專利名稱：來自棉花的纖維特異性β－微管蛋白啟動子的分離和鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及轉(zhuǎn)基因植物和用于創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因植物的啟動子，更具體地涉及纖維特異性啟動子。
背景技術(shù)：
棉花是紡織工業(yè)最廣泛使用的天然纖維，全世界棉花年產(chǎn)量為1億捆，總值450億美元。在過去的幾十年間雖然已通過經(jīng)典育種明顯改進(jìn)了纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量，但是通過經(jīng)典育種進(jìn)一步改善纖維性質(zhì)的潛力已被限制，因?yàn)樾枰锓N相容性和可利用的性狀?；蚬こ烫峁┝诉M(jìn)一步改良棉花的新途徑，其是通過導(dǎo)入基因以產(chǎn)生具有高度所需特征的新種質(zhì)而進(jìn)行。
棉花纖維(種毛)是經(jīng)歷快速同步延伸的單細(xì)胞毛狀體。皮層(cortical)微管提供了規(guī)范和調(diào)控細(xì)胞延伸的纖維素微原纖維排列所需的空間信息(Giddings和Staehelin，1991；Cyr和Palevitz，1995；Fisher和Cyr，1995)。纖維發(fā)育由4個重疊階段組成(即起始、初級細(xì)胞壁形成、次生細(xì)胞壁形成和成熟)(Basra和Malik，1984)。微管蛋白和肌動蛋白可能在發(fā)育纖維細(xì)胞中起重要功能作用。成熟纖維是纖維素、水、少量蛋白質(zhì)、果膠、半纖維素、礦物質(zhì)、蠟、少量有機(jī)酸、糖和色素的生物學(xué)組合物，其提供優(yōu)異的穿著性能和美學(xué)(Arthur，1990；Basra和Malik，1984；Ryser，1985)。纖維分化和發(fā)育需要許多基因，這些基因在纖維發(fā)育的不同階段差異表達(dá)，目前僅鑒別了參與大量纖維特異性結(jié)構(gòu)蛋白、酶、多糖、蠟或木質(zhì)素的生物合成的一些基因(John和Crow，1992；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Kawai等，1998；Whittaker和Triplett，1999)。這些分離的基因由于其纖維特異性表達(dá)可被認(rèn)為具有改良棉花纖維的潛在應(yīng)用。例如，John已使用纖維特異性基因啟動子產(chǎn)生基因工程棉花以收獲改變的纖維(John，1996b，1997a，1997b)。
啟動子是確定植物和動物發(fā)育過程中基因表達(dá)的時空特異性的DNA片段。在過去十年間已從各種植物和動物中鑒別和分離了許多組織特異性基因及其啟動子，包括一些棉花組織特異性基因和啟動子(Loguerico等，1999；Kawai等，1998；Song和Allen，1997；Ma等，1997；John，1996a；Rinehart等，1996；Hasenfratz等，1995；John和Peterson，1994；John和Crow，1992)。有幾種啟動子以顯示在棉花中以纖維特異性方式控制基因表達(dá)(Rinehart等，1996；John，1996a；John和Crow，1992)。一些植物組織特異性啟動子可被用于在特異組織中以發(fā)育調(diào)控模式表達(dá)外源蛋白質(zhì)(John，1996b，1997a，1997b)。
發(fā)明概述從棉花中分離了編碼β-微管蛋白的纖維特異性基因(命名為CFTUB2)。所分離的完整CFTUB2 cDNA長度為1.623kb，包括1.338kb的開放讀框?；贑FTUB2 cDNA的序列，從棉花中分離了兩個CFTUB2啟動子片段(1.433kb和0.984kb)。將兩個CFTUB2啟動子片段(1.3和0.9kb)與GUS基因融合以構(gòu)建用于分析啟動子功能的基因表達(dá)載體。通過Southem印跡雜交鑒別了具有CFTUB2啟動子/GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因棉花和煙草植物。在所研究的所有轉(zhuǎn)基因棉花植物中，僅在新生纖維中檢測到GUS活性，而在花器官如花藥、花瓣和萼片中或在和根中未檢測到該活性。這一結(jié)果與Northem印跡分析一起提示CFTUB2啟動子在棉花中是纖維特異性的。該啟動子在棉花纖維中在轉(zhuǎn)錄水平控制特異基因表達(dá)。所分離的啟動子可用于通過基因操作改良棉花纖維，產(chǎn)生具有高纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的新棉花品種。
附圖簡述

圖1示出棉花CFTUB2基因cDNA的核苷酸序列(1623bp；SEQID NO1)。
圖2示出分離的1433bp CFTUB2啟動子片段的核苷酸序列(SEQID NO2)，984bp片段相應(yīng)于這一序列的核苷酸449-1433。
圖3示出在表達(dá)載體中的與gus基因融合的CFTUB2啟動子的構(gòu)建體。
詳細(xì)描述CFTUB2啟動子是棉花中的活性纖維特異性啟動子。來自各種棉花組織的cDNA的Northern印跡分析結(jié)果顯示包含CFTUB2基因的一cDNA克隆在8和14 DPA(開花后天數(shù))的初生(young)纖維中強(qiáng)表達(dá)，并且在4、8和14 DPA的初生胚珠中也表達(dá)，但在所有其它組織中很少表達(dá)或不表達(dá)。該cDNA克隆的測序揭示其長度為1623bp，含有一1338bp的開放讀框(圖1)。將棉花CFTUB2的核苷酸和預(yù)計(jì)的多肽序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CFTUB2 cDNA與已知的來自其它植物(如擬南芥屬、煙草、水稻、大豆、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜等)的β-微管蛋白cDNA和基因在氨基酸水平有96-98％同源性，在核苷酸水平有78％以上的同源性(Liaud等，1992；Snustad等，1992；Villemur等，1994；Tonoike等，1994；Taylor等，1994；Kang等，1994；Okamura等，1997；Chu等，1998；Okamura等，1999)。
CFTUB2基因的轉(zhuǎn)錄物顯示在8 DPA的棉花新生纖維中有最高的積累，隨后隨著纖維的進(jìn)一步發(fā)育基因產(chǎn)物(mRNA)的積累有一可見的降低。棉花胚珠不同發(fā)育階段中的基因表達(dá)的比較也示出基因轉(zhuǎn)錄物在8 DPA胚珠中的積累比在4和14 DPA中的積累多，隨著從8 DPA至28 DPA纖維發(fā)育，基因產(chǎn)物的積累逐漸降低至不可檢水平。這提示該基因與其它棉花纖維特異性基因一樣在棉花纖維和胚珠發(fā)育過程中以轉(zhuǎn)錄水平嚴(yán)格調(diào)控而特異表達(dá)(Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，197；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992)。
分離該啟動子區(qū)的兩個片段并分別克隆進(jìn)pGEM-T載體。CFTUB2啟動子的一個片段長度為1433bp(圖2)，另一個長度為984bp。兩個片段均是有活性的纖維特異性啟動子。用CFTUB2啟動子/GUS融合基因構(gòu)建體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化煙草和棉花，用含有CaMV35S啟動子/GUS融合體的pBI121載體作為陽性對照。與Northern印跡分析結(jié)果一致，在所研究的所有31個轉(zhuǎn)基因棉花植物中，由CFTUB2啟動子驅(qū)動的GUS基因特異地在新生纖維中表達(dá)，但不在其它組織中表達(dá)；而在陽性對照棉花植物(35SGUS)的所有組織中均檢測到GUS活性。總共獲得36個轉(zhuǎn)化棉花植物，將其移植到土壤中生長成熟。類似地，發(fā)現(xiàn)在CFTUB2啟動子驅(qū)動下的GUS基因活性僅在所研究的所有15個轉(zhuǎn)基因煙草植物的種子中檢測到，提示CFTUB2啟動子活性在煙草中也是組織特異性的(棉花纖維是種皮的延伸種毛，其與煙草種皮有組織學(xué)相應(yīng)性)。這一結(jié)果與上述Northern印跡分析結(jié)果一起表明CFTUB2啟動子在轉(zhuǎn)錄水平控制棉花纖維中基因特異表達(dá)。
因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方案是得自棉花纖維β-微管蛋白基因CFTUB2的纖維特異性啟動子。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是包含棉花纖維CFTUB2基因啟動子的1433bp活性片段的纖維特異性啟動子。
本發(fā)明的再一實(shí)施方案是包含棉花纖維CFTUB2基因啟動子的984bp活性片段的纖維特異性啟動子。
本發(fā)明的再一實(shí)施方案是棉花纖維特異性啟動子，其包含SEQID NO2的CFTUB2啟動子片段的活性片段?；钚云问情L度比SEQID NO2短但仍保持作為棉花中纖維特異性啟動子的活性的序列。片段可包含SEQ ID NO2序列的切除、缺失、截短或取代，或其組合。優(yōu)選的活性片段由SEQ ID NO2的核苷酸449-1433組成。
本發(fā)明的啟動子可用于產(chǎn)生具有改變的纖維特征的轉(zhuǎn)基因棉花。本發(fā)明的纖維特異性啟動子的應(yīng)用使得可以在棉花纖維中選擇性表達(dá)轉(zhuǎn)基因，從而可采用的轉(zhuǎn)基因類型更多。選擇性表達(dá)避免了以下問題，如由轉(zhuǎn)基因的系統(tǒng)表達(dá)造成的轉(zhuǎn)基因植物的代謝負(fù)擔(dān)，或者轉(zhuǎn)基因在非纖維組織中表達(dá)的副作用。在棉花纖維中表達(dá)而在棉花植物的其它部分不表達(dá)的所需基因的例子包括(1)彩色棉花所需的花青苷基因，(2)用于增加棉花纖維強(qiáng)度的來自蠶或蜘蛛的絲蛋白，(3)用于改善熱性質(zhì)和絕緣特征的棉花纖維中的聚羥基丁酸酯的生物合成(John等，1996)?，F(xiàn)有技術(shù)中有無數(shù)增強(qiáng)纖維的基因的例子，它們可有利地與本發(fā)明的啟動子連接，用于經(jīng)熟知技術(shù)轉(zhuǎn)化棉花(參見，例如Umbeck，1992)，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的表達(dá)。參見例如，John，1996b，1997a，1997b；John等，1996。實(shí)施例1 編碼在棉花纖維發(fā)育早期表達(dá)的CFTUB2序列的纖維特異性cDNA的分離棉花種子用70％乙醇表面消毒30-60秒，用10％H2O2表面消毒30-60分鐘，之后用無菌水清洗。種子在培養(yǎng)室中于光照下28℃在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，從無菌幼苗中切下的子葉和下胚軸用作轉(zhuǎn)化外植體材料。棉花植物在罐中培養(yǎng)以用于DNA和RNA提取。
用硫氰酸胍方法或SV總RNA分離系統(tǒng)(Promega)從棉花新生纖維、子房、花藥、花瓣、萼片、葉和根中提取總RNA。用mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech)的寡(dT)-纖維素旋轉(zhuǎn)柱純化聚(A)+RNA。用cDNA合成試劑盒(Pharmacia Biotech)合成棉花cDNA。通過將cDNA片段插入ZAP表達(dá)載體(Stratagene)構(gòu)建棉花cDNA文庫。
將分別來自約8和14 DPA的棉花新生纖維的聚(A)+RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，用于構(gòu)建棉花cDNA文庫。從該纖維cDNA文庫中隨機(jī)挑取約200個cDNA克隆，隨后測序。根據(jù)序列數(shù)據(jù)選擇潛在參與細(xì)胞擴(kuò)張的一些克隆。
為發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物在棉花纖維中特異表達(dá)的cDNA克隆，用來自克隆的探針與分離自棉花纖維、胚珠、花藥、花瓣、萼片、蕾、葉和根的總RNA進(jìn)行Northern印跡雜交，從而分析所選cDNA克隆的表達(dá)模式。來自不同棉花組織的RNA樣品在瓊脂糖—甲醛凝膠上分離，經(jīng)毛細(xì)印跡轉(zhuǎn)移至Hybond-N尼龍膜上。RNA Northem印跡在68℃、ExpressHyb溶液(Clontech)中與隨機(jī)標(biāo)記(PromegaPrime-a-Gene標(biāo)記系統(tǒng))制備的32P cDNA探針雜交。雜交后，在68℃用0.1×SSC，0.5％SDS洗印跡30-60分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一個cDNA克隆在8和14 DPA的新生纖維中強(qiáng)表達(dá)，在4、8和14 DPA的初生胚珠中也表達(dá)，但在所有其它組織中很少或不表達(dá)。
將PCR片段和cDNA片段亞克隆進(jìn)載體中，用制備自Qiagen質(zhì)粒試劑盒的質(zhì)粒DNA作為PCR反應(yīng)的模板。由自動測序儀測序PCR產(chǎn)物。該cDNA克隆的測序表明其長度為1623bp，含有1338bp的開放讀框，與β-微管蛋白基因相同(圖1)。這是從棉花中分離的第一個CFTUB2 cDNA克隆。將棉花CFTUB2的核苷酸和預(yù)計(jì)的多肽序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CFTUB2 cDNA與已知的來自其它植物(如擬南芥屬、煙草、水稻、大豆、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜等)的β-微管蛋白cDNA和基因在氨基酸水平有96-98％同源性，在核苷酸水平有78％以上的同源性(Liaud等，1992；Snustad等，1992；Villemur等，1994；Tonoike等，1994；Taylor等，1994；Kang等，1994；Okamura等，1997；Chu等，1998；Okamura等，1999)。
來自不同棉花組織的總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄用作示差展示PCR反應(yīng)中的模板的第一鏈cDNA。用示差展示試劑盒(Clontech)進(jìn)行示差展示分析。用2pg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄的起始材料，以寡(dT)作為引物在42℃反應(yīng)1小時合成第一鏈cDNA。示差展示PCR反應(yīng)為94℃ 5分鐘、40℃ 5分鐘和68℃ 5分鐘的初始循環(huán)、隨后兩個循環(huán)的94℃ 2分鐘、40℃ 5分鐘和68℃ 5分鐘、隨后25個循環(huán)的94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘和68℃ 2分鐘以及最終的68℃延伸7分鐘。切下差示展示靶帶，再擴(kuò)增以進(jìn)行進(jìn)一步分析。取可重復(fù)的纖維特異性差示展示產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分析。收獲每一靶帶的cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增再生。隨后將分離的cDNA亞克隆進(jìn)載體并測序。
Northern印跡分析顯示CFTUB2基因的轉(zhuǎn)錄物在8 DPA的棉花新生纖維中有最高的積累，隨后隨著纖維的進(jìn)一步發(fā)育基因產(chǎn)物(mRNA)的積累有一可見的降低。棉花胚珠不同發(fā)育階段中的基因表達(dá)的比較也示出基因轉(zhuǎn)錄物在8 DPA胚珠中的積累比在4和14DPA中的積累多，隨著從8 DPA至28 DPA的纖維發(fā)育，基因產(chǎn)物的積累逐漸降低至不可檢水平。這提示該基因與其它棉花纖維特異性基因一樣在棉花纖維和胚珠發(fā)育過程中以轉(zhuǎn)錄水平嚴(yán)格調(diào)控而特異表達(dá)(Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，197；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992)。實(shí)施例2 CFTUB2啟動子的分離基于篩選的CFTUB2 cDNA序列，經(jīng)基因組步行PCR從棉花基因組步行(Genome Walker)文庫中分離CFTUB2啟動子。
用下述方法棉花植物葉中提取和純化總DNA，將液氮加至4g葉組織，充分均質(zhì)葉。在一50ml試管中向均質(zhì)組織中加入20ml冰冷的提取緩沖液(63g/L葡萄糖、0.1M Tris.HCl(pH8.0)、5mM EDTA、20g/L PVP-40、1g/L DIECA、1g/L抗壞血酸、2ml/L β-巰基乙醇)，250rpm離心15分鐘。除去上清后，向每管中加入10ml裂解緩沖液。將重懸的沉淀在65℃保溫30分鐘。向每管中加入10ml氯仿，與樣品混合并在3500rpm離心10分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至新管中，重復(fù)1次氯仿提取。將上清轉(zhuǎn)移至新管中，向每管中加入0.6體積異丙醇進(jìn)行DNA沉淀。3500rpm離心30分鐘后，用70％乙醇洗DNA。隨后將分離的基因組DNA溶解在無菌水或TE(10mM Tris.HCl，1mMEDTA)中備用。
從棉花植物的葉中構(gòu)建棉花基因組DNA文庫。將DNA用BamHI部分消化，將DNA片段克隆進(jìn)ZAP表達(dá)載體(Stratagene)的BamHI位點(diǎn)。
用通用基因組步行試劑盒(Clontech)構(gòu)建基因組步行文庫。來自棉花葉的基因組DNA分別用5種限制酶消化，隨后經(jīng)苯酚/氯仿純化，并用乙醇沉淀。將消化的DNA于基因組步行銜接子連接。相繼進(jìn)行兩輪基因組步行PCR反應(yīng)。在初級PCR中使用1微升每一基因組步行DNA文庫作為模板，初級PCR引物用作二級PCR的模板。PCR起始為95℃ 1分鐘，隨后35個循環(huán)的95℃ 15秒、68℃4分鐘，最終在68℃延伸6分鐘。切下靶PCR條帶，經(jīng)Geneclean試劑盒(Bio 101)純化。
分離啟動子區(qū)的兩個片段并分別克隆進(jìn)pGEM-T載體。CFTUB2啟動子的一個片段長度為1433bp，另一個片段長度為984bp(圖2)。經(jīng)PCR方法在棉花0.9kb CFTUB2啟動子片段的5-末端和3’-末端分別產(chǎn)生HindIII和BamHI位點(diǎn)。將HindIII/BamHI片段首先亞克隆進(jìn)pGEM-T載體(Promega)。用HindIII和BamHI消化含有CFTUB2啟動子片段的質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段。通過在pBI121載體的HindIII/BamHI位點(diǎn)中插入該片段置換CaMV35S啟動子而產(chǎn)生嵌合CFTUB2啟動子/GUS構(gòu)建體。
將1.3kb BamHI/BamHI CFTUB2啟動子片段首先亞克隆進(jìn)pGEM-T載體(Promega)。用BamHI消化含有CFTUB2啟動子片段的質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段。通過將該片段插入pBI101載體的BamHI位點(diǎn)產(chǎn)生嵌合CFTUB2啟動子/GUS構(gòu)建體。實(shí)施例3 CFTUB2啟動子的功能分析為了鑒定CFTUB2啟動子在CFTUB2基因的纖維特異性表達(dá)中的功能，在基因表達(dá)載體pBI101或pBI121(缺失CaMV35S啟動子)中分別將CFTUB2啟動子的1.3kb片段或0.9kb片段與gus編碼序列融合(圖3)。用CFTUB2啟動子/GUS融合基因的構(gòu)建體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化煙草和棉花，用含有CaMV35S啟動子/GUS融合體的pBI121載體作為陽性對照。CaMV35S啟動子在棉花和其它植物的所有組織中均是活性的，其是一種組成型啟動子(Odell等，1985；Ow等，1987；McCabe和Martinell，1993)。將含有CFTUB2啟動子/GUS融合基因或CaMV35S啟動子/GUS對照的雙元載體轉(zhuǎn)移進(jìn)根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA 4404中。用于轉(zhuǎn)化的棉花外植體得自如實(shí)施例1所述培養(yǎng)的棉花幼苗。煙草外植體材料得自煙草幼苗。煙草種子用70％乙醇表面消毒30-60秒，用0.1％HgCl2表面消毒15分鐘，隨后用無菌水洗。種子在培養(yǎng)室中于光照下28℃在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，從無菌幼苗上切下的葉用作轉(zhuǎn)化外植體。用載體經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花子葉和下胚軸外植體及煙草葉外植體，將轉(zhuǎn)化植物移植到溫室土壤中生長至成熟。
將煙草葉切成2×2cm的片，浸入農(nóng)桿菌懸液5分鐘。在具有1mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)感染的煙草外植體48小時，然后轉(zhuǎn)移至含有100mg/L卡那霉素和1mg/L 6-BA的MS選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30天，選擇轉(zhuǎn)化的莖(卡那霉素抗性莖)。從愈傷組織上切下轉(zhuǎn)化莖，在含有50-100mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上生根。將轉(zhuǎn)化的煙草植物轉(zhuǎn)移至溫室土壤中生長至成熟。
用子葉和下胚軸作為外植體進(jìn)行棉花轉(zhuǎn)化。棉花種子用70％乙醇表面消毒30秒鐘，用10％H2O2表面消毒60分鐘，隨后用無菌水洗。這些種子在無菌水中于28℃保溫。過夜后，種子發(fā)芽。取出胚并置于IM培養(yǎng)基(1/2{MS(大量營養(yǎng)素，微量營養(yǎng)素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L}+phytogel2g/L pH＝6.4)上，于28℃保溫7天。棉花的子葉和下胚軸用作轉(zhuǎn)化外植體。在切成5mm2(mm)塊后，將外植體浸入根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA 4404懸液(OD600＝0.2-0.4)中15分鐘，然后將外植體置于CM培養(yǎng)基(MS(大量營養(yǎng)素，微量營養(yǎng)素，EDTA-Fe)+VB110mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L pH＝6.4)上于24℃培養(yǎng)2天。用液體MS培養(yǎng)基洗后，將外植體置于SM培養(yǎng)基(MS(大量營養(yǎng)素，微量營養(yǎng)素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB61mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L+卡那霉素50mg/L+Cefutoxime 200mg/L pH＝6.4)上在培養(yǎng)室中于光照下、28℃進(jìn)行選擇，每月傳代培養(yǎng)。在SM上傳代培養(yǎng)2-3個月后，從外植體誘導(dǎo)愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至DM培養(yǎng)基(MS(大量營養(yǎng)素，微量營養(yǎng)素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+KNO319g/L+MgCl20.7mg/L+葡萄糖30g/L++phytogel3g/L pH＝6.4)上，每月傳代培養(yǎng)。約5個月后，體細(xì)胞胚開始形成。在DM培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng)幼胚，直至它們發(fā)育成熟。將成熟胚轉(zhuǎn)移至GM培養(yǎng)基(1/2{MS(大量營養(yǎng)素，微量營養(yǎng)素，EDTA-Fe)+VB110mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L}+NAA 0.01mg/L+葡萄糖30g/L++phytogel 3.5g/L pH＝6.4)上，于盒中發(fā)育成小植物。然后將小植物移植到土壤中進(jìn)行植物生長，收集轉(zhuǎn)基因種子。
通過DNA Southern印跡雜交和GUS組織化學(xué)分析來分析具有嵌合CFTUB2啟動子/GUS基因(或35SGUS基因)的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花植物以及作為陰性對照的非轉(zhuǎn)化植物。用限制酶消化來自棉花和煙草葉的總基因組DNA，在瓊脂糖凝膠上分離，并經(jīng)毛細(xì)印跡轉(zhuǎn)移至Hybond-N尼龍膜上。DNA Southem印跡在68℃、ExpressHyb溶液(Clontech)中與隨機(jī)標(biāo)記(Promega Prime-a-Gene標(biāo)記系統(tǒng))制備的32P DNA探針雜交。雜交后，在68℃用0.1×SSC，0.5％SDS洗印跡30-60分鐘。在-70℃將32P標(biāo)記的尼龍膜曝光在X-光片上進(jìn)行放射自顯影。Southem印跡分析的結(jié)果證實(shí)CFTUB2啟動子/GUS基因整合進(jìn)煙草和棉花基因組中。總共獲得325個轉(zhuǎn)化的棉花植物，它們屬于31個轉(zhuǎn)化品系，將它們移植在土壤中生長至成熟。
根據(jù)Jefferson等(1987)所述的方案稍作修改在轉(zhuǎn)基因煙草和棉花植物中進(jìn)行GUS活性的組織化學(xué)分析。將植物的新鮮組織在由0.1M磷酸鈉(pH7.0)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mM亞鐵氰化鉀和0.5mM鐵氰化鉀及0.1％ X-gluc(Clontech)組成的X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)溶液中保溫過夜。染色的植物材料隨后通過依次用100％和70％乙醇清洗而洗清并固定，檢查樣品并直接或在顯微鏡下照相。與Northem印跡分析結(jié)果一致，在所研究的所有31個轉(zhuǎn)基因棉花植物中，由CFTUB2啟動子驅(qū)動的GUS基因在新生纖維中特異表達(dá)，但是在其它組織中不表達(dá)，而GUS活性在陽性對照棉花植物(35SGUS)的所有組織中均檢測到?？偣搏@得36個轉(zhuǎn)化的棉花植物，并將它們移植至土壤中生長成熟，所有植物均是僅在新生纖維中有可檢測水平的GUS活性，但在花器官如花藥、花瓣和萼片或在葉和根中沒有可檢測水平的GUS活性。類似地，發(fā)現(xiàn)在CFTUB2啟動子驅(qū)動下的GUS基因活性僅在所研究的所有15個轉(zhuǎn)基因煙草植物的種子中檢測到，提示CFTUB2啟動子活性在煙草中也是組織特異性的。這一結(jié)果與上述Northem印跡分析結(jié)果一起表明CFTUB2啟動子在棉花纖維中在轉(zhuǎn)錄水平控制基因特異性表達(dá)。
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序列表<110>蔡林李學(xué)寶程寧輝劉建偉<120>來自棉花的纖維特異性β-微管蛋白啟動子的分離和鑒定<130>2577-138<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1623<212>DNA<213>Arabidopsis sp.<400>1ggcacgagta tatttttcct ctccaatttt ccgtcacttt cccgagaaaa tgagagaaat 60ccttcacatc caaggtggcc aatgcggcaa tcagatagga gccaagttct gggaagtcgt 120atgtgccgaa catggcatcg attcaacggg tcgatatggt ggtgactcgg agctccagct 180tgagcgaatc aatgtttact acaacgaagc cagttgtggc cgttttgttc cccgcgcagt 240tttaatggat ctggaacccg gaaccatgga tagcgtaaga tccggtcctt acggacaaat 300tttccgaccc gataacttcg ttttcggaca gtccggtgcg ggaaacaatt gggctaaggg 360acattacact gaaggagcgg agcttatcga ttccgttctc gacgtggtta gaaaggaagc 420cgaaaattgc gattgcttgc aagggtttca ggtatgccat tctttgggaa gaagaacggg 480ttccggaatg ggaacgttgt tgatatcgaa gatacgagag gagtatccgg accgaatgat 540gcttacgttt tcggtgtttc catctcccaa ggtttctgat actgttgttg aaccttacaa 600cgcgacactc tcagttcatc agcttgtgga aaatgctgat gagtgtatgg ttcttgataa 660cgaagctctc tacgatatct gtttccgtac cctcaagctc actactccaa gttttggaga 720tctcaaccat ctaatttctg ccaccatgag tggtgtaaca tgctgccttc gcttccctgg 780tcagcttaac tcagatctcc gcaaacttgc tgtaaacctt attccattcc ctcgactaca 840tttcttcatg gtgggatttg cgcctctcac ctcacgcggt tcccaacagt acagagccct 900cactgtccct gaacttacac agcaaatgtg ggatgccaag aacatgatgt gtgcagctga 960tcctcgacac ggtcgatacc tcacagcatc agcggtcttc cgtgggaaga tgagcacgaa 1020agaggttgat gagcagatga tcaatgtgca aaacaagaac tcatcttact ttgttgaatg 1080gatcccgaac aatgtgaagt ccactgtttg tgacatccct ccaatcggct taaagatggc 1140atccacattt atcgggaact ctacttcaat ccaagagatg ttcaggaggg tgagtgaaca 1200attcactgcc atgttccgta ggaaagcttt cttgcattgg tatactggag aagggatgga 1260tgagatggag ttcacagaag cggagagtaa catgaatgac ttggtttctg agtaccaaca 1320ataccaggat gcaactgcag atgatgaaga gtacgaggaa gaggaggaat acgaggcaga 1380ggcttaaaat ctaatggaat aatttggatg tttttcgttg tgttttggat tgggcttgtg 1440gagtgtgttg atgcaatttc tcactgcctg tttttggtct ttggatcact gtattgttga 1500ttgtgtcgac tttagttttg tcctcacagc ttacggagta tatgttgttg tattgcttgt 1560tgattcatct tataagtaat ttctagtaca ccttaagtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620aaa 1623<210>2<211>1433<212>DNA<213>Arabidopsis sp.<400>2actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtgctt gatatctatg attttcagat 60ttgcataaga cttctatcta tcagaagacg cctgcagagg atcccaaatt agtctaaaat 120tatcttcagt ctcggaaacc aactcaggac ccaaaacccg tcgctcaccc aactcagtct 180aatataacag agtatgacac ttatgaccat atagagcctc gtaaggtgcc atctagatgc 240cagattggaa actgttattg taggcgaact caactaacgg taaaaaatcc tctcaactac 300cttagtaata aatcacatag ctccaaatcg tatcctctag tatatgaatc accttctcaa 360attgaccatc ggtctgagga tggaatgcag accggtgcca ccgatttact aatggtacct 420ataaaaaatt attatttttt aaaaaattga tgtgaccagt ggttggagag agaggtctac 480cgattggtca agtggcacca attttttatt ttacctcctg cctagattcg taaatactat 540tgcatttatc tcatttcatt atttatttaa ttattttata ttatttggat aaaaattcta 600atactttact tttttttaaa aagaatttat ttaattattt tatattattt agataaaaat 660tctaatactt tacttttttt ttaaaaagaa tttcaattgc gttttttctt aatttagttt 720taattctata ctaattataa aaattctgat cggattagtg tggtgtcaaa gtcaagtcac 780atgaattttg ttggagaaaa aataaaaatt aaacacattt ttcgattaat ttattatata 840tataataata taaacacatt tttatttaat gttgtcaata atatttttta attaaaattt 900cagcacaaca attacactct catcattaaa tttaatctta ttaccataat taaaattgtg 960aggacaatta ttttttaatc tcaccctcca ttaatgcata ttattaattt ttgttcgata 1020cttcttattt cactcctaac attaatcatt aacccaattt tgaactgtta taatttctta 1080acttattcac tattgtggct ctgggtccat ctggaaaggc caccgtccag gctgtccaac 1140cacactttgc cacgtcatca attccagtaa ctacattgtt acagttacta agcaaatccc 1200aatttcaaaa attcaatttc ccaggaaaac gaaacgtccg ttactaaccg acctaaaacc 1260cagctcaacc tgccgtcaat taacggaaat cttttaactc ctctatataa cccaaaacca 1320ctctcatcac catttcccca taaaaagaat ttccggaatt cttattcctt ttatattttt 1380cctctccaat ttcccgtcac tttccggaga aaatgagaga aatccttcac atc143權(quán)利要求
1.棉花纖維特異性啟動子，包括棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的啟動子。
2.棉花纖維特異性啟動子，包括棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的啟動子的1433bp片段，其具有SEQ ID NO2所示序列。
3.棉花纖維特異性啟動子，包括棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的啟動子的984bp片段，其具有SEQ ID NO2的核苷酸449-1433的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉花β一微管蛋白基因CFTUB2及其活性片段。這些啟動子顯示出強(qiáng)纖維特異性活性。
文檔編號C07K14/415GK1382215SQ00813724
公開日2002年11月27日 申請日期2000年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月1日
發(fā)明者蔡林, 李學(xué)寶, 程寧輝, 劉建偉 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院