專利名稱：制備二肽的方法以及該方法的中間產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備下式1的二肽的方法， 其中G是一個保護(hù)基，而N保護(hù)性L-亮氨酸在一種活化劑存在下與L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合。
WO-A-96/11209公開的方法中N-(1，1-二甲基乙氧基)羰基-L-亮氨酸與L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合。
該已知方法的缺點(diǎn)是使用昂貴的保護(hù)基團(tuán)，因此從商業(yè)的觀點(diǎn)來看，此方法缺少吸引力。本發(fā)明提供一種具有商業(yè)價值的方法，用于制備在制備例如WO-A-96/11209介紹的藥物中的上述中間產(chǎn)物。
按照本發(fā)明應(yīng)用甲?；鞅Ｗo(hù)基來實(shí)現(xiàn)此目的。
涉及兩個氨基酸偶合的二肽偶合是通常的已知方法，并且在文獻(xiàn)中有詳細(xì)說明。在這些偶合中，最終的N端氨基酸的活化酸基團(tuán)與最終的C端氨基酸或氨基酸衍生物的氨基反應(yīng)。本方法中最終的N端氨基酸的氨基基團(tuán)借助于保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。
本發(fā)明的方法中，兩種富含對映異構(gòu)體的氨基酸進(jìn)行偶合。富含對映異構(gòu)體的氨基酸的對映體過量優(yōu)選大于80％，尤其優(yōu)選大于90％，更特別優(yōu)選大于98％。眾所周知，氨基酸偶合時N端氨基酸可能產(chǎn)生外消旋作用。當(dāng)使用甲?；Ｗo(hù)基時尤其如此，例如thehandbooks Houben-Weyl，Band 15/1(1974)，第166頁以及在ThePeptides，Academic Press 1979，第1卷，第279頁中介紹的那樣。因此，人們不將甲酰基保護(hù)基團(tuán)用于富含對映異構(gòu)體的氨基酸偶合。目前，申請人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)按照本發(fā)明用甲?；鞅Ｗo(hù)基團(tuán)進(jìn)行偶合時，不發(fā)生外消旋或只有很低程度的外消旋。此外，申請人發(fā)現(xiàn)，假如發(fā)生外消旋作用，根據(jù)本發(fā)明的偶合產(chǎn)物尤其適合通過結(jié)晶富集需要的非對映形。
本發(fā)明方法的另一優(yōu)勢是在所述方法中可以使用廉價活化劑。
本發(fā)明方法中使用的N-甲?；?L-亮氨酸可以用已知方法制備，舉例來說使L-亮氨酸與甲酸以及例如一種酸酐接觸制備。優(yōu)選使用醋酸酐。
L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的制備舉例來說能夠由L-叔亮氨酸如下制備L-叔亮氨酸和光氣轉(zhuǎn)換成L-叔亮氨酸-N-羧基酐，再用N-甲胺將它轉(zhuǎn)換成L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。
在本發(fā)明方法中使用一種活化劑和一種堿活化N-甲?；?L-亮氨酸，活化劑優(yōu)選具有空間位阻的?；然蚵燃姿嵬轷?。這種活化步驟為眾所周知的方法并且在肽偶合中經(jīng)常應(yīng)用。因此，選用的堿優(yōu)選為所述活化步驟中使用的、外消旋程度低的已知堿。作為堿優(yōu)選使用N-甲基嗎啉。
進(jìn)行活化的溫度不是非常重要，實(shí)踐中通常為-30℃至+30℃，優(yōu)選-20℃至+10℃。
如果需要，在溶劑中進(jìn)行活化，優(yōu)選在反應(yīng)混合物中呈惰性的溶劑。酯性溶劑實(shí)例有酯類，尤其是醋酸乙酯、醋酸異丙酯和醋酸異丁酯；醚類，尤其是四氫呋喃(THF)、甲基-叔-丁基醚(MTBE)以及二氧雜環(huán)己烷；腈類，尤其是乙腈。
在一個實(shí)施方案中，首先進(jìn)行活化，然后進(jìn)行偶合步驟。對于偶合，使活化的N-甲?；?L-亮氨酸與L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺接觸。優(yōu)選使用L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺溶液。
原則上，偶合反應(yīng)溫度與活化作用溫度保持一致。優(yōu)選偶合溫度與活化溫度大致相同。L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的合適溶劑的實(shí)例有醇類，尤其是甲醇、乙醇以及異丙醇；酯類，尤其是醋酸乙酯、醋酸異丙酯以及醋酸異丁酯；醚類，尤其是THF、MTBE和二氧雜環(huán)己烷。
另一方面，也可以采用一步法進(jìn)行活化以及偶合反應(yīng)，其中N-甲酰基-亮氨酸、L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺以及所述堿溶解于上述的合適溶劑中，并將所述活化劑加入該溶液。
然后，合成的N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺可以用通常的已知方法去甲?；缭谒嵝原h(huán)境中。去甲?；梢岳缭谒原h(huán)境、水/醇混合物或兩相體系中進(jìn)行。
進(jìn)行去甲酰的溫度例如為20℃-110℃，優(yōu)選40℃-80℃。如果需要，例如通過結(jié)晶可以純化合成的N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺或L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，肽偶合發(fā)生外消旋的情況下，結(jié)晶可增加保護(hù)或未保護(hù)的二肽中的N端氨基酸的對映體過量。
可用于結(jié)晶的合適溶劑的實(shí)例有烴類，尤其是庚烷和己烷；酯類，尤其是醋酸異丙酯、醋酸異丁酯和醋酸乙酯；醚類，尤其是MTBE；醇類，尤其是甲醇、乙醇、異丙醇以及丁醇；或者它們的混合物。合適的溶劑混合物實(shí)例為庚烷和醋酸異丙酯的混合物。
進(jìn)行結(jié)晶的溫度并不特別重要，主要取決于所選溶劑的物理參數(shù)，尤其是沸點(diǎn)。實(shí)踐中，通常在20℃-100℃之間進(jìn)行結(jié)晶。
根據(jù)肽偶合的具體實(shí)施方案，例如通過萃取或結(jié)晶分離獲得的中間產(chǎn)物N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺可能是有利的。
獲得的L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺可用于例如制備藥物，例如WO-A-96/11209和WO-A-97/12902介紹的N-(α-任選取代的巰基羧基)-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。舉例來說，α-任選取代的巰基羧基是式R1S-C(R2)-C(O)-的基團(tuán)，其中R1是氫或R3CO，其中R3是C1-4烷基、(C1-4烷基)芳基、(C1-6烷基)雜芳基、C3-6環(huán)烷基、(C3-6環(huán)烷基)C1-4烷基、C2-6鏈烯基、(C2-6鏈烯基)芳基、芳基或雜芳基；R2是H或C1-4烷基-C(O)-A-或C1-4烷基-NH-C(O)-A基團(tuán)，其中A是 p和q分別獨(dú)立為0或1R4＝H或C1-6烷基(各R4彼此獨(dú)立)Y和Z各自獨(dú)立為H或(C0-4烷基)R5，其中R5是NHR4、N(R4)2(R4彼此獨(dú)立)、COOR4、CONHR4、NHCO2R4、NHSO2R4或NHCOR4以及W是O、S(O)m，m＝0、1或2，或者為NR6R6＝H、C1-4烷基、COR7、CO2R7、CONHR7或SO2R7R7＝H、C1-4烷基、芳基、雜芳基、(C1-4烷基)芳基或(C1-4烷基)雜芳基R和S分別獨(dú)立為CH或N。
這些化合物可以用已知方法制備，例如活化取代或非取代的α-巰基羧酸，然后使用經(jīng)典肽偶合方法將它與據(jù)本發(fā)明獲得的二肽L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合，見WO-A-96/11209和WO-A-97/12902介紹。
現(xiàn)在以實(shí)施例為基礎(chǔ)闡明本發(fā)明，當(dāng)然本發(fā)明并不僅限于此。
實(shí)施例I由N-甲?；?L-亮氨酸和L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制備N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺在-18℃的氮環(huán)境中，將氯甲酸異丁基酯(6.5g，48mmol)加入N-甲酰基-L-亮氨酸(8.0g，50mmol)的四氫呋喃(125ml)溶液中。然后將N-甲基嗎啉(4.8g，48mmol)滴加入溶液，控制滴加速度使溶液溫度保持＜-15℃。形成沉淀物。
持續(xù)攪拌15min后，加入L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺(6.5g，45mmol)的四氫呋喃(50ml)溶液，加入時保持溶液溫度＜-15℃。隨后在-18℃下持續(xù)攪拌1小時。
使反應(yīng)混合物加熱到0℃并在此溫度下加入水(100g)。然后在真空下蒸餾除去THF。加入醋酸異丙酯(75ml)，然后用鹽酸將反應(yīng)混合物的pH值調(diào)至1.5。分層后，分別用50和35ml的醋酸異丙酯萃取水溶液相兩次。然后用50和25ml的飽和碳酸氫鈉溶液洗滌收集的有機(jī)相，最后用25ml水洗滌。然后在真空下蒸發(fā)有機(jī)相。
以良好產(chǎn)率獲得了N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，對映體過量(L-亮氨酸部分)為99％(HPLC)。
實(shí)施例II由N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制備L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺11.7g(41mmol)的N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺(見實(shí)施例I)懸浮于1M HCl(100ml)中并加熱到40℃。在此溫度下攪拌18小時后(所有的原料都溶解入溶液中)，冷卻到室溫，然后用50ml的醋酸異丙酯萃取。
分層后，用50％的氫氧化鈉溶液將水相的pH值調(diào)至10。用醋酸異丙酯(75ml)萃取兩次。收集的有機(jī)相在真空下蒸發(fā)。
將殘留物懸浮于庚烷(75ml)中并加熱到65℃。然后加入恰好使所有原料溶解的醋酸異丙酯量。通過冷卻到室溫結(jié)晶并過濾后，用庚烷(25ml)洗滌結(jié)晶物兩次然后干燥。以良好產(chǎn)率獲得了L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，純度＝＞98％(HPLC)對映體過量(L-亮氨酸部分)＝99％(HPLC)。
實(shí)施例III由N-甲?；?L-亮氨酸和L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制備N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺在-15℃的氮環(huán)境中，氯甲酸異丁基酯(12.3g，90mmol)配入到N-甲酰基-L-亮氨酸(15.9g，100mmol)的醋酸異丙酯(85ml)懸浮液中。然后將N-甲基嗎啉(9.1g，90mmol)的醋酸異丙酯(25ml)溶液滴加入懸浮液，滴加速度使溫度保持在＜-10℃。
在持續(xù)攪拌90分鐘后，形成的懸浮液加入到冷卻的L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺(13.0g，90mmol)的甲醇(65ml)溶液中，加入時溶液溫度保持＜-10℃。隨后在-10℃持續(xù)攪拌30分鐘。
將反應(yīng)混合物加熱到室溫并在此溫度下攪拌2小時。在反應(yīng)混合物中加入水(100ml)，然后用37％鹽酸水溶液將pH值調(diào)至1.0。分層后，水溶液相用75ml的醋酸異丙酯洗滌兩次。收集的有機(jī)相用100和50ml的飽和碳酸鈉溶液分別洗滌。
在真空下蒸發(fā)有機(jī)相。獲得N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的對映體過量(L-亮氨酸部分)為98％(HPLC)。
實(shí)施例IV由N-甲?；?L-亮氨酸和L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制備N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺按照實(shí)施例III所述制備，但是溫度變?yōu)?-5℃。獲得N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的對映體過量(L-亮氨酸部分)為86％(HPLC)。
實(shí)施例V由N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺制備L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺按照實(shí)施例II所述處理實(shí)施例IV獲得的物質(zhì)。獲得L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的對映體過量(L-亮氨酸部分)為95％(HPLC)。
權(quán)利要求
1.一種制備下式1的二肽的方法， 其中G為保護(hù)基，N保護(hù)性L-亮氨酸在活化劑存在下與L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺偶合，該方法的特征在于甲?；米鞅Ｗo(hù)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺的對映體過量大于98％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中N-甲?；?L-亮氨酸的對映體過量大于98％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)的方法，其中獲得的N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺接著進(jìn)行一次或多次結(jié)晶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)的方法，其中隨后將獲得的二肽去甲?；?。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中隨后將獲得的L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺進(jìn)行一次或多次結(jié)晶。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中隨后將所述L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺與取代或未取代的α-巰基羧酸偶合形成相應(yīng)的N-α-任選取代的巰基羧基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。
8.N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺。
9.N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，該二肽中的N端氨基酸的對映體過量大于80％。
10.N-甲酰基-L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，該二肽中的N端氨基酸的對映體過量大于98％。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，其非對映體過量大于80％。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺，其非對映體過量大于98％。
13.根據(jù)權(quán)利要求8-12任意一項(xiàng)的N-甲?；?L-亮氨酰-L-叔亮氨酸-N-甲基酰胺在制備藥物中的用途。
全文摘要
制備N－甲酰基－L－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺的方法,其中N－甲?；璍－亮氨酸與L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺在一種活化劑存在下偶合。優(yōu)選使用對映體過量大于98%的L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺和對映體過量大于98%的N－甲?；璍－亮氨酸。如果需要,將獲得的二肽接著去甲?；⒑铣傻腘－甲酰基－L－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺或L－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺進(jìn)一步進(jìn)行一次或多次結(jié)晶。本發(fā)明也涉及N－甲?；璍－亮氨酰－L－叔亮氨酸－N－甲基酰胺及其在制備藥物中的用途。
文檔編號C07K1/06GK1382155SQ00814737
公開日2002年11月27日 申請日期2000年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月27日
發(fā)明者W·H·J·貝斯藤, Q·B·布羅克斯特曼, M·J·M·普勞姆 申請人:Dsm有限公司