專利名稱：：對鱗翅目昆蟲有活性的蘇云金芽孢桿菌δ內(nèi)毒素組合物及其使用方法1.0發(fā)明背景1.1發(fā)明領域本發(fā)明總體上涉及分子生物學領域。更具體地講，某些實施方案涉及含有來自細菌的DNA片段和蛋白的方法和組合物。更具體地講，本發(fā)明涉及來自蘇云金芽孢桿菌的編碼鱗翅目毒性結(jié)晶蛋白的新型基因。披露了用于制備和使用上述DNA片段、編碼合成修飾過的Cry蛋白的DNA片段、以及天然和合成結(jié)晶蛋白的各種方法，例如，用DNA片段作為診斷探針和蛋白生產(chǎn)的模板，并將蛋白、融合蛋白載體和肽用于各種免疫學和診斷應用中。還披露了制備、利用核酸片段開發(fā)含有本文所披露的DNA片段的轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法。1.2相關技術的說明幾乎所有的大田作用、植物、和商品化種植區(qū)都容易受到一種或多種昆蟲蟲害的侵襲。危害特別大的是鞘翅目和鱗翅目害蟲。例如，蔬菜和蕓薹作物，如洋薊、大頭菜、arugula、韭、蘆筍、扁豆、菜豆、萵苣(例如，頭、葉、長葉萵苣)、甜菜、大白菜、黃體芋薯、花莖甘藍、瓜類(例如，甜瓜、西瓜、crenshaw、密瓜、哈密瓜)、抱子甘藍、甘藍、cardoni、胡蘿卜、napa、花椰菜、秋葵、洋蔥、芹菜、歐芹、鷹嘴豆、歐洲防風、菊苣、豌豆、大白菜、胡椒、芥藍、馬鈴薯、黃瓜、南瓜、葫蘆、紅蘿卜、干球洋蔥、蕪菁甘藍、茄子、婆羅門參、沙拉菜、冬蔥、菊苣、大豆、大蒜、菠菜、葉用蔥、西葫蘆、生菜、甜菜、甘薯、蘿卜、牛皮菜、辣根、番茄、無頭甘藍、蘿卜和各種香料作物對下列一種或多種害蟲的侵害敏感苜蓿尺蠖、粘蟲、甜菜粘蟲、洋薊羽蛾、菜青蟲、甘藍尺蠖、菜螟、玉米穗蟲、芹菜食葉蟲、橫條菜青蟲、歐洲玉米鉆心蟲、菜蛾、綠色三葉草蟲、進口菜青蟲、甜瓜野螟、雜食性卷葉蟲、泡菜蟲、樹皮蟲復合體、鹽堿地毛蟲、大豆尺蠖、煙草蚜蟲、番茄果蟲、番茄天蛾、番茄蟯蟲、絨毛豆毛蟲、和黃條粘蟲。類似地，諸如苜蓿、牧草和青貯飼料的牧草作物通常會受到如下害蟲的侵害粘蟲、牛肉粘蟲、苜蓿毛蟲、歐洲叩頭蟲、多種尺蠖和網(wǎng)蟲，以及黃條粘蟲。果樹類和藤本作物，如蘋果、杏、櫻桃、油桃、桃、梨、李、梅、榅桲、杏仁、栗樹、榛樹、美洲山核桃、阿月渾子樹、核桃、柑橘、黑刺莓、藍莓、草莓、蔓越橘、紅醋栗、羅干莓、懸鉤子、草莓、葡萄、萼梨、香蕉、獼猴桃、柿子、石榴、菠蘿、熱帶水果，通常容易受到以下害蟲的侵害并落葉瘦果天蛾、卷蛾、粘蟲、柑橘夜蛾、香蕉叩頭蟲、黑頭火蟲、藍莓卷葉蟲、尺蠖、草莓果蟲、柑橘夜蛾、蔓越橘環(huán)切蟲、東方天幕毛蟲、美國白鵝、美國白蛾、歐洲榛卷葉蟲、歐洲榛網(wǎng)蟲、果樹卷葉蟲、葡萄卷葉蛾、葡萄卷葉蟲、葡萄葉食葉蟲、綠色果蟲、gummosos-batrachedracommosae、舞毒蛾、山核桃剝殼蟲、天蛾、尺蠖、臍橙蟲、斜條卷葉蟲、雜食性卷葉蟲、雜食性尺蠖、橙卷葉蛾、食橙蟲、東方果蛾、流行卷葉蟲、桃小食心蟲、山核桃鞘蛾、斜條卷葉蟲、紅色卷曲毛蟲、糙皮切根蟲、鹽堿地毛蟲、尺蠖、天幕毛蟲、thecla-theclabasillides、煙草蚜蟲、卷葉蛾、叢生蘋果芽蛾、雜色卷葉蟲、胡桃毛蟲、Western天幕毛蟲、和黃條粘蟲。大田作物，如歐洲油菜/油菜籽油菜、月見草、meadowfoam、玉米(大田玉米、甜玉米、爆裂玉米)、棉花、蛇麻、西蒙得木、花生、水稻、紅花、小型谷物(大麥、燕麥、黑麥、小麥等)、高粱、大豆、向日葵、和煙草通常是以下昆蟲的侵害對象，包括粘蟲、亞洲及其他玉米鉆心蟲、條紋向日葵蛾、甜菜粘蟲、棉鈴蟲、甘藍尺蠖、玉米切根蟲(包括Southern和Western變種)、棉葉鉆孔蟲、菜蛾、歐洲玉米鉆心蟲、綠色三葉草蟲、頭蛾、頭蟲、進口菜青蟲、尺蠖(包括Anacamptodesspp.)、斜條卷葉蟲、雜食性野螟、豆莢蟲、豆莢蟲、鹽堿地毛蟲、西南玉米鉆心蟲、大豆尺蠖、斑點切根蟲、向日葵蛾、煙草蚜蟲、煙草天蛾、絨毛豆毛蟲?；▔参?、花、觀賞植物、蔬菜和盆栽植物通常會受到以下害蟲的采食，如粘蟲、杜鵑花蛾、甜菜粘蟲、菜蛾、天蛾、佛州蕨葉蛾、玉米天蠶蟲、尺蠖、夾竹桃蛾、雜食性卷葉蟲、雜食性尺蠖和煙草蚜蟲。林木、果樹、觀賞植物、和長堅果的樹木以及灌木和其他苗木通常容易受到各種昆蟲的侵害，如袋蛾、黑頭蚜蟲、褐尾蛾、加州橡樹蟲、冷杉毒蛾、榆尺蠖、美國白蛾、果樹卷葉蟲、綠條槭樹蟲、舞毒蛾、短葉松卷蛾、含羞草網(wǎng)蟲、松樹蝴蝶、紅色卷曲毛蟲、鞍背刺蛾、鞍形天社蛾、春秋星尺蠖、云杉蚜蟲、天幕毛蟲、卷葉蛾和西方毒蛾。類似的，草坪草通常會受到諸如粘蟲、草地網(wǎng)蟲和熱帶草地網(wǎng)蟲的侵害。由于具有商業(yè)價值的作物通常是昆蟲侵害的目標，因此在很多場合下都需要對環(huán)境敏感的控制或根除昆蟲侵害的方法。對于農(nóng)場主、育苗人、種植業(yè)者和尋求利用不損害生態(tài)的組合物控制昆蟲群體的商業(yè)區(qū)和居民區(qū)來說尤其如此。近年來所開發(fā)出的應用最廣泛的對環(huán)境敏感的殺蟲制劑已經(jīng)包含了來自蘇云金芽孢桿菌的微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌，它能產(chǎn)生專門對某些綱和種的昆蟲有毒性的結(jié)晶蛋白和包含體。業(yè)已證實蘇云金芽孢桿菌的很多不同的菌株能產(chǎn)生殺蟲性結(jié)晶蛋白。含有能產(chǎn)生殺蟲蛋白的蘇云金芽孢桿菌的組合物業(yè)已商業(yè)化，并被用作環(huán)境可以接受的殺蟲劑，因為這種組合物對特定的目標昆蟲有很高的毒性，但對植物和其他非目標生物沒有危害。1.2.1蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白δ內(nèi)毒素δ內(nèi)毒素被用于控制多種食葉毛蟲和甲蟲以及蚊子。這些蛋白類伴胞晶體又被稱作殺蟲結(jié)晶蛋白、結(jié)晶蛋白、Bt包含體、結(jié)晶包含體、包含體、和Bt毒素，它們是由蘇云金芽孢桿菌所產(chǎn)生的一大類殺蟲蛋白，這些蛋白在易感的昆蟲宿主采食后具有毒性。在過去幾十年里，對蘇云金芽孢桿菌毒素的結(jié)構(gòu)和功能的研究已經(jīng)包括了所有主要類型的毒素，盡管這些毒素在特定結(jié)構(gòu)和功能方面存在差別，但總結(jié)了結(jié)構(gòu)和功能方面的一般相似性。根據(jù)所積累的有關蘇云金芽孢桿菌毒素的知識，業(yè)已建立了蘇云金毒素起作用的一般化模式，并且包括被昆蟲采食、溶解在昆蟲胃腸中部(胃和小腸的組合)，對消化酶的抗性，有時部分消化作用實際上會“激活”該毒素，與胃腸中部的細胞結(jié)合，在昆蟲細胞上形成一個孔并破壞細胞內(nèi)部平衡(English和Slatin，1992)。蘇云金芽孢桿菌的一個獨特特征是在孢子形成期間產(chǎn)生結(jié)晶蛋白，這種蛋白專門對某些綱和種的昆蟲有毒性。業(yè)已證實很多不同的蘇云金芽孢桿菌菌株能產(chǎn)生殺蟲結(jié)晶蛋白。含有能產(chǎn)生對鱗翅目和雙翅目昆蟲具有殺蟲活性蛋白的蘇云金芽孢桿菌菌株的組合物業(yè)已被商業(yè)化，并被用作環(huán)境可以接受的殺蟲劑，因為該組合物對特定的目標昆蟲有很強的毒性，但對植物和其他非目標生物無害。在過去10年業(yè)已對蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白的殺蟲活性機制作了深入研究。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，所述結(jié)晶蛋白只是在該蛋白被昆蟲采食之后才對昆蟲有毒性。昆蟲胃腸中部的堿性pH和蛋白水解酶將所述蛋白溶解，因此可以釋放出對該昆蟲有毒性的成分。這些有毒成分破壞了胃腸中部的細胞，導致昆蟲停止進食，并最終使昆蟲死亡。因此，業(yè)已證實了蘇云金芽孢桿菌在對付各種昆蟲蟲害方面是一種有效的并且對環(huán)境無害的殺蟲劑。正如Hofte和Whiteliey所指出的(1989)，大多數(shù)殺蟲性蘇云金芽孢桿菌菌株對鱗翅目的昆蟲，即毛蟲類昆蟲有活性。而其他蘇云金芽孢桿菌菌株對雙翅目昆蟲，即蒼蠅和蚊子具有殺蟲活性，或者同時對鱗翅目和雙翅目有殺蟲活性。近年來，業(yè)已報導了少數(shù)幾種蘇云金芽孢桿菌菌株能產(chǎn)生對鞘翅目昆蟲，即甲蟲有毒性的結(jié)晶蛋白(Krieg等，1983；Sick等，1990；Donovan等，1992；Lambert等，1992a；1992b)。1.2.2編碼結(jié)晶蛋白的基因很多δ內(nèi)毒素在其氨基酸序列的相似性方面以不同的程度相關。傳統(tǒng)上，所述蛋白以及編碼這些蛋白的基因主要是根據(jù)其殺蟲活性的范圍分類的。Hofte和Whiteley的綜述(1989)討論了1990年以前在蘇云金芽孢桿菌中鑒定的基因和蛋白，并提供了傳統(tǒng)上被用于蘇云金芽孢桿菌基因和蛋白命名和分類的方案。cryI基因編碼鱗翅目毒性CryI蛋白。cryII基因編碼對鱗翅目和雙翅目昆蟲有毒性的CryII蛋白。cryIII基因編碼鞘翅目毒性CryIII蛋白，而cryIV基因編碼雙翅目毒性CryIV蛋白。根據(jù)序列相似性的程度，可將所述蛋白進一步分成亞類；為每一類里關系更密切的蛋白確定分類字符，如CryIA、CryIB、CryIC等。并賦予每一小類里關系更密切的蛋白以下名稱，如CryIC1、CryIC2等。最近，提出了一種新的命名法，該方法根據(jù)氨基酸序列同源性對Cry蛋白進行分類，而不是根據(jù)昆蟲定向?qū)Ｒ恍苑诸?Crickmore等，1998)。包括單一蛋白的等位變異在內(nèi)的許多已知毒素的分類方法歸納在以下網(wǎng)站中并定期更新http//www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/。最近一次更新的信息是1999年4月27日的信息，將該信息收作本文參考。1.2.3對鱗翅目有毒的結(jié)晶蛋白2.0發(fā)明概述由Schnepf等最近所作的綜述(1998)披露了源于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲結(jié)晶蛋白的多樣性。Cry1、Cry2和Cry9類型的Cry蛋白以其對鱗翅目幼蟲的毒性而著名，不過，毒性的程度根據(jù)目標鱗翅目害蟲而有很大不同(Hofte和Whiteley，1989)。例如，Cry1Ac對粘蟲、海岸夜蛾具有很弱的毒性，但對煙草蚜蟲、煙芽夜蛾具有很強毒性。另外，在一種類型Cry蛋白內(nèi)的氨基酸序列的微小的差別會對殺蟲活性產(chǎn)生很大影響(參見Schnepf等，1998，收作本文參考)。例如，Cry3Ba和Cry3Bb基因具有94％的氨基酸序列相同性，但僅有Cry3Bb對南方玉米切根蟲、十一星瓜葉甲具有明顯的毒性(Donovan等，1992)。類似的，Cry2Aa和Cry2Ab具有87％的氨基酸序列相同性，但僅有Cry2Aa對蚊子具有毒性(Widner和Whiteley，1990)。VonTersch等(1991)證實Cry1Ac蛋白僅在7個氨基酸上有差別(序列相同性大于99％)，但在殺蟲活性方面表現(xiàn)出顯著的差異。據(jù)Lee等(1996)報導，僅在2個氨基酸位點上有差別的Cry1Ab等位基因在對舞毒蛾的毒性方面表現(xiàn)出有10倍的差別。因此，即使被認為是已知Cry蛋白的等位產(chǎn)物或者屬于Cry蛋白亞類的Cry蛋白(Crickmore等，1998)，也可能具有獨特的和有用的殺蟲特性。國際專利申請?zhí)朩O98/00546和WO98/40490披露了從蘇云金芽孢桿菌中獲得的多種Cry1-、Cry2-和Cry9-相關的結(jié)晶蛋白。2.1CryDNA片段本發(fā)明涉及核酸片段，該核酸片段實際上可以從任何來源分離，它不含總的基因組DNA，并且編碼本文所披露的新型肽。編碼所述多肽的核酸片段可以編碼活性蛋白、一種或多種結(jié)晶蛋白的肽或多肽片段、多肽亞基、功能性結(jié)構(gòu)域等。另外，本發(fā)明包括可以用本領域技術人員所公知的方法完全在體外合成的核酸片段，該片段編碼本文所披露的新型Cry多肽、肽、肽片段、亞基、或功能性結(jié)構(gòu)域。在本文中，術語“核酸片段”是指分離的不含特定物種的總的基因組DNA的多核苷酸分子。因此，編碼一種內(nèi)毒素多肽的核酸片段是指這樣一種核酸片段，它包括一種或多種從獲得該核酸片段的物種的總的基因組DNA中分離的或純化的結(jié)晶蛋白編碼序列，在本發(fā)明中，它是革蘭氏陽性細菌屬芽孢桿菌屬的基因組，特別是被稱為蘇云金芽孢桿菌的芽孢桿菌。術語“核酸片段”包括多核苷酸片段和所述片段的更小的片段，以及重組載體，包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、噬菌體、和病毒等。類似地，含有分離的或純化的結(jié)晶蛋白編碼基因的DNA片段是指這樣的DNA片段，它除了肽編碼序列之外還包括其他因子，如基本上從其他天然存在的基因或蛋白編碼序列分離出的調(diào)控序列。就此而言，術語“基因”被用于簡單地表示功能性蛋白、多肽或肽編碼單位。正如本領域技術人員所了解的，該功能性術語包括基因組序列、操縱子序列和更小的工程化基因片段，它能表達或者協(xié)助表達蛋白、多肽或肽。另外，該術語包括含有至少一個可操作地連接于一個或多個蛋白編碼序列上的啟動子、可操作地連接于一個轉(zhuǎn)錄終止序列上的表達框?！盎旧蠌钠渌幋a序列分離出的”表示感興趣的基因(在本發(fā)明中是編碼全部或部分細菌殺蟲結(jié)晶蛋白的核酸片段或基因)構(gòu)成了該DNA片段的編碼區(qū)的主要部分，并且該DNA片段不含天然存在的編碼DNA的大部分，如大的染色體片段或其他功能性核酸片段或基因或操縱子編碼區(qū)。當然，它是指原始分離的DNA片段，并且不排除隨后由人工添加到該片段上的基因、重組基因、合成接頭、或編碼區(qū)。在具體實施方案中，本發(fā)明涉及含有編碼Cry肽的DNA序列的DNA片段和重組載體，在所述肽的氨基酸序列上包括大體上如以下序列所示的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63。例如，術語“大體上如SEQIDNO2、SEQIDNO4、或SEQIDNO6所示的序列”表示該序列基本上相當于SEQIDNO2、SEQIDNO4或SEQIDNO6的一部分，并且具有較少的氨基酸與這些序列中任一個的氨基酸序列不同或者在生物學功能方面相同。術語“生物學功能相同”為本領域所公知，并且在本文作進一步的定義(例如，說明性實施方案)。因此，與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63的氨基酸序列具有大約70％-80％，或者更優(yōu)選大約81、82、83、84、85、86、87、88、89或大約90％或更優(yōu)選91、92、93、94、95、96、97、98或大約99％的相同性或功能相同性的氨基酸序列就是“基本上與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63所示序列相同的”序列。另外，與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62的核酸序列具有大約70-80％，或者更優(yōu)選大約81、82、83、84、85、86、87、88、89或大約90％，更優(yōu)選91、92、93、94、95、96、97、98或大約99％的相同性或功能相同性的核酸序列就是“基本上與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62所示序列相同的”序列。還應當理解的是，氨基酸和核酸序列可以包括其他殘基，如其他N-或C-末端氨基酸或5’或3’序列，并且仍然基本上與本文所披露的序列之一相同，只要這些序列符合上文所提供的標準，包括保持蛋白的生物學活性，其中涉及到蛋白的表達。例如，末端序列的添加，特別是添加到核酸序列上的末端序列包括位于編碼區(qū)的5’或3’部分旁側(cè)的非編碼序列，或者可以包括各種內(nèi)部序列，即內(nèi)含子，已知它存在于基因內(nèi)部。無論編碼序列本身的長度如何，本發(fā)明的核酸片段都可以與諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、添加的限制酶位點、多克隆位點、和其他編碼片段等的其他DNA序列組合，因此其總長度可以有很大不同。因此，可以認為幾乎可以采用任何長度的核酸片段，其總長度優(yōu)選受制備的方便性和在預期的重組DNA方案中的應用的限制。例如，可以制備包括一個短的連續(xù)片段的核酸片段，所述短的連續(xù)片段編碼披露于SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63中的任何一種肽序列，或者該DNA片段與編碼披露于SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63中的任一種肽的DNA序列相同或互補，特別是披露于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62中的DNA片段。例如，還可以使用長度為大約18個核苷酸的DNA序列，以及長度達到大約10000、大約5000、大約3000、大約2000、大約1000、大約500、大約200、大約100、大約50、以及大約14個堿基對(包括所有中間長度)的DNA序列?？梢岳斫獾氖?，在本發(fā)明中“中間長度”表示所引用范圍內(nèi)的任何長度，如18、19、20、21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括大約200-500；500-1000；1000-2000；2000-3000；3000-5000范圍內(nèi)的所有整數(shù)；以及包括高達大約1000核苷酸的序列等?？梢岳斫獾氖?，本發(fā)明不局限于編碼本發(fā)明的肽或者編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63的氨基酸序列的特定核酸序列，包括具體披露于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62中的DNA序列。因此重組載體和分離的DNA片段可以各有不同地包括肽編碼區(qū)本身、在其基本編碼區(qū)上具有經(jīng)由選擇的改變或修飾的編碼區(qū)、或者它可以編碼較大的多肽，不過，它包括所述肽編碼區(qū)或可以編碼具有不同氨基酸序列的生物學功能等同的蛋白或肽。本發(fā)明的DNA片段包括生物學功能等同的肽。所述序列可能是由密碼子簡并性和功能等同性所產(chǎn)生的，已知這些現(xiàn)象在氨基酸序列以及由它所編碼的蛋白內(nèi)自然發(fā)生。另外，可以通過采用重組DNA技術產(chǎn)生功能性等同蛋白或肽，其中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可以根據(jù)對被改變的氨基酸特性的考慮而進行工程改造?？梢酝ㄟ^采用定向誘變技術導入人工設計的改變，例如，導入對蛋白免疫原性或測試變體的改進，以便在分子水平上檢測活性。如果需要，人們可以制備融合蛋白和肽，例如，其中，所述肽編碼區(qū)與具有所需功能的其他蛋白或肽的編碼區(qū)處在相同的表達單位內(nèi)，以便于純化或免疫檢測目的(例如，分別為可以通過親和層析純化的蛋白和酶標記編碼區(qū))。重組載體構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。特別有用的載體是這樣的載體，所述DNA片段的編碼部分受一個啟動子的控制，該部分要么編碼完整長度的蛋白要么編碼較小的肽。所述啟動子可以是與編碼本發(fā)明的肽的基因天然結(jié)合的啟動子的形式，例如，利用重組克隆和/或PCRTM技術并結(jié)合本文所披露的組合物通過分離位于所述編碼片段或外顯子上游的5’非編碼序列而獲得。2.2用CryDNA片段作為雜交探針和引物除了其用于指導本發(fā)明的結(jié)晶蛋白或肽表達之外，本發(fā)明所涉及的核酸序列還具有多種其他用途。例如，在核酸雜交實施方案中，還可將其用作探針或引物。這樣，可以設想這樣的核酸片段具有特殊用途，該片段包括由至少14個核苷酸長度的連續(xù)序列所組成的序列，該序列與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62的14個核苷酸長度連續(xù)DNA片段相同或互補。較長的連續(xù)的相同或互補序列，例如，編碼每一種多肽的大約20、30、40、50、100、200、500、1000、2000、5000bp等的序列(包括所有中間長度以及達到并包括完整長度基因序列)也可用于某些實施方案中。所述核酸探針與結(jié)晶蛋白編碼序列專一性雜交的能力使其能夠用于檢測互補序列在特定樣品中的存在。不過，還涉及其他用途，包括將所述序列信息用于制備突變型引物，或用于制備其他基因構(gòu)建物的引物。具有與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62的DNA序列相同或互補的由大約14-17或18-25、26-35、36-50或達到并包括大約100-200個核苷酸序列的連續(xù)核苷酸片段組成的序列區(qū)的核酸分子特別適合作為雜交探針，用于諸如Southern和Northern印跡。較小的片段通常可用于雜交實施方案中，其中，所述連續(xù)互補區(qū)的長度可以變化，如在大約10-14和大約100-200個核苷酸之間變動，不過根據(jù)希望檢測的互補序列的長度可以使用更大的連續(xù)互補性片段。當然，可以通過其他技術獲得片段，例如機械剪切或通過限制酶消化。例如，小的核酸片段可以通過化學方式直接合成該片段而方便地制備，該方法通常是使用自動化寡核苷酸合成儀實現(xiàn)的。另外，還可以通過采用核酸再生技術獲得片段，如US4683195和4683202中所披露的PCRTM技術(這兩份文獻分別被收作本文參考)，將特定的序列導入重組載體中進行重組生產(chǎn)，以及通過分子生物學領域的技術人員所公知的其他重組DNA技術獲得。因此，可以利用本發(fā)明核苷酸序列的能力與互補的DNA片段選擇性地形成雙鏈體分子。根據(jù)所設計的用途，人們可能希望采用不同的雜交條件來獲得探針對靶序列的不同程度的選擇性。如果應用需要較高的選擇性，人們通常需要采用相對嚴格的條件來形成雜合體，例如，人們需要選擇較低的鹽和/或高溫條件，如由大約0.02-0.15M氯化鈉在大約50-70℃下所提供的條件。這種選擇條件能容許在探針和模板或靶鏈之間有很少的錯配(如果有的話)，并且特別適用于分離結(jié)晶蛋白編碼DNA片段。通過雜交檢測DNA片段為本領域技術人員所公知，并且US4965188和5176995(分別被收作本文參考)中被披露的內(nèi)容可以作為雜交分析方法的典范。特別涉及披露于下列文獻中的內(nèi)容Maloy等，1990；Maloy，1994；Segal，1976；Prokop，1991；和Kuby，1991。當然，對于某些用途來說，例如，當人們希望利用與潛在的模板雜交的突變引物鏈制備突變體時或當人們試圖從相關物種中分離結(jié)晶蛋白編碼序列或功能性等同物時，通常需要較低嚴格的雜交條件，以便能夠形成異源雙鏈體。在這種場合下，人們需要采用諸如大約0.15-0.9M鹽和大約20-55℃溫度的條件。因此，根據(jù)相對對照雜交的陽性雜交信號可以方便地鑒定交叉雜交物種。在任何情況下，通?？梢岳斫獾氖?，通過增加甲酰胺的用量可以使條件變得更嚴格，甲酰胺能以與提高溫度相同的方式使雜交的雙鏈體去穩(wěn)定化。因此，雜交條件可以方便地加以操縱，并因此成為根據(jù)需要的結(jié)果而選擇的常用方法。在某些實施方案中，將本發(fā)明的核酸序列與諸如標記物的合適的裝置組合用于測定雜交是有利的。有多種合適的標記方法為本領域所公知，包括熒光素、放射性元素、酶促活性或其他配體，如能產(chǎn)生可檢測信號的親和素/生物素。在優(yōu)選實施方案中，人們有可能希望使用熒光素標記或酶標記，如脲酶或堿性磷酸酶或過氧化物酶，而不是使用放射性元素或其他對環(huán)境有害的試劑。對于酶標記來說，已知比色指示底物可用于提供人肉眼或分光光度計可見的形式，以便確定與含有互補核酸的樣品的專一性雜交。一般，希望本文所披露的雜交探針即可用作溶液雜交的試劑，又可以在采用固相的實施方案中使用。在涉及固相的實施方案中，將測試DNA(或RNA)吸附或以其他方式固定在特定基質(zhì)或表面上。然后在需要的條件下應用特定探針與所述固定的單鏈核酸進行專一性雜交。所述特定條件取決于以所需要特定標準為基礎的特定環(huán)境(例如，取決于G+C含量，靶核酸的類型、核酸的來源、雜交探針的大小等)。在洗滌雜交表面以便除去未專一性結(jié)合的探針分子之后，通過標記方法檢測專一性雜交甚至是定量。2.3重組表達Cry多肽的載體和方法在其他實施方案中，希望通過將所述編碼DNA片段置于重組或異源啟動子的控制之后而獲得某些優(yōu)點。在本文中，重組或異源啟動子是指在正常情況下不與天然環(huán)境中的編碼結(jié)晶蛋白或肽的DNA片段結(jié)合的啟動子。所述啟動子可以包括正常情況下與其他基因結(jié)合的啟動子和/或從任何細菌、病毒、真核細胞或植物細胞中分離的啟動子。當然，重要的是使用能有效指導所述DNA片段在被選擇用于表達的類型的細胞、生物或動物體內(nèi)表達的啟動子。將啟動子和細胞類型組合用于蛋白表達為分子生物領域的技術人員所公知，例如，參見Sambrook等，1989。所使用的啟動子可以是組成型的或誘導型的，并可以在合適的條件下使用，指導導入DNA片段的高水平表達，這在大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白或肽時是有優(yōu)勢的?？捎糜诟咚奖磉_的合適的啟動子系統(tǒng)包括，但不限于畢赤酵母屬載體表達系統(tǒng)(PharmaciaLKB生物技術)。在制備重組蛋白和肽的表達實施方案中，最常用的是較長的DNA片段，以編碼完整肽序列的DNA片段為最佳。不過，可以理解的是，使用較段的DNA片段指導結(jié)晶肽或表位核心區(qū)的表達，如用于制備抗結(jié)晶蛋白抗體也屬于本發(fā)明的范疇。特別有用的是編碼長度大約為8-大約50個氨基酸，更優(yōu)選大約8-大約30個氨基酸，更優(yōu)選大約8-大約20個氨基酸的肽抗原的DNA片段。所述肽表位可以是這樣的氨基酸序列，它包括來自SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63的連續(xù)氨基酸序列。2.4cry轉(zhuǎn)基因和表達Cry多肽的轉(zhuǎn)基因植物在另一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物能表達編碼本發(fā)明的新型肽和內(nèi)毒素的核酸片段。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法為本領域所公知。一般，該方法包括用含有可操作地連接于編碼區(qū)上的啟動子的DNA片段轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞，所述編碼區(qū)編碼CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽中的一種或多種。所述編碼區(qū)通?？刹僮鞯剡B接于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)上，因此，所述啟動子能夠在所述細胞中啟動該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄，并因此賦予該細胞在體內(nèi)生產(chǎn)所述多肽的能力。另外，在希望控制、調(diào)節(jié)、或降低特定重組結(jié)晶蛋白在特定轉(zhuǎn)基因細胞中的表達量的場合下，本發(fā)明還提供了表達結(jié)晶蛋白反義mRNA。用反義mRNA作為控制或降低細胞中感興趣的特定蛋白的量的手段為本領域所公知。本發(fā)明的另一方面包括能表達編碼本文所披露的一種或多種新型多肽組合物的基因或基因片段的轉(zhuǎn)基因植物。在本文中，術語“轉(zhuǎn)基因植物”是指整合了DNA序列的植物，該序列包括，但不限于正常情況下可能不存在的基因，正常情況下不會轉(zhuǎn)錄成RNA或翻譯成蛋白(表達的)的DNA序列，或人們希望導入非轉(zhuǎn)化植物的任何其他基因或DNA序列，如正常情況下存在于非轉(zhuǎn)化植物中的基因，但人們希望對它進行遺傳工程改造或改變其表達。可以預料的是，在某些場合下，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的細胞核或細胞質(zhì)基因組或這兩者業(yè)已通過穩(wěn)定導入cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83轉(zhuǎn)基因中的一種或多種而得到增大，這些轉(zhuǎn)基因是天然的、合成修飾的或突變的。在某些場合下，會將一個以上的轉(zhuǎn)基因整合到所述轉(zhuǎn)化宿主植物細胞的一個或多個基因組中。當將一種結(jié)晶蛋白編碼DNA片段整合到所述植物的基因組中時就是這種情況。在某些場合下，可能需要整合一種、兩種、三種、四種或更多種蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白(天然的或重組工程的)并在轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中穩(wěn)定地表達。例如，可以導入的優(yōu)選基因包括來自細菌的結(jié)晶蛋白編碼DNA序列，特別是本文所披露的從芽孢桿菌中獲得的一種或多種序列。高度優(yōu)選的核酸序列是從蘇云金芽孢桿菌中獲得的，或者對這些序列中的任一種進行過遺傳工程修飾，以便降低或提高該結(jié)晶蛋白在所述轉(zhuǎn)化宿主細胞中的殺蟲活性。轉(zhuǎn)化植物細胞和制備轉(zhuǎn)基因細胞系的方法為本領域所熟知，并且在本文中加以討論。當然，用于轉(zhuǎn)化所述細胞的載體、質(zhì)粒、粘粒、YACs(酵母人工染色體)和DNA片段一般包括本發(fā)明的操縱子、基因、或基因衍生的序列，該序列是天然的或合成產(chǎn)生的，特別是編碼本文所披露的結(jié)晶蛋白的序列。所述DNA結(jié)構(gòu)還可以包括諸如啟動子、增強子、多接頭的結(jié)構(gòu)，甚至是對所需要的感興趣的特定基因具有正向或負向調(diào)節(jié)活性的基因序列。所述DNA片段或基因可以編碼天然或修飾過的結(jié)晶蛋白，它們可以在所得到的重組細胞中表達，和/或能賦予再生的植物改進了的表型。通過將編碼對鱗翅目昆蟲有毒性的CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽的一種或多種轉(zhuǎn)基因DNA片段整合到所述轉(zhuǎn)基因植物中，這樣的轉(zhuǎn)基因植物有可能提高單子葉或雙子葉植物的殺蟲劑抗性。特別優(yōu)選的植物包括草坪草、木棉、高粱、棉花、玉米、大豆、燕麥、黑麥、小麥、亞麻、煙草、水稻、番茄、馬鈴薯、或其他蔬菜、觀賞植物和果樹等。在一個相關方面，本發(fā)明還包括按照上述方法生產(chǎn)的由所述轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的種子、所述種子的后代，以及由原始轉(zhuǎn)基因植物的后代所產(chǎn)生的種子。所述后代和種子在其基因組中穩(wěn)定地整合了結(jié)晶蛋白編碼轉(zhuǎn)基因，所述后代植物以孟德爾形式繼承了由導入穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因所產(chǎn)生的性狀。在其基因組中整合了編碼CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83結(jié)晶蛋白或多肽的一種或多種的轉(zhuǎn)基因DNA片段的所有轉(zhuǎn)基因植物都是本發(fā)明的方面。正如本領域技術人員所公知的，植物的后代被理解為表示來自該植物的任何后代或任何后裔，但在本發(fā)明中它表示還含有所述轉(zhuǎn)基因的任何后代或任何后裔。2.5位點專一誘變位點專一誘變是通過對特定的DNA進行專一性誘變，用于制備特殊的肽、或生物學功能等同蛋白或肽的技術。該技術還提供了一種制備或測試序列變體的方便的手段，例如，通過在DNA中導入一個或多個核苷酸序列變化整合一種或多種上述特征。位點專一誘變技術為本領域所熟知，并且在各種文獻中有所說明。一般，本發(fā)明的定向誘變是這樣進行的，首先獲得單鏈載體或?qū)㈦p鏈載體的兩條鏈熔化分離，所述載體的序列中包括編碼所需肽的DNA序列。制備具有所需突變序列的寡核苷酸引物，通常是合成制備。然后讓該引物與所述單鏈載體退火，并用諸如大腸桿菌聚合酶IKlenow的DNA聚合酶進行處理，以便完成具有突變的鏈的合成。因此，形成一種異源雙鏈體，其中，一股鏈編碼原有的非突變序列，而第二股鏈具有所需要的突變。然后用該異源雙鏈體載體轉(zhuǎn)化合適的細胞，如大腸桿菌細胞，并篩選包括具有突變的序列結(jié)構(gòu)的重組載體的克隆。用定向誘變所制備的內(nèi)毒素編碼核酸片段的序列變體提供了一種生產(chǎn)潛在有用的物種的方法，而且并不意味著局限其它可以獲得肽的序列變體和編碼它的DNA序列的方法。例如，編碼所需要的肽序列的重組載體可以用諸如羥基胺的誘變劑進行處理，以便獲得序列變體。2.6抗體組合物及其制備方法在特定實施方案中，本發(fā)明人試圖利用能結(jié)合本文所披露的一種或多種多肽的抗體，包括單克隆抗體或多克隆抗體。制備和鑒定抗體的方法為本領域所公知(例如，Harlow和Lane，1988；收作本文參考)。單克隆抗體可以利用眾所周知的技術方便地制備；如在美國專利4196265中所披露的技術，該文獻被收作本文參考。2.7ELISAs和免疫沉淀ELISAs可用于與本發(fā)明組合?，F(xiàn)有用于進行ELISAs的多種不同方法。這些方法為本領域技術人員所熟知?；綞LISA方法的例子可以從任何標準分子生物學實驗手冊中查閱到(例如，Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis著，分子克隆實驗室手冊，冷泉港，NY冷泉港實驗室，1989)。2.8Western印跡本發(fā)明的組合物在免疫吸印或Western印跡分析中具有很大用途。實現(xiàn)免疫吸印和Western印跡分析的方法為本領域技術人員所公知(參見Sambrook等，同上)。用于與Western印跡組合的以免疫學為基礎的檢測方法包括抗所述毒素部分的酶促、放射性標記、或熒光標記的二級抗體，它被認為在這一方面是特別有用的。2.9結(jié)晶蛋白篩選和檢測試劑盒本發(fā)明涉及用于篩選被懷疑含有結(jié)晶蛋白多肽或與結(jié)晶蛋白相關的多肽或產(chǎn)生多肽細胞的樣品的方法和試劑盒。一種試劑盒可以含有本發(fā)明的一種或多種抗體，并且還可以含有用于檢測樣品和本發(fā)明抗體之間的相互作用的試劑。所提供的試劑可以是放射性、熒光或酶標記過的，或者是表位或配體標記過的。該試劑盒可以含有一種能夠與本發(fā)明的核酸或抗體結(jié)合或相關作用的已知的放射性標記試劑。所述試劑盒的試劑可以是液體溶液，與固體支持物結(jié)合或作為干粉。當所述試劑是以液體溶液形式提供的時，該液體溶液優(yōu)選是水溶液。當所述試劑是以與固體支持物結(jié)合形式提供的時，該固體支持物優(yōu)選可以是層析介質(zhì)、具有多個孔的實驗平板或顯微鏡載玻片。當所述試劑是以干粉形式提供時，所述干粉可以通過添加所提供的合適的溶劑進行重建。在另一種實施方案中，本發(fā)明涉及免疫檢測方法和相關的試劑盒。建議將本發(fā)明的結(jié)晶蛋白或肽用于檢測能與它起反應的抗體，或者按照本發(fā)明方法制備的抗體，可將其用于檢測結(jié)晶蛋白或含有與結(jié)晶蛋白相關的表位的肽。一般，所述方法包括首先獲得被懷疑含有所述蛋白、肽或抗體的樣品，在能有效形成免疫復合物的條件下讓所述樣品與本發(fā)明的抗體或肽接觸，然后檢測該免疫復合物的存在。一般，免疫復合物形成的檢測為本領域所公知，并且可以通過采用多種方法實現(xiàn)。例如，本發(fā)明涉及應用ELISA、RIA、免疫吸印(例如，斑點吸印)，或間接免疫熒光技術等。正如本領域所公知的，通過使用二級結(jié)合配體，如二級抗體或生物素/親和素配體結(jié)合結(jié)構(gòu)可以獲得額外的優(yōu)勢。對于測定用途來說，可以采用需要檢測的任何被懷疑含有結(jié)晶蛋白或肽或與結(jié)晶蛋白相關的肽或抗體的樣品。預計，所述實施方案可用于滴定抗原或抗體樣品，和用于篩選雜交瘤等。在相關實施方案中，本發(fā)明涉及可用于檢測樣品中結(jié)晶蛋白或相關肽和/或抗體的存在的試劑盒的制備。樣品可以包括被懷疑含有結(jié)晶蛋白或肽的細胞、細胞上清液、細胞懸浮液、細胞提取物、酶部分、蛋白提取物或其他無細胞組合物。一般而言，本發(fā)明的試劑盒包括一種合適的結(jié)晶蛋白、肽或針對所述蛋白或肽的抗體，以及免疫檢測試劑和用于容納所述抗體或抗原和試劑的裝置。所述免疫檢測試劑通常包括與所述抗體或抗原結(jié)合或與二級結(jié)合配體結(jié)合的標記。典型的配體可以包括具有結(jié)合的標記的針對第一種抗體的二級抗體或抗原或生物素或親和素(或鏈霉親和素)，當然，正如上文所指出的，有多種典型的標記物為本領域所公知，并且所有這樣的標記都可用于本發(fā)明中。所述容器通常包括可將所述抗體、抗原或檢測試劑放入其中的小瓶，并優(yōu)選進行過合適的分裝。本發(fā)明的試劑盒通常還包括用于將抗體、抗原和試劑容器容納在一個密封的裝置中進行商業(yè)銷售的裝置。所述容器可以包括可將需要的小瓶裝入其中的注塑或吹塑而成的塑料容器。2.10表位核心序列本發(fā)明還涉及不含完整細胞和其他肽的蛋白或肽組合物，該組合物包括一種純化的蛋白或肽，這種蛋白或肽具有能與一種或多種抗結(jié)晶蛋白抗體發(fā)生免疫交叉反應的表位。具體地講，本發(fā)明涉及源于Cry蛋白或肽的抗原核心序列。在本文中，術語“具有能與一種或多種抗結(jié)晶蛋白抗體發(fā)生免疫交叉反應的表位”是指一種肽或蛋白抗原，它包括與位于結(jié)晶蛋白或多肽上的表位相似的一級、二級或三級結(jié)構(gòu)。相似性水平通常達到這樣的程度，使得針對所述結(jié)晶蛋白或多肽的單克隆或多克隆抗體能夠與所述交叉反應性肽或蛋白抗原結(jié)合、起反應或者能夠識別該抗原?？蓪⒏鞣N免疫測定方法用于所述抗體，例如，Western印跡、ELISA、和RIA等。所有這些方法為本領域技術人員所公知。適用于疫苗中的Cry免疫決定表位和/或其功能等同物的鑒定是比較簡單的事情(例如，US4554101；Jameson和Wolf，1988；Wolf等，1988；US4554101)。然后可以通過采用肽合成或重組技術將所述“表位核心序列”的氨基酸序列方便地整合到肽上。用于本發(fā)明中的優(yōu)選的肽通常其長度為大約8-大約20個氨基酸，更優(yōu)選大約8-15個氨基酸。通過制備包括修飾過的和/或延伸的表位/免疫原性核心序列的合成肽可以實現(xiàn)本發(fā)明的特殊優(yōu)點，這樣會產(chǎn)生針對結(jié)晶蛋白的“通用”表位肽，特別是CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83和相關序列。這些表位核心序列在本發(fā)明的特定方面被確定為特定多肽抗原的親水區(qū)。還可將計算化的肽序列分析程序(例如，DNAStar軟件，DNAStar公司，Madison，WI)用于設計本發(fā)明所披露的合成肽。使用諸如固相方法的常規(guī)合成技術(例如，通過使用商業(yè)化的肽合成儀，如應用生物系統(tǒng)430A型肽合成儀)可以方便地實現(xiàn)在其序列上包括一個抗原表位的表位序列或肽的合成。2.11生物學功能等同物可以對本發(fā)明的肽和編碼這些肽的DNA片段的結(jié)構(gòu)進行修飾和改變，但仍然能獲得編碼具有所需特征的蛋白或肽的功能性分子。下面討論基于對蛋白的氨基酸進行改變，以便產(chǎn)生一種等同、甚至是改善了的第二代分子。在本發(fā)明的特定實施方案中，希望突變的結(jié)晶蛋白可用于提高該蛋白的殺蟲活性，并因此提高重組轉(zhuǎn)基因在植物細胞中的殺蟲活性和/或表達。氨基酸的改變可以通過按照表1所給出的密碼子改變DNA序列的密碼而實現(xiàn)。表1氨基酸密碼子內(nèi)氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸IleIAUAAUCAUU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUCCUGCUU甲硫氨酸MetMAUG天冬酰胺AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCACCCCCGCCU谷氨酰胺GlnQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU例如可以用某些氨基酸取代一種蛋白結(jié)構(gòu)上的其他氨基酸，而不會明顯損失與諸如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點的相互結(jié)合能力。由于正是蛋白的相互作用能力和性質(zhì)決定了蛋白的生物學功能活性，可以對蛋白序列進行某些氨基酸序列取代，并對其潛在的DNA編碼序列進行取代，但仍然能獲得具有類似特性的蛋白。因此，本發(fā)明人希望可以對所披露的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應的DNA序列進行各種改變，但不會明顯損失其生物學用途或活性。在進行所述改變時，要考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水性氨基酸指數(shù)在賦予一種蛋白相互作用生物學功能方面的重要性為本領域所公知(Kyte和Doolittle，1982，被收作本文參考)。人們認為氨基酸的相對親水特征決定了所得到的蛋白的二級結(jié)構(gòu)，而二級結(jié)構(gòu)又決定了該蛋白與其他分子，例如，酶、底物、受體、DNA、抗體和抗原等的相互作用。根據(jù)氨基酸的疏水性和電荷特征給每一種氨基酸確定了親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)，它們是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本領域眾所周知的是，某些氨基酸可以被具有類似親水指數(shù)或得分的其他氨基酸所取代，但仍然能得到具有類似生物學活性的蛋白，即仍然能獲得生物學功能等同蛋白。在進行這種改變時，優(yōu)選取代親水指數(shù)在±2范圍內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選在±1范圍內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選在±0.5范圍內(nèi)的氨基酸。本領域還了解的是，類似氨基酸的取代可以根據(jù)親水性有效進行。被收作本文參考的US4554101指出由其相鄰氨基酸的親水性所決定的蛋白的最大局部平均親水性與該蛋白的生物學特性相關。正如在US4554101中所披露的，氨基酸殘基具有以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。眾所周知的是，氨基酸可以被具有類似親水性值的其他氨基酸所取代，但仍然能獲得生物學等同物，具體地講，獲得一種免疫學等同蛋白。在這種改變中，優(yōu)選取代其親水性值在±2范圍內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選±1范圍內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選在±0.5范圍內(nèi)的氨基酸。因此，如上文所述，氨基酸取代通常是取決于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如，其疏水性、親水性、電荷和大小等?？紤]到了上述各種特征的典型的取代為本領域技術人員所熟知，并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。2.12殺蟲組合物及其使用方法本發(fā)明人希望本文所披露的結(jié)晶蛋白組合物能特別用作對大田作用、牧草、果樹和蔬菜以及觀賞植物局部和/或系統(tǒng)使用的殺蟲劑。在一種優(yōu)選實施方案中，生物殺蟲組合物包括細菌細胞中油性可流動的懸浮液，所述細菌細胞能表達本文所披露的新型結(jié)晶蛋白。所述細胞優(yōu)選是蘇云金芽孢桿菌NRRLB-21921、NRRLB-21922、NRRLB-21923、NRRLB-21924、NRRLB-21925、NRRLB-21926、NRRLB-21927、NRRLB-21928、NRRLB-21929、NRRLB-21930、NRRLB-21931、NRRLB-21932、NRRLB-21933、NRRLB-21934、NRRLB-21935、NRRLB-21936、NRRLB-21937、NRRLB-21938、NRRLB-21939、NRRLB-21940、NRRLB-21941、NRRLB-21942、NRRLB-21943、NRRLB-21944。不過，能表達本文所披露的新型核酸片段并產(chǎn)生結(jié)晶蛋白的任何這樣的細菌宿主細胞都可以使用，如蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或假單胞菌。在另一個重要實施方案中，所述生物殺蟲組合物含有一種水可分散的顆粒。該顆粒含有能表達本文所披露的新型結(jié)晶蛋白的細菌細胞。優(yōu)選的細菌細胞是蘇云金芽孢桿菌NRRLB-21921、NRRLB-21922、NRRLB-21923、NRRLB-21924、NRRLB-21925、NRRLB-21926、NRRLB-21927、NRRLB-21928、NRRLB-21929、NRRLB-21930、NRRLB-21931、NRRLB-21932、NRRLB-21933、NRRLB-21934、NRRLB-21935、NRRLB-21936、NRRLB-21937、NRRLB-21938、NRRLB-21939、NRRLB-21940、NRRLB-21941、NRRLB-21942、NRRLB-21943、NRRLB-21944，不過，預計用本文所披露的DNA片段轉(zhuǎn)化過的并且能表達所述結(jié)晶蛋白的細菌，如蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或假單胞菌也可以使用。在第三種重要實施方案中，所述生物殺蟲組合物含有一種可濕性粉、塵、顆粒、或膠體濃縮物。該粉含有能表達本文所披露的新型結(jié)晶蛋白的細菌細胞。優(yōu)選的細菌細胞是蘇云金芽孢桿菌NRRLB-21921、NRRLB-21922、NRRLB-21923、NRRLB-21924、NRRLB-21925、NRRLB-21926、NRRLB-21927、NRRLB-21928、NRRLB-21929、NRRLB-21930、NRRLB-21931、NRRLB-21932、NRRLB-21933、NRRLB-21934、NRRLB-21935、NRRLB-21936、NRRLB-21937、NRRLB-21938、NRRLB-21939、NRRLB-21940、NRRLB-21941、NRRLB-21942、NRRLB-21943、NRRLB-21944細胞，不過，預計用本文所披露的DNA片段轉(zhuǎn)化過的并且能表達所述結(jié)晶蛋白的細菌，如蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌或假單胞菌也可以使用?？蓪⑦@種干燥形式的殺蟲復合體制成在濕潤后能馬上溶解的，或者以控制釋放、緩釋、或其他時間決定形式的溶解。在第四個重要實施方案中，所述殺蟲組合物含有一種細菌細胞的水懸浮液，如上述能表達結(jié)晶蛋白的細胞。所述水懸浮液可以濃縮母液的形式提供，該母液在使用之前稀釋，或者以能直接使用的稀釋過的溶液形式提供。對于這些涉及應用細菌細胞的方法來說，含有結(jié)晶蛋白基因的細胞宿主可以在任何常用營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，其中，所述DNA結(jié)構(gòu)提供了一種選擇優(yōu)點，提供一種選擇培養(yǎng)基，以便基本上所有或所有細胞都具有該蘇云金芽孢桿菌基因。然后可以根據(jù)常規(guī)方法收獲這些細胞。另外，可以在收獲之前對細胞進行處理。當所述殺蟲組合物含有完整的能表達感興趣蛋白的蘇云金芽孢桿菌細胞時，可以用多種方法配制這種細菌?？梢酝ㄟ^與各種稀釋劑、惰性材料，如無機礦物質(zhì)(葉硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、和磷酸鹽等)或植物材料(粉碎的玉米棒子芯、稻殼和核桃殼等)混合將其作為可濕性粉、顆?；驂m使用。該制劑可以包括分散-粘附佐劑、穩(wěn)定劑、其他殺蟲添加劑或表面活性劑。液體制劑可以是水基的或無水的并被用作泡沫、懸浮液、乳化濃縮液等。其成分可以包括流變劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑或聚合物。另外，所述新型殺蟲多肽可以通過天然或重組細菌表達系統(tǒng)在體外制備，并分離以便隨后在大田中應用。所述蛋白可以存在于粗制細胞裂解液、懸浮液、膠體等中，或者可以進行純化、精練、緩沖和/或進一步的加工，然后配制成活性殺生物制劑。類似的，在某些場合下，可能希望從能表達結(jié)晶蛋白的細菌培養(yǎng)物中分離結(jié)晶和/或孢子，并以所述結(jié)晶和/或孢子的溶液、懸浮液或膠體制劑作為活性生物殺昆蟲組合物使用。無論使用方法如何，所述活性成分都是以殺蟲有效的量使用，該有效量根據(jù)以下因素而變化，例如，要控制的特定鞘翅目昆蟲，要處理的特定植物或作物，環(huán)境條件，以及使用該殺蟲活性組合物的方法、比例和量。所披露的殺蟲組合物可以通過將細菌細胞、結(jié)晶和/或孢子懸浮液或分離的蛋白成分與需要的農(nóng)業(yè)上可以接受的載體配制在一起而制成。在以合適的方法使用之前，該組合物以諸如凍干、冷凍干燥、脫水形式制備，或者用含水載體、介質(zhì)或合適的稀釋劑，如鹽水或其他緩沖液制備。所制成的組合物可以是粉塵或顆粒材料形式，或者用油(植物油或礦物油)制成的懸浮液，或水或油/水乳液，或作為可濕性粉，或與任何其他適用于農(nóng)業(yè)用途的載體材料組合。合適的農(nóng)用載體可以是固體或液體，并且為本領域所公知。術語“農(nóng)業(yè)上可以接受的載體”包括所有佐劑、大腸桿菌、惰性成分、分散劑、表面活性劑、增粘劑、粘接劑等，這些成分通常被用于殺蟲制備技術中；并且為殺蟲制劑領域的技術人員所公知。所述制劑可以與一種或多種液體佐劑混合，并且通過各種方式制備，大腸桿菌，通過用常規(guī)制備技術將所述殺蟲組合物與合適的佐劑均勻混合、攪拌和/或研磨。本發(fā)明的殺蟲組合物被用于目標鱗翅目昆蟲的環(huán)境中，通常通過常規(guī)方法，噴灑在要保護的植物或作物的葉面上，優(yōu)選使用噴霧方法。殺蟲應用的強度和持續(xù)時間將根據(jù)要處理的特定害蟲、作物的具體條件以及特定的環(huán)境條件而確定。活性成分與載體的比例理所當然地取決于該殺蟲組合物的化學性質(zhì)、溶解度和穩(wěn)定性，以及所涉及到的特定制劑。其他應用技術包括噴粉、噴灑、浸泡、土壤注射、種子包衣、幼苗包衣、噴霧、煙霧、迷霧、和霧化等也是容易實施的，并且在某些場合下是必須的，例如，會導致根或莖侵害的昆蟲，或用于脆弱的蔬菜用植物或觀賞植物。這些應用方法同樣為本領域技術人員所公知。本發(fā)明的殺蟲組合物可以單獨或者與包括，但不限于其他殺蟲劑的其他化合物組合應用于本發(fā)明方法中。本發(fā)明方法還可用于其他處理劑組合，如表面活性劑、洗滌劑、聚合物或緩釋制劑。本發(fā)明的殺蟲組合物可以制成用于系統(tǒng)性或局部使用。用于環(huán)境、系統(tǒng)或葉面使用的殺蟲組合物的濃度可以根據(jù)特定制劑的性質(zhì)、使用方法、環(huán)境條件、和殺生物活性度而有很大的不同。通常，生物殺蟲組合物在應用制劑中的濃度至少占重量的大約1％，并且可以高達(包括)占重量的大約99％。所述多肽組合物的干燥制劑可以占該蛋白組合物重量的大約1-99％或更高，而液體制劑通常包括重量百分比大約為1-99％或更高的活性成分。含有完整細菌細胞的制劑通常含有大約104～107細胞/毫克。所述殺蟲制劑可以根據(jù)需要一次或多次應用于特定植物或目標區(qū)域上，每英畝的常見大田用量為大約50-500克活性成分，或者大約500-1000克活性成分，或者大約1000-5000克或更高活性成分。5.0說明性實施方案的說明5.1本發(fā)明的某些優(yōu)點將蘇云金芽孢桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因用于殺蟲蛋白的植物生產(chǎn)，并因此賦予重要的農(nóng)藝植物抗蟲性在美國和國外正迅速得到商業(yè)上的認可。對新的殺蟲性狀的需求不僅沒有減弱而是成功地形成了對植物中cry基因的操縱。例如，對抗蟲性發(fā)展?jié)摿Φ年P注使得迫切需要組裝一種殺蟲蛋白武器(即cry基因)，以便提供未來殺蟲特征所必需的遺傳材料。另外，能產(chǎn)生蘇云金芽孢桿菌Cry蛋白的轉(zhuǎn)基因植物仍然容易受到二次蟲害的損害，因此，有必要研究針對這些害蟲效力改善了的其他Cry蛋白。本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白是多種殺蟲蛋白的總稱，包括若干對鱗翅目菌落有毒性的殺蟲蛋白，所述菌落對特定類型的Cry1蛋白有抗性。對多種鱗翅目害蟲所作的生物分析證實，這些蛋白具有殺蟲活性，并且這些蛋白對多種目標昆蟲的效力有所不同。由所述毒素蛋白所引起的昆蟲譜系的變化表明作用的不同模式對于未來的抗蟲管理策略來說可能是重要的。本發(fā)明cry基因的植物表達，可以賦予該宿主植物抗蟲性，正如在來自蘇云金芽孢桿菌cry基因業(yè)已證實了的。5.2探針和引物在另一方面，本發(fā)明所提供的DNA序列信息可用于制備具有與本文所披露的特定多核苷酸的基因序列專一性雜交能力的較短的DNA(或RNA)序列。在這些方面，根據(jù)特定結(jié)晶蛋白基因序列制備了合適長度的核酸探針，例如，根據(jù)披露于SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62所示的序列。所述DNA和核酸探針與結(jié)晶蛋白編碼基因序列專一性雜交的能力使得它們特別適用于多種實施方案。最重要的是，所述探針可用于多種測定中，用于檢測特定樣品中互補序列的存在。在某些實施方案中，使用寡核苷酸引物是有利的。所述引物的序列是用本發(fā)明的多核苷酸設計的，用于通過PCRTM技術檢測、擴增或誘變源于蘇云金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白基因的特定片段。還可以用所述引物通過PCRTM擴增來自其他物種的相關結(jié)晶蛋白基因的片段。為了提供本發(fā)明的某些優(yōu)點，用于雜交研究或?qū)嶒灥膬?yōu)選核酸序列包括與結(jié)晶蛋白編碼序列互補的至少14-30個核苷酸序列，如在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62中所示序列。至少大約14個核苷酸的長度有助于確保該片段具有形成雙鏈體分子的足夠長度，它是穩(wěn)定的并且具有選擇性。通常優(yōu)選在長度上超過大約14個堿基的互補序列分子，以便提高雜合體的穩(wěn)定性和選擇性，并因此改進所獲得的特定雜交分子的質(zhì)量和程度。人們通常優(yōu)選設計具有大約14-大約20個核苷酸的基因互補片段的核酸分子，甚至需要更長的互補區(qū)。所述片段可以方便地制備，例如，通過化學方法直接合成該片段，采用核酸再生技術，如US4683195和4683202中所披露的PCRTM技術，以上專利被收作本文參考，或者從含有合適的插入片段和合適的限制位點的重組質(zhì)粒上切除特定的DNA片段。5.3表達載體本發(fā)明涉及包括本發(fā)明多核苷酸的表達載體。因此，在一種實施方案中，表達載體是包括可操作地連接于編碼本發(fā)明多肽的編碼區(qū)上的啟動子的分離、純化DNA分子，該編碼區(qū)可操作地連接于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)上，以便由所述啟動子啟動該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。在本文中，術語“可操作地連接”表示啟動子與編碼區(qū)的連接形式使得該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄受該啟動子的控制和調(diào)節(jié)。將啟動子可操作地連接于編碼區(qū)上的方法為本領域所公知。在一種優(yōu)選實施方案中，編碼本發(fā)明結(jié)晶蛋白的DNA重組表達優(yōu)選是在芽孢桿菌屬宿主細胞中進行的。優(yōu)選的宿主細胞包括蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和相關的芽孢桿菌，最優(yōu)選蘇云金芽孢桿菌屬的細胞。能在細菌中起作用的啟動子為本領域所公知，用于芽孢桿菌結(jié)晶蛋白的代表性和優(yōu)選啟動子包括已知結(jié)晶蛋白基因啟動子中的任一種，包括cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83基因啟動子。另外，還可以人工制備誘變的或重組結(jié)晶蛋白編碼基因啟動子，并用于促進本文所披露的新型基因片段的表達。在另一種實施方案中，編碼本發(fā)明結(jié)晶蛋白的DNA重組表達是用轉(zhuǎn)化過的革蘭氏陰性細菌進行的，如大腸桿菌或假單胞菌宿主細胞。能夠使目標多肽在大腸桿菌和其他革蘭氏陰性宿主細胞中高水平表達的啟動子在本領域中也是眾所周知的。當用本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化植物時，選擇在植物中具有啟動表達能力的啟動子。能在植物中起作用的啟動子在本領域中也是公知的。正如所披露的(Poszkowski等，1989；Odell等，1985)可用于在植物中表達所述多肽的啟動子是誘變型的、病毒的、合成的、組成型的，時序調(diào)控的、空間調(diào)控的和空間-時序調(diào)控的(Chau等，1989)。還要選擇啟動子指導轉(zhuǎn)化過的植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)的活性能力。結(jié)構(gòu)基因可以由植物組織中的多種啟動子啟動。啟動子可以是能影響雙子葉或單子葉植物的接近組成型的，如CaMV35S啟動子，或組織專一性或發(fā)育專一性的啟動子。當啟動子是諸如CaMV35S的接近組成型的啟動子時，在多種轉(zhuǎn)化過的植物組織中可以提高多肽的表達(例如，愈傷組織、葉片、種子和根)。另外，可以利用含有組織專一性啟動子的整合植物載體實現(xiàn)對特定植物組織轉(zhuǎn)化的指導。一種典型的組織專一性啟動子是凝集素啟動子，它對種子組織有專一性。大豆種子中的凝集素蛋白是由單一基因(Le1)編碼的，該基因僅在種子成熟期間表達，并且占總的種子mRNA的2-5％。業(yè)已全面鑒定了凝集素基因和種子專一性啟動子，并用于在轉(zhuǎn)基因煙草植物中指導種子專一性表達(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。將含有編碼感興趣多肽的編碼區(qū)的表達載體工程改造成受凝集素啟動子的控制，并利用諸如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法的方法將該載體導入植物(Dhir等，1991)。所述多肽的表達是專一性地在轉(zhuǎn)基因植物的種子中進行的。由組織專一性啟動子轉(zhuǎn)化過的植物細胞所產(chǎn)生的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物可以與由不同的組織專一性啟動子轉(zhuǎn)化過的植物細胞所產(chǎn)生的第二種轉(zhuǎn)基因植物進行雜交，以便產(chǎn)生在一種以上特定組織中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化效果的雜交轉(zhuǎn)基因植物。代表性組織專一性啟動子有玉米蔗糖合成酶1(Yang等，1990)，玉米醇脫氫酶1(Vogel等，1989)，玉米集光復合體(Simpson，1986)，玉米熱激蛋白(Odell等，1985)，豌豆小亞基RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)，Ti質(zhì)粒甘露氨酸合成酶(Langridge等，1989)，Ti質(zhì)粒胭脂氨酸合成酶(Langridge等，1989)，矮牽牛查爾酮異構(gòu)酶(VanTunen等，1988)，菜豆富甘氨酸蛋白1(Keller等，1989)，CaMV35S轉(zhuǎn)錄物(Odell等，1985)和馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)。優(yōu)選的啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子、S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子，水稻肌動蛋白啟動子、玉米組蛋白啟動子、融合的CaMV35S-擬南芥屬組蛋白啟動子、CaMV35S啟動子、CaMV19S啟動子、nos啟動子、Adh啟動子、肌動蛋白啟動子、組蛋白啟動子、核酮糖二磷酸羧化酶啟動子、R-等位啟動子、根細胞啟動子、α-微管蛋白啟動子、ABA-誘導型啟動子、膨脹誘導型啟動子、rbcS啟動子、玉米蔗糖合成酶1啟動子、玉米醇脫氫酶1啟動子、玉米集光復合體啟動子、玉米熱激蛋白啟動子、豌豆小亞基RuBP羧化酶啟動子、Ti質(zhì)粒甘露氨酸合成酶啟動子、Ti質(zhì)粒胭脂氨酸合成酶啟動子、矮牽牛查爾酮異構(gòu)酶啟動子、菜豆富甘氨酸蛋白1啟動子、CaMV35S轉(zhuǎn)錄物啟動子、馬鈴薯patatin啟動子、cab啟動子、PEP羧化酶啟動子和S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。選擇哪一種表達載體以及最終將一種多肽編碼區(qū)可操作地連接于哪一種啟動子上直接取決于所需要的功能特性，例如，蛋白表達的位點和時間，以及要轉(zhuǎn)化的宿主細胞。這些特征是構(gòu)建重組DNA分子領域所固有的公知局限性。不過，用于實施本發(fā)明的載體能夠指導可操作地與它連接的多肽編碼區(qū)的表達。用于在高等植物中基因表達的典型載體為本領域所公知，并且包括源于所披露的根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)。不過，已知若干其他的植物整合載體系統(tǒng)能夠在植物中起作用，包括所公開的pCaMVCN轉(zhuǎn)移控制載體(Fromm等，1985)。質(zhì)粒pCaMVCN(購自Pharmacia，Piscataway，NJ)包括花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子。在優(yōu)選實施方案中，用于表達所述多肽的載體包括能在植物細胞中起作用的選擇標記，優(yōu)選抗藥性選擇標記。一種優(yōu)選的抗藥性標記是這樣的基因，其表達會導致卡那霉素抗性；即含有所披露的胭脂氨酸合成酶啟動子，Tn5新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)和胭脂氨酸合成酶3’非翻譯區(qū)的嵌合基因(Rogers等，1988)。RNA聚合酶能通過發(fā)生聚腺苷酸化的位點轉(zhuǎn)錄編碼DNA序列。通常，位于聚腺苷酸化位點下游數(shù)百個堿基對處的DNA序列是轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。這些區(qū)是轉(zhuǎn)錄的mRNA有效聚腺苷酸化所必需的。制備表達載體的方法為本領域所公知。用于轉(zhuǎn)化植物的表達載體(轉(zhuǎn)化載體)和制備這種載體的方法披露于US4971908，4940835，4769061和4757011中，這些專利的內(nèi)容被收作本文參考?？梢詫λ鲚d體進行修飾，以使其含有本發(fā)明的編碼序列。業(yè)已開發(fā)了多種方法用于通過互補的粘性末端或平端將DNA可操作地連接到載體上。例如，可以將互補的均聚物尾添加到要插入的DNA片段上和載體DNA上。所述載體和DNA片段然后通過互補均聚物尾之間的親鍵結(jié)合在一起，形成重組DNA分子。編碼具有賦予一種細胞殺蟲活性的能力的多肽的編碼區(qū)優(yōu)選是CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽編碼基因。5.7新型多肽的命名本發(fā)明人將本發(fā)明的多肽隨意命名為CryET31、CryET40、CryET43、CryET44、CryET45、CryET46、CryET47、CryET49、CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83。類似地，還將編碼這些多肽的新型核酸序列分別隨意命名為cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83。根據(jù)結(jié)晶蛋白內(nèi)毒素的修訂過的命名法而對基因或蛋白命名的正式確定應該由蘇云金芽孢桿菌命名協(xié)會作出，成立該協(xié)會是為了對蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白進行系統(tǒng)分類。本發(fā)明人希望本發(fā)明所提供的隨意確定的命名能夠被官方命名機構(gòu)采納作為這些序列的名稱。5.8轉(zhuǎn)化過的宿主細胞和轉(zhuǎn)基因植物用含有結(jié)晶蛋白編碼基因片段的一種或多種表達載體轉(zhuǎn)化細菌、酵母細胞、植物細胞、或完整植株的方法和組合物是本發(fā)明的其他方面。由所述轉(zhuǎn)化方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因細菌、酵母細胞、植物細胞、或植物或由所述轉(zhuǎn)基因植物所產(chǎn)生的后代和種子也是本發(fā)明的進一步實施方案。轉(zhuǎn)化細菌和酵母細胞的方法為本領域所公知。通常，轉(zhuǎn)化方法與用于轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌或釀酒酵母的其他細菌或酵母的眾所周知的方法相似。對植物細胞進行DNA轉(zhuǎn)化的方法包括農(nóng)桿菌屬植物介導的轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、將基因轉(zhuǎn)入花粉、注射到生殖器官、注射到未成熟的胚胎和粒子轟擊。上述每一種方法各自具有獨特的優(yōu)點和不足。因此，將基因?qū)胍环N特定植物品系的特定方法對于其他植物品系來說并不一定最有效。但眾所周知的是，哪一種方法適用于特定的植物品系。有多種用于將轉(zhuǎn)化DNA片段導入細胞的方法，但并不是所有方法都適用于將DNA輸送到植物細胞中。據(jù)信，合適的方法實際上包括可將DNA導入細胞的任何方法，如通過農(nóng)桿菌屬感染、直接輸送DNA，例如通過PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993)，通過脫水/抑制介導的DNA攝取、通過電穿孔、通過用碳化硅纖維激發(fā)、通過對DNA包衣的顆粒進行加速等。在某些實施方案中，加速方法是優(yōu)選的，并且包括，例如，微粒轟擊等。用于將DNA導入細胞的技術為本領域技術人員所公知。業(yè)已披露了用于將基因?qū)爰毎乃姆N通用方法(1)化學方法(Graham和vanderEb，1973；Zatloukal等，1992；(2)物理方法，如顯微注射(Capecchi，1980)，電穿孔(Wong和Neumann等，1982；Fromm等，1985；US5384253)和基因槍(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受體介導的機制(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。5.8.3農(nóng)桿菌屬介導的轉(zhuǎn)移農(nóng)桿菌屬介導的轉(zhuǎn)移是普遍被應用于將基因?qū)胫参锛毎南到y(tǒng)，因為DNA可以導入完整的植物組織中，因此沒有必要由原生質(zhì)體再生完整的植株。利用農(nóng)桿菌屬介導的植物整合載體將DNA導入植物細胞為本領域所公知。例如，參見已經(jīng)公開的方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。另外，Ti-DNA的整合是一個比較精確的過程，只會產(chǎn)生很少的重組。要轉(zhuǎn)移的DNA區(qū)域是由其邊界序列確定的，通常將介入DNA插入植物基因組中，正如所披露的(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。正如所披露的，現(xiàn)代農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化載體能夠在大腸桿菌和農(nóng)桿菌屬中復制，可以進行方便地操作(Klee等，1985)。另外，農(nóng)桿菌屬介導的基因轉(zhuǎn)移載體上所取得的最新技術進展業(yè)已改善了該載體上基因和限制位點的排列，以便有利于構(gòu)建能夠表達多種多肽編碼基因的載體。所披露的載體(Rogers等，1987)具有常見的多接頭區(qū)，其旁側(cè)是啟動子和聚腺苷酸化位點，用于指導所插入的多肽編碼基因表達，這樣的載體適用于本發(fā)明的目的。另外，可將含有有臂和無臂Ti基因的農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化。在農(nóng)桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化有效的植物品系上，要選擇上述方法，因為基因轉(zhuǎn)移的方便性和特定性質(zhì)。對葉片和諸如子葉和下胚軸的其他組織所進行的農(nóng)桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化似乎局限于農(nóng)桿菌屬能天然感染的植物。農(nóng)桿菌屬介導的轉(zhuǎn)化在雙子葉植物中最有效。只有少數(shù)的單子葉植物似乎是農(nóng)桿菌屬的天然宿主，盡管正如所披露的，業(yè)已用農(nóng)桿菌屬載體在蘆筍上生產(chǎn)出了轉(zhuǎn)基因植物(Bytebier等，1987)。因此，在商業(yè)上重要的谷類作物，如水稻、玉米和小麥必須用其他方法轉(zhuǎn)化。不過，正如上文所提到的，蘆筍的轉(zhuǎn)化也可以用農(nóng)桿菌屬實現(xiàn)(例如，參見Bytebier等，1987)。用農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物通常在一個染色體上含有一個基因。所述轉(zhuǎn)基因植物可以被稱為在添加的基因上是雜合的。不過，因為術語“雜合的”通常被用于表示在一對染色體中的第二個染色體的相同基因座上存在一個互補基因，而在含有一個添加基因的植物中沒有這樣的基因，因此認為這種植物的更確切的名稱應當是獨立分離體，因為所添加的外源基因在有絲分裂和減數(shù)分裂期間會獨立地分離。更優(yōu)選的是在添加的結(jié)構(gòu)基因上純合的轉(zhuǎn)基因植物，即含有兩個添加的基因的轉(zhuǎn)基因植物，在染色體對的每一個染色體的相同基因座上存在一個基因。純合的轉(zhuǎn)基因植物可以通過下述步驟獲得，如對含有單一的添加基因的獨立分離的轉(zhuǎn)基因植物進行有性交配(自交)，讓某些所產(chǎn)生的種子發(fā)芽，并分析所產(chǎn)生的植株相對于對照(天然的非轉(zhuǎn)基因的)或獨立分離的轉(zhuǎn)基因植物而言，羧化酶活性增強?？梢岳斫獾氖?，可以讓兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物交配，以便產(chǎn)生含有兩個獨立分離的添加的外源基因的后代。合適后代的自交能夠產(chǎn)生在編碼感興趣的多肽的兩種所添加的外源基因上純合的植物。還可以與親本植物進行回交和與非轉(zhuǎn)基因植物進行異型雜交。植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化可以用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔、以及上述處理的組合的方法實現(xiàn)(例如，參見Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。上述系統(tǒng)在不同植物品系上的應用取決于由原生質(zhì)體再生特定植物品系的能力。業(yè)已披露了由原生質(zhì)體再生禾本科作物的代表性方法(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。5.8.4其他轉(zhuǎn)化方法植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化可以用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔、以及上述處理的組合的方法實現(xiàn)(例如，參見Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。業(yè)已披露了由原生質(zhì)體再生禾本科作物的代表性方法(Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。5.8.5植物中的基因表達盡管近年來在制備能表達諸如蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白的細菌蛋白的轉(zhuǎn)基因植物方面取得了很大進展，但在植物中表達天然細菌基因的結(jié)果通常是失敗的。不過，近年來，業(yè)已發(fā)現(xiàn)若干潛在的因素決定著特定編碼序列的蛋白表達水平的程度。例如，科學家現(xiàn)在已經(jīng)了解到在細胞中保持大量的特定mRNA實際上是一個關鍵因素。另人遺憾的是，導致編碼外源蛋白的mRNA較低的穩(wěn)定狀態(tài)水平的原因是多種多樣的。首先，完整長度RNA合成的出現(xiàn)機會不高。這可能是由于，諸如在轉(zhuǎn)錄期間RNA的提前終止或者是由于在轉(zhuǎn)錄期間出人意料的mRNA加工所導致的。其次，完整長度RNA可以在植物細胞中產(chǎn)生，但然后在細胞核中進行加工(剪接、添加聚腺苷酸)，加工的方式產(chǎn)生了無功能的mRNA。如果RNA不是正確合成、終止和聚腺苷酸化的，它就不能轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中進行翻譯。類似的，在細胞質(zhì)中，如果mRNA的半衰期縮短(它的半衰期是由它的一級或二級序列決定的)，就會產(chǎn)生數(shù)量不足的蛋白產(chǎn)物。另外，翻譯效率對mRNA的半衰期也有影響(影響的程度不確定)。另外，每一種RNA分子折疊成一種特定的結(jié)構(gòu)或者是結(jié)構(gòu)家族，該結(jié)構(gòu)是由其序列決定的。任何RNA的特定結(jié)構(gòu)都可能導致在細胞質(zhì)中具有更高或更低的穩(wěn)定性。結(jié)構(gòu)本身也可能是mRNA在細胞核中進行加工的決定因素。明顯改變RNA的序列有可能對其折疊結(jié)構(gòu)產(chǎn)生大的影響。所述結(jié)構(gòu)本身或特定的結(jié)構(gòu)特征還有可能起著決定RNA穩(wěn)定性的作用。為了克服外源基因表達中的上述局限，研究人員業(yè)已在RNA上鑒定了有可能對RNA的穩(wěn)定性產(chǎn)生特殊影響的特定序列和信號。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，需要優(yōu)化所披露的核酸片段在植物中的表達。實現(xiàn)這一目的的一種特定方法是通過改變所述細菌基因，以便除去會減弱在轉(zhuǎn)化過的植物細胞中表達的序列或基序。工程改造編碼序列以便優(yōu)化在植物中的表達的過程通常被稱為將DNA序列“植物化”。特別成問題的序列是富含A+T的序列。另人遺憾的是，由于蘇云金芽孢桿菌具有富含A+T的基因組，必須對天然結(jié)晶蛋白基因序列進行修飾，以便優(yōu)化在植物中的表達。序列基序ATTTA(或在RNA中為AUUUA)業(yè)已被認為是哺乳動物細胞mRNA上的去穩(wěn)定化序列(Shaw和Kamen，1986)。很多存活期短的mRNA具有富含A+T的3’非翻譯區(qū)，并且，這些區(qū)通常具有ATTTA序列，有時候以多拷貝形式或作為多聚體存在(例如，ATTTATTTA...)。Shaw和Kamen證實將不穩(wěn)定mRNA的3’末端轉(zhuǎn)移到穩(wěn)定的RNA(珠蛋白或VA1)上，會明顯降低該穩(wěn)定RNA的半衰期。它們還進一步證實了，ATTTA五聚體對穩(wěn)定的mRNA具有明顯的去穩(wěn)定化作用，并且無論該信號位于其3’末端或者是位于其編碼序列內(nèi)部都能發(fā)揮其作用。不過，ATTTA序列的數(shù)量和/或該序列所處的序列環(huán)境在決定其是否能作為去穩(wěn)定化序列起作用方面起著重要作用。Shaw和Kamen證實，ATTTA三聚體對mRNA穩(wěn)定性的影響明顯低于五聚體的影響，而二聚體或單聚體對穩(wěn)定性沒有影響(Shaw和Kamen，1987)。要指出的是，ATTTA的多聚體，如五聚體能自動產(chǎn)生富含A+T的區(qū)。這被證實是細胞質(zhì)的作用而不是細胞核的作用。在其他不穩(wěn)定的mRNA上，ATTTA序列可能只是以單一拷貝存在，但通常包括在富含A+T的區(qū)域內(nèi)。從到目前為止所收集到的動物細胞的數(shù)據(jù)可以看出，至少在某些情況下ATTTA對穩(wěn)定性來說是重要的，但尚不可能預測所出現(xiàn)的哪一個ATTTA是去穩(wěn)定化因子或者在植物中是否會出現(xiàn)這種影響。在動物細胞中對mRNA降解的某些研究還證實了在某些情況下RNA降解可能始于在富含A+T區(qū)域上所發(fā)生的核酸侵襲。尚不清楚這種裂解作用是否發(fā)生在ATTTA序列上。還有例子表明mRNA所具有的不同的穩(wěn)定性取決于它們被表達的細胞類型或取決于它們被表達時所處的細胞周期的階段。例如，組蛋白mRNA在DNA合成期間是穩(wěn)定的，但如果終止DNA合成它就不穩(wěn)定。某些組蛋白mRNA的3’末端似乎決定著這種作用(Pandey和Marzluff，1987)。這似乎不是由ATTTA引起的，也不清楚是什么控制著該mRNA的有差別的穩(wěn)定性。另一個例子是在B細胞成熟期間在B淋巴細胞中IgGmRNA穩(wěn)定性的差別(Genovese和Milcarek，1988)。最后一個例子是突變型β-地中海貧血珠蛋白mRNA的不穩(wěn)定性。在骨髓細胞中該基因是正常表達的，在這里所述突變型mRNA是不穩(wěn)定的，而野生型mRNA是穩(wěn)定的。當所述突變基因在HeLa或L細胞中體外表達時，其突變型mRNA沒有表現(xiàn)出不穩(wěn)定性(Lim等，1988)。上述例子都提供了mRNA的穩(wěn)定性可以由細胞類型或細胞周期特定因子介導的證據(jù)。另外，這種類型的不穩(wěn)定性與特定序列沒有關系。由于上述不確定性，不可能預測哪一種RNA在特定細胞中可能是不穩(wěn)定的。另外，甚至是ATTTA基序也有可能根據(jù)該RNA所存在的細胞的性質(zhì)而以不同的方式起作用。Shaw和Kamen(1987)業(yè)已報導了激活蛋白激酶C可以阻斷由ATTTA介導的降解。對于植物和動物的大多數(shù)真核mRNA來說，在3’末端添加聚腺苷酸序列是常見的。目前被接受的添加聚腺苷酸的看法是，新生的轉(zhuǎn)錄物超過了成熟的3’末端。在該轉(zhuǎn)錄物上包含了聚腺苷酸化和形成正確的3’末端的信號。在3’末端所進行的這一加工過程包括裂解mRNA和在成熟的3’末端添加聚腺苷酸。通過在植物和動物mRNA上尋找靠近聚腺苷酸尾的共有序列，有可能鑒定看上去與添加聚腺苷酸和3’末端裂解相關的共有序列。共同的共有序列似乎對于這些加工來說是重要的。這些信號通常是序列AATAAA的變異形式。在動物細胞中，業(yè)已鑒定了有功能的該序列的某些變體。在植物細胞中，似乎有多種有功能的序列(Wickens和Stephenson，1984；Dean等，1986)。由于所有這些共有序列都是AATAAA的變體，因此它們都是富含A+T的序列。該序列通常出現(xiàn)在成熟mRNA的聚腺苷酸尾前面15-20bp處。對動物細胞所做的研究表明，該序列與聚腺苷酸的添加和3’成熟相關。在該序列上進行的定向誘變可以破壞其功能(Conway和Wickens，1988；Wickens等，1987)。不過，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，距離推測的聚腺苷酸信號3’末端多達50-100bp的序列也是必要的；即具有正常的AATAAA但在其下游已經(jīng)被取代或破壞了以至不能正確聚腺苷酸化的基因(Gil和Proudfoot，1984；Sadofsky和Alwine，1984；McDevitt等，1984)。就是說，聚腺苷酸化信號本身不足以完成完整、正確的加工。尚不清楚除了聚腺苷酸信號之外還需要什么樣的特殊下游序列，或者是否存在具有該功能的特殊序列。因此，序列分析只能夠鑒定潛在的聚腺苷酸化信號。在天然存在的正常聚腺苷酸化的mRNA上，業(yè)已觀察到了這一過程的中斷，是通過改變該mRNA上的聚腺苷酸化信號或其他序列而實現(xiàn)的，可以在功能性mRNA水平上獲得顯著影響。業(yè)已在若干種天然存在的mRNA上觀察到了這一結(jié)果，到目前為止其結(jié)果都是基因?qū)Ｒ恍缘摹I(yè)已證實，在天然mRNA上，正確的聚腺苷酸化對于mRNA的積累是重要的，并且破壞這一過程可能明顯影響mRNA的含量。不過，還沒有足夠的知識來預測改變正?；虻暮蠊Ｔ诋愒椿蛏?，更難于預測其后果。不過，所鑒定的推測位點有可能是功能異常的。就是說這些位點有可能不是作為正常的聚腺苷酸位點，而是起著異常位點的作用，從而產(chǎn)生不穩(wěn)定的mRNA。在動物細胞系統(tǒng)中，AATAAA到目前為止是在mRNA的聚腺苷酸位點上游所鑒定到的最常見的信號，不過，業(yè)已發(fā)現(xiàn)了至少4種變體(Wickens和Stephenson，1984)。在植物中，所做的研究不是那么多，但已經(jīng)了解到可以使用類似于AATAAA的多種序列。表2中的植物位點只是在Dean等(1986)的研究中被稱為主要和次要，該研究僅分析了三種類型的植物基因。將聚腺苷酸化位點確定為主要或次要僅僅表示其在業(yè)已分析的天然存在的基因上作為有功能的位點出現(xiàn)的頻率。對于植物來說，這是一個非常有限的數(shù)據(jù)庫。要以任何確定性預測被命名為主要或次要的位點在異源基因中部分或完全起作用的可能性是大還是小是困難的，所述異源基因如編碼本發(fā)明的結(jié)晶蛋白的基因。表2-植物基因上的聚腺苷酸化位點PAAATAAA主要共有位點P1AAATAAT主要植物位點P2AAACCAA次要植物位點P3AATATAA″P4AAATCAA″P5AATACTA″P6AATAAAA″P7AATGAAA″P8AAAGCAT″P9AATTAAT″P10AATACAT″P11AAAAATA″P12AATTAAA次要動物位點P13AAATTAA″P14AAATACA″P15ACATAAA″本發(fā)明提供了用于制備合成的植物基因的方法，該基因能以明顯高于野生型基因的水平表達其蛋白產(chǎn)物，所述野生型基因此前通常被用于植物轉(zhuǎn)化。在另一方面，本發(fā)明還提供了編碼非植物蛋白的新型合成植物基因。如上文所述，天然蘇云金芽孢桿菌基因在植物中的表達通常是成問題的。蘇云金芽孢桿菌基因編碼序列的性質(zhì)不同于植物基因以及在植物中表達的很多其他異源基因。具體地講，蘇云金芽孢桿菌基因的腺苷(A)和胸苷(T)的含量很高(大約62％)，而植物基因和大多數(shù)業(yè)已在植物中表達的其他細菌基因A+T的含量為45-55％。由于遺傳密碼的簡并性以及任何氨基酸的密碼子選擇的數(shù)量有限，某些芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)編碼序列上絕大部分“過多的”A+T出現(xiàn)在密碼子的第三個位置上。就是說，某些芽孢桿菌的基因在很多密碼子中的第三個核苷酸是A或T。因此，A+T的含量能部分決定密碼子使用的傾向。另外，已經(jīng)了解到基因能在它進化的生物體內(nèi)進化出最大的功能。這意味著來自一種生物的基因上出現(xiàn)的特定核苷酸序列在該生物中除了編碼特定的氨基酸片段之外可能不起作用，但它在其他生物中有可能被認為是基因控制因子(如轉(zhuǎn)錄啟動子或終止子，聚腺苷酸添加位點，內(nèi)含子剪接位點，或特殊的mRNA降解信號)。另人吃驚的是，這些錯讀的信號不是異源基因表達的更常見的特征，但可以通過很多生物的相對同源A+T含量(大約50％)來得到部分解釋。這種A+T含量加上遺傳密碼的性質(zhì)明確限制了任何特定寡核苷酸序列出現(xiàn)的可能性。因此，來自大腸桿菌的A+T含量為50％的基因含有任何特定富含A+T片段的可能性比來自蘇云金芽孢桿菌的基因的要低。通常，為了獲得S-內(nèi)毒素基因在植物中的高水平表達，通過對含有該結(jié)構(gòu)基因的DNA進行定向誘變，除去ATTTA序列和推測的聚腺苷酸化信號，對現(xiàn)有的編碼S-內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)編碼序列(結(jié)構(gòu)基因)進行修飾。最好是將所有聚腺苷酸化信號和ATTTA序列幾乎完全除去，盡管在僅部分除去上述特定序列的情況下也觀察到了提高了的表達水平。另外，如果制備編碼目標蛋白表達的合成基因的話，要選擇密碼子，以避免ATTTA序列和推測的聚腺苷酸化信號。對于本發(fā)明來說，推測的聚腺苷酸化信號包括，但不一定局限于AATAAA、AATAAT、AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA和CATAAA。在取代ATTTA序列和聚腺苷酸化信號時，優(yōu)選使用這樣的密碼子，要避免使用植物基因組中罕見的密碼子。對特定的DNA序列進行掃描，以鑒定具有超過4個連續(xù)的腺苷或胸苷核苷酸的區(qū)域。對A+T區(qū)域進行掃描以便尋找潛在的植物聚腺苷酸化信號。盡管5個或更多個連續(xù)A或T核苷酸的缺乏消除了大多數(shù)植物聚腺苷酸化信號，如果在10個核苷酸中鑒定到了一個以上的次要聚腺苷酸化信號，那么最好改變該區(qū)域的核苷酸序列，以便除去上述信號，同時保持原有編碼的氨基酸序列。第二個步驟是考慮在第一個步驟中鑒定的富含A+T區(qū)域周圍的大約15-大約30個核苷酸殘基。如果其周圍區(qū)域的A+T含量低于80％，就要檢查該區(qū)域的聚腺苷酸化信號。根據(jù)聚腺苷酸化信號對該區(qū)域所做的改變?nèi)Q于(1)所存在的聚腺苷酸化信號的數(shù)量和(2)主要植物聚腺苷酸化信號的存在。檢查延伸區(qū)域中植物聚腺苷酸化信號的存在。通過對DNA序列進行定向誘變除去聚腺苷酸化信號。還要檢查所述延伸區(qū)域中ATTTA序列的多個拷貝，也要通過誘變將該序列除去。破壞含有多個連續(xù)A+T堿基或G+C堿基的區(qū)域同樣是優(yōu)選的，因為這樣的區(qū)域被推測為具有由于自身互補性而形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的更高的可能性。因此，插入異源堿基對可以降低形成自身互補二級結(jié)構(gòu)的可能性，已知在某些生物中該二級結(jié)構(gòu)能抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。在大多數(shù)情況下，使用含有不超過5個連續(xù)A+T或G+C的序列可以降低上述負面影響。5.8.6用于誘變的合成寡核苷酸在將寡核苷酸用于誘變時，需要保持正確的氨基酸序列和閱讀框，沒有將常見的限制位點導入修飾過的基因，如BglII、HindIII、SacI、KpnI、EcoRI、NcoI、PstI和SalI。上述限制位點出現(xiàn)在很多克隆載體的多接頭插入位點上。當然，也要避免導入新的聚腺苷酸化信號、ATTTA序列或超過5個A+T或G+C的連續(xù)片段。寡核苷酸的優(yōu)選大小為大約40-大約50個堿基，但在大約18-大約100個堿基內(nèi)的片段都可以使用。在大多數(shù)情況下，在合成片段的兩端要保持與模板DNA的至少大約5-大約8個堿基對的同源性，以便確保引物與模板的正確雜交。所述寡核苷酸要避免長于5個堿基對的A+T或G+C的序列。用于取代野生型密碼子的密碼子如果可能的話優(yōu)選應當避免TA或CG雙聯(lián)體。密碼子是從植物優(yōu)選的密碼子列表中選擇的(如下面的表3所示)，以避免在植物基因組中罕見的密碼子，并且應當盡量篩選優(yōu)選將G+C的含量調(diào)整到大約50％的密碼子。推測具有很多連續(xù)的A+T堿基或G+C堿基的區(qū)域具有因為自身互補性而形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的更大的可能性。優(yōu)選通過插入異源堿基對破壞該區(qū)域，并應當降低形成諸如發(fā)卡結(jié)構(gòu)的自身互補性二級結(jié)構(gòu)的可能性，已知這種結(jié)構(gòu)在某些生物中能抑制轉(zhuǎn)錄(轉(zhuǎn)錄終止子)和翻譯(弱化子)。另外，可以制備編碼特定氨基酸序列的完全合成的基因，避免出現(xiàn)5個或更多連續(xù)的A+T或G+C核苷酸區(qū)域。如果可能的話，要選擇在密碼子中避免出現(xiàn)TA和CG雙聯(lián)體的密碼子。密碼子使用可以根據(jù)植物優(yōu)選密碼子使用表(如表3)進行正常化，并將GC含量優(yōu)選調(diào)整到大約50％。應當對所得到的序列進行檢查，以確保具有最少的推測的植物腺苷酸化信號和ATTTA序列。表3-植物中優(yōu)選的密碼子使用氨基酸密碼子植物中的利用百分比氨基酸密碼子植物中的利用百分比ARGCGA7LEUCUA8CGC11CUC20CGG5CUG10CGU25CUU28AGA29UUA5AGG23UUG30SERUCA14ALAGCA23UCC26GCC32UCG3GCG3UCU21GCU41AGC21GLYGGA32AGU15GGC20THRACA21GGG11ACC41GGU37ACG7ILEAUA12ACU31AUC45PROCCA45AUU43CCC19VALGUA9CCG9GUC20CCU26GUG28HISCAC65GUU43CAU35LYSAAA36GLUGAA48AAG64GAG52ASNAAC72ASPGAC48AAU28GAU52GLNCAA64TYRUAC68CAG36UAU32PHEUUC56CYSUGC78UUU44UGU22METAUG100TRPUGG100同樣最好避免應用經(jīng)常出現(xiàn)在克隆載體上的限制位點。不過，在所述基因上插入若干獨特的限制位點對于分析基因表達或構(gòu)建基因變體來說是有利的。5.8.7“植物化的”基因結(jié)構(gòu)以雙鏈DNA形式存在的植物基因的表達包括通過RNA聚合酶從該DNA的一股鏈轉(zhuǎn)錄mRNA，以及隨后在細胞核內(nèi)對該mRNA初級轉(zhuǎn)錄物進行加工。該加工包括向RNA的3’末端添加聚腺苷酸核苷酸的3，非翻譯區(qū)。DNA向mRNA的轉(zhuǎn)錄通常是由被稱為啟動子的DNA片段調(diào)控的。該啟動子片段含有一個堿基序列，該序列發(fā)出信號使RNA聚合酶與DNA結(jié)合，并利用一股DNA鏈作模板產(chǎn)生相應的RNA鏈啟動mRNA的轉(zhuǎn)錄。在現(xiàn)有文獻中業(yè)已披露了能在植物細胞中起作用的多種啟動子，其中包括胭脂氨酸合成酶(NOS)和章魚氨酸合成酶(OCS)啟動子(這兩個啟動子是由根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒攜帶的)，花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子，來自核酮糖二磷酸羧化酶的小亞基光誘導型啟動子(ssRUBISCO，一種含量很高的植物多肽)，以及甘露氨酸合成酶(MAS)啟動子(Velten等，1984；Velten和Schell，1985)。上述所有啟動子都已經(jīng)被用于產(chǎn)生各種類型的DNA結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)已經(jīng)在植物中表達(例如，參見國際專利申請公開流水號WO84/02913)。在本發(fā)明中可以使用已知或者發(fā)現(xiàn)其能在植物細胞中引起RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。所述啟動子可以從植物或植物病毒中獲得，包括，但不局限于CaMV35S啟動子和從諸如ssRUBISCO基因的植物基因中分離的啟動子。正如下文所披露的，所選擇的特定啟動子最好能夠?qū)е鲁浞值谋磉_，以便產(chǎn)生有效量的蛋白。如果必要，可以對用于本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)(即嵌合的植物基因)中的啟動子進行修飾，以便改變其控制特征。例如，可將CaMV35S啟動子連接到ssRUBISCO基因部分上，以便在缺少光照的情況下抑制ssRUBISCO的表達，從而產(chǎn)生一種能在葉片中起作用但不能在根中起作用的啟動子。所得到的嵌合啟動子可以在本發(fā)明中使用。因此，對于本說明書來說，術語“CaMV35S啟動子”包括CaMV35S啟動子的變體，例如，通過與操縱子區(qū)連接、隨機或控制誘變等所產(chǎn)生的啟動子。另外，可以改變所述啟動子，使其含有多個“增強子序列”，以便提高基因的表達。由本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的RNA還含有一個5’非翻譯前導序列。該序列可以來自被選擇用于表達該基因的啟動子，并可以進行特殊修飾，以便增強mRNA的翻譯。所述5’非翻譯區(qū)還可以從病毒RNA、合適的真核基因、或合成基因序列中獲得。本發(fā)明并不局限于在下面的實施例中所提供的結(jié)構(gòu)。相反，所述非翻譯前導序列可以是病毒外被蛋白編碼序列的非翻譯區(qū)的5’末端的一部分，或者是啟動子序列的一部分，或者可以來自一種不相關的啟動子或編碼序列。在任何情況下，起始位點的旁側(cè)序列都最好遵循Kozak(1984)所報導的增強轉(zhuǎn)錄啟動的翻譯共有序列規(guī)則。本發(fā)明的cryDNA結(jié)構(gòu)還可以含有一個或多個修飾過的或完全合成的結(jié)構(gòu)編碼序列，該序列做過改變，以便增強cry基因在植物中的性能。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)基因可以選擇性地編碼一種融合蛋白，該蛋白包括氨基末端葉綠體轉(zhuǎn)運肽或分泌信號序列。所述DNA結(jié)構(gòu)還包括一個3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)含有能在植物中起作用的聚腺苷酸化信號，以便導致在病毒RNA的3’末端添加聚腺苷酸。合適的3’區(qū)的例子有(1)含有農(nóng)桿菌屬Ti質(zhì)?；虻木巯佘账峄盘柕?’轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，如胭脂氨酸合成酶(NOS)基因和(2)植物基因，如大豆儲存蛋白(7S)基因，和RuBP羧化酶(E9)基因的小亞基。5.9生產(chǎn)抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的方法通過用含有重組的cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83基因的片段轉(zhuǎn)化諸如植物細胞的合適的宿主細胞，所編碼的結(jié)晶蛋白的表達(即對鞘翅目昆蟲具有殺蟲活性的細菌結(jié)晶蛋白或多肽)可以導致抗蟲植物的產(chǎn)生。舉例來說，人們可以用含有蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白的編碼區(qū)和一種合適的選擇標記的表達載體轉(zhuǎn)化植物胚芽細胞的懸浮液，如小麥或玉米細胞，利用諸如粒子轟擊的方法(Maddock等，1991；Vasil等，1992)，將用DNA包衣的微粒輸送到受體細胞內(nèi)。然后由轉(zhuǎn)化過的胚性愈傷組織再生能表達所述殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物的形成還可以用本領域已知的其他細胞轉(zhuǎn)化方法實現(xiàn)，如農(nóng)桿菌屬介導的DNA轉(zhuǎn)移(Fraley等，1983)。另外，可以通過將DNA直接轉(zhuǎn)入花粉(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988)、通過將DNA注射到植物的生殖器官(Pena等，1987)、或者通過將DNA直接注射到未成熟的胚胎細胞中然后使脫水的胚胎再水合(Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986)將DNA導入植物中。單一的植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或各種轉(zhuǎn)化過的外殖體再生、發(fā)育、和培養(yǎng)植物的方法為本領域所公知(Weissbach和Weissbach，1988)。該再生和生長方法通常包括以下步驟選擇轉(zhuǎn)化過的細胞，使這種單一化的細胞通過胚胎發(fā)育的常見階段并通過長根的小植株階段。以類似方法再生轉(zhuǎn)基因胚胎和種子。然后將所得到的轉(zhuǎn)基因的長根的幼苗種植到諸如土壤的合適的生長介質(zhì)中。由葉片外殖體發(fā)育或再生含有通過農(nóng)桿菌屬導入的編碼感興趣多肽的外源基因的植物可以通過業(yè)已公開的本領域所公知的方法實現(xiàn)(Horsch等，1985)。在該方法中，在存在選擇試劑的條件下，在能誘導轉(zhuǎn)化過的植物品系的幼苗再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體(Fraley等，1983)。該方法通常能在2-4個月內(nèi)生成幼苗，然后將這些幼苗轉(zhuǎn)移到合適的根誘導培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有選擇試劑和抗生素以便抑制細菌生長。在有選擇試劑的條件下能長根形成小植株的幼苗隨后被移植到土壤或其他培養(yǎng)基中，以便產(chǎn)生根。上述方法根據(jù)所采用的具體植物品系而有所不同，這些不同為本領域所公知。如上文所述，優(yōu)選讓再生的植物自花授粉以便產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物。或者，讓從再生的植物上獲得的花粉與由種子長成的在農(nóng)業(yè)上重要的植物，優(yōu)選自交系進行雜交。相反，用來自上述重要的自交系植物的花粉對再生的植物進行授粉。用本領域技術人員所公知的方法培養(yǎng)含有所需多肽的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有編碼CryET31、CryET40、CryET43，CryET44、CryET45，CryET46，CryET47，CryET49，CryET51、CryET52、CryET53、CryET54、CryET55、CryET56、CryET57、CryET59、CryET60、CryET61、CryET62、CryET63、CryET64、CryET66、CryET67、CryET68、CryET72、CryET73和CryET83多肽中的一種或多種的較高含量的編碼區(qū)(例如，cryET31、cryET40、cryET43、cryET44、cryET45、cryET46、cryET47、cryET49、cryET51、cryET52、cryET53、cryET54、cryET55、cryET56、cryET57、cryET59、cryET60、cryET61、cryET62、cryET63、cryET64、cryET66、cryET67、cryET68、cryET72、cryET73和cryET83基因)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是獨立的分離體，并且能將該基因及其活性傳給其后代。一種更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物在該基因上是純合的，并且能以有性交配的方式將該基因傳給其所有后代。來自轉(zhuǎn)基因植物的種子可以在大田中或溫室中生長，并讓所得到的性成熟的轉(zhuǎn)基因植物自花授粉，以便產(chǎn)生不分離的植物。來自上述植物的后代成為不分離的品系，例如，優(yōu)選在大田中，在多種環(huán)境條件下評估該品系對鞘翅目昆蟲的提高了的殺蟲能力。本發(fā)明人期望本發(fā)明能特別適用于生產(chǎn)具有商業(yè)價值的轉(zhuǎn)基因植物，包括各種草坪草、小麥、玉米、水稻、大麥、燕麥，各種觀賞植物和蔬菜，以及多種結(jié)堅果和水果的樹木和植物。5.10定義下面的名詞或短語具有下文所提供的含義。表達細胞內(nèi)過程的組合，包括由諸如結(jié)構(gòu)基因的編碼DNA分子所進行的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以便產(chǎn)生多肽。相同性或相同百分比是指兩種核酸或蛋白序列之間的相似性程度。兩個序列的排比是通過合適的計算機程序完成的。一種被普遍采用和接受的用于進行序列排比的計算機程序是CLUSTALWv1.6(Thompson等，核酸研究，224673-4680，1994)。用匹配的堿基或氨基酸的數(shù)量除以堿基或氨基酸的總數(shù)，并乘以100，以便獲得相同百分比。例如，如果兩個具有580個堿基對的序列具有145個匹配的堿基的話，它們的相同百分比為25％。如果兩個比較的序列具有不同的長度，就用匹配的數(shù)量除以這兩種長度中較短的一個。例如，如果在具有200個氨基酸和400個氨基酸的蛋白之間有100個匹配的氨基酸的話，相對較短的序列而言它們的相同百分比為50％。如果較短序列的長度低于150個堿基或50個氨基酸的話，用匹配數(shù)量的除以150(對核酸堿基而言)或50(對氨基酸而言)，并乘以100，以便獲得相同百分比。啟動子一種DNA序列或一組DNA序列上的識別位點，它提供了結(jié)構(gòu)基因的表達控制因子，RNA聚合酶能專一性地結(jié)合在它上面，并啟動所述基因的RNA合成(轉(zhuǎn)錄)。再生由植物細胞(例如，植物原生質(zhì)體或外殖體)長出植物的過程。結(jié)構(gòu)基因編碼一種多肽的多核苷酸序列，該序列能表達以便產(chǎn)生多肽，或者它在其天然宿主細胞中是隱性的或不能夠表達，但可以分離并純化，并可操作地連接于能夠在一種或多種類型的宿主細胞中起作用的至少一個啟動子上，以便表達所編碼的多肽。轉(zhuǎn)化將外源DNA序列(例如，載體、重組DNA分子)導入細胞或原生質(zhì)體中的過程，其中，所述外源DNA被整合到染色體上或者能夠自主復制。轉(zhuǎn)化過的細胞業(yè)已通過將外源DNA分子導入其中而改變了它的DNA的細胞。轉(zhuǎn)基因細胞由轉(zhuǎn)化過的細胞產(chǎn)生或再生的或由轉(zhuǎn)基因細胞產(chǎn)生的任何細胞。典型的轉(zhuǎn)基因細胞包括由轉(zhuǎn)化的植物細胞，特別是由轉(zhuǎn)基因植物獲得的諸如葉、根、莖的細胞，例如，體細胞或生殖細胞所產(chǎn)生的植物愈傷組織。轉(zhuǎn)基因植物由轉(zhuǎn)化的植物細胞或原生質(zhì)體所產(chǎn)生的植物或其后代，其中，該植物DNA中含有原先在相同品系的天然的非轉(zhuǎn)基因植物中不存在的導入的外源DNA分子。術語“轉(zhuǎn)基因植物”和“轉(zhuǎn)化過的植物”在本領域中有時候被用作同義語，用來定義其DNA中含有外源DNA分子的植物。不過，將由轉(zhuǎn)化過的植物細胞或原生質(zhì)體再生的植物或愈傷組織稱為轉(zhuǎn)基因植物更科學一些，并且在下文中將采用這一用法。載體能夠在宿主細胞中復制和/或能可操作地連接其他DNA片段以便使所連接的片段復制的DNA分子。質(zhì)粒是一種典型的載體。5.11分離同源基因和基因片段本發(fā)明的基因和δ內(nèi)毒素不僅包括本文所披露的完整長度的序列，而且還包括這些序列的片段或融合蛋白，它們保留了本文所披露的該序列特有的殺蟲活性。本領域技術人員可以理解的是，可以通過若干種方法鑒定并獲得殺蟲性δ內(nèi)毒素。特定的基因或其部分可以從培養(yǎng)物保藏所獲得或者通過合成構(gòu)建，例如，通過使用基因合成儀。所述基因的變異可以利用產(chǎn)生點突變的標準技術方便地構(gòu)建。另外，利用商業(yè)化的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶按照標準方法可以制備所述基因的片段。例如，可以利用諸如Bal31的酶或定向誘變從所述基因的末端進行系統(tǒng)的核苷酸切除。另外，可以利用多種其他的限制酶獲得編碼活性片段的基因?？梢杂玫鞍酌钢苯荧@得δ內(nèi)毒素的活性片段。還可以用本文所披露的技術從芽孢桿菌菌株和/或DNA文庫中分離等同的δ內(nèi)毒素和/或編碼所述等同的δ內(nèi)毒素的基因。例如，可以用本文所披露的并要求保護的δ內(nèi)毒素的抗體從蛋白混合物中鑒定并分離其他δ內(nèi)毒素。具體地講，可以制備針對δ內(nèi)毒素的最穩(wěn)定的并且與其他蘇云金芽孢桿菌的δ內(nèi)毒素差別最大的部分的抗體。然后可以利用上述抗體通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)或Western印跡專一性地鑒定具有所述特有的殺蟲活性的等同的δ內(nèi)毒素。用于鑒定本發(fā)明的δ內(nèi)毒素和基因的另一種方法是通過使用寡核苷酸探針。所述探針是具有一個可檢測標記的核苷酸序列。正如本領域所公知的，如果所述探針分子和核酸樣品能通過在這兩種分子之間形成強的鍵而雜交的話，就有理由認為所述探針和樣品是基本上相同的。所述探針的可檢測標記提供了用已知方式確定是否發(fā)生了雜交的手段。所述探針分析提供了一種鑒定本發(fā)明的了不起的δ內(nèi)毒素基因的快速方法?？梢杂米鞅景l(fā)明探針的核苷酸片段可以利用DNA合成儀通過標準方法合成。在用核苷酸片段作探針時，可以用本領域技術人員所公知的任何合適的標記物標記特定的探針，包括放射性和非放射性標記。典型的放射性標記物包括32P、125I、或35S等。用放射性同位素標記過的探針可以用互補于DNA樣品的核苷酸序列利用DNase和DNA聚合酶通過常規(guī)的缺口翻譯反應構(gòu)建。然后將所述探針和樣品混合在雜交緩沖液中，并保持在合適的溫度下，直到發(fā)生退火。然后，洗去膜上的外來材料，留下所述樣品和結(jié)合的探針分子，通常通過放射性自顯影和/或液體閃爍技術計數(shù)檢測并定量。例如，非放射性標記包括生物素或甲狀腺素的配體，以及諸如水解酶或過氧化物酶的酶，或諸如熒光素的各種化學發(fā)光劑，或諸如熒光素及其衍生物的熒光化合物。還可以用不同類型的標記物在兩端對探針進行標記，以便于分離，例如，利用同位素標記物對上述末端進行標記，并用生物素標記物對另一個末端進行標記。雙鏈體的形成和穩(wěn)定性取決于雜合體兩股鏈之間的顯著的互補性，并且正如上文所指出的，允許一定程度的錯配。因此，本發(fā)明的探針包括所述序列的突變(單一突變和多突變)、缺失、插入、及其組合，其中，所述突變、插入和缺失可以與感興趣的目標多核苷酸形成穩(wěn)定的雜合體。可以用多種方法在特定的多核苷酸序列上產(chǎn)生突變、插入和缺失，可以采用本領域技術人員目前所知的方法以及將來會被本領域技術人員所知的其他方法。上述探針上的潛在的變異在某種程度上是由于遺傳密碼的豐余性。由于豐余性，即有一種以上的編碼核苷酸三聯(lián)體(密碼子)可用于編碼用來形成蛋白的大多數(shù)的氨基酸。因此，不同的核苷酸序列可能編碼一種特定的氨基酸。因此，蘇云金芽孢桿菌δ內(nèi)毒素和肽的氨基酸序列可以通過編碼該蛋白或肽的相同氨基酸序列的等同的核苷酸序列制備。因此，本發(fā)明包括這樣的等同核苷酸序列。另外，反向或互補序列是本發(fā)明的一方面，并且可以方便地為本領域技術人員所采用。另外業(yè)已證實，通過改變氨基酸序列可以構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白，如果所述改變不會改變該蛋白的二級結(jié)構(gòu)的話(Kaiser和Ketdy，1984)。因此，本發(fā)明包括本文所披露的氨基酸序列的突變體，該突變體不改變該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，或者如果其結(jié)構(gòu)被改變了的話，其生物學活性被基本上保留。另外，本發(fā)明還包括具有編碼本發(fā)明δ內(nèi)毒素的全部或部分基因的生物變體。所述變體可以用本領域技術人員所公知的技術制備。例如，可以用紫外線輻射制備宿主生物的變體。類似的，所述變體可以包括無孢子宿主細胞，這種細胞也可以用本領域公知的方法制備。6.0實施例下面的實施例是用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的。本領域技術人員應當理解的是，在實施例中所披露的技術是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的能很好實施本發(fā)明的代表性技術，因此，可以本認為是實施本發(fā)明的組成性的優(yōu)選方式。不過，在閱讀本說明書的前提下，本領域技術人員應當理解的是，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下可以對所披露的具體實施方案進行多種改變，但仍然能獲得類似或相似的結(jié)果。6.1例1-鑒定含有新型δ內(nèi)毒素的蘇云金芽孢桿菌菌株通過采用特殊DNA探針進行Southern印跡雜交鑒定含有新型殺蟲蛋白基因的野生型蘇云金芽孢桿菌菌株。發(fā)現(xiàn)有24個獨特的cry基因與蘇云金芽孢桿菌基因中的cry1、cry2或cry9類型的毒素基因相關。采用各種方法克隆所述新型基因，并在蘇云金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白陰性(Cry-)菌株中表達這些基因。所述方法包括PCRTM擴增編碼所述毒素基因的活性部分的cry-相關基因的部分。然后將所述PCRTM產(chǎn)物與來自編碼原毒素的C-末端區(qū)的cry1Ac基因的片段連接。然后在蘇云金芽孢桿菌重組菌株中表達該基因融合體，以便產(chǎn)生雜合的原毒素。在這種場合下，已經(jīng)認識到所擴增的DNA序列可用于設計雜交探針，用于從野生型蘇云金芽孢桿菌菌株中分離編碼新型cry基因的完整的編碼序列。通過生物測定篩選野生型蘇云金芽孢桿菌菌株并鑒定對鱗翅目昆蟲的幼蟲有毒性的菌株(方法披露于例10中)。然后對活的菌株進行遺傳學檢查，以便確定它是否含有新型毒素基因。用于進行該測定的方法在下文披露，并且包括從蘇云金芽孢桿菌菌株中分離基因組DNA，限制酶消化，Southern印跡雜交，以及分析雜交的限制片段，以便確定在菌株中存在哪一個基因。通過以下方法提取總的基因組DNA。將營養(yǎng)細胞重新懸浮在含有50mM葡萄糖、20mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA和4毫克/毫升溶菌酶的裂解緩沖液中。在37℃下培養(yǎng)該懸浮液1小時。在培養(yǎng)之后，用等體積的苯酚提取該懸浮液一次，然后用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(50∶48∶2)提取一次，再用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)提取一次。通過添加1/10體積的3M乙酸鈉和2倍體積的100％乙醇使DNA從水相中沉淀出來。通過離心收集沉淀的DNA，用70％的乙醇洗滌，并重新懸浮在蒸餾水中。用限制酶ClaI和PstI消化DNA樣品。這兩種酶的組合所產(chǎn)生的消化片段的形式在用探針wd207(如下文所述)雜交時能夠鑒定很多已知的cry1相關的毒素基因。與已知基因的預期片段大小不一致的雜交片段被歸類為未知，并且被用作克隆和鑒定的候選片段。通過1.0％的瓊脂糖凝膠在1倍TBE(0.089MTris硼酸，0.089M硼酸，0.002MEDTA)中以2伏/厘米凝膠長度的電壓電泳一夜對消化的DNA進行大小分離。然后按照Southern的方法(1975)將分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到MilliporeImmobilon-NC硝酸纖維素濾膜(Millipore公司，Bedford，MA)上。通過在真空烘箱中在80℃下烤干所述濾膜將DNA片段固定在硝酸纖維素膜上。為了鑒定含有與cry1基因相關的序列的DNA片段，對寡核苷酸wd207的5’末端進行放射性標記，并用作雜交探針。為了對探針進行放射性標記，將1-5皮摩爾wd207添加到含有3微升[γ-32P]ATP(3000Ci/mM，使mCi/毫升)、70mMTris-HCl，pH7.8，10mM氯化鎂，5mMDTT，和10單位T4多核苷酸激酶(Promega公司，Madison，WI)的反應物(20微升總體積)中。在37℃下培養(yǎng)該反應物20分鐘，使放射性磷酸轉(zhuǎn)移到寡核苷酸的5’末端，并使它能被用作雜交探針。在該分析中所使用的被稱為wd207的寡核苷酸探針具有以下序列5’-TGGATACTTGATCAATATGATAATCCGTCACATCTGTTTTTA-3’(SEQIDNO51)將該寡核苷酸設計成能與cry1基因的位于原毒素蛋白水解活化位點下游的保守區(qū)專一性雜交。表4給出了某些蘇云金芽孢桿菌毒素基因及其與wd207的性質(zhì)。Wd207序列的方向是顛倒的，并且與cry基因的編碼序列相反。表4然后在45℃下在3×SSC(1×SSC＝0.15M氯化鈉，0.015M檸檬酸鈉)，0.1％SDS、10×Denhardt’s試劑(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)和0.2毫克/毫升肝素中將標記過的探針與硝酸纖維素濾膜培養(yǎng)一夜。在該培養(yǎng)階段之后，在45℃下通過若干次更換3×SSC、0.1％SDS洗滌所述濾膜。然后將濾膜吸干，并在-70℃下對柯達X-OMATARX光膠片(Eastman柯達公司，Rochester，NY)曝光一夜，使用增感屏，以便獲得放射性自顯影。然后對該放射性自顯影進行分析，以便確定哪一種野生型蘇云金芽孢桿菌菌株含有可能是新的cry1基因。由于該探針僅有42個核苷酸，限制內(nèi)切酶ClaI和PstI的識別位點不可能出現(xiàn)在cry1-相關基因的雜交區(qū)域內(nèi)。因此，推測每一個雜交限制片段表示一個cry1相關基因。根據(jù)該片段在瓊脂糖凝膠中相對已知大小的DNA片段的遷移距離測定雜交限制片段的大小(以千堿基對計算)。所述片的的大小可用于確定該片段是否代表已知的cry1基因。例如，從cry1Ac基因的DNA序列了解到，wd207能夠與在用ClaI和PstI消化cry1AcDNA之后所產(chǎn)生的0.43kb的片段雜交。如果一種菌株的S0uthern印跡出現(xiàn)了0.43kb的雜交片段，該菌株就被界定為cry1Ac的可能的基因型。選擇不能夠輕易地確認為可能基因型的片段作為進一步分析的候選物。由于很多含有cry1的菌株具有一個以上cry1相關基因，給所有片段一個推測的命名。表5-基因和蛋白概述1包括構(gòu)建含有部分Mbol片段的基因組文庫(例4)，構(gòu)建含有大小篩選的BamHI或HindIII限制片段的基因組文庫(例5)，通過PCRTM擴增新型cry和構(gòu)建新型cry基因融合體(例6)的方法。2雜交探針，包括通過消化cry1Aa基因獲得的700bp的EcoRI片段，來自cry2Aa、cryET59、和cryET83基因的基因片段，以及合成的寡核苷酸(wd207，pr56)。6.2例2-鑒定含有新型CRY2相關基因的蘇云金芽孢桿菌菌株由蘇云金芽孢桿菌的毒素基因的cry2型所編碼的蛋白對鱗翅目和雙翅目昆蟲的幼蟲具有活性。通過對從鱗翅目活性菌株中提取的DNA進行Southern印跡雜交分析鑒定新型cry2相關基因。按6.1節(jié)所披露的方法分離總基因組DNA。用限制內(nèi)切核酸酶Sau3A消化該DNA，按上述方法在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳。將消化過的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，以便用含有cry2Aa基因的DNA片段檢測。在55℃下進行雜交，洗滌濾膜，并對X光膠片進行曝光，以便獲得放射性自顯影。在Sau3A消化之后用cry2Aa基因進行的雜交得到了雜交片段的特有形式，從而能夠鑒定cry2Aa、cry2Ab、和cry2Ac基因。不同于該雜交形式的雜交片段表明了在該菌株中存在新型cry2相關基因。一旦鑒定一種菌株含有一個或多個新型cry2相關基因，就再次進行Southern印跡雜交。這一過程與上述過程相同，所不同的是，使用另一種限制酶，通常是HindIII。由于向HindIII這樣的酶(6堿基裂解酶)對DNA的裂解頻率低于Sau3A或MpoI，它更有可能產(chǎn)生含有完整的cry2相關基因的限制片段，然后可以方便地克隆該片段。6.3例3-鑒定含有新型cry9類型基因的蘇云金芽孢桿菌菌株設計被稱為pr56的cry9專一性寡核苷酸，以便鑒定具有cry9型基因的菌株。該寡核苷酸相當于所述基因的4349-4416號核苷酸(GenBank保藏號Z37527)。Pr56的序列如下5’-AGTAACGGTGTTACTATTAGCGAGGGCGGTCCATTCTTTAAAGGTCGTGCACTTCAGTTAGC-3’(SEQIDNO52)。將蘇云金芽孢桿菌分離物成斑或成片涂在SGNB平板上，每一個平板不超過50個分離物，并在25℃下生長一夜。將蘇云金芽孢桿菌克隆轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并將該濾膜放置在新的SGNB平板上使菌落一側(cè)向上，在30℃下生長一夜。然后，將該濾膜放在Whartman濾紙上使菌落一側(cè)向上，在變性溶液(1.5M氯化鈉，0.5N氫氧化鈉)中浸泡20分鐘。在變性后，將該濾膜放在Whartman濾紙上，在中和溶液(3M氯化鈉，1.5MTris-HCl，pH7.0)中浸泡20分鐘。最后，用3×SSC(1×SSC＝0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉)洗滌濾膜，以便除去細胞碎片，并在真空烘箱中在80℃下烘烤90分鐘。用T4多核苷酸激酶用[γ-32P]ATP對cry9專一性寡核苷酸pr56(大約10皮摩爾)進行末端標記。該標記反應在37℃下進行20分鐘，并通過在100℃下培養(yǎng)該反應物3分鐘終止反應。在乙醇沉淀之后，將標記過的寡核苷酸重新懸浮在100微升蒸餾水中。在47℃下在6×SSC、10×denhardt’s溶液、0.5％甘氨酸、0.2％SDS中將所述濾膜與cry9專一性探針一起培養(yǎng)一夜。在47℃下用3×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜2次，每次15分鐘，并在47℃下用1×SSC、0.1％SDS洗滌濾膜2次，每次15分鐘。在-70℃下用干燥的濾膜對X-OMATXAR-5膠片(Eastman柯達公司)進行曝光，使用增感屏。所產(chǎn)生的放射性自顯影出現(xiàn)了含有能與cry9探針雜交的DNA的蘇云金芽孢桿菌的24種分離物。為了鑒定這些菌株中cry9C型基因，設計了對cry9C基因(GenBank保藏號Z37527)專一的兩種相反的寡核苷酸引物，以便用于聚合酶鏈式反應分析。Pr58的序列為5’-CGACTTCTCCTGCTAATGGAGC-3’(SEQIDNO53)。Pr59的序列為5’-CTCGCTAATAGTAACACCGTTACTTGCC-3’(SEQIDNO54)。從被認為含有cry9型基因的蘇云金芽孢桿菌的分離物中分離質(zhì)粒DNA。蘇云金芽孢桿菌分離物在30℃下在Luria瓊脂平板上生長一夜，并將每一種分離物的二接種環(huán)的細胞懸浮在50mM葡萄糖、10mMTris-HCl、1mMEDTA(1×GTE)中，其中含有4毫克/毫升溶菌酶。在室溫下培養(yǎng)10分鐘之后，用標準堿性裂解方法提取質(zhì)粒DNA(Maniatis等，1982)。將該質(zhì)粒DNA重新懸浮在20微升1×TE(10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH7.5)中。將2微升質(zhì)粒DNA制劑用于PCRTM反應。擴增是用Perkin-ElmerDNA熱循環(huán)儀(Perkin-ElmerCetus，F(xiàn)osterCity，CA)在100微升體積中進行的，使用Perkin-ElmerGeneAmpTM試劑盒中所提供的材料和方法。PCRTM的條件如下95℃30秒，46℃30秒，70℃1分鐘；30輪。以cry9基因為模板使用上述引物進行的PCRTM應當?shù)玫酱蠹s970bp的DNA片段。在能與cry9探針雜交的24個菌株中僅有1個菌株EG9290產(chǎn)生了預測的擴增DNA片段。6.4例4-通過構(gòu)建MBOI部分消化文庫克隆蘇云金芽孢桿菌毒素基因在構(gòu)建基因組DNA文庫時使用限制性內(nèi)切酶MboI是因為它具有4個堿基對的識別序列，該序列通常出現(xiàn)在長的DNA片段上。按6.1節(jié)所披露的方法從蘇云金芽孢桿菌中分離總基因組DNA。在能對DNA鏈進行有限的裂解的條件下消化該DNA。業(yè)已披露了確定上述條件的方法(Maniatis等，1982)。以這種方式消化DNA，產(chǎn)生了一組基本上隨機裂解的、重疊片段，用這些片段制備代表完整基因組的文庫。通過在0.6％的瓊脂糖，1×TBE凝膠上以2伏/厘米凝膠長度的電壓進行瓊脂糖凝膠電泳過夜，根據(jù)大小分離消化過的DNA片段。用溴化乙錠對凝膠進行染色，以便在長波紫外光下可以觀察到消化過的DNA。用剃須刀片切除含有大約9-12kb的DNA片段的凝膠條。通過將該凝膠條放入透析袋中用足夠的TE(10mMTris-HCl、1mMEDTA)覆蓋該凝膠條從瓊脂糖中除去DNA片段。然后將透析袋密封并放入裝有1×TBE緩沖液的水平電泳裝置中。以100伏的電壓用2小時時間將DNA從凝膠條中電洗脫到TE中。除去透析袋中的TE，用苯酚∶氯仿(1∶1)提取，然后用氯仿提取。然后通過乙醇沉淀的標準技術收集DNA片段(參見Maniatis等，1982)。為了在大腸桿菌中建立所述部分消化過的DNA的文庫，將所述片段連接到穿梭載體pHT315(Arantes和Lereclus，1991)上。該質(zhì)粒含有大腸桿菌和蘇云金芽孢桿菌的復制起點，編碼對抗生素紅霉素和氨芐青霉素的抗性的基因，以及多克隆位點。將所述MboI的片段與BamHI消化過的pHT315混合，所述pHT315用小牛腸或細菌堿性磷酸酶(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)處理過，以便除去消化過的質(zhì)粒上的5’-磷酸，避免該載體本身的重新連接。在純化之后，將T4連接酶和連接緩沖液(Promega公司，Madison，WI)添加到含有消化過的載體和MboI片段的反應物中。在15℃下培養(yǎng)該反應物一夜，或者在室溫下培養(yǎng)1小時，以便MboI片段插入并連接到pHT315載體DNA上。然后按照生產(chǎn)商所介紹的方法將連接混合物導入轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌SURE細胞中(Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，CA)。然后將轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌細胞鋪平板到含有50-75微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，并在37℃下培養(yǎng)一夜。在每一個平板上生長的數(shù)百個氨芐青霉素抗性克隆表明了在上述每一個菌落的細胞中重組質(zhì)粒的存在。為了分離具有編碼毒素基因序列的菌落，首先將所述菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。這一目的是通過簡單地將圓形硝酸纖維素濾膜(MilliporeHATF08525，Millipore公司，Bedford，MA)直接放置到含有轉(zhuǎn)化過的菌落的LB氨芐青霉素瓊脂平板上而實現(xiàn)的。當將所述濾膜從所述平板上緩慢剝?nèi)r，粘附在濾膜上的菌落就形成了原始平板上菌落圖案的真實的復制品。有來自每一個菌落的足夠的細胞留在平板上，這些細胞在37℃下生長5-6小時就能恢復其菌落。然后將該平板在4℃下保存待用。然后用具有轉(zhuǎn)移菌落的硝酸纖維素濾膜放在新的LB氨芐青霉素瓊脂平板上，使菌落一側(cè)向上，在37℃下讓其生長直徑大約1毫米。為了從重組大腸桿菌細胞中釋放出DNA，將硝酸纖維素濾膜放在兩張Whatman3MM層析紙上(Whatman國際有限公司，Maidstone，英格蘭)，使菌落一側(cè)向上，在0.5N氫氧化鈉，1.5M氯化鈉中浸泡15分鐘。這一處理能夠裂解細胞并使所釋放的DNA變性，使它粘附在硝酸纖維素濾膜上。然后通過將該濾膜放在兩張Whatman紙上，使菌落一側(cè)向上，在1M乙酸銨，0.02M氫氧化鈉浸泡10分鐘，中和該濾膜。在3×SSC中漂洗該濾膜，風干，并在真空烘箱中在80℃下烘烤1小時。然后該濾膜就可以用探針進行雜交研究，以便鑒定不同類型的蘇云金芽孢桿菌基因，如在上面的實施例中所披露的。為了鑒定含有克隆的cry1相關基因的菌落，用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶對cry1專一性寡核苷酸wd207的5’末端進行標記。將標記過的探針添加到放在3×SSC、0.1％SDS、10×denhardt’s試劑(0.2％BSA、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％Ficoll)、0.2毫克/毫升肝素中的濾膜上，并在47℃下培養(yǎng)一夜。上述條件使得所述標記過的寡核苷酸能與存在于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落的硝酸纖維素膜印跡上的相關序列雜交。在培養(yǎng)之后，通過在45℃下若干次更換3×SSC、0.1％SDS洗滌所述濾膜。將濾膜吸干，并在-70℃下對柯達X-OMATATX光膠片(Eastman柯達公司，Rochester，NY)曝光一夜，使用增感屏。通過將放射性自顯影上的信號與原始轉(zhuǎn)化平板上的菌落進行比較鑒定含有克隆的cry1-相關序列的菌落。然后在LB氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中生長分離的菌落，可以從該培養(yǎng)基中收獲細胞，并按照標準堿性裂解微量制備方法制備重組質(zhì)粒(Manistis等，1982)。然后將質(zhì)粒DNA用作模板進行必要的DNA測序反應，以便證實克隆的基因是新的。如果所克隆的基因是新的，就將該質(zhì)粒導入蘇云金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白陰性菌(Cry-)中，以便能夠表達并鑒定所編碼的蛋白。上述方法詳細披露于以下步驟。6.5例5-克隆特殊的內(nèi)切酶限制片段在第二節(jié)業(yè)已結(jié)合cry2相關基因披露了鑒定含有新型蘇云金芽孢桿菌基因的特殊限制片段的方法?？寺∫阎笮〉南拗破蔚姆椒ɑ旧吓c所述用于克隆MboI片段的方法相同。用限制酶(例如，HindIII)消化DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳，以便根據(jù)大小分離其片段。用剃須刀片切除通過Southern印跡分析(例2)所確定的具有適當大小的片段，并將其從凝膠條上電洗脫到TE緩沖液中，然后從TE緩沖液中沉淀。然后將分離的限制片段連接到大腸桿菌/蘇云金芽孢桿菌穿梭載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，以便構(gòu)建按大小選擇的文庫。然后按例4所述方法用特殊的基因探針與該文庫雜交，以便分離含有克隆的新型基因的菌落。6.6例6-克隆PCRTM擴增的片段一種用于克隆并表達來自蘇云金芽孢桿菌新型的cry1基因片段的快速方法是用聚合酶鏈式反應發(fā)展起來的。設計旁側(cè)引物以便與cry1基因的5’末端和內(nèi)部的保守區(qū)退火，除了某些cry3基因之外，大多數(shù)蘇云金芽孢桿菌cry基因是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的，至少在一定程度上是由含有親本細胞專一性σE或sigE、σ因子的RNA聚合酶調(diào)控的。所述σE-調(diào)控的cry基因具有被σE識別的5’啟動子序列。比較這些啟動子序列發(fā)現(xiàn)了明顯的序列變異，盡管可以鑒定到共有序列(Baum和Malvar，1995)。設計了一種被稱為“sigE”的引物，它含有與cry1AcσE序列相同的序列，該引物能與未鑒定的cry基因的5’末端相關σE啟動子序列退火。SigE引物還含有BbuI位點(同切點酶SphI)，以便克隆擴增的片段。SigE引物的序列如下5’-ATTTAGTAGCATGCGTTGCACTTTGTGCATTTTTTCATAAGATGAGTCATATGTTTTAAAT-3’(SEQIDNO55)。被稱為KpnR的反向引物能與cry1基因的3’附近的區(qū)域退火，該區(qū)域通常是保守的。該引物具有一個在cry1A基因之間保守的Asp718位點(同切點酶KpnI)，以便克隆擴增的片段，并能夠構(gòu)建含有Cry1Ac蛋白的羧基末端部分的融合蛋白。KpnR引物的序列如下5’-GGATAGCACTCATCAAAGGTACC-3’(SEQIDNO56)用PerkinElmerDNA熱循環(huán)儀和以下參數(shù)進行PCRTM94℃，2分鐘；94℃30秒，40輪；40℃2分鐘；72℃3分鐘；在72℃下進行20輪培養(yǎng)之后再進行10秒鐘的延伸。對標準PCRTM緩沖液(體積100微升)進行改進，使其含有1×TaqExtender緩沖液，sigE和KpnR引物各25微摩爾，0.5-1.5微升Taq(Stratagene公司)和0.5-1.0微升Taq聚合酶。通常，在PCRTM中含有來自新型蘇云金芽孢桿菌分離物的1-2微升DNA制劑。用結(jié)合了上述引物的cry基因進行的PCRTM能導致大約2.3kb的DNA片段擴增，其旁側(cè)是BbuI和Asp718的限制位點。為了克隆并表達上述基因片段，使用cry1Ac穿梭載體pEG1064。該質(zhì)粒來自cry1Ac穿梭載體pEG857(Baum等，1990)，進行了以下改進。通過用限制性內(nèi)切酶NcoI裂解pEG857在cry1Ac編碼區(qū)內(nèi)的單一的NcoI位點上產(chǎn)生移碼突變，用Klenow聚合酶補平NcoI產(chǎn)生的末端，并用T4連接酶連接所述平端。用類似方法除去位于cry1Ac基因的3’末端的多克隆位點上的Asp718位點，只留下包含在cry1Ac編碼序列的單一的Asp718位點。在導入蘇云金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白陰性菌株內(nèi)之后由于所述移碼突變所得到的不能指導質(zhì)粒pEG1064結(jié)晶蛋白的生產(chǎn)，為了克隆并表達未知的cry基因，用BbuI和Asp718裂解pEG1064，并通過凝膠電泳純化載體片段。通過PCRTM擴增總的蘇云金芽孢桿菌DNA獲得未知cry基因的擴增片段，用限制性內(nèi)切酶BbuI和Asp718進行消化，并連接到pEG1064載體片段的BbuI和Asp718位點上。用以前所披露的電穿孔方法(Mettus和Macaluso，1990)用所述連接混合物轉(zhuǎn)化氯霉素抗性的Cry-蘇云金芽孢桿菌菌株EG10368或EG10650。通過相差顯微鏡評估氯霉素抗性分離物的結(jié)晶蛋白生產(chǎn)能力。然后讓能形成結(jié)晶的分離物(Cry+)在C2液體培養(yǎng)基(Donovan等，1988)中生長，以便獲得結(jié)晶蛋白用于SDS-PAGE分析和昆蟲生物實驗。由于發(fā)生在cry1Ac基因上的移碼突變，從轉(zhuǎn)化體中所獲得的結(jié)晶蛋白不可能來自載體pEG1064。因此，Cry-轉(zhuǎn)化體含有未知的cry基因片段，該片段在Asp718位點上與cry1Ac基因的3’部分融合。推測該基因融合體在蘇云金芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)錄是由整合在擴增的cry基因片段上的SigE啟動子啟動的。所述融合蛋白含有未知Cry蛋白的完整的活性毒素區(qū)、它能夠在蘇云金芽孢桿菌中產(chǎn)生結(jié)晶。6.7例7-克隆cry9相關基因從蘇云金芽孢桿菌菌株EG9290中分離總的DNA用于克隆研究。讓EG9290在30℃下在1倍腦心浸漬液、0.5％甘油(BHIG)中生長一夜。在上午，將過夜生長物懸浮在50微升BHIG中，并在30℃下攪拌培養(yǎng)該培養(yǎng)物，直到培養(yǎng)物的Klett讀數(shù)達到150(紅色濾膜)。通過離心收集細胞，懸浮在含有4毫克/毫升溶菌酶和100微克/毫升RNaseA的5毫升1×GTE緩沖液中，并在37℃下培養(yǎng)20分鐘。通過添加0.5毫升20％SDS裂解細胞。通過添加2.5毫升7.5M的乙酸銨和1毫升異丙醇使所釋放出的DNA沉淀。用玻璃微量移液管纏繞沉淀的DNA將其從混合物中取出，并用80％乙醇洗滌。將DNA重新懸浮在1×TE中，分別用1體積的緩沖過的苯酚和氯仿∶異戊醇(24∶1)提取，并按上述方法沉淀。纏繞取出的DNA用80％乙醇洗滌，風干數(shù)分鐘，并懸浮在600微升1×TE中。估計DNA的濃度為500微克/毫升。利用部分消化的EG9290DNA的MboI片段和本文所披露的一般方法構(gòu)建EG9290總DNA的文庫。將部分MboI片段插入克隆載體pHT315的單一的BamHI位點，利用電感受態(tài)細胞和由Stratagene(LaJolla，CA)所提供的方法以及BioRadGenePulserTM裝置(Bio-Rad實驗室，Hercules，CA)通過電穿孔將所述連接混合物用于轉(zhuǎn)化抗氨芐青霉素的大腸桿菌SureTM細胞。用32P標記過的探針進行菌落吸印雜交鑒定具有cry9型基因的重組克隆，所述探針由通過用引物pr58和pr59擴增EG9290DNA所產(chǎn)生的推測的cry9C片段組成。通過Mettus和Macaluso(1990)所披露的電穿孔方法用來自大腸桿菌重組克隆的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化抗紅霉素的蘇云金芽孢桿菌菌株EG10368。將細胞鋪平板到含有20微克/毫升紅霉素的淀粉瓊脂平板上，并在30℃下培養(yǎng)。6天之后，從所述平板上回收具有透明度較低外觀的菌落，并劃線接種到含有20微克/毫升紅霉素的新的淀粉瓊脂平板上，以便分離單菌落。通過相差顯微鏡發(fā)現(xiàn)具有透明度較低的外觀的菌落能產(chǎn)生大的伴胞包含體/結(jié)晶。在液體培養(yǎng)基中評估能產(chǎn)生伴胞包含體/結(jié)晶的重組EG10368克隆結(jié)晶蛋白產(chǎn)量。將單一菌落接種到含有10微克/毫升紅霉素的C2培養(yǎng)基，并在30℃下生長3天，在此期間，該培養(yǎng)物充分產(chǎn)生了孢子并裂解。通過離心使孢子和結(jié)晶沉淀，并重新懸浮在20mMTris-HCl、1mMEDTA，pH7.0中。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析該材料的樣品。發(fā)現(xiàn)最初被確定為9290-2和9290-3的兩個EG10368重組克隆能產(chǎn)生特有的大約130kDa的蛋白。將9290-2命名為EG12102，而9290-3被，命名為EG12103。EG12102蛋白被命名CryET59，EG12103蛋白被命名CryET60。利用標準堿性裂解方法由EG12102和EG12103制備質(zhì)粒DNA。用限制性內(nèi)切酶XbaI消化該質(zhì)粒證實這兩種菌株具有獨特的cry基因。EG12102和EG12103的cry質(zhì)粒被分別命名為pEG945和pEG946，將其用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化抗氨芐青霉素的大腸桿菌SureTM細胞，采用由stratagene公司所提供的電感受態(tài)細胞和方法。含有pEG945的大腸桿菌重組菌株被命名為EG12132，含有pEG946的大腸桿菌重組菌株被命名為EG12133。利用Qiagenmidi柱質(zhì)粒純化試劑盒和方法(Qiagen公司，Valencia，CA)從所述大腸桿菌重組菌株中純化pEG945和pEG946。用類似方法從蘇云金芽孢桿菌菌株EG6346的aizawai亞種克隆cryET83基因。對來自EG6346的基因組DNA進行Southern印跡分析發(fā)現(xiàn)了能與cryET59探針雜交的獨特的限制片段。設計一系列簡并寡核苷酸引物pr95、pr97和pr98，以便擴增來自基因組DNA的與cry9相關的序列。所述引物的序列如下pr955’-GTWTGGACSCRTCGHGATGTGG-3’(SEQIDNO57)pr975’-TAATTTCTGCTAGCCCWATTTCTGGATTTAATTGTTGATC-3’(SEQIDNO58)pr985’-ATWACNCAAMTWCCDTTRG-3’(SEQIDNO59)其中，D＝A，G；H＝A，C，T；M＝A，C；N＝A，C，G，T；R＝A，G；S＝C，G；和W＝A，T。利用Taq聚合酶、TaqExtenderTM、反向引物pr95和pr97以及總的EG6346DNA進行的PCRTM得到了一種DNA片段，該片段在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上看上去很微弱。將該DNA用作利用反向引物pr97和pr98進行第二輪PCRTM的模板。所得到的擴增DNA片段適用于克隆并用作隨后的克隆實驗的雜交探針。將EG6346DNA的部分消化過的9-12kb的MboI片段連接到克隆載體pHT315的獨特的BamHI位點上構(gòu)建EG6346總DNA的文庫。通過菌落吸印雜交鑒定具有cryET83基因的重組大腸桿菌克隆，利用EG6346專一性DNA片段作為化學發(fā)光雜交探針，并利用購自NENTM生命科學制品(Boston，MA)的CDP-StarTM核酸化學發(fā)光制劑試劑盒制備該雜交探針。將具有cryET83基因的重組質(zhì)粒命名為pEG397。將含有pEG397的大腸桿菌重組菌株命名為EG11786。將含有pEG397的蘇云金芽孢桿菌重組菌株命名為EG11785。6.8例8-對克隆的蘇云金芽孢桿菌毒素基因進行測序按照已經(jīng)建立的雙脫氧鏈終止DNA測序方法(Sanger等，1977)制定克隆的毒素基因的部分序列。雙鏈質(zhì)粒模板DNA的制備是用標準顯性裂解方法或利用Qiagen質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen公司，Valencia，CA)實現(xiàn)的。測序反應是用SequenaseTM2.0版DNA測序試劑盒(美國生物化學/Amersham生命科學公司，Cleveland，OH)，按照生產(chǎn)商的方法，并使用35S-dATP作為標記同位素(購自杜邦NEN研究制品，Boston，MA)進行的。在6％(重量/體積)丙烯酰胺，42％(重量/體積)尿素測序凝膠上進行該反應物的變性凝膠電泳。在室溫下讓干燥的凝膠對柯達X-OMATARX光膠片(Eastman柯達公司，Rochester，NY)曝光一夜。另外，用自動測序方法對某些cry基因進行測序。用ABIPRISMTM染料脫氧測序化學試劑盒(應用生物系統(tǒng)，F(xiàn)osterCity，CA)按照生產(chǎn)商推薦的方法對DNA樣品進行測序。完成的反應物在ABI377自動DNA測序儀上測序。用SequencherTM3.0版DNA分析軟件(基因編碼公司，AnnArbor，MI)分析DNA序列數(shù)據(jù)。根據(jù)前面反應的測序數(shù)據(jù)設計用于啟動測序反應的連續(xù)的寡核苷酸。將利用在例2所披露的寡核苷酸探針wd207所測定的cry1相關基因的序列用作原始測序引物。該寡核苷酸能與cry基因的保守區(qū)退火。但由于wd207的方向是顛倒的和相反的，它產(chǎn)生朝向編碼區(qū)5’末端的序列，使得該基因的可變區(qū)的序列可讀。通常對250-300個核苷酸進行測序就足于測定該基因的身份。如果需要更多的資料，可以合成一種或多種其他的寡核苷酸，以便延續(xù)該序列，直到能夠確定該序列是否是單一的。在wd207不能作為引物很好地發(fā)揮作用的情況下，使用被設計用于與cry基因的保守區(qū)退火的其他寡核苷酸。一種這樣的寡核苷酸是上文所披露的KpnR引物。對克隆的cry2相關基因的測序采用所述對cry1基因進行測序的相同的通用方法，所不同的是，使用對cry2基因上的保守區(qū)專一的寡核苷酸作為測序引物。用于該實施例中的兩種引物是wd268和wd269，如下文所示。引物wd268相當于cry2Aa的579-597號核苷酸5’-AATGCAGATGAATGGGG-3’(SEQIDNO60)。引物wd269相當于cry2Aa的1740-1757號核苷酸5’-TGATAATGGAGCTCGTT-3’(SEQIDNO61)。CryET59和cryET60的測序是用引物pr56開始的。CryET83的測序是用引物pr98開始的。用于測序反應的連續(xù)的寡核苷酸是根據(jù)以前反應的測序資料設計的。使用PC/GENE序列分析包(Intelligenetics，MoontainView，CA)中的FSTNSCAN程序?qū)⑺玫降男蛄信c已知cry基因序列進行比較。該分析可以對克隆的cry基因相對已知的cry基因作出初步的分類(表11)。表6.DNA序列的同源性比較11FSTNSCAN的Ktup值設定為2。利用PC/GENE序列分析包中的FASTA程序(Ktup＝6)比較cryET59和cryET60序列。6.9例9-在蘇云金芽孢桿菌宿主中表達克隆的毒素基因從通過與一種基因?qū)Ｒ恍蕴结橂s交鑒定的大腸桿菌菌落中分離質(zhì)粒DNA。然后利用Mettus和Macaluso(1990)的電穿孔方法將所分離的質(zhì)粒導入蘇云金芽孢桿菌的結(jié)晶蛋白陰性菌株中。所使用的每一種克隆載體(參見表5)具有一個能賦予獲得該質(zhì)粒細胞抗生素抗性的基因。通過在含有25毫克/毫升紅霉素(pHT315)或5毫克/毫升氯霉素(pEG597或pEG1064)的瓊脂平板上生長篩選蘇云金芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體。然后通過相差顯微鏡評估抗生素抗性菌落的結(jié)晶蛋白生產(chǎn)能力。然后在C2培養(yǎng)基(Donovan等，1988)上生長能產(chǎn)生結(jié)晶的菌落，以便獲得通過SDS-PAGE和昆蟲生物實驗進行分析的培養(yǎng)物。用來自Cry+菌落的細胞接種C2培養(yǎng)物，并在25-30℃下，在有合適抗生素的條件下生長3天。在此期間，培養(yǎng)物生長到穩(wěn)定階段，產(chǎn)生孢子并裂解，將蛋白包含體釋放到培養(yǎng)基中。通過離心收獲培養(yǎng)物，離心能夠使孢子和結(jié)晶沉淀。用0.005％TritonX-100，2mMEDTA溶液洗滌該沉淀，并再次離心。將洗滌的沉淀以1/10原始體積重新懸浮在0.005％TritonX-100，2mMEDTA中。通過在100℃下將該所述懸浮液在溶解緩沖液中培養(yǎng)5分鐘將結(jié)晶蛋白從孢子-結(jié)晶懸浮液中溶解出來。利用丙烯酰胺濃度為10％的凝膠通過SDS-PAGE對溶解的結(jié)晶蛋白進行大小分離。在大小分離之后，通過用考馬斯亮蘭R-250染色觀察蛋白。Cry1和Cry9相關結(jié)晶蛋白的預期大小大約為130kDa。Cry2相關結(jié)晶蛋白的預期大小大約為65kDa。6.10例10-克隆的蘇云金芽孢桿菌毒素基因的殺蟲活性在C2培養(yǎng)基中生長能產(chǎn)生單一克隆的cry基因的蘇云金芽孢桿菌重組菌株，直到該培養(yǎng)物充分地產(chǎn)生孢子并裂解。將C2培養(yǎng)物用于評估所產(chǎn)生的結(jié)晶蛋白的殺蟲活性。每一種培養(yǎng)物用0.005％TritonX-100進行稀釋，以便獲得用于兩劑生物測定篩選的合適的稀釋液。將50微升每一種稀釋液局部加樣到32個孔中，每一個孔含有1.0毫升人工飲食(表面積為175平方毫米)。在每一個處理過的孔中放入一條鱗翅目幼蟲，并用透明的有孔的米拉布覆蓋托盤。除了P.xylostella生物實驗之外，該實驗使用的三齡期幼蟲，所有生物實驗都是用新生幼蟲進行的。在28-30℃下飼養(yǎng)7天之后統(tǒng)計幼蟲死亡率，并將百分死亡率表達為死亡的幼蟲數(shù)量相對處理過的幼蟲總數(shù)的比例(表12)。在某些場合下，在7天之后觀察到了對幼蟲生長的嚴重阻礙，同樣記錄受到阻礙/未受到阻礙幼蟲的比例。在表7中所給出的生物實驗結(jié)果表明，由重組蘇云金芽孢桿菌菌株所產(chǎn)生的結(jié)晶蛋白確實具有殺蟲活性，而且，該結(jié)晶蛋白對所實驗過的鱗翅目昆蟲具有不同的活性。表7A.用ET結(jié)晶蛋白進行的生物實驗評估甜菜夜蛾草地貪夜蛾表7B.用ET結(jié)晶蛋白進行的生物實驗評估PlutellaxylostellaOstrinianubilalis250nl/孔2500nl/孔#受到阻礙250nl/孔2500nl/孔#受到阻礙％死亡率％死亡率/#處理％死亡率％死亡率/#處理Cry1Ac10010001001000ET310201001000ET400680002/32ET4351000461000ET44000003/32ET45000004/32ET46080000ET4710010001001000ET49050000ET51000000ET52243001416/32ET5389704465/32ET5414100025891/32ET56000000ET570970070ET591001000961000ET601001000100960ET610110002/32ET629710001001000ET6310010001001000ET64401000681000ET661001000861000ET678710000791/32ET72000000ET73220931000對照220000表7C.用ET結(jié)晶蛋白進行的生物實驗評估HeliothisvirescensHelicoverpazea表7D.用ET結(jié)晶蛋白進行的生物實驗評估AgrotisipsilonTrichoplustani其他的生物實驗是用被稱為CryET59、CryET60、CryET66和CryET83的結(jié)晶蛋白進行的。利用Brussock，S.M.和Currier，T.C.所披露的方法通過SDS-PAGE和粒度測定方法對在C2培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的結(jié)晶蛋白進行定量1990，“利用SDS-PAGE對蘇云金芽孢桿菌δ內(nèi)毒素進行定量”，參見蘇云金芽孢桿菌的分析化學(L.A.Hickle和W.L.Fitch著)，美國化學協(xié)會，78-87頁。表8-CryET59和CryET60的生物實驗評估1AI＝Agrotisipsilon，HV＝Heliothisvirescerns，HZ＝HelicoverpazeaON＝Ostrinianubilalis，PX＝Plutellaxylostella，rPX＝PlutellaxylostellacolonyresistanttoCrylAandCryIFtoxins，SE＝Spodopteraexigua，TN＝Trichoplusiani.2對照＝不添加毒素對所述方法進行改進，以便取消用3MHEPES進行的綜合步驟。通過用分子動態(tài)模型300A計算密度測定儀和純化的牛血清白蛋白(Pierce，Rockford，IL)作模板進行的密度測定對通過SDS-PAGE分離的結(jié)晶蛋白進行定量。在表8中所示的生物實驗結(jié)果表明，CryET59和CryET60對多種鱗翅目昆蟲有毒素，包括對Cry1A和Cry1F結(jié)晶蛋白有抗性的P.xylostella菌落。用CryET66進行的8種劑量測定證實了對P.xylostella的易感和抗性菌落的良好的毒素(表14)。在這種情況下，通過用0.005％TritonX-100對結(jié)晶蛋白懸浮液進行系列稀釋制備8種結(jié)晶蛋白濃度，并將50微升每一種濃度的稀釋液局部添加到含有1.0毫升人工飲食的孔中。在所述孔干燥以后，將一條幼蟲放入每一種處理過的孔中，并用透明的有孔的米拉布覆蓋托盤(每一種結(jié)晶蛋白濃度使用32條幼蟲)。在28-30℃下飼養(yǎng)7天之后，統(tǒng)計幼蟲死亡率，死亡率數(shù)據(jù)表達為LC50和LC95，分別為導致50％和95％死亡率的結(jié)晶蛋白濃度(納克/175平方毫米飲食孔)(Daum，1970)。表9CryET66對Plutellaxylostella的毒性CryET66對Cry1A抗性Plutellaxylostella的毒性1結(jié)晶蛋白濃度，為要達到50％的死亡率每孔所需要的結(jié)晶蛋白納克數(shù)2結(jié)晶蛋白濃度，為要達到95％的死亡率每孔所需要的結(jié)晶蛋白納克數(shù)表15表示CryET83蛋白對多種鱗翅目害蟲具有毒性，并且與其他Cry9型蛋白CryET59和CryET60相比對S.exigua和H.virescens具有改善了的毒性。表10-CryET83對鱗翅目幼蟲的毒性11以處理過的幼蟲的百分死亡率計算的毒性2納克CryET83結(jié)晶蛋白/175平方毫米飲食孔3表8中所披露的縮略語；SF＝草地灘夜蛾表5中的重組蘇云金芽孢桿菌菌株交由ARS專利培養(yǎng)物保藏中心保藏，并被授予了表11所示的NRRL保藏號。表11.生物學保藏物6.11例11-修飾cry基因，以便在植物中表達已知無論是完整長度的或是截短的野生型cry基因在植物中的表達都很差。通常cry基因的G+C含量較低(37％)，并且通常含有很多富含A+T的區(qū)，潛在的聚腺苷酸化位點和多個ATTTA序列。表12示出了潛在的聚腺苷酸化序列，這些序列在制備“植物化”基因結(jié)構(gòu)時應當避免表12-潛在聚腺苷酸化信號的序列表*表示潛在的主要植物聚腺苷酸化位點**表示潛在的次要動物聚腺苷酸化位點所有其他的是潛在次要植物聚腺苷酸化位點可以誘變的區(qū)域可以按以下方式選擇。對cry基因的DNA序列的所有區(qū)進行了鑒定，這些區(qū)含有5個或5個以上連續(xù)的堿基對，這些堿基對是A或T。根據(jù)長度在20-30個堿基對區(qū)域上的周圍序列中A+T的最高百分比將其分類。分析所述DNA的有可能含有聚腺苷酸化位點或ATTTA序列的區(qū)域。然后設計寡核苷酸，它能最大限度地A+T連續(xù)區(qū)，它含有一個或多個聚腺苷酸化位點或ATTTA序列。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的報導，有2個潛在的植物聚腺苷酸化位點業(yè)已被證實更為重要。篩選能提高G+C含量的密碼子，但不能產(chǎn)生可用于克隆并組裝該修飾過的基因的酶的限制位點(例如，BamHI、BglII、SacI、NcoI、EcoRV等)。要避免含有雙鏈體TA或GC的類似密碼子，有報導這些密碼子是植物中經(jīng)常出現(xiàn)的密碼子。盡管CaMV35S啟動子通常在大多數(shù)植物組織中是高水平的組成型啟動子，但相對在葉片組織中的水平而言，在花組織中有CaMV35S啟動子啟動的基因的表達水平較低。由于受到某些昆蟲損害的經(jīng)濟學上重要的目標是花部分或由花產(chǎn)生的部分(例如，棉蕾和棉桃、煙草花芽、番茄芽和果實)，相對由CaMV35S啟動子所獲得的水平而言增強在上述組織結(jié)晶蛋白的表達通常是有利的。玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子與CaMV35S啟動子類似。業(yè)已分離了該啟動子并且工程連接到植物轉(zhuǎn)化載體上。相對CaMV35S啟動子，F(xiàn)MV35S啟動子在花組織中是高水平表達的，同時還能在諸如葉片的其他組織中提供同樣高水平的基因表達?？梢詷?gòu)建一種植物轉(zhuǎn)化載體，其中，完整長度的合成cry基因是由FMV35S啟動子啟動的?？梢杂盟鲚d體轉(zhuǎn)化煙草植物，并通過Western印跡或ELISA免疫測定比較結(jié)晶蛋白在葉片和花組織中的表達。業(yè)已將FMV啟動子用于在花組織中產(chǎn)生相對CaMV啟動子而言較高水平的結(jié)晶蛋白。6.12例12-用fsRUBISCO啟動子和葉綠體轉(zhuǎn)運肽表達合成的cry基因植物中編碼RUBISCO小亞基(SSU)的基因通常是高水平表達的，受光線調(diào)控的，并且有時候表現(xiàn)出組織專一性。上述表達特殊在很大程度上取決于該基因的啟動子序列。在轉(zhuǎn)化過的植物中用SSU啟動子表達異源基因是可能的。通常，植物含有多個SSU基因，并且不同SSU基因的表達水平和組織專一性也不同。SSU蛋白是在細胞核中編碼的，并且以前體形式在細胞質(zhì)中合成，它含有被稱為葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)的N-末端延長部分。CTP將所述前體引導至葉綠體中，并促進SSU蛋白被吸收到葉綠體中。在這一過程中，CTP被從SSU蛋白上裂解下來。業(yè)已將CTP序列用于將異源蛋白引導至轉(zhuǎn)化植物的葉綠體中。SSU啟動子具有用于在植物中表達異源基因的若干優(yōu)點。某些SSU啟動子是高水平表達的，并且能產(chǎn)生與它一樣高或高于用CaMV35S啟動子所獲得的表達水平。由SSU啟動子表達的組織分布與CaMV35S啟動子的分布不同，因此，為了控制某些害蟲，將結(jié)晶蛋白的表達定向到SSU能最高水平表達的細胞中是有利的。例如，盡管相對來說它是組成型的，在葉片中，CaMV35S啟動子在微管組織中的表達高于在葉片其他部分的表達，而大多數(shù)SSU啟動子在葉片的葉肉細胞中表達水平最高。某些SSU啟動子也是組織專一性較高的，因此，可以利用專一性SSU啟動子僅在一小類植物組織中表達本發(fā)明的蛋白，如果發(fā)現(xiàn)這種蛋白在某些細胞中的表達對該細胞是有害的話。例如，為了控制科羅拉多馬鈴薯象甲，最好利用SSU啟動子指導結(jié)晶蛋白在葉片中表達，而不是在可食用的塊莖中表達。利用SSUCTP序列將結(jié)晶蛋白定位到葉綠體中也可能是有利的。將蘇云金芽孢桿菌結(jié)晶蛋白定位到葉綠體中可以保護這種蛋白不受細胞質(zhì)中的蛋白酶的破壞。這可以穩(wěn)定該蛋白，并導致積累較高含量的活性毒素。含有CTPcry基因可以與SSU啟動子或諸如CaMV35S的其他啟動子組合使用。6.13例13-利用信號肽將Cry蛋白定向到胞外空間或液泡中由本文所披露的合成基因所產(chǎn)生的蘇云金芽孢桿菌蛋白位于植物細胞的細胞質(zhì)中，并且這種細胞質(zhì)定位會使得該植物具有殺蟲效果。對于某些用途來說，將蘇云金芽孢桿菌蛋白引導至植物細胞的其他區(qū)室可能是有利的。將蘇云金芽孢桿菌蛋白定位于除細胞質(zhì)以外的其他區(qū)室可能會導致使蘇云金芽孢桿菌蛋白較少地接觸細胞質(zhì)蛋白酶，從而更多地積累這種蛋白增強殺蟲活性。胞外定位可以導致使某些昆蟲更有效地接觸蘇云金芽孢桿菌蛋白，產(chǎn)生更大的效力。如果發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌蛋白對植物細胞功能有損傷，將這種蛋白定位于非細胞質(zhì)區(qū)室可以保護該細胞不受這種蛋白的破壞。在植物以及其他真核生物中，被指定定位于胞外或若干特定的區(qū)室中的蛋白通常是以具有被稱為信號肽的N-末端氨基酸延長部分形式合成的。該信號肽能指導所述蛋白進入?yún)^(qū)室化途徑，并且在區(qū)室化過程中作為早期步驟從成熟蛋白上裂解下去。對于胞外蛋白來說，分泌途徑通常包括共同翻譯插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并在這一階段裂解信號肽。然后成熟蛋白通過高爾基體進入小泡，小泡與質(zhì)膜融合從而將蛋白釋放到胞外空間。預定進入其他區(qū)室的蛋白也遵循類似的途徑。預定進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的蛋白也遵循該方案，但這種蛋白特別局限于合適的區(qū)室中。在植物中，某些蛋白也定向于液泡，它是很多植物細胞的細胞質(zhì)中另一種膜結(jié)合區(qū)室。液泡定向蛋白在高爾基體處偏離上述途徑，從這里它進入會與液泡融合的小泡。這種蛋白定向的共同特征是啟動區(qū)室化過程的信號肽。將信號肽與蛋白融合在很多場合下會導致該蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定向。這一步驟的效率也有可能取決于成熟蛋白本身的序列。將蛋白定向到特定區(qū)室而不是胞外間隙的信號尚未明確定義。將所述蛋白引導至特定區(qū)室的很多所述信號似乎包含在所述成熟蛋白的氨基酸序列內(nèi)。對于某些液泡定向蛋白來說已經(jīng)證實了這一點，但尚不可能精確地確定所述序列。對于含有信號序列而不是其他區(qū)室化信號的蛋白來說，分泌到胞外間隙中似乎是“預設的”。因此，將蘇云金芽孢桿菌蛋白引導至細胞質(zhì)外面的方法是將合成的蘇云金芽孢桿菌基因與編碼已知植物信號肽的DNA序列融合。這種融合基因能產(chǎn)生進入分泌途徑的蘇云金芽孢桿菌蛋白，并導致朝向液泡或其他區(qū)室的胞外分泌或定向。業(yè)已披露了若干植物基因的信號序列。早先已經(jīng)公開了煙草致病相關蛋白PR1b的上述序列(Cornelissen等，1986)。PR1b蛋白通常定位于胞外空間。另一種類型的信號肽包含在豆類的種子儲存蛋白上。所述蛋白定位于種子的蛋白體上，它是存在于種子中的液泡樣區(qū)室。業(yè)已披露了菜豆7S儲存蛋白β亞基的信號肽DNA序列PvuB(Doyle等，1986)。根據(jù)公開的上述序列，可以用寡核苷酸化學合成編碼PR1b和PvuB的信號肽的基因。在某些場合下，為了實現(xiàn)異源蛋白的分泌或區(qū)室化，有必要在信號肽的正常裂解位點之外包括某些氨基酸序列。這對于確保信號肽的正確裂解來說是必要的。6.13例14-利用cry轉(zhuǎn)基因分離抗蟲的轉(zhuǎn)基因植物6.14.1植物基因構(gòu)建以雙鏈DNA形式存在的植物基因的表達包括通過RNA聚合酶由所述DNA的一股鏈轉(zhuǎn)錄mRNA，然后在細胞核內(nèi)對mRNA初級轉(zhuǎn)錄物進行加工。這一過程涉及到3’非翻譯區(qū)，它向RNA的3’末端添加聚酰苷酸核苷酸。從DNA向mRNA的轉(zhuǎn)錄是由一個通常被稱為啟動子的DNA區(qū)遙控的。所述啟動子區(qū)包括一個堿基序列，它向RNA聚合酶發(fā)信號，使它與DNA結(jié)合，并啟動mRNA的轉(zhuǎn)錄，利用所述DNA鏈之一作模板生產(chǎn)相應的RNA鏈。在現(xiàn)有文獻中業(yè)已披露了能在植物細胞中起作用的多種啟動子。所述啟動子可以從植物或植物病毒獲得，并且包括，但不限于胭脂氨酸合成酶(NOS)和章魚氨酸合成酶(OCS)啟動子(由根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒攜帶)，花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子，來自核糖1，5-二磷酸羧化酶的小亞基的光誘導型啟動子(ssRUBISCO，在一種含量很高的植物多肽)，和玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子。業(yè)已將上述所有啟動子用于制備已經(jīng)在植物中表達了的各種類型的DNA結(jié)構(gòu)(例如，參見US5463175，被專門收作本文參考)。所選擇的特定啟動子應當能夠?qū)е旅妇幋a序列的充分表達，以便導致產(chǎn)生有效量的蛋白。一類優(yōu)選的啟動子是組成型啟動子，如CaMV35S或FMV35S啟動子，它們能在大多數(shù)植物器官中高水平表達(例如，參見US5378619，被專門收作本文參考)。另一種類型的優(yōu)選啟動子是根增強或?qū)Ｒ恍詥幼樱鏑aMV衍生的4as-1啟動子或小麥pox1啟動子(US5023179，被專門收作本文參考；Hertig等，1991)。將根增強或?qū)Ｒ恍詥幼佑糜谠谵D(zhuǎn)基因玉米植物上控制玉米切根蟲是特別優(yōu)選的。如果需要，可以對用于本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)(即嵌合植物基因)上的啟動子進行修飾，以便改變其控制特性。例如，可將CaMV35S啟動子連接到ssRUBISCO基因部分，以便在缺乏光照的情況下抑制ssRUBISCO的表達，從而產(chǎn)生能在葉片中起作用但不能在根中起作用的啟動子。所得到的嵌合啟動子可以在本發(fā)明中使用。因此，對于本說明書來說，術語“CaMV35S”啟動子包括CaMV35S啟動子的變異，例如，通過與操縱子連接、隨機或控制誘變等所產(chǎn)生的啟動子。另外，可以改變所述啟動子以便包括多個“增強子序列”，從而有助于增強基因表達。通過本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的RNA還含有5’非翻譯前導序列。該序列可以來自被選擇用于表達該基因的啟動子，并可以進行特別修飾，以便增強mRNA的翻譯。所述5’非翻譯區(qū)還可以從病毒RNA獲得，從合適的真核基因獲得，或從合成基因序列獲得。本發(fā)明不局限于其非翻譯區(qū)來自與啟動子序列相伴的5’非翻譯序列的結(jié)構(gòu)。為了優(yōu)化在諸如玉米的單子葉植物中的表達，所述DNA表達結(jié)構(gòu)應當包括一個內(nèi)含子，該內(nèi)含子通常被放在非翻譯序列中靠近mRNA的5’末端處。該內(nèi)含子可以獲自，但不限于下列一組內(nèi)含子玉米hsp70內(nèi)含子(US5424412；被專門收作本文參考)或水稻Act1內(nèi)含子(McElroy等，1990)，正如下文所述，將玉米hsp70內(nèi)含子用于本發(fā)明中。如上文所述，本發(fā)明的嵌合植物基因的3’非翻譯區(qū)包括能在植物中起作用的聚腺苷酸化信號，導致在RNA的3’末端添加腺苷酸核苷酸。優(yōu)選3’區(qū)的例子有(1)含有農(nóng)桿菌屬Ti質(zhì)?；虻木巯佘账峄盘柕?’轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，所述基因如胭脂氨酸合成酶(NOS)基因和(2)諸如豌豆ssRUBISCOE9基因的植物基因(Fischhoff等，1987)。6.14.2植物轉(zhuǎn)化和表達可以用任何合適方法將含有本發(fā)明的結(jié)構(gòu)編碼序列的基因插入基因組中。合適的植物轉(zhuǎn)化載體包括源于根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的載體，以及披露于以下文獻中的載體，例如，Herrera-Estrella(1983)，Bevan(1983)，Klee(1985)和歐洲專利申請公開號EP0120516。除了來自農(nóng)桿菌屬的Ti或Ri質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體之外，還可以用其他方法將本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)插入植物細胞。例如，所述方法可以包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、能增強游離DNA攝取的化合物，通過微粒轟擊進行的游離DNA輸送，以及用病毒或花粉進行轉(zhuǎn)化(Fromm等，1986；Armstrong，1990；Fromm等，1990)。6.14.3構(gòu)建cry基因的單子葉植物表達載體為了在轉(zhuǎn)基因植物是有效表達cry基因，該基因必須具有合適的序列組成(Diehn，1996)。為了將cry基因放在適于在單子葉植物中表達的載體上(即受強化的花椰菜花葉病毒35S啟動子控制，并與hsp70內(nèi)含子連接，隨后是胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位點(如在被專門收作本文參考文獻的US5424412中所披露的)，可以使用諸如pMON19469的載體。所述載體便于用NcoI和EcoRI限制酶消化。然后對大約4.6kb的較大的載體帶進行電泳、純化、并用T4DNA連接酶連接到含有合成的cry基因的NcoI-EcoRI片段上。然后將該連接混合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，回收羧芐青霉素抗性菌落，并通過DNA微量制備方法回收質(zhì)粒DNA。然后使用諸如NcoI和EcoRI(同時)，NotI和/或PstI單獨或組合的酶對所述DNA進行限制性內(nèi)切酶分析，以便鑒定含有與諸如hsp70內(nèi)含子融合的cry編碼序列的，受強化CaMV35S啟動子控制的克隆。為了將所述基因插入適合回收穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的抗蟲植物的載體上，通過凝膠電泳分離并純化來自pMON33708的含有與hsp70內(nèi)含子融合的賴氨酸氧化酶編碼序列并受強化CaMV35S啟動子控制的3.75kbNotI限制片段。然后將該片段與諸如pMON30460的事先用NotI和小牛腸堿性磷酸酶處理過的載體連接(pMON30460含有受CaMV35S啟動子控制的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列)。通過將該連接混合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌獲得卡那霉素抗性菌落，并可以通過對質(zhì)粒微量制DNA進行限制性內(nèi)切酶消化鑒定含有所需質(zhì)粒的菌落?？蓪⒅T如NotI、EcoRV、HindIII、NcoI、EcoRI和BglII的限制酶用于鑒定兩個基因的方向為串聯(lián)關系的合適的克隆(即cry表達框的3’末端與nptII表達框的5’末端連接。通過將載體DNA電穿孔轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體中，然后通過蛋白質(zhì)印跡和ELISA分析證實所得到的質(zhì)粒在玉米原生質(zhì)體中表達的Cry蛋白。大體上按在被專門收作本文參考的US5424412中所披露的方法通過粒子槍轟擊將該載體導入玉米胚胎的基因組DNA，然后通過巴龍霉素選擇獲得能表達cry基因的玉米植物。舉例來說，所述載體可以通過與能產(chǎn)生潮霉素抗性的質(zhì)粒一起共同轟擊導入玉米的未成熟的胚胎盾片(IES)中，然后進行潮霉素選擇并再生。然后通過ELISA分析鑒定能表達cry蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米品系。然后將來自上述過程的后代種子用于測試對昆蟲采食的保護作用。7.0參考文獻下面的參考文獻以及提供對本文所列舉的文獻的補充的代表性方法或其他細節(jié)的程度被專門收作本文參考。U.S.Patent4,196,265，issuedApr.1，1980.U.S.Patent4,554,101，issuedNov.19，1985.U.S.Patent4,683,195，issuedJul.28，1987.U.S.Patent4,683,202，issuedJul.28，1987.U.S.Patent4,757,011，issuedJul.12，1988.U.S.Patent4,769,061，issuedSep.6，1988.U.S.Patent4,940,835，issuedFeb.23，1990.U.S.Patent4,965,188，issuedOct.23，1990.U.S.Patent4,971,908，issuedNov.20，1990.U.S.Patent4,987,071，issuedJan.22，1991.U.S.Patent5,023,179，issuedJun11，1991.U.S.Patent5,176,995，issuedOct.15，1991.U.S.Patent5,334,711，issuedAug.2，1994.U.S.Patent5,378,619，issuedJan3，1995.U.S.Patent5,384,253，issuedJan.24，1995.U.S.Patent5,424,412，issuedJun13，1995.U.S.Patent5,463,175，issuedOct31，1995.U.S.Patent5,631,359，issuedMay20，1997.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO84/02913.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO91/03162.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO92/07065.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO93/15187.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO93/23569.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO94/02595.Int.Pat.Appl.Publ.No.WO94/13688.Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0120516.Eur.Pat.Appl.Publ.No.EP0360257.Eur.Pat.Appl.Publ.No.92110298.4ArantesandLereclus，Gene，108115-119，1991.Abdullahetal.，Biotechnology，41087，1986.Baumetal.，Appl.Environ.Microbiol.，563420-3428，1990.Benbrooketal.，InProceedingsBioExpo1986，Butterworth，Stoneham，MA，pp.27-54，1986.Bevanetal.，NucleicAcidsRes.，11(2)369-85，1983.Bytebieretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，845345，1987.Callisetal.，GenesandDevelopment，11183，1987.Campbell，″MonoclonalAntibodyTechnology，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，″Vol.13，BurdenandVonKnippenberg，Eds.pp.75-83，Elsevier，Amsterdam，1984.Capecchi，″HighefficiencytransformationbydirectmicroinjectionofDNAintoculturedmammaliancells，″Cell，22(2)479-488，1980.Cashmoreetal.，Gen.Eng.ofPlants，PlenumPress，NewYork.29-38，1983.Charleseta.，Annu.Rev.Entomol.，41451-472，1996.Chauetal.，Science，244174-181，1989.Chenetal.，Nucl.AcidsRes.，204581-9，1992.ChowriraandBurke，Nucl.AcidsRes.，202835-2840，1992.Clapp，″Somaticgenetherapyintohematopoieticcells.Currentstatusandfutureimplications，″Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993.CollinsandOlive，Biochem.，322795-2799，1993.ConwayandWickens，InRNAProcessing，p.40，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1988.Cornelissenetal.，Nature，321(6069)531-2，1986.Crickmoreetal.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62807-813，1998.Cristouetal.，PlantPhysiol.，87671-674，1988.Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，″Adenovirusenhancementoftransferrin-polylysine-mediatedgenedelivery，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)8850-8854，1991.Curiel，Wagner，Cotten，Bimstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，″High-efficiencygenetransfermediatedbyadenoviruscoupledtoDNA-polylysinecomplexes，″Hum.Gen.Ther.，3(2)147-154，1992.Deanetal.，Nucl.AcidsRes.，14(5)2229，1986.Dhir，S.K.，Dhir，S.，Hepburn，A.，andWidholm，J.M.，“FactorsaffectingtransientgeneexpressioninelectroporatedGlycine-maxprotoplasts，”PlantCellRep.，10(2)106-110，1991.Dhir，S.K.，Dhir，S.，Sturtevant，A.P.，andWidholm，J.M.，“RegenerationoftransformedshootsforelectroporatedsoybeanGlycine-maxL.Merr.Protoplasts，PlantCellRep.，10(2)97-101，1991.Diehnetal.，Genet.Eng.(N.Y.)，1883-99，1996.Donovanetal.，J.Biol.Chem.263561-567，1988.Donovanetal.，Appl.Environ.Microbiol.583921-3927，1992.Doyleetal.，J.Biol.Chem.，261(20)9228-38，1986.Dropulicetal.，J.Virol.，661432-41，1992.EglitisandAnderson，″Retroviralvectorsforintroductionofgenesintomammaliancells，″Biotechniques，6(7)608-614，1988.Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，″Retroviral-mediatedgenetransferintohemopoieticcells，″Avd.Exp.Med.Biol.，24119-27，1988.Elroy-SteinandMoss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876743-7，1990.EnglishandSlatin，InsectBiochem.Mol.Biol.，221-7，1992.Fraleyetal.，Biotechnology，3629，1985.Fraleyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，804803，1983.Frommetal.，Biotechnology(N.Y.)，8(9)833-9，1990.Frommetal.，Nature，319791-793，1986.Fromm，Taylor，Walbot，″Expressionofgenestransferredintomonocotanddicotplantcellsbyelectroporation，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)5824-5828，1985.Fujimuraetal.，PlantTiss.Cult.Lett.，274，1985.Fynan，Webster，F(xiàn)uller，Haynes，Santoro，Robinson，″DNAvaccinesprotectiveimmunizationsbyparenteral，mucosal，andgeneguninoculations，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)11478-11482，1993.GaoandHuang，Nucl.AcidsRes.，212867-72，1993.Gefteretal.，Somat.CellGenet.，3231-236，1977.GenoveseandMilcarek，InRNAProcessing，p.62，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1988.GilandProudfoot，Nature，312473，1984.Goding，″MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice，″pp.60-74.2ndEdition，AcademicPress，Orlando，F(xiàn)L，1986.GrahamandvanderEb，″TransformationofratcellsbyDNAofhumanadenovirus5，″Virology，54(2)536-539，1973.Guerrier-Takadaetal.，Cell，35849，1983.HampelandTritz，Biochem.，284929，1989.Hampeletal.，Nucl.AcidsRes.，18299，1990.HarlowandLane，″AntibodiesALaboratoryManual，″ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1988.Herrera-Estrellaetal.，Embo.J.，2(6)987-996，1983.Hertigetal.，PlantMol.Biol.，16(1)171-4，1991.Hess，InternRev.Cytol.，107367，1987.Hfteetal.，Microbiol.Rev.，53242-255，1989.Horsch，R.B.，F(xiàn)ry，J.E.，Hoffmann，N.L.，Eichholtz，D.，Rogers，S.G.，andFraley，R.T.，“Asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants，”Science，227(4691)1229-1231，1985.JamesonandWolf，″TheAntigenicIndexANovelAlgorithmforPredictingAntigenicDeterminants，″Compu.Appl.Biosci.，4(1)181-6，1988.JohnstonandTang，″Geneguntransfectionofanimalcellsandgeneticimmunization，″MethodsCell.Biol.，43(A)353-365，1994.Jorgensenetal.，Mol.Gen.Genet.，207471，1987.Kashani-Sabetetal.，AntisenseRes.Dev.，23-15，1992.Kelleretal.，EMBOJ.，81309-14，1989.Klee，H.J.，Yanofsky，M.F.，andNester，E.W.，“Vectorsfortransformationofhigherplants，”Bio-Technology，3(7)637-642，1985.Kleinetal.，Nature，32770，1987.Kleinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858502-8505，1988.KohlerandMilstein，Eur.J.Immunol.，6511-519，1976.KohlerandMilstein，Nature，256495-497，1975.Kreigetal.，InZangew.Ent.，96500-508，1983.KyteandDoolittle，Asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotein，″J.Mol.Biol.，157(1)105-132，1982.Lambertetal.，Appl.Environ.Microbiol.，582536-2642，1992B.Lambertetal.，Gene，110131-132，1992A.Langridgeetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863219-3223，1989.Leeetal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.229139-146.L′Huillieretal.，EMBOJ.，114411-8，1992.Lieberetal.，MethodsEnzymol.，21747-66，1993.Lindstrometal.，DevelopmentalGenetics，11160，1990.Lisziewiczetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，908000-4，1993.Lorzetal.，Mol.Gen.Genet.，199178，1985.Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，″HighefficiencyretroviralmediatedgenetransductionintosingleisolatedimmatureandreplatableCD34(3+)hematopoieticstem/progenitorcellsfromhumanumbilicalcordblood，″J.Exp.Med.，178(6)2089-2096，1993.Luoetal.，PlantMol.Biol.Reporter，6165，1988.Maddocketal.，ThirdInternationalCongressofPlantMolecularBiology，Abstract372，1991.Maloyetal.，″MicrobialGenetics″2ndEdition.JonesandBarlettPublishers，Boston，MA，1994.Maloy，S.R.，″ExperimentalTechniquesinBacterialGenetics″JonesandBartlettPublishers，Boston，MA，1990.Maniatisetal.，″MolecularCloningaLaboratoryManual，″ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY.，1982.Marcotteetal.，Nature.335454，1988.McCabeetal.，Biotechnology，6923，1988.McDevittetal.，Cell，37993-999，1984.McElroy，Zhang，Wu，″Isolationofanefficientpromoterforuseinricetransformation，″PlantCell，2163-171，1990.MettusandMacaluso，Appl.Environ.Microbiol.561128-1134，1990Neuhausetal.，Theor.Appl.Genet.，7530，1987.Odelletal.，Nature，313810，1985.Ohkawa，Yuyama，Taira，″ActivitiesofHIV-RNAtargetedribozymestranscribedfroma′shot-gun′typeribozyme-trimmingplasmid，″Nucl.AcidsSymp.Ser.，2715-6，1992.Ojwangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910802-6，1992.Omirullehetal.，PlantMol.Biol.，21415-428，1993.PandeyandMarzluff，In″RNAProcessing，″p.133，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1987.Penaetal.，Nature，325274，1987.Perraultetal，Nature，344565，1990.PerrottaandBeen，Biochem.，3116，1992.Piekenetal.，Science，253314，1991.Poszkowskietal.，EMBOJ.，32719，1989.Potrykusetal.，Mol.Gen.Genet.，199183，1985.Poulsenetal.，Mol.Gen.Genet.，205193-200，1986.ProkopandBajpai，，Ann.N.Y.Acad.Sci.，646，1991.Rogersetal.，InMethodsForPlantMolecularBiology，A.WeissbachandH.Weissbach，eds.，AcademicPressInc.，SanDiego，CA1988.Rogersetal.，MethodsEnzymol.，153253-277，1987.Rossietal.，AidsRes.Hum.Retrovir.，8183，1992.SadofskyandAlwine，Mol.Cell.Biol.，4(8)1460-1468，1984.Sambrooketal.，″AntibodiesALaboratoryManual，″ColdSpringHarborLaboratory，ColdspringHarbor，NY，1989.Sambrooketal.，″MolecularCloningALaboratoryManual，″ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1989.Sangeretal.，″DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74(12)5463-5467，1977.Sarveretal.，Science，247(4947)1222-5，1990.SavilleandCollins，Cell，61685-696，1990.SavilleandCollins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888826-8830，1991.Scanlonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810591-5，1991.Scaringeetal.，Nucl.AcidsRes.，185433-5441，1990.Schnepfetal.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62775-806，1998.ShawandKamen，Cell，46659-667，1986.ShawandKamen，In“RNAProcessing”，p.220，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1987.Sicketal.，Nucl.AcidsRes.，181305，1990.Simpson，Science，23334，1986.Spielmannetal.，Mol.Gen.Genet.，20534，1986.Tairaetal.，Nucl.AcidsRes.，195125-30，1991.Toriyamaetal.，TheorAppl.Genet.，7316，1986.Uchimiyaetal.，Mol.Gen.Genet.，204204，1986.Usmanetal.，J.Am.Chem.Soc.，1097845-7854，1987.UsmanandCedergren，TIBS，1734，1992.VanTunenetal.，EMBOJ.，71257，1988.Vasiletal.，″Herbicide-resistantfertiletransgenicwheatplantsobtainedbymicroprojectilebombardmentofregenerableembryogeniccallus，″Biotechnology，10667-674，1992.Vasil，Biotechnology，6397，1988.Venturaetal.，Nucl.AcidsRes.，213249-55，1993.Vodkinetat.，Cell，341023，1983.Vogel，J.M.，Dawe，R.K.，andFreeling，M.，“Regulationofthecelltype-specificexpressionofmaizeAdhlandShlelectroporation-directedgenetransferintoprotoplastsofseveralmaizetissues，”J.Cell.Biochem.，(Suppl.0)13PartD，1989.VonTersch，M.A.，Robbins，H.L.，Jany，C.S.，andJohnson，T.，Appl.Environ.Microbiol.57349-358，1991.Wagneretal.，″Couplingofadenovirustotransferrin-polylysine/DNAcomplexesgreatlyenhancesreceptor-mediatedgenedeliveryandexpressionoftransfectedgenes，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)6099-6103，1992.Weerasingheetal.，J.Virol.，655531-4，1991.WeissbachandWeissbach，MethodsforPlantMolecularBiology，(eds.)，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA，1988.Wenzleretal.，PlantMol.Biol.，1241-50，1989.WickensandStephenson，Science，2261045，1984.Wickensetal.，In“RNAProcessing，”p.9，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1987.Widner，W.R.，andWhiteley，H.R.，J.Bacteriol.，1722826-2832，1990.WongandNeumann，″Electricfieldmediatedgenetransfer，″Biochim.Biophys.Res.Commun.，107(2)584-587，1982.Woolfetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897305-7309，1992.Yamadaetal，PlantCellRep.，485，1986.Yangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，874144-48，1990.Yuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906340-4，1993.Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，″Transferrintectionahighlyefficientwaytoexpressgeneconstructsineukaryoticcells，″Ann.N.Y.Acad.Sci.，660136-153，1992.Zhouetal.，MethodsEnzymol.，101433，1983.Zhouetal.，Mol.CellBiol.，104529-37，1990.根據(jù)本說明書，無須過多的實驗就可以制備并完成本文所披露的并要求保護的所有組合物和方法。盡管業(yè)已以優(yōu)選實施方案的形式披露了本發(fā)明的組合物和方法，對本領域技術人員來說，顯而易見的是，在不超出本發(fā)明概念、構(gòu)思和范圍的前提下，可以對所述組合物、方法以及所述方法的步驟和步驟的順序進行改變。更具體地講，顯而易見的是，在化學上和生理學上相關的某些試劑可以取代本文所披露的相關試劑，但仍然能獲得相同或相似的結(jié)果。所有這些對本領域技術人員來說顯而易見的類似的取代和改進都被視為屬于由所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的構(gòu)思、范圍和概念。因此，希望被授權(quán)的獨占權(quán)利由下面的權(quán)利要求書所述。序列表序列表<110>J.A.鮑姆(Baum，JamesA.)C.-R.楚(Chu，Chih-Rei)W.P.多諾范(Donovan，WilliamP.)A.J.吉爾黙(Gilmer，AmyJ.)M.J.魯帕(Rupar，MarkJ.)<120>對鱗翅目昆蟲有活性的蘇云金芽孢桿菌δ內(nèi)毒素組合物及其使用方法<130>MECO201-CN<160>63<170>PatentInversion3.0<210>1<211>1899<212>DNA<213>蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>CDS<222>(1)..(1899)<400>1atgaataatgtattaaataacggaagaactactatttgtgatgcgtat48MetAsnAsnValLeuAsnAsnGlyArgThrThrIleCysAspAlaTyr151015aatgtagtggcccatgatccatttagttttgagcataaatcattagat96AsnValValAlaHisAspProPheSerPheGluHisLysSerLeuAsp202530accatccgaaaagaatggatggagtggaaaagaacagatcatagttta144ThrIleArgLysGluTrpMetGluTrpLysArgThrAspHisSerLeu354045tatgtagctcctatagtcggaactgtttctagctttctgctaaagaag192TyrValAlaProIleValGlyThrValSerSerPheLeuLeuLysLys505560gtggggagtcttattggaaaaaggatattgagtgaattatgggggtta240ValGlySerLeuIleGlyLysArgIleLeuSerGluLeuTrpGlyLeu65707580atatttcctagtggtagcacaaatctaatgcaagatattttaagggag288IlePheProSerGlySerThrAsnLeuMetGlnAspIleLeuArgGlu859095acagaacaattcctaaatcaaagacttaatacagacactcttgcccgt336ThrGluGlnPheLeuAsnGlnArgLeuAsnThrAspThrLeuAlaArg100105110gtaaatgcggaattggaagggctgcaagcgaatataagggagtttaat384ValAsnAlaGluLeuGluGlyLeuGlnAlaAsnIleArgGluPheAsn115120125caacaagtagataattttttaaatcctactcaaaaccctgttccttta432GlnGlnValAspAsnPheLeuAsnProThrGlnAsnProValProLeu130135140tcaataacttcttcagttaatacaatgcagcaattatttctaaataga480SerIleThrSerSerValAsnThrMetGlnGlnLeuPheLeuAsnArg145150155160ttaccccagttccgtgtgcaaggataccaactgttattattaccttta528LeuProGlnPheArgValGlnGlyTyrGlnLeuLeuLeuLeuProLeu165170175tttgcacaggcagccaatatgcatctttcttttattagagatgttgtt576PheAlaGlnAlaAlaAsnMetHisLeuSerPheIleArgAspValVal180185190ctcaatgcagatgaatggggaatttcagcagcaacattacgtacgtat624LeuAsnAlaAspGluTrpGlyIleSerAlaAlaThrLeuArgThrTyr195200205caaaattatctgaaaaattatacaacagagtactctaattattgtata672GlnAsnTyrLeuLysAsnTyrThrThrGluTyrSerAsnTyrCysIle210215220aatacgtatcaaactgcgtttagaggtttaaacacccgtttacacgat720AsnThrTyrGlnThrAlaPheArgGlyLeuAsnThrArgLeuHisAsp225230235240atgttagaatttagaacatatatgtttttaaatgtatttgaatatgta768MetLeuGluPheArgThrTyrMetPheLeuAsnValPheGluTyrVal245250255tctatctggtcgttgtttaaatatcaaagccttctagtatcttctggc816SerIleTrpSerLeuPheLysTyrGlnSerLeuLeuValSerSerGly260265270gctaatttatatgcaagcggtagtggaccacagcagactcaatcattt864AlaAsnLeuTyrAlaSerGlySerGlyProGlnGlnThrGlnSerPhe275280285acttcacaagactggccatttttatattctcttttccaagttaattca912ThrSerGlnAspTrpProPheLeuTyrSerLeuPheGlnValAsnSer290295300aattatgtgttaaatggctttagtggcgctagacttacgcagactttc960AsnTyrValLeuAsnGlyPheSerGlyAlaArgLeuThrGlnThrPhe305310315320cctaatattggtggtttacctggtactactacaactcacgcattgctt1008ProAsnIleGlyGlyLeuProGlyThrThrThrThrHisAlaLeuLeu325330335gcggcaagggtcaattacagtggaggagtttcgtctggtgatataggc1056AlaAlaArgValAsnTyrSerGlyGlyValSerSerGlyAspIleGly340345350gctgtgtttaatcaaaattttagttgtagcacatttctcccacctttg1104AlaValPheAsnGlnAsnPheSerCysSerThrPheLeuProProLeu355360365ttaacaccatttgttaggagttggctagattcaggttcagatcgaggg1152LeuThrProPheValArgSerTrpLeuAspSerGlySerAspArgGly370375380ggtgttaataccgttacaaattggcaaacagaatcgtttgagtcaact1200GlyValAsnThrValThrAsnTrpGlnThrGluSerPheGluSerThr385390395400ttaggtttaaggtgtggtgcttttacagctcgtggtaattcaaactat1248LeuGlyLeuArgCysGlyAlaPheThrAlaArgGlyAsnSerAsnTyr405410415ttcccagattattttatccgtaatatttcaggagttcctttagttgtt1296PheProAspTyrPheIleArgAsnIleSerGlyValProLeuValVal420425430agaaatgaagatttaagaagaccgttacactataatgaaataagaaat1344ArgAsnGluAspLeuArgArgProLeuHisTyrAsnGluIleArgAsn435440445atagaaagtccttcaggaacacctggtggattacgagcttatatggta1392IleGluSerProSerGlyThrProGlyGlyLeuArgAlaTyrMetVal450455460tctgtgcataatagaaaaaataatatctatgccgtgcatgaaaatggt1440SerValHisAsnArgLysAsnAsnIleTyrAlaValHisGluAsnGly465470475480actatgattcatttagcgccggaagattatacaggattcaccatatcg1488ThrMetIleHisLeuAlaProGluAspTyrThrGlyPheThrIleSer485490495ccgatacatgcaactcaagtgaataatcaaacgcgaacatttatttct1536ProIleHisAlaThrGlnValAsnAsnGlnThrArgThrPheIleSer500505510gaaaaatttggaaatcaaggtgattccttaagatttgaacaaagcaac1584GluLysPheGlyAsnGlnGlyAspSerLeuArgPheGluGlnSerAsn515520525acgacagcacgttatacacttagaggaaatggaaatagttacaatctt1632ThrThrAlaArgTyrThrLeuArgGlyAsnGlyAsnSerTyrAsnLeu530535540tatttaagagtatcttcactaggaaattccactattcgagttactata1680TyrLeuArgValSerSerLeuGlyAsnSerThrIleArgValThrIle545550555560aacggtagggtttatactgcttcaaatgttaatactactacaaataac1728AsnGlyArgValTyrThrAlaSerAsnValAsnThrThrThrAsnAsn565570575gatggagttaatgataatggcgctcgttttttagatattaatatgggt1776AspGlyValAsnAspAsnGlyAlaArgPheLeuAspIleAsnMetGly580585590aatgtagtagcaagtgataatactaatgtaccgttagatataaatgtg1824AsnValValAlaSerAspAsnThrAsnValProLeuAspIleAsnVal595600605acatttaactccggtactcaatttgagcttatgaatattatgtttgtt1872ThrPheAsnSerGlyThrGlnPheGluLeuMetAsnIleMetPhe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rAlaIleSerLeuTyrAspAla101010151020ArgAsnValValLysAsnGlyAspPheAsnAsnGlyLeuAlaCys102510301035TrpAsnValLysGlyHisValAspValGlnGlnSerHisHisArg104010451050SerValLeuValIleProGluTrpGluAlaGluValSerGlnAla105510601065ValArgValCysProGlyArgGlyTyrIleLeuArgValThrAla107010751080TyrLysGluGlyTyrGlyGluGlyCysValThrIleHisGluIle108510901095GluAsnAsnThrAspGluLeuLysPheLysAsnCysGluGluGlu110011051110GluValTyrProThrAspThrGlyThrCysAsnAspTyrThrAla111511201125HisGlnGlyThrAlaValCysAsnSerArgAsnAlaGlyTyrGlu113011351140AspAlaTyrGluValAspThrThrAlaSerValAsnTyrLysPro114511501155ThrTyrGluGluGluThrTyrThrAspValArgArgAspAsnHis116011651170CysGluTyrAspArgGlyTyrValAsnTyrProProValProAla117511801185GlyTyrMetThrLysGluLeuGluTyrPheProGluThrAspLys119011951200ValTrpIleGluIleGlyGluThrGluGlyLysPheIleValAsp120512101215SerValGluLeuLeuLeuMetGluGlu1220122權(quán)利要求1.一種分離的多肽，它與SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO24、SEQIDNO40或SEQIDNO44的相同性至少為85％。2.一種分離的多肽，它與SEQIDNO2、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO24、SEQIDNO38、SEQIDNO40或SEQIDNO44的相同性至少為91％。3.一種分離的多肽，它與SEQIDNO2、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO28、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO44或SEQIDNO50的相同性至少為95％。4.一種分離的多肽，它與SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50或SEQIDNO63的相同性至少為99％。5.如權(quán)利要求4的多肽，包括選自下列一組的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63。6.一種編碼上述權(quán)利要求中任一項的多肽的分離的核酸序列。7.一種組合物，含有權(quán)利要求1-5中任一項的多肽和稀釋劑。8.如權(quán)利要求7的組合物，其中，所述多肽選自下列一組SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50和SEQIDNO63。9.如權(quán)利要求7的組合物，含有蘇云金芽孢桿菌細胞的細胞提取物、細胞懸浮液、細胞勻漿物、細胞裂解液、細胞上清液、細胞過濾液或細胞沉淀。10.如權(quán)利要求7的組合物，其中，所述組合物是粉末、粉塵、小團、顆粒、噴霧劑、乳液、膠體、或溶液。11.如權(quán)利要求7的組合物，所述多肽的重量占大約1-99％。12.通過一種方法制備的殺蟲多肽，該方法以下步驟(a)在能有效產(chǎn)生殺蟲多肽的條件下培養(yǎng)具有以下保藏號的蘇云金芽孢桿菌NRRLB-21784、NRRLB-21783、NRRLB-21917、NRRLB-21786、NRRLB-21787、NRRLB-21785、NRRLB-21788、NRRLB-21915或NRRLB-21916；和(b)從所述細胞獲得所產(chǎn)生的殺蟲多肽。13.一種蘇云金芽孢桿菌細胞，它的NRRL保藏號為NRRLB-21784、NRRLB-21783、NRRLB-21917、NRRLB-21786、NRRLB-21787、NRRLB-21785、NRRLB-21788、NRRLB-21915或NRRLB-21916。14.一種分離多核苷酸，它與SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO23、SEQIDNO39或SEQIDNO43的相同性至少為85％。15.如權(quán)利要求15的多核苷酸，其中，所述多核苷酸與SEQIDNO1、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO27、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO43或SEQIDNO49的相同性至少為95％。16.如權(quán)利要求15的多核苷酸，其中，所述多核苷酸與SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49或SEQIDNO62的相同性至少為99％。17.如權(quán)利要求15的多核苷酸，包括SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49或SEQIDNO62的核酸序列。18.如權(quán)利要求14-17中任一項的多核苷酸，其中，所述分離的多核苷酸是以載體形式提供的。19.如權(quán)利要求14-17中任一項的多核苷酸，其中，所述分離的多核苷酸可操作地連接于啟動子上。20.如權(quán)利要求19的多核苷酸，其中，所述啟動子是植物可表達的啟動子。21.如權(quán)利要求20的多核苷酸，所述植物可表達的啟動子選自下列一組玉米蔗糖合成酶1啟動子、玉米醇脫氫酶1啟動子、玉米集光復合體啟動子、玉米熱激蛋白啟動子、豌豆小亞基RuBP羧化酶啟動子、Ti質(zhì)粒甘露氨酸合成酶啟動子、Ti質(zhì)粒胭脂氨酸合成酶啟動子、矮牽牛查爾酮異構(gòu)酶啟動子、菜豆富甘氨酸蛋白1啟動子、馬鈴薯蛋白啟動子、凝集素、CaMV35S、和S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。22.如權(quán)利要求18的多核苷酸，其中，所述載體是質(zhì)粒、桿狀病毒、人工染色體、毒粒、粘粒、噬菌粒、噬菌體或病毒載體。23.一種轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，包括編碼權(quán)利要求1-5中任一項多肽的核酸序列。24.如權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，其中，所述核酸選自下列一組SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49和SEQIDNO62。25.如權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，它被進一步限定為原核或真核宿主細胞。26.如權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，它被進一步限定為細菌細胞或植物細胞。27.如權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，其中，所述細菌細胞是蘇云金芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、農(nóng)桿菌屬或假單胞菌屬細胞。28.如權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，其中，所述細菌細胞是蘇云金芽孢桿菌NRRLB-21784、NRRLB-21783、NRRLB-21917、NRRLB-21786、NRRLB-2177、NRRLB-21785、NRRLB-21788、NRRLB-21915或NRRLB-21916細胞。29.如權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，其中，所述細菌細胞是根癌農(nóng)桿菌細胞。30.如權(quán)利要求26的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，被進一步限定為單子葉或雙子葉植物細胞。31.如權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，其中，所述植物細胞選自下列一組玉米、小麥、大豆、燕麥、棉花、水稻、黑麥、高粱、甘蔗、番茄、煙草、木棉、亞麻、馬鈴薯、大麥、草坪草、牧草、漿果、水果、豆類、蔬菜、觀賞植物、灌木、仙人掌、多汁植物和樹木細胞。32.如權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，其中，所述植物細胞是玉米、小麥、水稻、或甘蔗細胞。33.如權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)化過的宿主細胞，其中，所述植物細胞是大豆、棉花、馬鈴薯、番茄、或煙草細胞。34.一種轉(zhuǎn)基因植物，在其基因組中整合了一種特定的多核苷酸，該核苷酸包括編碼權(quán)利要求1-5中任一項的多肽的第一個序列區(qū)。35.如權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述第一個序列區(qū)編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34、SEQIDNO36、SEQIDNO38、SEQIDNO40、SEQIDNO42、SEQIDNO44、SEQIDNO46、SEQIDNO48、SEQIDNO50或SEQIDNO63。36.如權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述第一個序列區(qū)包括SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO41、SEQIDNO43、SEQIDNO45、SEQIDNO47、SEQIDNO49或SEQIDNO62。37.如權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物，被進一步限定為單子葉植物。38.如權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物，被進一步限定為玉米、小麥、燕麥、水稻、大麥、草坪草或牧草植物。39.如權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物，被進一步限定為雙子葉植物。40.如權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物，被進一步限定為豆類植物、大豆、煙草、番茄、馬鈴薯、棉花、水果、漿果、蔬菜或樹木。41.如權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)基因植物的任何一代的后代，其中，所述后代包括第一種特定的序列區(qū)。42.如權(quán)利要求34的任一代植物的種子，其中，所述種子包括所述第一種序列區(qū)。43.如權(quán)利要求39的任一代后代的種子，其中，所述種子包括所述第一種序列區(qū)。44.如權(quán)利要求42或43的任一代種子的植物，其中，所述植物包括所述第一種序列區(qū)。45.一種控制鱗翅目昆蟲的方法，包括讓所述昆蟲與權(quán)利要求1-5中任一項的多肽接觸。46.如權(quán)利要求45的方法，其中，所述多肽是以粉末、粉塵、小團、顆粒、噴霧劑、乳液、膠體或溶液形式提供的。47.如權(quán)利要求45的方法，其中，所述多肽是由轉(zhuǎn)化過的宿主細胞提供的。48.如權(quán)利要求47的方法，其中，所述轉(zhuǎn)化過的宿主細胞是細菌或植物細胞。49.如權(quán)利要求45的方法，其中，所述多肽是由轉(zhuǎn)基因植物提供的。50.如權(quán)利要求49的方法，其中，所述植物是玉米、棉花或大豆植物。51.一種制備抗蟲植物的方法，包括(a)讓受體植物細胞與一種多核苷酸組合物接觸，該組合物至少含有編碼權(quán)利要求1-5中任一項的多肽的第一種核酸序列；(b)篩選含有所述第一種核酸序列的受體植物細胞；和(c)由所選擇的細胞再生植物；其中，所述植物相對相應的未轉(zhuǎn)化的植物而言具有增強了的抗蟲性。全文摘要披露了含有新型結(jié)晶蛋白的蘇云金芽孢桿菌菌株,這種蛋白具有針對鱗翅目昆蟲的殺蟲活性。還披露了新型蘇云金芽孢桿菌基因及其所編碼的結(jié)晶蛋白,以及制備和使用含有本發(fā)明的新型核酸序列的轉(zhuǎn)基因細胞的方法。文檔編號C07K14/325GK1390259SQ00815677公開日2003年1月8日申請日期2000年9月13日優(yōu)先權(quán)日1999年9月15日發(fā)明者J·A·鮑姆,C·R·楚,W·P·多諾范,A·J·吉爾默,M·J·魯帕申請人:孟山都技術有限公司