化合物，特別是，由于認(rèn)為P物質(zhì)作為初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)的遞質(zhì)，與疼痛的傳遞有關(guān)，因此預(yù)期可將其開(kāi)發(fā)作為鎮(zhèn)痛藥，并且一直在對(duì)此進(jìn)行研究。此外，預(yù)期也可將其用作試劑，以闡明高等動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的信息處理機(jī)構(gòu)。
然而，真蛸的后部唾液腺除含有上述章魚(yú)唾腺精外，還含有具有使甲殼類(lèi)動(dòng)物麻痹的效應(yīng)的糖蛋白、章魚(yú)毒素(cephalotoxin)、已知為河豚毒的河豚毒素等有毒物質(zhì)，因此稱(chēng)為毒腺。此外，已知有含有章魚(yú)胺、5-羥色胺、酪胺、去甲腎上腺素、組胺、乙酰膽堿等生物必需胺類(lèi)以及蛋白水解酶、透明質(zhì)酸酶等酶類(lèi)的物質(zhì)(Boucaud-Camou，E.&Boucher-Rodoni，R.1983.Feeding and digestion in Cephalopods.載于“The mollusca”，(Saleuddin，A.S.M.&Wilbur，K.M.)，Academic pressand New York.)?？墒牵瑳](méi)有關(guān)于發(fā)現(xiàn)除章魚(yú)唾腺精以外的速激肽的報(bào)道。此外，雖然已知章魚(yú)唾腺精具有使哺乳動(dòng)物平滑肌收縮、血管擴(kuò)張和降壓的作用，但是關(guān)于章魚(yú)唾腺精對(duì)真蛸的作用卻幾乎一無(wú)所知。
因此，需要從更多的動(dòng)物物種中發(fā)現(xiàn)速激肽，以了解速激肽對(duì)各種動(dòng)物物種的作用以及物種特異性，通過(guò)結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性研究等闡明高等動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的信息處理機(jī)構(gòu)以及獲取可用于藥品開(kāi)發(fā)的信息。
因而，本發(fā)明的課題是發(fā)現(xiàn)新的速激肽、了解其結(jié)構(gòu)、闡明其生理活性、提供能夠用作試劑以闡明高等動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的信息處理機(jī)構(gòu)、或者用作研制農(nóng)藥或者藥品的基礎(chǔ)化合物。
此外，本發(fā)明的課題還在于弄明白這些速激肽的前體肽以及編碼這些速激肽的基因，提供所述速激肽的制備方法。
其中本發(fā)明提供由以下氨基酸序列(II)所示的速激肽H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH2(II)(式中，Xaa表示Val、Ile、Phe或Tyr)。
此外，在本說(shuō)明書(shū)中，若無(wú)具體說(shuō)明，則氨基酸殘基用IUPAC和IUB確定的3字母表述。
也就是說(shuō)，本發(fā)明者們?yōu)榱藦恼骝俚暮蟛客僖合佾@得新型速激肽，將魚(yú)類(lèi)(鯉魚(yú))的直腸收縮作為指標(biāo)進(jìn)行檢查，從真蛸的后部唾液腺分離純化出在上述氨基酸序列(II)中用氨基酸序列式(1)和式(2)表示的速激肽H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2(1)(以下將這種速激肽稱(chēng)為化合物(1))H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2(2)(以下將這種速激肽稱(chēng)為化合物(2))確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且通過(guò)全合成確認(rèn)了其結(jié)構(gòu)和生理活性。
此外，本發(fā)明者們根據(jù)上述氨基酸序列制備了引物，對(duì)從真蛸后部唾液腺制備的總RNA，通過(guò)組合使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法等基因序列分析方法，確知作為速激肽前體的多肽的完整的一級(jí)氨基酸序列如序列標(biāo)識(shí)號(hào)3所示。
本發(fā)明者們還確定了編碼所述速激肽的前體多肽的基因具有序列標(biāo)識(shí)號(hào)4中所示的核苷酸序列。
因而，作為另一方案，本發(fā)明提供具有序列標(biāo)識(shí)號(hào)3所示氨基酸序列或在該氨基酸序列中添加、缺失1個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或用其它氨基酸置換1個(gè)或多個(gè)氨基酸而被修飾的氨基酸序列的速激肽前體多肽。
此外，作為再一方案，本發(fā)明提供編碼所述速激肽及其前體多肽的基因、特別是由序列標(biāo)識(shí)號(hào)4所示的核苷酸序列構(gòu)成的基因、以及含有這些基因的載體以及用載體轉(zhuǎn)化的宿主、或者用這些基因通過(guò)基因重組技術(shù)制備前體多肽和速激肽的方法。
圖2是反相HPLC的展開(kāi)圖，顯示在實(shí)施例3中作為本發(fā)明肽的化合物(2)的最終洗脫圖形。
圖3表示實(shí)施例6中本發(fā)明化合物(1)使鯉魚(yú)直腸收縮的活性的結(jié)果，顯示了將相當(dāng)于1只真蛸量的化合物(1)加入到腔中時(shí)的結(jié)果。
圖4表示實(shí)施例6中本發(fā)明化合物(2)使鯉魚(yú)直腸收縮的活性的結(jié)果，顯示了將相當(dāng)于1只真蛸量的化合物(2)加入到腔中時(shí)的結(jié)果。
圖5表示實(shí)施例7中本發(fā)明化合物(1)使豚鼠回腸收縮的活性的結(jié)果，顯示了在腔中加入1×10-8M化合物(1)時(shí)的結(jié)果。
圖6表示實(shí)施例7中本發(fā)明化合物(2)使豚鼠回腸收縮的活性的結(jié)果，顯示了在腔中加入1×10-8M化合物(2)時(shí)的結(jié)果。
圖7表示在本發(fā)明前體多肽的氨基酸序列中，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明速激肽的氨基酸序列的存在部分(下劃線部分)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供的新型肽是具有使脊椎動(dòng)物腸道收縮作用的速激肽，可以從真蛸中按照例如以下方法進(jìn)行分離純化。
也就是說(shuō)，用熱水從真蛸后部唾液腺進(jìn)行提取，向該提取液中加入乙酸至3％的濃度，冷卻后離心分離獲得粗制提取物。使所述粗制提取物吸附在C18柱(例如Sep-Pak(注冊(cè)商標(biāo))柱Waters Co.制造)中后，用含有0.1％三氟乙酸(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為T(mén)FA)的60％甲醇洗脫，分別收集肽流分，對(duì)該流分進(jìn)行離子交換層析、反向?qū)游龅?，可以分離、精制目標(biāo)肽。
此外，由于本發(fā)明的肽是氨基酸殘基數(shù)為12的肽，因此可以用通常的肽合成儀(例如433A型肽合成儀，PE Bio Systems Japan制造)通過(guò)固相合成法等常規(guī)有機(jī)合成化學(xué)的方法來(lái)容易地合成。用這些方法獲得的粗制肽，在必要時(shí)可以通過(guò)反相高效液相色譜法或結(jié)晶等常用的精制方法，將本發(fā)明的肽進(jìn)行精制。
另一方面，可以如下測(cè)定從真蛸分離的速激肽前體多肽的氨基酸序列以及編碼所述多肽的基因的核苷酸序列。
即根據(jù)如上所述獲得的速激肽的氨基酸序列制備引物，對(duì)從真蛸后部唾液腺制備的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，測(cè)定了約500個(gè)堿基對(duì)的基因序列，然后可以用5’-RACE法、3’-RACE法測(cè)定5’末端和3’末端的基因序列。在本發(fā)明中，按照這種方法確定了真蛸的速激肽前體多肽具有序列標(biāo)識(shí)號(hào)3所示的氨基酸序列，編碼該前體多肽的基因具有序列標(biāo)識(shí)號(hào)4所示的核苷酸序列。
因而，本發(fā)明的速激肽前體多肽以及速激肽可以通過(guò)基因重組法來(lái)制備。亦即當(dāng)通過(guò)基因重組法制備時(shí)，例如可以構(gòu)建插入了序列標(biāo)識(shí)號(hào)4所示基因的載體，用所述載體轉(zhuǎn)化宿主后，培養(yǎng)所述宿主或者使其生長(zhǎng)，從所述宿主或所述宿主的培養(yǎng)液分離精制目標(biāo)前體多肽。然后，為了從前體多肽獲得目標(biāo)速激肽，可以使用酶等對(duì)前體多肽進(jìn)行切下(加工)和修飾，必要時(shí)可以進(jìn)行精制。
由于本發(fā)明的肽是引起脊椎動(dòng)物平滑肌收縮、血管擴(kuò)張和降壓的速激肽，因此不僅可以將其用作研究神經(jīng)傳遞系統(tǒng)的試劑，還可以將其用作有用的化合物來(lái)提供藥物開(kāi)發(fā)的新途徑。
例如，以本發(fā)明的肽作為有效成分的藥物，可以與藥劑學(xué)上常用的賦形劑一起以膠囊、片劑、注射劑等適當(dāng)?shù)膭┬?，?jīng)口或經(jīng)胃腸外給藥。具體地說(shuō)，可以將本發(fā)明的肽與乳糖、淀粉或其衍生物、纖維素衍生物等賦形劑混合，然后充填到明膠膠囊中，配制膠囊劑。
另外，除了上述賦形劑之外，還可以加入羧甲基纖維素鈉、藻酸、阿拉伯樹(shù)膠等粘合劑以及水進(jìn)行捏合，必要時(shí)制粒，然后進(jìn)一步加入滑石、硬脂酸鎂等潤(rùn)滑劑，用通常的壓片機(jī)壓片，制備片劑。
當(dāng)胃腸外給藥時(shí)，可以用助溶劑和無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌生理鹽水溶解本發(fā)明的肽，將其密封到安瓿中，制成注射劑。在這種情況下，根據(jù)需要還可以含有穩(wěn)定劑、緩沖物質(zhì)等。另外，可以將本發(fā)明的肽以粉末形式填充到管形瓶中，制備成使用時(shí)加入無(wú)菌蒸餾水溶解的制劑。這些胃腸外制劑可以通過(guò)靜脈注射或靜脈點(diǎn)滴給藥。
另外，本發(fā)明的作為有效成分的肽的給藥量可以考慮各種因素例如所要治療的病癥、患者的癥狀、嚴(yán)重程度、患者的年齡以及給藥途徑等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。一般而言，在口服時(shí)，作為有效成分，通常在0.1-1000mg/天/人、優(yōu)選1-500mg/天/人的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇給藥，而在胃腸外給藥時(shí)，在口服給藥量的約1/100-1/2左右的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇給藥。
(b)向C18柱的吸附向(a)得到的粗制提取物中加入20ml 1.0M HCl，在4℃以30,000×g離心分離30分鐘。讓所得的上清液通過(guò)Sep-Pak(注冊(cè)商標(biāo))VacC18柱(10g，35cc，Waters Co.制造)。用200ml 0.1％TFA洗滌柱子之后，用100ml 60％甲醇/0.1％TFA洗脫保留的物質(zhì)，將洗脫液減壓濃縮后，將其冷凍干燥，獲得干燥物質(zhì)0.363g。
(c)陽(yáng)離子交換柱層析(1)將在(b)中獲得的干燥物質(zhì)溶于150ml 10mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中，使用TSK凝膠SP TOYOPERL PACK 650S(20-50μm，Φ22×200mm，Tosoh Co.制造)進(jìn)行陽(yáng)離子交換柱層析(陽(yáng)離子交換HPLC)，在100mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中，用60分鐘，以0M-0.6M NaCl線性濃度梯度、3.0ml/min的流速洗脫。通過(guò)215nm的紫外線吸收監(jiān)測(cè)，以每6ml收集流分，按照下述實(shí)施例6所述的方法，對(duì)洗脫的各流分進(jìn)行生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在0M NaCl濃度下洗脫的流分具有直腸收縮增強(qiáng)活性。
(d)反相高效液相柱層析(1)用Capcell pak C18 UG80(5μm，Φ10×250mm，資生堂生產(chǎn))，對(duì)在(c)中所得的活性流分進(jìn)行反相高效液相柱層析(反相HPLC)，在0.1％TFA(pH 2.2)中，用60分鐘，以0％-60％的乙腈線性濃度梯度、1.5ml/min進(jìn)行洗脫。對(duì)每3ml的洗脫流分進(jìn)行生物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)用30％-36％的乙腈洗脫的流分具有活性。
(e)陽(yáng)離子交換HPLC(2)對(duì)(d)中獲得的流分用TSK凝膠SP SP-5PW(10μm，Φ7.5×75mm，Tosoh Co.制造)進(jìn)行陽(yáng)離子交換HPLC，在10mM磷酸緩沖液(pH 4.7)中，用60分鐘，以0M-0.6M NaCl的線性濃度梯度、1.0ml/min的流速進(jìn)行洗脫。對(duì)每2ml洗脫流分進(jìn)行生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在0.13-0.15M NaCl濃度下洗脫的流分具有活性。
(f)反相HPLC(2)對(duì)(e)中所得的流分用Capcell pak C18 UG80(5μm，Φ4.6×150mm，資生堂生產(chǎn))進(jìn)行反相HPLC，在0.1％TFA(pH 2.2)中，用40分鐘，以20-40％的乙腈線性濃度梯度、1.0ml/mi的流速進(jìn)行洗脫。分成各自1ml的流分，確認(rèn)了用濃度約23％的乙腈洗脫的流分(在下文中稱(chēng)為流分A)以及用濃度約25％的乙腈洗脫的流分(在下文中稱(chēng)為流分B)具有活性。實(shí)施例2從活性流分精制肽類(lèi)(其1從活性流分A精制)將實(shí)施例1的分離操作(f)中獲得的活性流分A用Capcell pak C18UG80(5μm，Φ4.6×150mm，資生堂生產(chǎn))進(jìn)行反相HPLC，在0.1％TFA(pH 2.2)中，以0.5ml/min的流速，用濃度為22％的乙腈展開(kāi)。獲得在保留時(shí)間14.5分鐘顯示出單峰的化合物。將該化合物稱(chēng)為化合物(1)。


圖1顯示了該反相HPLC的展開(kāi)圖。實(shí)施例3從活性流分精制肽類(lèi)(其2從活性流分B精制)將實(shí)施例1的分離操作(f)中獲得的活性流分B用Capcell pak C18UG80(5μm，Φ4.6×150mm，資生堂生產(chǎn))進(jìn)行反相HPLC，在0.1％TFA(pH 2.2)中；以0.5ml/min的流速，用濃度為24％的乙腈展開(kāi)。獲得在保留時(shí)間13分鐘顯示出單峰的化合物。將該化合物稱(chēng)為化合物(2)。
圖2顯示了該反相HPLC的展開(kāi)圖。
表1肽的氨基酸序列(單位pmol)

化合物(1)和化合物(2)的分子量用MALDI TOF-MS(Voyager Elite，PE Bio Systerms Japan Co.制造)測(cè)定。其測(cè)定值示于下表2中。
表2肽的MS數(shù)據(jù)

根據(jù)以上的儀器分析數(shù)據(jù)，確定了從活性流分A分離、精制的作為真蛸神經(jīng)肽類(lèi)的化合物(1)可以用以下氨基酸序列(1)表示。
H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2(1)還確定了從活性流分B分離、精制的作為真蛸神經(jīng)肽類(lèi)的化合物(2)可以用以下氨基酸序列(2)表示。
H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2(2)實(shí)施例5通過(guò)固相法合成肽類(lèi)肽類(lèi)的合成用PE Bio Systems Japan Co.制造的433A型全自動(dòng)肽合成儀按照FastMoc(注冊(cè)商標(biāo))法合成。
此外，在化合物(1)的合成中，用Fmoc-NH-SAL-A樹(shù)脂(渡邊化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn))作為載體，使用Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Val、Fmoc-Gly、Fmoc-Leu和Fmoc-Met。
另外，在化合物(2)的合成中，用Fmoc-NH-SAL-A樹(shù)脂(渡邊化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn))作為載體，使用Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Ile、Fmoc-Gly、Fmoc-Leu和Fmoc-Met。(其中，F(xiàn)moc表示9-芴基甲氧羰基，Boc表示叔丁氧羰基，tBu表示叔丁基。)為了從反應(yīng)完成后的肽樹(shù)脂切下粗制肽并且將其去保護(hù)，使用4.3％苯酚/2.1％1，2-乙二硫醇/4.3％苯硫基甲烷/4.3％水/85％TFA。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，向?yàn)V液中加入醚使肽沉淀，用醚將沉淀洗滌3次，獲得約100mg粗制肽。將其中約10mg粗制肽通過(guò)反相HPLC精制，獲得約6mg的精制肽。
在使用Capcell pak C18的反相HPLC中，所述精制肽的保留時(shí)間分別與得自真蛸的化合物(1)和(2)的保留時(shí)間完全一致。此外，在鯉魚(yú)直腸收縮活性方面，合成物與各自的天然物質(zhì)的活性相同。實(shí)施例6鯉魚(yú)直腸收縮活性的測(cè)定鯉魚(yú)直腸收縮活性的測(cè)定如下進(jìn)行。亦即取出鯉魚(yú)腸，將其兩端用棉線固定，一端固定在添加樣品用的室(容量為2ml)中，另一端連接于傳感器上，作為檢查的標(biāo)本。將待檢測(cè)的樣品用生理鹽水溶解，加入到樣品室中，記錄收縮所引起的張力的變化。
其結(jié)果示于圖3和圖4中。
根據(jù)圖中的結(jié)果可以看出，化合物(1)(圖3)和化合物(2)(圖4)使鯉魚(yú)腸道強(qiáng)力收縮。實(shí)施例7豚鼠回腸收縮活性的測(cè)定豚鼠回腸收縮活性的測(cè)定按照Champagne等(Champagne，D.E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91，138-142，1994)的方法進(jìn)行。
取出豚鼠回腸，將其兩端用棉線固定，一端固定在添加樣品用的室(容量為5ml)中，另一端連接于傳感器上，作為檢查的標(biāo)本。另外，在樣品室中一直用37℃的生理鹽水保持恒定，將待檢測(cè)的樣品用生理鹽水溶解，加入到樣品室中，記錄收縮所引起的張力的變化。
其結(jié)果示于圖5和圖6中。
根據(jù)圖中的結(jié)果可以看出，化合物(1)(圖5)和化合物(2)(圖6)分別在1×10-8M濃度下使豚鼠回腸強(qiáng)力收縮。實(shí)施例8前體多肽的全氨基酸結(jié)構(gòu)及其編碼基因的核苷酸序列的測(cè)定(1)真蛸后部唾液腺總RNA的制備將約1g的真蛸后部唾液腺在液氮中粉碎，將其溶于10ml TRIzol(注冊(cè)商標(biāo))試劑(GIBCO BRL Co.制造)中，然后勻漿。在室溫下靜置5分鐘后，將其分為每份1ml，在每份混合物中加入200μl氯仿并攪拌后，用冷卻離心機(jī)(佐久間制作所公司制造)離心分離(15,000rpm，15分鐘，4℃)。取上層水層，向每份中加入0.5ml異丙醇，于室溫下靜置10分鐘。用冷卻離心機(jī)離心分離(15,000rpm，10分鐘，4℃)后，除去上清液，加入1ml 75％乙醇后再次離心分離(10,000rpm，5分鐘，4℃)。除去上清液，將殘余物風(fēng)干約10分鐘，加入10μl DEPC處理水，于60℃保溫10分鐘，溶解RNA。用上述方法獲得約3mg總RNA。
(2)簡(jiǎn)并3’-RACE根據(jù)從真蛸后部唾液腺分離的肽的序列，設(shè)計(jì)以下簡(jiǎn)并引物，并且按照常規(guī)方法合成。Oct-TK-M-15’-AA(A/G)CCICCII(C/G)II(C/G)II(C/G)IGA(A/G)TT(C/T)AT-3’Oct-TK-M 5’-GA(A/G)TT(C/T)AT(A/T/C)GGI(C/T)TIATGGG-3’(各式中英文字母基于“Nucleotide Abbreviation List”(細(xì)胞工學(xué)別冊(cè)，“Biotechnology Experiment Illustrated”秀潤(rùn)社)；以下各式中與此相同。)接著，用5’/3’-RACE試劑盒(Boehringer Mannheim Co.制造)，按照以下程序進(jìn)行簡(jiǎn)并3’-RACE。亦即加入2μg總RNA、4μl cDNA合成緩沖液、2μl dNTP混合物、1μl寡聚dT-錨定引物(12.5pmol/μl)、1μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶(20單位/μl)、DEPC處理水，使總體積為20μl，于55℃保溫60分鐘后，于65℃處理10分鐘，合成第一鏈cDNA。
接著，在以下條件下進(jìn)行第一輪3’-RACE。亦即將5μl第一鏈cDNA、5μl 10×PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、3μl Oct-TK-M-1(100pmol/μl)、1μl PCR錨定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注冊(cè)商標(biāo))(寶酒造社生產(chǎn))、水混合，使總體積為50μl，在94℃反應(yīng)5分鐘后，以94℃ 30秒、45℃ 30秒、72℃ 2分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后于72℃反應(yīng)7分鐘。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)中，使用GeneAmpPCR System 2400熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Co.制造)。
隨后，將第一輪PCR產(chǎn)物用離心柱(spin column)(MicroSpin(注冊(cè)商標(biāo))S-400，Amersham Pharmacia Co.制造)精制，在以下條件下進(jìn)行第二輪3’-RACE。亦即將3μl第一輪PCR產(chǎn)物、5μl 10×PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、3μl Oct-TK-M(100pmol/μl)、1μl PCR錨定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注冊(cè)商標(biāo))(寶酒造社生產(chǎn))、水混合，使總體積為50μl，在94℃反應(yīng)5分鐘后，以94℃ 30秒、45℃ 30秒、72℃ 2分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后于72℃反應(yīng)7分鐘。
將5μl反應(yīng)液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增了約300bp的PCR產(chǎn)物。
(3)PCR產(chǎn)物的連接反應(yīng)將PCR產(chǎn)物經(jīng)離心柱精制，將其中3μl PCR產(chǎn)物與2μl TA克隆載體pCR2.1(Invitrogen Co.制造)、5μl Ligation high(東洋紡社生產(chǎn))混合，于16℃進(jìn)行1小時(shí)的連接反應(yīng)。
(4)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化將上述(3)中所得的10μl連接反應(yīng)溶液混合到感受態(tài)細(xì)胞Competent high大腸桿菌DH5α(東洋紡社制造)中，在冰中靜置30分鐘后，于42℃進(jìn)行熱激50秒。在冰中冷卻2分鐘后，加入1ml SOC培養(yǎng)基，于37℃孵育30分鐘。隨后，在LB/Amp.(含有50μg/ml氨芐青霉素的LB)瓊脂培養(yǎng)基上涂布35μl X-gal后，涂布10μl轉(zhuǎn)化子。將殘留的轉(zhuǎn)化子以10,000rpm離心沉淀1分鐘，將體積減至100μl左右，全部涂布到LB/Amp.瓊脂培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
(5)菌落PCR將所得的菌落作為模板，在以下條件下進(jìn)行菌落PCR。亦即將大腸桿菌細(xì)胞、5μl 10×反應(yīng)緩沖液、5μl 2mM dNTP、3μl 25mM MgCl2、0.5μl M13FW引物(100pmol/μl)、0.5μl M13RV引物(100pmol/μl)、0.5μlrTaq DNA聚合酶(東洋紡社制造)和水混合，使總體積為50μl，于90℃反應(yīng)10分鐘后，以94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后于72℃再反應(yīng)5分鐘。將5μl反應(yīng)液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳。
此外，在該反應(yīng)中使用的M13FW引物和M13RV引物按照常規(guī)方法合成。其序列示于下面。
M13FW5’-GTAAAACGACGGCCAGTG-3’M13RV5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’(6)DNA序列通過(guò)離心柱精制目的大小(約500bp)的菌落PCR產(chǎn)物，用DNA測(cè)序試劑盒(PE Biosystems Co.制造)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序使用ABIPRISM 310Genetic分析儀(PE Biosystems Co.制造)。
用基因分析軟件GENETYX-MAC(Software Development Co.制造)分析所得的序列，結(jié)果確定了約500bp的部分cDNA的序列。
(7)5’-RACE根據(jù)部分cDNA的核苷酸序列，合成以下引物。TK-M-5’-1R5’-TTCAGGTTTCAGTTCATTGGG-3’TK-M-5’-2R5’-TTTCGGTGGACCTCTCTTAC-3’TK-M-5’-3R5’-TTCAGACATAGAACCAGGATG-3’接著，用5’/3’-RACE試劑盒(Boehringer Mannheim Co.制造)，按照以下程序進(jìn)行5’-RACE。首先，將2μg總RNA與1μl TK-M-5’-1R(12.5pmol/μl)混合，于70℃處理10分鐘，然后在冰中冷卻。然后，將4μl cDNA合成緩沖液、2μl dNTP混合物、1μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶(20單位/μl)、DEPC處理水混合，使總體積為20μl，于55℃保溫60分鐘后，于65℃處理10分鐘，合成第一鏈cDNA。接著，在用離心柱精制第一鏈cDNA后，加入2.5μl反應(yīng)緩沖液、2.5μl 2mM dATP，于94℃處理3分鐘，然后加入1μl末端轉(zhuǎn)移酶(10單位/μl)，在于37℃保溫20分鐘后，于70℃處理10分鐘，合成以dA加尾的cDNA。
接著在下述條件下進(jìn)行第一輪PCR和第二輪PCR。
①第一輪PCR將5μl dA加尾的cDNA、5μl 10×PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、1μl TK-M-5’-2R(12.5pmol/μl)、1μl寡聚dT-錨定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注冊(cè)商標(biāo))(寶酒造社生產(chǎn))和水混合，使總體積為50μl，在94℃反應(yīng)5分鐘后，以94℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后于72℃反應(yīng)7分鐘。
②第二輪PCR將3μl經(jīng)離心柱精制的第一輪PCR產(chǎn)物、5μl 10×PCR緩沖液、8μl dNTP混合物、1μl TK-M-5’-3R(12.5pmol/μl)、1μl PCR錨定引物(12.5pmol/μl)、0.5μl TaKaRa Ex Taq(注冊(cè)商標(biāo))(寶酒造社生產(chǎn))和水混合，使總體積為50μl，以與第一輪PCR相同的循環(huán)進(jìn)行第二輪PCR。
用以上方法獲得的第二輪PCR產(chǎn)物通過(guò)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，確證了約300bp的條帶。
將所述第二輪PCR產(chǎn)物按照上述方法(3)、(4)、(5)和(6)中所述的方法進(jìn)行測(cè)序。
結(jié)果，可以確定速激肽前體肽的編碼基因(cDNA)的大小(約460bp)以及其推定的氨基酸數(shù)(87個(gè)氨基酸殘基)和序列。其氨基酸序列示于序列標(biāo)識(shí)號(hào)3中，而cDNA的序列示于序列標(biāo)識(shí)號(hào)4中。
另外，在前體多肽中，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明速激肽的氨基酸序列所存在的部分示于圖7中。圖中用下劃線表示的氨基酸序列的部分是存在對(duì)應(yīng)于本發(fā)明肽的氨基酸序列的部分。實(shí)施例9制劑實(shí)施例片劑組成化合物(1)或(2) 10g乳糖 125g微晶纖維素 25g玉米淀粉 25g5％羥丙基甲基纖維素 100ml硬脂酸鎂 5g將上述成分按照常規(guī)方法捏合、制粒，干燥后壓片，獲得每片中含有10mg化合物(1)或化合物(2)作為有效成分的190mg片劑。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供的真蛸神經(jīng)肽在低濃度下使鯉魚(yú)直腸迅速收縮，而且是具有引起隨后持續(xù)收縮作用的神經(jīng)肽，這樣的結(jié)果與P物質(zhì)的平滑肌收縮所特有的雙相收縮類(lèi)似。
另外，本發(fā)明的真蛸神經(jīng)肽的C末端一側(cè)具有引起哺乳動(dòng)物平滑肌收縮和血管擴(kuò)張以及降壓作用的速激肽所特有的結(jié)構(gòu)-Phe-Yaa-Gly-Leu-Met-NH2(式中，Yaa的定義同前)。因此，本發(fā)明的真蛸神經(jīng)肽被分類(lèi)為速激肽。
因此，本發(fā)明的真蛸神經(jīng)肽可以用作生化試劑以闡明神經(jīng)傳遞系統(tǒng)，而且，通過(guò)對(duì)分子水平的結(jié)構(gòu)活性相關(guān)性的研究，可以獲得開(kāi)發(fā)醫(yī)藥和農(nóng)藥的新途徑。
并且，按照本發(fā)明獲得的速激肽的前體多肽及其編碼基因，成為制備本發(fā)明速激肽的重要的工具。
序列表<110>三得利株式會(huì)社(SUNTORY LIMITED)<120>新的速激肽、這些前體多肽及其編碼基因<130>SN-36<150>JP11-216922<151>1999-07-30<150>JP2000-86236<151>2000-03-27<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>肽<222>(1)..(12)<223>在C末端酰胺化<400>1Lys Pro Pro Ser Ser Ser Glu Phe Val Gly Leu Met1 5 10<210>2<211>12<212>PRT<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>肽<222>(1)..(12)<223>在C末端酰胺化<400>2Lys Pro Pro Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Leu Met1 5 10<210>3<211>87<212>PRT<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>肽<222>(1)..(87)<400>3Met Ile Arg Val Gly Leu Ile Leu Cys Cys Ile Phe Ile Ala Gly Val1 5 10 15Phe Glu Ala Ser Ser Ala Asp Asp Met Leu Thr Ala His Asn Leu Ile20 25 30Lys Arg Ser Glu Val Lys Pro Pro Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Leu35 40 45Met Gly Arg Ser Glu Glu Leu Thr Arg Arg Leu Ile Gln His Pro Gly50 55 60Ser Met Ser Glu Thr Ser Lys Arg Gly Pro Pro Lys Lys Val Ser Arg65 70 75 80Arg Pro Tyr Ile Leu Lys Lys85<210>4<211>460<212>DNA<213>真蛸(OCTOPUS VULGARIS)<220><221>CDS<222>(94)..(354)<400>4acagatctca caaaatttga gaagaaaatt ctataaaacc tgagaaatcc ctaatattcc 60atacagattc ttattgtgat ttctatattc aac atg att aga gta ggt ttg atc 114Met Ile Arg Val Gly Leu Ile1 5ctg tgt tgt atc ttc att gct gga gtg ttt gaa gcc agt tct gct gat 162Leu Cys Cys Ile Phe Ile Ala Gly Val Phe Glu Ala Ser Ser Ala Asp10 15 20gac atg ctt aca gca cat aat ttg att aaa aga tct gaa gtt aaa cct 210Asp Met Leu Thr Ala His Asn Leu Ile Lys Arg Ser Glu Val Lys Pro25 30 35cct tca tcc tca gaa ttc ata ggc tta atg gga cgt tct gaa gag ttg 258Pro Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Leu Met Gly Arg Ser Glu Glu Leu40 45 50 55aca cga cga tta att caa cat cct ggt tct atg tct gaa aca agt aag 306Thr Arg Arg Leu Ile Gln His Pro Gly Ser Met Ser Glu Thr Ser Lys60 65 70aga ggt cca ccg aaa aaa gtt tct cgt cgt cca tat att ctt aag aaa 354Arg Gly Pro Pro Lys Lys Val Ser Arg Arg Pro Tyr Ile Leu Lys Lys75 80 85tgaatgttac caaaatattt caggcgattt taatcccaat gaactgaaac ctgaatctaa 414catttgttaa aataaaatat gaaagcacaa aaaaaaaaaa aaaaaa460
權(quán)利要求
1.由以下特性表示的速激肽(1)氨基酸殘基數(shù)為12；(2)N末端為L(zhǎng)ys；(3)C末端的5個(gè)氨基酸具有以下氨基酸序列(I)-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH2(I)(式中，Xaa表示Val、Ile、Phe或Tyr)。
2.權(quán)利要求1的肽，該肽由以下氨基酸序列(II)表示H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Xaa-Gly-Leu-Met-NH2(II)(式中，Xaa表示Val、Ile、Phe或Tyr)。
3.權(quán)利要求1或2的肽，該肽得自真蛸(Octopus vulgaris)的后部唾液腺。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的肽，該肽由以下氨基酸序列(1)表示H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2(1)。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的肽，該肽由以下氨基酸序列(2)表示H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2(2)。
6.速激肽的前體多肽，該前體多肽具有序列標(biāo)識(shí)號(hào)3所示氨基酸序列或在所述氨基酸序列中添加、缺失和/或用其它氨基酸置換1個(gè)或多個(gè)氨基酸而被修飾的氨基酸序列。
7.編碼權(quán)利要求6所述速激肽前體多肽的DNA。
8.一種DNA，所述DNA由序列標(biāo)識(shí)號(hào)4所示堿基序列組成。
9.與權(quán)利要求7或8的DNA雜交的DNA。
10.與編碼序列標(biāo)識(shí)號(hào)1-3所示氨基酸序列的多核苷酸雜交的DNA。
11.一種載體，所述載體含有權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的DNA。
12.用權(quán)利要求11所述載體轉(zhuǎn)化的宿主。
13.速激肽前體多肽的生產(chǎn)方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求12的宿主或者使其生長(zhǎng)，然后從該宿主或該宿主的培養(yǎng)液中提取速激肽的前體多肽。
14.速激肽的前體多肽，所述前體多肽是按照權(quán)利要求13的方法獲得的。
15.速激肽的生產(chǎn)方法，其特征在于從按照權(quán)利要求13的方法獲得的速激肽前體多肽中切下速激肽的前體，隨后對(duì)C末端進(jìn)行修飾。
16.按照權(quán)利要求15的方法獲得的速激肽。
17.權(quán)利要求16的速激肽，所述速激肽由以下氨基酸序列(1)和氨基酸序列(2)表示H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2(1)H-Lys-Pro-Pro-Ser-Ser-Ser-Glu-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2(2)。
18.一種藥物或農(nóng)藥，所述藥物或農(nóng)藥以權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的速激肽作為有效成分。
全文摘要
提供從軟體動(dòng)物真蛸的后部唾液腺分離、純化的速激肽,這些速激肽是表現(xiàn)出以下特性的速激肽:(1)氨基酸殘基數(shù)為12;(2)N末端為L(zhǎng)ys;(3)C末端的5個(gè)氨基酸具有氨基酸序列式(I)－Phe－Xaa－Gly－Leu－Met－NH
文檔編號(hào)C07K7/08GK1376162SQ00813358
公開(kāi)日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2000年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月30日
發(fā)明者南方宏之, 巖越榮子, 黑田京子 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社