專利名稱：治療骨質(zhì)疏松的ep4受體選擇性激動(dòng)劑的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及包含前列腺素激動(dòng)劑的方法和藥物組合物，在脊椎動(dòng)物、特別是哺乳動(dòng)物、包括人類中可用于預(yù)防骨損失、恢復(fù)或增加骨質(zhì)量和提高骨愈合，包括治療呈現(xiàn)低骨質(zhì)量和/或骨缺損的疾病。本發(fā)明具體涉及包含EP4受體選擇性前列腺素激動(dòng)劑的方法和藥物組合物。
骨質(zhì)疏松是一種全身性骨骼疾病，以低骨質(zhì)量和骨組織衰退為特征，結(jié)果是骨脆性和骨折敏感性增加。在美國(guó)，該疾病波及兩千五百萬(wàn)人以上，每年導(dǎo)致一百三十萬(wàn)人骨折，包括500,000例脊柱、250,000例髖部和240,000例腕骨折。髖部骨折是骨質(zhì)疏松最為嚴(yán)重的后果，其中5-20％患者在一年內(nèi)死亡，50％以上的幸存者喪失能力。
老年人面臨最大的骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)，因此預(yù)期隨著人口的老化，這個(gè)問(wèn)題日益突出。世界范圍的骨折意外據(jù)預(yù)測(cè)在今后60年內(nèi)增加三倍，一項(xiàng)研究估計(jì)在2050年世界上將有四百五十萬(wàn)例髖部骨折。
女性比男性面臨更大的骨質(zhì)疏松危險(xiǎn)。女性在絕經(jīng)后五年內(nèi)經(jīng)歷骨損失的急劇加速。其他增加該危險(xiǎn)的因素包括吸煙、酒精濫用、久坐的生活方式和低鈣攝取量。
骨質(zhì)疏松的治療目前存在兩種主要的藥物療法。第一種是使用抗吸收性化合物來(lái)減少骨組織的吸收。
雌激素是抗吸收劑的一個(gè)實(shí)例。已知雌激素減少骨折。另外，Black等在EP 0605193A1報(bào)道了雌激素、特別是當(dāng)口服給藥時(shí)降低血漿LDL水平，升高有益的血漿高密度脂蛋白(HDL)水平。不過(guò)，雌激素不能在既定的骨質(zhì)疏松骨骼中恢復(fù)骨回到青壯年水平。此外，長(zhǎng)期雌激素療法已經(jīng)牽涉各種疾病，包括子宮癌、子宮內(nèi)膜癌和可能的乳腺癌的危險(xiǎn)增加，導(dǎo)致很多女性回避這種治療。顯著不可取的與雌激素療法有關(guān)的后果支持了對(duì)開(kāi)發(fā)可供替代的骨質(zhì)疏松療法的需求，它們應(yīng)當(dāng)對(duì)血清LDL具有可取的效果，但是不會(huì)導(dǎo)致不可取的后果。
第二種類型的骨質(zhì)疏松藥物療法是使用同化劑來(lái)促進(jìn)骨生成，增加骨質(zhì)量。這類藥物預(yù)期恢復(fù)骨至既定的骨質(zhì)疏松骨骼。
某些前列腺素激動(dòng)劑公開(kāi)在GB 1478281、GB 1479156和美國(guó)專利4,175,203、4,055,596、4,175,203、3,987,091與3,991,106中，它們例如可用作腎血管舒張藥。
美國(guó)專利4,033,996公開(kāi)了某些8-氮雜-9-氧代(與二氧代)-硫雜-11，12-seco前列腺素作為腎血管舒張藥，可用于預(yù)防血栓生成、誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素釋放和用作免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。
法國(guó)專利897,566公開(kāi)了某些氨基酸衍生物，用于治療神經(jīng)病學(xué)、精神或心血管疾病。
J.Org.Chem.(有機(jī)化學(xué)雜志)26，1961，1437公開(kāi)了N-乙?；?N-芐基-對(duì)氨基苯基巰基乙酸。
美國(guó)專利4,761,430公開(kāi)了作為降脂劑的某些芳基苯磺酰胺化合物。
美國(guó)專利4,443,477公開(kāi)了作為降脂劑的某些磺酰氨基苯基羧酸。
美國(guó)專利3,528,961公開(kāi)了作為染劑的某些ε-己內(nèi)酰胺衍生物。
美國(guó)專利3,780,095公開(kāi)了作為利膽劑的某些?；桨坊人帷?br> 美國(guó)專利4,243,678公開(kāi)了某些?；鶡N基氨基鏈烷酸，它們?cè)谖笣兊闹委熤芯哂袑?shí)用性，是皮脂腺分泌抑制劑，用于對(duì)抗皮膚炎癥。
美國(guó)專利4,386,031公開(kāi)了某些N-苯甲?；?ω-苯胺基鏈烷羧酸，它們是抗變態(tài)反應(yīng)劑、血栓形成性聚集抑制劑、抗炎劑和降脂劑。
除了骨質(zhì)疏松以外，僅美國(guó)每年就有大約兩千萬(wàn)至兩千五百萬(wàn)女性和越來(lái)越多的男性因骨質(zhì)量減少而患有可檢測(cè)的椎骨骨折，另有250,000例髖部骨折見(jiàn)諸報(bào)道。與后者情況有關(guān)的是，在前兩年內(nèi)的死亡率為12％，有30％的患者在骨折后需要家庭護(hù)理。不僅如此，由于這些骨折愈合緩慢或不良，恢復(fù)期的經(jīng)濟(jì)與醫(yī)學(xué)后果預(yù)期因總?cè)丝诶匣黾印?br> 雌激素已經(jīng)顯示(Bolander等，38th Annual Meeting OrthopedicResearch Society(第38屆矯形研究學(xué)會(huì)年會(huì))，1992)改善四肢骨折愈合的質(zhì)量。因此，雌激素替代療法應(yīng)當(dāng)是-種有效的骨折恢復(fù)的治療方法。不過(guò)，患者對(duì)雌激素療法的順應(yīng)性是相對(duì)較差的，這是由于它的副作用，包括月經(jīng)的恢復(fù)、乳房痛、子宮癌的危險(xiǎn)增加、乳腺癌的感知危險(xiǎn)增加和孕激素的伴隨使用。另外，男性可能反對(duì)使用雌激素治療。對(duì)有益于患有衰弱性骨折的患者并且增加患者順應(yīng)性的療法存在需求。
已經(jīng)證明，前列腺素E2(PGE2)在切除卵巢的(OVX)大鼠模型中能夠恢復(fù)損失的骨，這是-種絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的模型。Ke，H.Z.等，Bone(骨)，23249-255，1998。不過(guò)，存在與PGE2有關(guān)的嚴(yán)重副作用。Jee，W.S.S.和Ma，Y.F.Bone(骨)，21297-304，1997。
盡管存在各種骨質(zhì)疏松療法，在可供替代的骨質(zhì)疏松療法領(lǐng)域仍然存在持續(xù)的需求和持續(xù)的研究。另外，對(duì)骨折愈合療法也存在需求。而且，對(duì)能夠促進(jìn)骨向存在缺損的骨骼區(qū)重新生長(zhǎng)的療法存在需求，這些缺損例如是由骨腫瘤所導(dǎo)致或產(chǎn)生的。進(jìn)而，對(duì)能夠促進(jìn)骨向適用骨移植物的骨骼區(qū)重新生長(zhǎng)的療法存在需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療哺乳動(dòng)物呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病的方法，包含對(duì)所述哺乳動(dòng)物給以EP4受體選擇性激動(dòng)劑、其前體藥物或所述EP4受體選擇性激動(dòng)劑或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明特別涉及這樣的方法，其中所述疾病是骨質(zhì)疏松、虛弱、骨質(zhì)疏松性骨折、骨缺損、兒童自發(fā)性骨損失、牙槽骨損失、下頜骨損失、骨折、骨切開(kāi)術(shù)、與牙周炎有關(guān)的骨損失或假體向內(nèi)生長(zhǎng)。在優(yōu)選的本發(fā)明方法中，EP4受體選擇性激動(dòng)劑是全身給藥的，例如口服、皮下、肌內(nèi)或經(jīng)由氣霧劑。在其他優(yōu)選的本發(fā)明方法中，EP4激動(dòng)劑是局部給藥的。
本發(fā)明的方法尤其可用于虛弱。
本發(fā)明的方法還尤其可用于骨質(zhì)疏松。
本發(fā)明的方法還尤其可用于骨折或骨質(zhì)疏松性骨折。
優(yōu)選用在本發(fā)明方法中的EP4選擇性激動(dòng)劑包括式I化合物 其前體藥物和所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽，其中Q是COOR3、CONHR4或四唑-5-基；A是單鍵或順式雙鍵；B是單鍵或反式雙鍵；U是 或 R2是α-噻吩基、苯基、苯氧基、單取代的苯基和單取代的苯氧基，所述取代基是氯、氟、苯基、甲氧基、三氟甲基或(C1-C3)烷基；R3是氫、(C1-C5)烷基、苯基或?qū)?聯(lián)苯基；R4是COR5或SO2R5；R5是苯基或(C1-C5)烷基。
優(yōu)選用在本發(fā)明方法中的-組式I EP4受體選擇性激動(dòng)劑是其中Q是5-四唑基和U是 的那些式I化合物，構(gòu)成式IA化合物。 在這組內(nèi)特別優(yōu)選的化合物包括5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；5S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮；5R-(3S-羥基-4-苯基-丁-1-烯基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮；和5S-(3R-羥基-4-苯基-丁基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。
優(yōu)選用在本發(fā)明方法中的另一組式I EP4受體選擇性激動(dòng)劑是其中Q是COOH的那些式I化合物。在這組內(nèi)特別優(yōu)選的化合物包括7-{2S-[3R-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；和7-[2R-(3S-羥基-4-苯基-丁-1-烯基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸。
優(yōu)選地治療絕經(jīng)后的女性和60歲以上的男性。還優(yōu)選的是與年齡無(wú)關(guān)的個(gè)體，他們的骨質(zhì)量顯著減少，也就是在年齡的正常水平之下大于或等于1.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在本發(fā)明的方法中，呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病例如包括骨質(zhì)疏松、兒童自發(fā)性骨損失、牙槽骨損失、下頜骨損失、骨折、骨切開(kāi)術(shù)、與牙周炎有關(guān)的骨損失和假體向內(nèi)生長(zhǎng)。
用于治療“繼發(fā)性骨質(zhì)疏松”的方法也包括在本發(fā)明的方法內(nèi)?！袄^發(fā)性骨質(zhì)疏松”包括脊椎動(dòng)物、例如哺乳動(dòng)物(包括人類)的糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)誘發(fā)的骨質(zhì)疏松、固定術(shù)誘發(fā)的骨質(zhì)疏松、肝素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松和免疫抑制誘發(fā)的骨質(zhì)疏松。這些方法是這樣進(jìn)行的，對(duì)所述脊椎動(dòng)物、例如哺乳動(dòng)物給以“繼發(fā)性骨質(zhì)疏松”治療量的EP4受體選擇性前列腺素激動(dòng)劑、其前體藥物或所述EP4受體選擇性前列腺素激動(dòng)劑或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及用于在脊椎動(dòng)物、例如哺乳動(dòng)物(包括人類)面部重建、上頜骨重建和/或下頜骨重建之后加強(qiáng)骨移植物、誘導(dǎo)椎骨骨性結(jié)合、提高長(zhǎng)骨延長(zhǎng)、提高骨愈合的方法，包含對(duì)所述已經(jīng)經(jīng)歷面部重建、上頜骨重建和/或下頜骨重建的脊椎動(dòng)物、例如哺乳動(dòng)物給以骨提高量的EP4受體選擇性前列腺素激動(dòng)劑、其前體藥物或所述EP4受體選擇性前列腺素激動(dòng)劑或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明的活性EP4受體選擇性前列腺素激動(dòng)劑可以局部應(yīng)用于骨重建的部位或者可以全身給藥。
優(yōu)選的劑量是約0.001至約100mg/kg/天的EP4受體選擇性激動(dòng)劑、其前體藥物或所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽。尤其優(yōu)選的劑量是約0.01至約10mg/kg/天的EP4受體選擇性激動(dòng)劑、其前體藥物或所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽。
措辭“呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病”指這樣一種疾病，其中骨質(zhì)量的水平低于因年齡而異的正常標(biāo)準(zhǔn)，這是由世界衛(wèi)生組織″Assessment ofFracture Risk and its Application to Screening for PostmenopausalOsteoporosis(骨折危險(xiǎn)度評(píng)估及其在篩選絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用)(1994)。Report of a World Health Organization Study Group(國(guó)際衛(wèi)生組織研究組報(bào)告)。World Health Organization Technical Series843″所定義的。包括在“呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病”中的是原發(fā)性與繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，如上所述。還包括牙周疾病、牙槽骨損失、骨切開(kāi)術(shù)后和兒童自發(fā)性骨損失。措辭“呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病”還包括骨質(zhì)疏松的長(zhǎng)期并發(fā)癥，例如脊柱彎曲、高度減少和假體手術(shù)。
措辭“呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病”還指脊椎動(dòng)物、例如哺乳動(dòng)物已知發(fā)展為上述疾病、包括骨質(zhì)疏松的機(jī)會(huì)顯著高于平均水平(例如絕經(jīng)后的女性、50歲以上的男性)。其他骨質(zhì)量增加或提高用途包括骨恢復(fù)、增加骨折愈合速度、完全代替骨移植手術(shù)、提高骨移植的成功率、面部重建或上頜骨重建或下頜骨重建之后的骨愈合、假體向內(nèi)生長(zhǎng)、椎骨骨性結(jié)合或長(zhǎng)骨延長(zhǎng)。
本發(fā)明的方法還可以與矯形裝置聯(lián)合使用，例如脊柱融合支架、脊柱融合硬件、內(nèi)部與外部骨固定裝置、螺釘和釘子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可，術(shù)語(yǔ)骨質(zhì)量實(shí)際上指每單位面積的骨質(zhì)量，有時(shí)(盡管嚴(yán)格上不準(zhǔn)確)稱為骨礦物質(zhì)密度。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括防止(例如預(yù)防)、減輕和治愈性治療。
“藥學(xué)上可接受的”表示載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽必須與制劑的其他成分是相容的，并且對(duì)其受藥者無(wú)害。
表達(dá)方式“前體藥物”指藥物的前體化合物，它們?cè)诮o藥之后體內(nèi)經(jīng)由一定的化學(xué)或生理學(xué)過(guò)程釋放藥物(例如前體藥物在生理學(xué)pH下或者通過(guò)酶的作用轉(zhuǎn)化為所需的藥物形式)。示范性前體藥物在裂解后釋放對(duì)應(yīng)的藥物化合物。
表達(dá)方式“藥學(xué)上可接受的鹽”指含有陰離子的無(wú)毒陰離子鹽，例如(但不限于)氯化物、溴化物、碘化物、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、甲磺酸鹽和4-甲苯磺酸鹽。該表達(dá)方式還指無(wú)毒的陽(yáng)離子鹽，例如(但不限于)鈉、鉀、鈣、鎂、銨或質(zhì)子化的苯乍生(N，N’-二芐基乙二胺)、膽堿、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、芐乙胺(N-芐基苯乙胺)、哌嗪或氨丁三醇(2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇)。
本發(fā)明的方法導(dǎo)致骨生成，導(dǎo)致骨折率減少。本發(fā)明對(duì)本領(lǐng)域的重大貢獻(xiàn)在于提供增加骨生成的方法，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和有關(guān)骨障礙的預(yù)防、阻滯和/或消退。
本發(fā)明還涉及化合物，選自7-{2S-[3R-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；7-(2S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；和5S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
本發(fā)明還特別涉及7-{2S-[3R-羥基-4-(3-苯氧基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
本發(fā)明還特別涉及5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮。
本發(fā)明還特別涉及7-(2S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸。
本發(fā)明還特別涉及7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
本發(fā)明還特別涉及5S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
其他特征和優(yōu)點(diǎn)將因描述發(fā)明的說(shuō)明書和權(quán)利要求書而顯而易見(jiàn)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述任何EP4受體選擇性激動(dòng)劑都可以用作本發(fā)明的EP4受體選擇性激動(dòng)劑。EP4選擇性激動(dòng)劑是這樣的化合物，它們對(duì)EP1、EP2和EP3受體的IC50比對(duì)EP4受體亞型的IC50至少大10倍。例如，7-(2-(3-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸是-種EP4受體選擇性PGE2激動(dòng)劑，它的EP4受體結(jié)合IC50為16nM。對(duì)所有其他EP受體亞型、包括EP1、EP2和EP3受體亞型來(lái)說(shuō)，關(guān)于7-(2-(3-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸的IC50大于3200nM。
式I化合物可以按照U.S.4,177,346所公開(kāi)的方法制備，引用在此作為參考文獻(xiàn)。
用在本發(fā)明方法中的EP4受體選擇性激動(dòng)劑全部是適合于治療用途的活性劑，它們?cè)诩棺祫?dòng)物、例如哺乳動(dòng)物、特別是人類中刺激骨生成和增加骨質(zhì)量。由于骨生成與骨質(zhì)疏松和與骨有關(guān)的障礙的發(fā)展密切相關(guān)，用在本發(fā)明方法中的激動(dòng)劑憑借它們對(duì)骨的作用預(yù)防、阻止和/或消退骨質(zhì)疏松。
在本發(fā)明方法中用作脊椎動(dòng)物、例如哺乳動(dòng)物(尤其是人，特別是女性)呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病(例如骨質(zhì)疏松)治療藥物的EP4選擇性激動(dòng)劑的實(shí)用性在常規(guī)測(cè)定法中得到這些激動(dòng)劑活性的證明，包括受體結(jié)合測(cè)定法、環(huán)AMP測(cè)定法、體內(nèi)測(cè)定法和骨折愈合測(cè)定法，均如下所述。這類測(cè)定法還提供這樣一種手段，由此能夠比較EP4選擇性激動(dòng)劑彼此和與其他已知化合物和組合物的活性。這些比較的結(jié)果可用于確定用于治療脊椎動(dòng)物、例如哺乳動(dòng)物、包括人的這類疾病的劑量水平。
體內(nèi)測(cè)定法骨同化劑在刺激骨生成和增加骨質(zhì)量中的活性可以在未受損傷的雄性或雌性大鼠、性激素缺陷型雄性(睪丸切除術(shù))或雌性(卵巢切除術(shù))大鼠中加以試驗(yàn)。
在該研究中可以使用不同年齡(例如3個(gè)月齡)的雄性或雌性大鼠。大鼠是未受損傷的或閹割的(切除卵巢或切除睪丸的)，對(duì)其皮下注射或管飼不同劑量(例如1、3或10mg/kg/天)的前列腺素激動(dòng)劑達(dá)30天。在閹割大鼠中，治療開(kāi)始于手術(shù)后的第二天(目的是防止骨損失)或骨損失已經(jīng)發(fā)生之時(shí)(目的是恢復(fù)骨質(zhì)量)。在研究期間，所有大鼠可以自由接近水和含有1.46％鈣、0.99％磷和4.96IU/g維生素D3的粒狀商品飼料(Teklad嚙齒動(dòng)物飼料#8064，Harlan Teklad，Madison，WI)。在處死前12天和2天對(duì)所有大鼠皮下注射10mg/kg鈣黃綠素。處死大鼠。測(cè)定下列終點(diǎn)股骨礦物質(zhì)測(cè)量在尸體解剖時(shí)摘除每只大鼠的右股骨，利用雙能量X-射線吸光分析(DXA，QDR 1000/W，Hologic Inc.，Waltham，MA)掃描，其中安裝有″Regional High Resolution Scan″軟件(Hologic Inc.，Waltham，MA)。掃描場(chǎng)大小為5.08×1.902cm，分辨率為0.0254×0.0127cm，掃描速度為7.25mm/秒。分析股骨掃描圖象，測(cè)定全股骨(WF)、遠(yuǎn)側(cè)股骨干骺端(DFM)、股骨干(FS)和近側(cè)股骨(PF)的骨面積、骨礦物質(zhì)含量(BMC)和骨礦物質(zhì)密度(BMD)。
脛骨組織形態(tài)測(cè)定法分析在尸體解剖時(shí)摘除右脛骨，除去肌肉，切成三部分。將近側(cè)脛骨和脛骨干固定在70％乙醇中，在逐級(jí)濃度的乙醇中脫水，在丙酮中脫脂，然后包埋在甲基丙烯酸甲酯(Eastman Organic Chemicals，Rochester，NY)中。
利用Reichert-Jung Polycut S切片機(jī)切制近側(cè)脛骨干骺端的冠狀切片，厚度為4和10μm。將4μm切片用改進(jìn)的Masson氏三色染劑染色，而10μm切片保持未染色。每只大鼠的一份4μm切片和一份10μm切片用于骨松質(zhì)的組織形態(tài)測(cè)定。
利用Reichert-Jung Polycut S切片機(jī)切制脛骨干的橫切片，厚度為10μm。這些切片用于骨密質(zhì)的組織形態(tài)測(cè)定。
骨松質(zhì)的組織形態(tài)測(cè)定Bioquant OS/2組織形態(tài)測(cè)定系統(tǒng)(R&M Biometrics，Inc.，Nashville，TN)用于近側(cè)脛骨干骺端次生松質(zhì)距離生長(zhǎng)板-骺接點(diǎn)1.2與3.6mm之間的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)組織形態(tài)測(cè)定法測(cè)量。脛骨干骺端區(qū)的前1.2mm需要省略，目的是使測(cè)量限制在次生松質(zhì)。4μm切片用于測(cè)定與骨體積、骨結(jié)構(gòu)和骨吸收有關(guān)的指數(shù)，而10μm切片用于測(cè)定與骨生成和骨轉(zhuǎn)換有關(guān)的指數(shù)。
I)與小梁骨體積和結(jié)構(gòu)有關(guān)的測(cè)量和計(jì)算(1)總干骺端面積(TV，mm2)距離生長(zhǎng)板-骺接點(diǎn)1.2與3.6mm之間的干骺端面積；(2)小梁骨面積(BV，mm2)TV內(nèi)小梁骨的總面積；(3)小梁骨周長(zhǎng)(BS，mm)小梁總周界的長(zhǎng)度；(4)小梁骨體積(BV/TV，％)BV/TV×100；(5)小梁骨數(shù)量(TBN，#/mm)1.199/2×BS/TV；(6)小梁骨厚度(TBT，μm)(2000/1.199)×(BV/BS)；(7)小梁骨分離(TBS，μm)(2000×1.199)×(TV-BV)。
II)與骨吸收有關(guān)的測(cè)量和計(jì)算(1)破骨細(xì)胞數(shù)量(OCN，#)總干骺端面積內(nèi)的破骨細(xì)胞總數(shù)；(2)破骨細(xì)胞周長(zhǎng)(OCP，mm)被破骨細(xì)胞覆蓋的小梁周界的長(zhǎng)度；(3)破骨細(xì)胞數(shù)量/mm(OCN/mm，#/mm)OCN/BS；(4)破骨細(xì)胞周長(zhǎng)百分率(％OCP，％)OCP/BS×100。
III)與骨生成和轉(zhuǎn)換有關(guān)的測(cè)量和計(jì)算(1)單-鈣黃綠素標(biāo)記的周長(zhǎng)(SLS，mm)用一種鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的小梁周界的總長(zhǎng)度；(2)雙-鈣黃綠素標(biāo)記的周長(zhǎng)(DLS，mm)用兩種鈣黃綠素標(biāo)記物標(biāo)記的小梁周界的總長(zhǎng)度；(3)標(biāo)記間寬度(ILW，μm)兩種鈣黃綠素標(biāo)記物之間的平均距離；(4)礦質(zhì)化周長(zhǎng)百分率(PMS，％)(SLS/2+DLS)/BS×100；(5)礦物質(zhì)外積率(MAR，μm/天)ILW/標(biāo)記間隔；(6)骨生成率/表面反射(BFR/BS，μm/d/μm)(SLS/2+DLS)×MAR/BS；(7)骨轉(zhuǎn)換率(BTR，％/y)(SLS/2+DLS)×MAR/BV×100。
骨密質(zhì)的組織形態(tài)測(cè)定Bioquant OS/2組織形態(tài)測(cè)定系統(tǒng)(R&M Biometrics，Inc.，Nashville，TN)用于脛骨干骨密質(zhì)的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)組織形態(tài)測(cè)定法測(cè)量。在骨膜與內(nèi)密質(zhì)表面上測(cè)量總組織面積、骨髓腔面積、骨膜周長(zhǎng)、內(nèi)密質(zhì)周長(zhǎng)、單標(biāo)記的周長(zhǎng)、雙標(biāo)記的周長(zhǎng)和標(biāo)記間寬度，計(jì)算骨密質(zhì)面積(總組織面積-骨髓腔面積)、骨密質(zhì)面積百分率(密質(zhì)面積/總組織面積×100)、骨髓面積百分率(骨髓腔面積/總組織面積×100)、骨膜與內(nèi)密質(zhì)的標(biāo)記周長(zhǎng)百分率((單標(biāo)記周長(zhǎng)/2+雙標(biāo)記周長(zhǎng))/總周長(zhǎng)×100)、礦物質(zhì)外積率(標(biāo)記間寬度/間隔)和骨生成率(礦物質(zhì)外積率×[(單標(biāo)記周長(zhǎng)/2+雙標(biāo)記周長(zhǎng))/總周長(zhǎng)])。
統(tǒng)計(jì)學(xué)利用StatView 4.0軟件包(Abacus Concepts，Inc.，Berkeley，CA)可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。差異性分析(ANOVA)試驗(yàn)和隨后的Fisher’sPLSD(Stat View，Abacus Concepts Inc.，1918 Bonita Ave，Berkeley，CA 94704-1014)用于比較組間差異。
穩(wěn)定過(guò)度表達(dá)重組人EP4受體的293-S細(xì)胞系中cAMP升高的測(cè)定使用基于所公開(kāi)的序列(1)的寡核苷酸引物和來(lái)自原代人肺細(xì)胞的RNA(EP4)作為模板，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)生成代表人EP4受體的全部可譯框架的cDNA。將cDNA克隆到pcDNA3(Invitrogen Corporation，3985B Sorrento Valley Blvd.，San Diego，CA 92121)的多個(gè)克隆部位，用于經(jīng)由磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293-S人胚胎腎細(xì)胞。擴(kuò)展G418-耐受性集落，試驗(yàn)特異性[3H]PGE2結(jié)合。證明高水平特異性[3H]PGE2結(jié)合的轉(zhuǎn)染體進(jìn)一步經(jīng)過(guò)Scatchard分析法鑒定，以測(cè)定對(duì)PGE2的Bmax和Kd。選擇用于化合物篩選的細(xì)胞系每個(gè)細(xì)胞具有大約256,400個(gè)受體，對(duì)PGE2(EP4)的Kd＝2.9nM。母代293-S細(xì)胞中受體的組成型表達(dá)可以忽略不計(jì)。在補(bǔ)充有胎牛血清(最終10％)和G418(最終700μg/ml)的RPMI中供養(yǎng)細(xì)胞。
293-S/EP4細(xì)胞系中的cAMP應(yīng)答是這樣測(cè)定的，經(jīng)由劇烈重?fù)魪呐囵B(yǎng)燒瓶?jī)?nèi)分離細(xì)胞到1ml Ca++與Mg++缺陷型PBS中，加入不含血清的RPMI至終濃度為1×10細(xì)胞/ml，加入3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)至終濃度為1mM。將一毫升細(xì)胞懸液立即等分到2ml帶螺帽的微量離心機(jī)內(nèi)，在37℃、5％CO2、95％相對(duì)濕度下敞口保溫10分鐘。然后按1∶100稀釋比向細(xì)胞加入所要試驗(yàn)的化合物，以便最終的DMSO或乙醇濃度為1％。加入化合物后立即蓋住試管，顛倒兩次混和，在37℃下保溫12分鐘。然后在100℃下保溫10分鐘使樣本溶解，立即在冰上冷卻5分鐘。以1000×g離心5分鐘，使細(xì)胞碎屑形成粒狀沉淀，將澄清的溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新的試管內(nèi)。利用商業(yè)上可得到的cAMP放射免疫測(cè)定試劑盒RIA(NEK-033，DuPont/NEN Research Products，549 Albany St.，Boston，MA 02118)，將澄清的溶胞產(chǎn)物按1∶10稀釋在cAMP RIA測(cè)定緩沖液(包括在該試劑盒內(nèi))中后，測(cè)定cAMP濃度。通常，將細(xì)胞用6-8種濃度所要試驗(yàn)的化合物處理，濃度增量為1 log。利用劑量應(yīng)答曲線直線部分的線性回歸分析，在計(jì)算器上進(jìn)行EC50計(jì)算。
參考文獻(xiàn)1.Regan，J.W.Bailey，T.J.Pepperl，D.J.Pierce，K.L.Bogardus，A.M.Donello，J.E.Fairbairn，C.E.Kedzie，K.M.Woodward，D.F.和Gil，D.W.1994，克隆特征為藥理學(xué)定義的EP2亞型的新的人前列腺素受體(Cloning of a Novel Human ProstaglandinReceptor with Characteristics of the Pharmaclogically DefinedEP2 Subtype).Mol.Pharmacology(分子藥理學(xué))46213-220.
與前列腺素E2受體結(jié)合的測(cè)定膜的制備所有操作均是在4℃下進(jìn)行的。收獲表達(dá)前列腺素E21型(EP1)、2型(EP2)、3型(EP3)或4型(EP4)受體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，懸浮在A緩沖液(50mMTris-HCI(pH7.4)，10mM MgCl2，1mM EDTA，1mM Pefabloc肽，(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)，10μM膦酰二肽，(Sigma，St.Louis，MO)，1μM抑胃酶肽A，(Sigma，St.Louis，MO)，10μM抑彈性蛋白酶肽，(Sigma，St.Louis，MO)，100μM抗蛋白酶肽，(Sigma，St.Louis，MO))中達(dá)2百萬(wàn)細(xì)胞每ml。在2個(gè)十五秒的爆發(fā)集落中用Branson Sonifier(Model#250，Branson UltrasonicsCorporation，Danbury，CT)進(jìn)行聲波處理，使細(xì)胞溶解。以100×g離心10分鐘除去未溶解的細(xì)胞和碎屑。然后以45,000×g離心30分鐘，收獲膜。將膜的粒狀沉淀再次懸浮達(dá)3-10mg蛋白質(zhì)每ml A緩沖液，蛋白質(zhì)的濃度是通過(guò)Bradford的方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.(分析生物化學(xué))，72，248(1976))測(cè)定的。然后將再次懸浮的膜貯存在-80℃下備用。
結(jié)合測(cè)定使如上制備的冷凍膜融化，稀釋在上述A緩沖液中達(dá)0.5mg/ml(對(duì)大鼠EP2來(lái)說(shuō))或0.3mg/ml(對(duì)大鼠EP4來(lái)說(shuō))。將一體積膜制備物與0.05體積供試化合物或緩沖液和一體積3nM3H-前列腺素E2(#TRK 431，Amersham，Arlington Heights，IL)合并在A緩沖液中。將混合物(總體積為205μL)在25℃下保溫1小時(shí)。然后利用Tomtec收獲器(ModelMach II/96，Tomtec，Orange，CT)，通過(guò)GF/C型玻璃纖維濾器(#1205-401，Wallac，Gaithersburg，MD)過(guò)濾回收膜。通過(guò)濾器捕獲結(jié)合有3H-前列腺素E2的膜，而緩沖液和未結(jié)合的3H-前列腺素E2通過(guò)濾器進(jìn)入廢液。然后將每份樣本用3ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)，10mMMgCl2，1mM EDTA洗滌3次。然后將濾器在微波爐內(nèi)加熱干燥。為了測(cè)定與膜結(jié)合的3H-前列腺素量，將干燥過(guò)的濾器放置在含有閃爍流體的塑料袋內(nèi)，在LKB 1205 Betaplate讀數(shù)器(Wallac，Gaithersburg，MD)中計(jì)數(shù)。從代替50％特異性結(jié)合的3H-前列腺素E2所需要供試化合物的濃度測(cè)定IC50。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法生成表達(dá)大鼠EP2或EP4前列腺素E2受體的293S細(xì)胞。通常，按照上面公開(kāi)的熟知方法制備相當(dāng)于所公開(kāi)的全長(zhǎng)受體5’與3’末端的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))引物，在利用來(lái)自大鼠腎的總RNA的RT-PCR反應(yīng)中用于EP2和EP4受體。
關(guān)于大鼠EP2受體的全長(zhǎng)編碼序列是按照Nemoto等，Prostaglandins(前列腺素)，1997，54，713-725所公開(kāi)的方法制備的。關(guān)于大鼠EP4受體的全長(zhǎng)編碼序列是按照Sando等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊)，1994，200，1329-1333所公開(kāi)的方法制備的。這些全長(zhǎng)受體用于制備表達(dá)EP2和EP4受體的293S細(xì)胞。
關(guān)于EP1受體的全長(zhǎng)編碼序列是按照Funk等，Journal ofBiological Chemistry(生物化學(xué)雜志)，1993，268，26767-26772所公開(kāi)的方法制備的。關(guān)于EP2受體的全長(zhǎng)編碼序列是按照Regan等，Molecular Pharmacology(分子藥理學(xué))，1994，46，213-220所公開(kāi)的方法制備的。關(guān)于EP3受體的全長(zhǎng)編碼序列是按照Regan等，BritishJournal of Pharmacology(英國(guó)藥理學(xué)雜志)，1994，112，377-385所公開(kāi)的方法制備的。關(guān)于EP4受體的全長(zhǎng)編碼序列是按照Bastien，Journal of Biological Chemistry(生物化學(xué)雜志)，1994，269，11873-11877所公開(kāi)的方法制備的。這些全長(zhǎng)受體用于制備表達(dá)EP1、EP2、EP3和EP4受體的293S細(xì)胞。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法生成表達(dá)人EP1、EP2、EP3或EP4前列腺素E2受體的293S細(xì)胞。通常，按照上面公開(kāi)的熟知方法制備相當(dāng)于所公開(kāi)的全長(zhǎng)受體5’與3’末端的PCR(聚合酶鏈反應(yīng))引物，用在利用來(lái)自人腎(對(duì)EP1來(lái)說(shuō))、人肺(對(duì)EP2來(lái)說(shuō))、人肺(對(duì)EP3來(lái)說(shuō))或人淋巴細(xì)胞(對(duì)EP4來(lái)說(shuō))的總RNA作為來(lái)源的RT-PCR反應(yīng)中。通過(guò)TA懸突法將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)所克隆的受體的同一性。
通過(guò)電穿孔法將293S細(xì)胞(Mayo，Dept.of Biochemistry，Northwestern Univ.)用所克隆的受體轉(zhuǎn)染在pcDNA3中。在選擇被G418轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之后，建立表達(dá)該受體的穩(wěn)定細(xì)胞系。
使用未標(biāo)記的PGE2作為競(jìng)爭(zhēng)劑，在全細(xì)胞3H-PGE2結(jié)合測(cè)定之后選擇表達(dá)最大數(shù)量受體的克隆細(xì)胞系。
骨折愈合測(cè)定法全身給藥后對(duì)骨折愈合的效果測(cè)定骨折技術(shù)將3月齡Sprage-Dawley大鼠用氯胺酮麻醉。在右脛骨或股骨近側(cè)的前正中面上切1cm切口。下面描述脛骨手術(shù)技術(shù)。使切口進(jìn)行至骨處，在距離脛骨粗隆遠(yuǎn)側(cè)4mm和前脊內(nèi)側(cè)2mm處鉆1mm洞。利用0.8mm不銹鋼管進(jìn)行髓內(nèi)插釘術(shù)(最大負(fù)載36.3N，最大剛度61.8N/mm，在與骨相同的條件下試驗(yàn))。沒(méi)有進(jìn)行髓管的紋孔。利用帶有鈍爪的特殊設(shè)計(jì)的可調(diào)鉗進(jìn)行三點(diǎn)彎曲，在脛腓接點(diǎn)上2mm處產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的閉合骨折。為了減少軟組織損傷，注意不使骨折移位。用單絲尼龍縫合線縫合皮膚。手術(shù)是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的。在插釘術(shù)后立即拍攝放射照片，排除骨折位于指定骨干區(qū)之外或者插釘移位的大鼠。將其余動(dòng)物隨機(jī)分為下列幾組，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)小組有10-12只動(dòng)物，試驗(yàn)骨折的愈合。第一組每日接受載體(水∶100％乙醇＝95∶5)管飼1ml/大鼠，而其他組每日接受0.01至100mg/kg/天供試化合物管飼(1ml/大鼠)達(dá)10、20、40和80天。
在10、20、40和80天，將每組的10-12只大鼠用氯胺酮麻醉，通過(guò)驅(qū)血法處死。解剖摘除兩側(cè)脛腓骨，剝離所有軟組織。將來(lái)自每組5-6只大鼠的骨貯存在70％乙醇中進(jìn)行組織學(xué)分析，將來(lái)自每組另外5-6只大鼠的骨貯存在Ringer氏緩沖溶液(+4℃，pH 7.4)中進(jìn)行放射照相和生物力學(xué)試驗(yàn)。
組織學(xué)分析骨折骨的組織學(xué)分析方法以前已經(jīng)為Mosekilde和Bak所公開(kāi)(TheEffects of Growth Hormone on Fracture Healing in RatsAHistological Description(生長(zhǎng)激素對(duì)大鼠骨折愈合的影響組織學(xué)描述).Bone(骨)，1419-27，1993)。簡(jiǎn)而言之，將骨折部位鋸開(kāi)8mm至骨折線的每一側(cè)，未脫鈣地包埋在甲基丙烯酸甲酯中，在Reichert-Jung Polycut切片機(jī)上切8μm厚的冠狀切片。使用Masson三色染劑染色的中-冠狀切片(包括脛骨和腓骨)造影觀察經(jīng)過(guò)和沒(méi)經(jīng)過(guò)治療的細(xì)胞和組織對(duì)骨折愈合的響應(yīng)。粘膠纖維紅染色的切片用于證明骨痂結(jié)構(gòu)特征和區(qū)分骨折部位上的網(wǎng)狀骨與板狀骨。進(jìn)行下列測(cè)量(1)骨折間隙——測(cè)量骨折中骨密質(zhì)兩端之間的最短距離，(2)骨痂長(zhǎng)度和骨痂直徑，(3)骨痂的總骨體面積，(4)骨痂區(qū)內(nèi)每組織面積的骨組織，(5)骨痂中的纖維組織，和(6)骨痂中的軟骨面積。
生物力學(xué)分析
生物力學(xué)分析方法以前已經(jīng)為Bak和Andreassen所公開(kāi)(TheEffects of Aging on Fracture Healing in Rats(年齡對(duì)大鼠骨折愈合的作用)，Calcif Tissue Int 45292-297，1989)。簡(jiǎn)而言之，在生物力學(xué)試驗(yàn)之前拍攝所有骨折的放射照片。通過(guò)破壞性三點(diǎn)或四點(diǎn)彎曲工藝分析愈合中的骨折的力學(xué)性質(zhì)。測(cè)定最大負(fù)載、剛度、最大負(fù)載下的能量、最大負(fù)載下的偏轉(zhuǎn)和最大應(yīng)力。
局部給藥后對(duì)骨折愈合的效果測(cè)定骨折技術(shù)在該研究中使用處于麻醉下的大約2年齡的雌性或雄性beagle狗。通過(guò)緩慢連續(xù)的三點(diǎn)彎曲負(fù)載產(chǎn)生橫向橈骨骨折，如Lenehan等所述(Lenehan，T.M.；Balligand，M.；Nunamaker，D.M.；Wood，F(xiàn).E.Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs(EHDP對(duì)狗骨折愈合的影響).J Orthop Res(矯形研究雜志)3499-507；1985)。拉一條線穿過(guò)骨折部位，以確保完全的解剖學(xué)上的骨裂。此后，通過(guò)緩慢釋放粒狀沉淀或者以適合的制劑給藥達(dá)10、15或20周，例如糊劑、凝膠劑溶液或懸液，進(jìn)行化合物的緩慢釋放，實(shí)現(xiàn)前列腺素激動(dòng)劑向骨折部位的局部釋放。
組織學(xué)分析骨折骨的組織學(xué)分析方法以前已經(jīng)為Peter等(Peter，C.P.；Cook，W.O.；Nunamaker，D.M.；Provost，M.T.；Seedor，J.G.；Rodan，G.A.Effects of alendronate on fracture healing and bone remodelingin dogs.J.Orthop.Res.(矯形研究雜志)1474-70，1996)和Mosekilde與Bak(The Effects of Growth Hormone on FractureHealing in RatsA Histological Description.Bone(骨)，1419-27，1993)所公開(kāi)。簡(jiǎn)而言之，在處死后，將骨折部位鋸開(kāi)3cm至骨折線的每一側(cè)，未脫鈣地包埋在甲基丙烯酸甲酯中，在Reichert-Jung Polycut切片機(jī)上切8μm厚的冠狀切片。使用Masson三色染劑染色的中-冠狀切片(包括脛骨和腓骨)造影觀察經(jīng)過(guò)和沒(méi)經(jīng)過(guò)治療的細(xì)胞和組織對(duì)骨折愈合的響應(yīng)。粘膠纖維紅染色的切片用于證明骨痂結(jié)構(gòu)特征和區(qū)分骨折部位上的網(wǎng)狀骨與板狀骨。進(jìn)行下列測(cè)量(1)骨折間隙——測(cè)量骨折中骨密質(zhì)兩端之間的最短距離，(2)骨痂長(zhǎng)度和骨痂直徑，(3)骨痂的總骨體面積，(4)骨痂區(qū)內(nèi)每組織面積的骨組織，(5)骨痂中的纖維組織，和(6)骨痂中的軟骨面積。
生物力學(xué)分析生物力學(xué)分析方法以前已經(jīng)為Bak和Andreassen(The Effects ofAging on Fracture Healing in Rats.Calcif Tissue Int 45292-297，1989)和Peter等(Peter，C.P.；Cook，W.O.；Nunamaker，D.M.；Provost，M.T.；Seedor，J.G.；Rodan，G.A.Effects of AlendronateOn Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs.J.Orthop.Res.(矯形研究雜志)1474-70，1996)所公開(kāi)。簡(jiǎn)而言之，在生物力學(xué)試驗(yàn)之前拍攝所有骨折的放射照片。通過(guò)破壞性三點(diǎn)或四點(diǎn)彎曲技術(shù)分析愈合中的骨折的力學(xué)性質(zhì)。測(cè)定最大負(fù)載、剛度、最大負(fù)載下的能量、最大負(fù)載下的偏轉(zhuǎn)和最大應(yīng)力。
按照本發(fā)明的方法，EP4受體選擇性激動(dòng)劑的給藥可以經(jīng)由任意全身和/或局部釋放EP4受體選擇性激動(dòng)劑的方式(例如在骨折、骨切開(kāi)術(shù)或矯形手術(shù)的部位)。這些方法包括口服、腸胃外或十二指腸內(nèi)途徑等。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的化合物是口服給藥的，但是也可以采用腸胃外給藥(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、透皮、皮下、直腸或骨髓內(nèi))，例如口服給藥對(duì)靶來(lái)說(shuō)是不適合的或者患者不能攝入藥物。
通過(guò)EP4受體選擇性激動(dòng)劑的局部用藥(例如至骨切開(kāi)術(shù)的骨折部位)，本發(fā)明的方法用于治療和促進(jìn)骨折和骨切開(kāi)術(shù)的愈合。將本發(fā)明的EP4受體選擇性激動(dòng)劑施用于骨折或骨切開(kāi)術(shù)的部位，例如將在適合溶劑(例如油性溶劑，如花生油)中的化合物注射到軟骨生長(zhǎng)板，或者在開(kāi)放手術(shù)的情況下，向那里局部施用在適合載體或稀釋劑中的化合物，例如骨蠟、軟化骨粉、聚合的骨粘固粉、骨密封膠等。作為替代選擇，局部用藥可以這樣實(shí)現(xiàn)，將化合物在適合載體或稀釋劑中的溶液或分散系涂抹在矯形手術(shù)常用的固體或半固體植入物表面或者結(jié)合在其內(nèi)部，例如滌綸網(wǎng)、凝膠泡沫與kiel骨或假體。
無(wú)論如何，化合物的給藥量與時(shí)機(jī)當(dāng)然將取決于所治療的受藥者、疾患的嚴(yán)重性、給藥的方式和主治醫(yī)師的判斷。因而，由于患者之間的差異性，本文給出的劑量是指導(dǎo)性的，醫(yī)師可以斟酌其認(rèn)為適合于患者的、實(shí)現(xiàn)療效(例如骨質(zhì)量增加)的藥物化合物劑量。在考慮所需治療的程度時(shí)，醫(yī)師必須平衡各種因素，例如骨質(zhì)量起始水平、患者的年齡、先前存在的疾病以及其他疾病的存在(例如心血管疾病)。
一般來(lái)說(shuō)，EP4受體選擇性激動(dòng)劑的用量足以增加骨質(zhì)量至骨折域值(如本文前面所引用的World Health Organization Study所述)以上的水平。
用在本發(fā)明方法中的EP4受體選擇性激動(dòng)劑化合物一般是以藥物組合物的形式給藥的，其中包含至少一種本發(fā)明的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。因而，EP4受體選擇性激動(dòng)劑可以以任意常規(guī)的口服、鼻內(nèi)、腸胃外、直腸或透皮劑型單獨(dú)給藥。
關(guān)于口服給藥，藥物組合物可以采取溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑等劑型?？梢圆捎闷瑒渲泻懈鞣N賦形劑，例如檸檬酸鈉、碳酸鈣和磷酸鈣，以及各種崩解劑，例如淀粉、優(yōu)選為馬鈴薯或木薯淀粉和某些復(fù)合硅酸鹽，以及粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠和阿拉伯膠。另外，出于制片目的，潤(rùn)滑劑也經(jīng)常是非常有用的，例如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石。也可以采用相似類型的固體組合物作為明膠軟與硬膠囊中的填充劑；這方面優(yōu)選的材料還包括乳糖或奶糖以及高分子聚乙二醇。若口服給藥需要水懸液和/或酏劑，本發(fā)明的組合物可以與各種甜味、矯味劑、著色劑、乳化劑和/或懸浮劑結(jié)合，以及與稀釋劑結(jié)合，例如水、乙醇、丙二醇、甘油和它們的各種組合。
出于腸胃外給藥的目的，可以采用在芝麻油或花生油中的溶液或者在丙二醇水溶液，以及相應(yīng)水溶性鹽的無(wú)菌水溶液。如果必要的話，這類水溶液可以被適當(dāng)緩沖，液體稀釋劑首先被足量鹽水或葡萄糖賦予等滲性。這些水溶液尤其適合域靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射的目的。在這方面，所用無(wú)菌水性介質(zhì)都可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)工藝獲得。
出于透皮(例如局部)給藥的目的，制備稀的、無(wú)菌的、含水或部分含水的溶液(濃度通常約0.1％至5％)或者類似于上述的腸胃外溶液。
制備含有一定量活性成分的各種藥物組合物的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的或者鑒于本文的公開(kāi)將是顯而易見(jiàn)的。關(guān)于制備藥物組合物的方法實(shí)例，參見(jiàn)Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington藥物科學(xué))，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版(1995)。
研究方案本研究的目的是測(cè)定EP4受體選擇性激動(dòng)劑、具體為7-(2-(3-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸在OVX大鼠模型中是否能夠恢復(fù)骨質(zhì)量。
將Sprague-Dawley雄性大鼠在3.5月齡時(shí)切除卵巢(OVX)。OVX后十個(gè)月，向大鼠皮下按30mg/kg/天注射載體或7-(2-(3-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸達(dá)28天進(jìn)行處理。解剖大鼠的尸體。在尸體解剖時(shí)摘除每只大鼠的右股骨，利用雙能量X-射線吸光分析(DEXA，QDR 1000/W，Hologic Inc.，Waltham，MA)掃描，其中安裝有″Regional High Resolution Scan″軟件(Hologic Inc.，Waltham，MA)。掃描場(chǎng)大小為5.08×1.902cm，分辨率為0.0254×0.0127cm，掃描速度為7.25mm/秒。分析股骨掃描圖象。按照H.Z.Ke等，Droloxifene，a New Estrogen Antagonist/Agonist，Prevents Bone Loss inOvariectomized Rats.ENDOCRINOLOGY(內(nèi)分泌學(xué))136；2435-2441，1995所述方法，測(cè)定全股骨(WF)、遠(yuǎn)側(cè)股骨干骺端(DFM)、股骨干(FS)和近側(cè)股骨(PF)的骨礦物質(zhì)含量(BMC)和骨礦物質(zhì)密度(BMD)。
研究結(jié)果和討論與用載體處理的OVX大鼠相比，用7-(2-(3-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸處理的OVX大鼠顯示總股骨BMC增加了17％，總股骨BMD增加了13％，遠(yuǎn)側(cè)股骨BMC增加了8％，遠(yuǎn)側(cè)股骨BMI增加了8％，股骨干BMC增加了20％，股骨干BMD增加了18％。在用7-(2-(3-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸處理的大鼠中沒(méi)有見(jiàn)到PGE2樣副作用。
該數(shù)據(jù)顯示，EP4受體選擇性PGE2激動(dòng)劑7-(2-(3-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸在已建立的骨質(zhì)稀少OVX大鼠中刺激骨生成和恢復(fù)骨。
一般實(shí)驗(yàn)工藝在約23℃下，按400MHz在Varian Unity 400分光計(jì)(Varian Co.，Palo Alto，California)上記錄質(zhì)子NMR光譜?；瘜W(xué)漂移以百萬(wàn)分之份數(shù)表示。峰形表示如下s單峰；d雙峰；t三重峰；q四重峰；m多重峰；bs寬的單峰。在Fisons Platform II分光計(jì)上得到大氣壓化學(xué)電離(APCI)質(zhì)譜。若描述含氯或溴離子的強(qiáng)度，則觀測(cè)預(yù)期的強(qiáng)度比(對(duì)于含35Cl/37Cl離子大約為3∶1，對(duì)于含79Br/81Br離子大約為1∶1)，僅給出較低質(zhì)量離子的強(qiáng)度。
在氮壓力下利用Biotage純化系統(tǒng)(Biotage，Dyax Corporation，Charlottesville，Virginia)進(jìn)行中壓色譜法。在低氮壓力下，在玻璃柱中，利用Baker硅膠(40m)(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)或硅膠60(EM Sciences，Gibbstown，N.J.)進(jìn)行快速色譜法。利用Chromatotron(model 7924T，Harrison Research)進(jìn)行徑向色譜法。利用Analtech Uniplates硅膠GF(20×20cm)(Ahaltech，Inc.Newark，DE)進(jìn)行制備色譜法。用作反應(yīng)溶劑的二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)和二氯甲烷(CH2Cl2)是無(wú)水級(jí)的，由Aldrich Chemical Company(Milwaukee，Wisconsin)提供。術(shù)語(yǔ)“濃縮”指在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上、在水抽吸壓力下除去溶劑。縮寫“h”代表小時(shí)。術(shù)語(yǔ)“TBAF”指氟化四丁基銨。術(shù)語(yǔ)“DMAP”指二甲氨基吡啶。術(shù)語(yǔ)“二氯甲烷”和“亞甲基氯”是同義詞，在本說(shuō)明書和實(shí)施例與制備例中可互換使用。
實(shí)施例17-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步驟A7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。在0℃下，向[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯(2.66g，9.63mmol)的THF(35ml)溶液中分批加入NaH(60重量％油懸液，426mg，10.7mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌40分鐘。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，加入7-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(假定10.6mmol，按照制備例7所述方法制備，但是使用不同量的試劑)的THF溶液，將反應(yīng)系攪拌18小時(shí)。加入AcOH，反應(yīng)混合物用EtOAc稀釋。有機(jī)溶液連續(xù)用飽和NaHCO3溶液(2x)、水(1x)和鹽水(1x)洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。殘余物經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用含有15％丙酮的甲苯洗脫，得到7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(2.26g)。1H NMR(CDCl3)δ7.27-7.15(m，3H)，7.08(m，1H)，6.66(dd，1H)，6.20(d，1H)，4.17(m，1H)，4.11(q，2H)，3.82(s，2H)，3.55(m，1H)，2.72(m，1H)，2.46-2.23(m，5H)，1.79(m，1H)，1.58(m，2H)，1.47-1.20(m，9H)；MS 420.2(M+1)，418.2(M-1).
步驟B7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3S-羥基-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。向7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(2.1g，5.0mmol)的無(wú)水CH2Cl2(200ml)溶液中加入(R)-2-甲基-CBS-氧氮雜borolidine(1M甲苯溶液，5ml，5mmol)，將溶液冷卻至-45℃。將反應(yīng)混合物攪拌20分鐘，加入兒茶酚硼烷(1M THF溶液，15ml，15mmol)。將反應(yīng)混合物在-45℃下攪拌18小時(shí)。加入HCl水溶液(1N，100ml)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。分離酸性含水層，有機(jī)溶液用冰冷的1N NaOH(2x)、再用鹽水(1x)洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1 EtOAc∶己烷至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3S-羥基-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(800mg)，1H NMR鑒定為3S∶3R醇非對(duì)映體的大約6∶1混合物。1H NMR(CDCl3)δ7.23-7.17(m，3H)，7.06(m，1H)，5.67(dd，1H)，5.46(dd，1H)，4.37(m，1H)，4.08(q，2H)，4.00(m，1H)，3.44(m，1H)，2.80(m，2H)，2.67(m，1H)，2.41-2.12(m，5H)，1.70-1.20(m，13H)；MS 422.3(M+1).
步驟C7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。向7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3S-羥基-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(800mg，1.90mmol)的EtOH(50ml)溶液中加入10％披鈀碳(80mg)。將反應(yīng)混合物在45psi Parr搖動(dòng)器上氫化4.5小時(shí)。借助EtOH通過(guò)C鹽TM過(guò)濾除去催化劑。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至4∶1 EtOAc∶己烷)，得到7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(625mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.27-7.21(m，3H)，7.09(m，1H)，4.10(m，2H)，3.84(m，1H)，3.61(m，2H)，2.90(m，1H)，2.78(dd，1H)，2.68(m，1H)，2.47-2.25(m，4H)，2.12(m，1H)，1.92-1.22(m，17H)；MS424.3(M+1).
步驟D7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。向7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(595mg，1.40mmol)的EtOH(25ml)溶液中加入2NNaOH(6ml)。將反應(yīng)系在室溫下攪拌24小時(shí)，在真空中濃縮至約原體積的3/4。加入1N HCl水溶液，得到pH約為2。水溶液用亞甲基氯洗滌(3x)。合并有機(jī)層，用水、再用鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮，得到實(shí)施例1的標(biāo)題化合物(500mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.26-7.18(m，3H)，7.08(m，1H)，3.84(m，1H)，3.58(m，2H)，2.90(m，1H)，2.77(dd，1H)，2.68(m，1H)，2.43-2.28(m，4H)，2.10(m，1H)，1.78(m，1H)，1.66-1.22(m，13H)；MS 396.2(M+1)，394.2(M-1).
實(shí)施例27-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步驟A7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循實(shí)施例1步驟A所述工藝，使從[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯(4.16g，13.40mmol)和NaH(60％油懸液，590mg，14.7mmol)衍生的陰離子與7-(2R-甲?；?5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(假定14.74mmol)反應(yīng)24小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(溶劑梯度含有20％EtOAc的己烷至EtOAc)，得到7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(4.29g)。1H NMR(CDCl3)δ7.52(d，1H)，7.44(m，2H)，7.37(d，1H)，6.67(dd，1H)，6.22(d，1H)，4.80(m，1H)，4.08(q，2H)，3.90(s，2H)，3.54(m，1H)，2.70(m，1H)，2.37(m，2H)，2.24(m，3H)，1.78(m，1H)，1.56(m，2H)，1.44-1.20(m，9H)；MS 454.2(M+1)，452.2(M-1).
步驟B7-{2R-[3S-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯。在-45℃下，向7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.5g，3.31mmol)與(R)-2-甲基-CBS-氧氮雜borolidine(1M甲苯溶液，0.5ml，0.5mmol)的CH2Cl2(100ml)溶液中滴加兒茶酚硼烷(1M THF溶液，9.9ml，9.9mmol)。將溶液在-45℃下攪拌24小時(shí)，加入1N HCl。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，分離各層。水溶液用CH2Cl2洗滌(2x)，合并有機(jī)層，連續(xù)用冰冷的0.5N NaOH和鹽水洗滌(兩次)。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(含有50％EtOAc的己烷至含有60％EtOAc的己烷至含有80％EtOAc的己烷至EtOAc至含有5％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2R-[3S-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.23g)，HPLC分析鑒定為3S∶3R醇非對(duì)映體的大約5.5∶1混合物。
1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.35(m，4H)，5.72(dd，1H)，5.50(dd，1H)，4.44(m，1H)，4.09(q，2H)，4.01(m，1H)，3.44(m，1H)，2.90(d，2H)，2.71(m，1H)，2.37-2.12(m，5H)，1.70-1.21(m，13H)；MS 456.3(M+1)，454.3(M-1).
步驟C7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循實(shí)施例1步驟C所述工藝，在10％披鈀碳(120mg)的存在下，將7-{2R-[3S-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.18g，2.59mmol)的EtOH(50ml)溶液在40-45psi Parr搖動(dòng)器上氫化24小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(含有50％EtOAc的己烷至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.08g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.39(m，4H)，4.09(q，2H)，3.86(m，1H)，3.60(m，2H)，2.89(m，2H)，2.76(m，1H)，2.33(m，4H)，2.11(m，1H)，1.80(m，1H)，1.68-1.21(m，16H).
步驟D7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。遵循實(shí)施例1步驟D所述工藝，將7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.93g，4.22mmol)用6N NaOH(26ml)的EtOH(52ml)溶液水解24小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸(1.66g)。1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.39(m，4H)，3.88(m，1H)，3.58(m，2H)，2.84(m，3H)，2.34(m，4H)，2.10(m，1H)，1.80(m，1H)，1.67-1.26(m，13H)；MS430.4(M+1).
步驟E7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸的鈉鹽。向7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸(1.66g，3.87mmol)的EtOH(16ml)溶液中加入NaHCO3(325mg，3.87mmol)的水(3ml)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌5小時(shí)，在真空中濃縮。使殘余物與CH2Cl2共沸(3x)，得到實(shí)施例2的標(biāo)題化合物的鈉鹽(1.698g)。
1H NMR(CD3OD)δ7.48(m，4H)，3.80(m，1H)，3.69(m，1H)，3.52(m，1H)，2.94(m，1H)，2.81(m，2H)，2.32(m，2H)，2.13(m，3H)，1.81(m，1H)，1.69-1.26(m，13H)；MS 430.3(M-Na+1)，428.2(M-Na-1).
實(shí)施例35S-[4-(3-氯-苯基)-3-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步驟A7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例1步驟A所述工藝，使從[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯(3.35g，12.12mmol)和NaH(60％油懸液，533mg，13.3mmol)衍生的陰離子與7-(2R-甲?；?5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(假定13.3mmol)反應(yīng)18小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(含有20％EtOAc的己烷至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(1.52g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.24(m，2H)，7.17(s，1H)，7.06(m，1H)，6.64(dd，1H)，6.20(d，1H)，4.15(m，1H)，3.80(s，2H)，3.50(m，1H)，2.72(m，1H)，2.46-2.20(m，5H)，1.78(m，1H)，1.59(m，2H)，1.40(m，4H)，1.24(m，2H).
步驟B7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例1步驟C所述工藝，在10％披鈀碳(86mg)的存在下，將7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(860mg，2.31mmol)的MeOH(40ml)溶液氫化1小時(shí)。經(jīng)過(guò)徑向色譜法純化(己烷至含有20％EtOAc的己烷至含有70％EtOAc的己烷)，得到7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg)。
步驟C7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在0℃下，向7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg，1.87mmol)的MeOH(30ml)溶液中加入NaBH4(35mg，0.921mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌45分鐘，加入水。在真空中除去揮發(fā)物，其余水溶液用亞甲基氯稀釋。將有機(jī)溶液用水、再用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有3％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[4-(3-氯苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.22(m，3H)，7.07(d，1H)，3.80(m，1H)，3.57(m，2H)，2.88(m，1H)，2.78(m，1H)，2.64(m，1H)，2.31(m，4H)，2.10(m，1H)，1.65-1.22(m，14H)；MS 377.3(M+1).
步驟D5S-[4-(3-氯-苯基)-3-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。將7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg，1.94mmol)、三甲基疊氮化硅(0.63ml，0.475mmol)與氧化二丁錫(96mg，3.87mmol)的甲苯(30ml)溶液在回流下加熱18小時(shí)。在真空中除去揮發(fā)物，殘余物用CH2Cl2稀釋。有機(jī)溶液用1N HCl、再用鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。殘余物經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有7％MeOH的CH2Cl2洗脫，得到TMS配合物。殘余物用MeOH稀釋，加入2N HCl，將溶液攪拌40分鐘。溶液用CH2Cl2稀釋，有機(jī)層用水、再用鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。殘余物經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用EtOAc至含有7％MeOH的CH2Cl2洗脫，得到5S-[4-(3-氯-苯基)-3-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(521mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.23(m，3H)，7.09(d，1H)，3.85(m，1H)，3.66(m，1H)，3.53(m，1H)，2.96(m，3H)，2.81(m，1H)，2.70(m，1H)，2.44(m，2H)，2.18(m，1H)，1.88-1.27(m，14H)；MS 420.2(M+1)，418.3(M-1).
實(shí)施例45S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步驟A7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例1步驟A所述工藝，使從[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯(2.68g，8.64mmol)和NaH(60％油懸液，400mg，10mmol)衍生的陰離子與7-(2R-甲?；?5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(假定10mmol)反應(yīng)18小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(含有30％EtOAc的己烷至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基)-庚腈(1.2g)。1H NMR(CDCl3)δ7.52(m，1H)，7.45(m，2H)，7.37(m，1H)，6.67(dd，1H)，6.23(d，1H)，4.18(m，1H)，3.90(s，2H)，3.53(m，1H)，2.73(m，1H)，2.45-2.23(m，5H)，1.79(m，1H)，1.60(m，2H)，1.41(m，4H)，1.24(m，2H)；MS 407.2(M+1)，405.3(M-1).
步驟B7-{2R-[3S-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在-45℃下，向7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚腈(1.14g，2.81mmol)與(R)-2-甲基-CBS-氧氮雜borolidine(1M甲苯溶液，0.42ml，0.42mmol)的CH2Cl2(112ml)溶液中滴加兒茶酚硼烷(1M THF溶液，8.4ml，8.4mmol)。將反應(yīng)混合物在-45℃下攪拌18小時(shí)，加入1N HCl。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌40分鐘，分離各層。有機(jī)溶液用冷1N NaOH洗滌(3次)。將有機(jī)溶液先后用1N HCl、水和鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2R-[3S-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(820mg)，1H NMR鑒定為大約2.5∶1的3S∶3R醇非對(duì)映體。1H NMR.1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.38(m，4H)，5.72(dd，1H)，5.49(dd，1H)，4.45(m，1H)，4.02(m，1H)，3.47(m，1H)，2.90(m，2H)，2.71(m，1H)，2.34(m，4H)，2.18(m，1H)，1.66(m，4H)，1.44(m，4H)，1.27(m，2H)；MS409.2(M+1).
步驟C7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例1步驟C所述工藝，在10％披鈀碳(100mg)的存在下，將7-{2R-[3S-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(810mg)的MeOH(40ml)溶液在50psi Parr搖動(dòng)器上氫化18小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有3％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(720mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.44(m，4H)，3.84(m，1H)，3.58(m，2H)，2.88(m，2H)，2.73(m，1H)，2.32(m，4H)，2.11(m，1H)，1.78(m，1H)，1.65-1.37(m，11H)，1.30(m，2H)；MS 411.2(M+1).
步驟D5S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循實(shí)施例3步驟D所述工藝，使7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(710mg，1.73mmol)與疊氮基三甲基硅烷(399mg，3.46mmol)和氧化二丁錫(43mg，1.7mmol)在甲苯(25ml)中反應(yīng)，在回流下加熱18小時(shí)。在真空中除去揮發(fā)物，殘余物用CH2Cl2稀釋。有機(jī)溶液連續(xù)用1N HCl(2次)、水(1次)和鹽水(1次)洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。殘余物經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2洗脫，得到5S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(450mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.44(m，4H)，3.87(m，1H)，3.65(m，1H)，3.50(m，1H)，3.01-2.73(m，5H)，2.42(m，2H)，2.16(m，1H)，1.86-1.23(m，14H)；MS 454.4(M+1)，452.4(M-1).
步驟E5S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮的鈉鹽。遵循實(shí)施例2步驟E所述工藝，將5S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(428mg，0.944mmol)用NaHCO3(79mg，0.94mmol)處理，得到鈉鹽(430mg)。1H NMR(CD3OD)δ7.48(m，4H)，3.79(m，1H)，3.67(m，1H)，3.51(m，1H)，2.86(m，5H)，2.30(m，2H)，2.12(m，1H)，1.84-1.27(m，14H)；MS 454.4(M-Na+1)，452.4(M-Na-1).
實(shí)施例55-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步驟A7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。將5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(150mg，0.41mmol)的DMF(5ml)溶液加入到NaH(60重量％油懸液，16mg，0.41mmol)的DMF(10ml)溶液中。1.5小時(shí)后，加入7-溴庚腈(78mg，0.41mmol)的DMF(5ml)溶液，將反應(yīng)混合物在90C下攪拌2.5小時(shí)。加入水(20ml)，水溶液用EtOAc洗滌(4×15ml)。合并有機(jī)溶液，用水洗滌(2×15ml)，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。殘余物經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc)，得到7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(161mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.09(m，2H)，6.95(m，2H)，3.81(m，1H)，3.54(m，2H)，2.86(m，1H)，2.68(m，2H)，2.29(m，4H)，2.06(m，1H)，1.74-1.23(m，13H)，0.85(s，9H)，0.04(m，3H)，0.19(m，3H)；MS475.1(M+1).
步驟B7-{2-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在0℃下，向7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(158mg，0.333mmol)的THF(20ml)溶液中加入TBAF(1M THF溶液，0.50ml，0.50mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時(shí)，加入飽和NaHCO3水溶液。在真空中除去揮發(fā)物。其余水溶液用CHCl3洗滌(4×5ml)，合并有機(jī)溶液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。殘余物經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc)，得到7-{2-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(82mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.15(m，2H)，7.00(m，2H)，3.77(m，1H)，3.58(m，2H)，2.89(m，1H)，2.79(m，1H)，2.64(m，1H)，2.34(m，4H)，2.12(m，1H)，1.68-1.24(m，14H)；MS 361.2(M+1).
步驟C5-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循實(shí)施例3步驟D所述工藝，使7-{2-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(71mg，0.197mmol)與疊氮基三甲基硅烷(45mg，0.394mmol)和氧化二丁錫(5mg，0.02mmol)在甲苯(10ml)中反應(yīng)，在回流下加熱16小時(shí)。加入另外的疊氮基三甲基硅烷(200mg)和氧化二丁錫(50mg)，將反應(yīng)混合物在回流下加熱5小時(shí)。反應(yīng)混合物用1N HCl(5ml)酸化至pH＝2，水溶液用EtOAc洗滌(4×10ml)。合并有機(jī)溶液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(EtOAc至39∶1 EtOAc∶MeOH至19∶1 EtOAc∶MeOH)，得到實(shí)施例5A的標(biāo)題化合物(39mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.16(m，2H)，7.00(m，2H)，3.81(m，1H)，3.68(m，1H)，3.53(m，1H)，2.99(m，3H)，2.80(m，1H)，2.68(m，1H)，2.47(m，2H)，2.20(m，1H)，1.88-1.22(m，14H)；MS 404.3(M+1)；402.3(M-1).
實(shí)施例65-(4-聯(lián)苯-3-基-3-羥基-丁基)-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步驟A7-{2-(4-聯(lián)苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例5步驟A所述工藝，在70℃下，將從5-[4-聯(lián)苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(239.1mg，0.564mmol)和NaHMDS(1M THF溶液，0.67ml，0.67mmol)衍生的陰離子用7-溴庚腈(118mg，0.620mmol)烷基化24小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2-[4-聯(lián)苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(187mg)。MS 533.3(M+1)。
步驟B7-[2-(4-聯(lián)苯-3-基-3-羥基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈。遵循實(shí)施例5步驟B所述工藝，將7-{2-[4-聯(lián)苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(187mg，0.351mmol)用TBAF(1M THF溶液，0.53ml，0.53mmol)去保護(hù)。加入是在0℃下進(jìn)行的，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有6％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)，得到7-[2-(4-聯(lián)苯-3-基-3-羥基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(85mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.58(m，1H)，7.51-7.33(m，4H)，7.21-7.12(m，4H)，3.85(m，1H)，3.60(m，2H)，2.90(m，1H)，2.83-2.60(m，2H)，2.45-2.30(m，4H)，2.14(m，1H)，1.73-1.25(m，14H).
步驟C5-(4-聯(lián)苯-3-基-3-羥基-丁基)-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循實(shí)施例3步驟D所述工藝，使7-[2-(4-聯(lián)苯-3-基-3-羥基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(109mg，0.260mmol)與疊氮基三甲基硅烷(0.69ml，0.52mmol)和氧化二丁錫(11mg，0.044mmol)在甲苯(5.3ml)中反應(yīng)，在回流下加熱72小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻，加入水?；旌衔镉?N HCl酸化至pH＝2，水溶液用含有5％MeOH的CH2Cl2洗滌(3次)。合并有機(jī)溶液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2)，得到實(shí)施例6的標(biāo)題化合物(107mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.57(m，1H)，7.51-7.32(m，4H)，7.25-7.13(m，4H)，3.91(m，1H)，3.74-3.50(m，2H)，2.96(m，3H)，2.77(m，1H)，2.50(m，2H)，2.22(m，1H)，2.07(m，1H)，1.90-1.22(m，14H)；MS 462.2(M+1)，460.1(M-1).
實(shí)施例75-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮
步驟A7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例5步驟A所述工藝，在70℃下，將從5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(250mg，0.684mmol)和NaHMDS(1M THF溶液，0.80ml，0.80mmol)衍生的陰離子用7-溴庚腈(142mg，0.748mmol)烷基化72小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有5％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(261.7mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.26(m，1H)，6.92(m，3H)，3.89(m，1H)，3.59(m，2H)，2.89(m，1H)，2.75(m，2H)，2.36(m，4H)，2.11(m，1H)， 1.72-1.26(m，13H)，0.89(s，9H)，0.09(s，6H)；MS 475.3(M+1).
步驟B7-{2-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例5步驟B所述工藝，將7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(261.7mg，0.551mmol)用TBAF(1M THF溶液，0.83ml，0.83mmol)去保護(hù)。加入是在0℃下進(jìn)行的，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(141mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.32(m，1H)，6.98(m，3H)，3.86(m，1H)，3.64(m，2H)，2.99-2.80(m，2H)，2.71(m，1H)，2.38(m，4H)，2.16(m，1H)，1.74-1.29(m，14H)；MS 361.3(M+1).
步驟C5-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循實(shí)施例6步驟C所述工藝，使7-{2-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(141.3mg，0.392mmol)與疊氮基三甲基硅烷(0.210ml，1.57mmol)和氧化二丁錫(29mg，0.116mmol)在甲苯(8ml)中反應(yīng)，在回流下加熱72小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2至含有6％MeOH的CH2Cl2)，得到實(shí)施例5C的標(biāo)題化合物(101.5mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.26(m，1H)，6.94(m，3H)，3.87(m，1H)，3.70(m，1H)，3.52(m，1H)，2.98(m，3H)，2.78(m，2H)，2.48(m，2H)，2.20(m，1H)，1.89-1.24(m，14H)；MS 404.2(M+1)，401.9(M-1).
實(shí)施例85S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步驟A7-{2R-[3S-羥基-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在-45℃下，向7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚腈(1.62g，4.34mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中加入(R)-2-甲基-CBS-氧氮雜borolidine(1M甲苯溶液，1.3ml，1.3mmol)。攪拌20分鐘后，滴加兒茶酚硼烷(1M THF溶液，13ml，13mmol)。將反應(yīng)系在-45℃下攪拌16小時(shí)，加入1N HCl。使混合物溫?zé)嶂潦覝?，分離各層。有機(jī)溶液用冷的1N NaOH洗滌(3次)。將有機(jī)溶液連續(xù)用1N HCl、水和鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶FtOAc至含有20％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2R-[3S-羥基-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(536mg)，HPLC鑒定為3S∶3R醇的8.2∶1混合物。1H NMR(CDCl3)δ7.24-7.17(m，3H)，7.07(m，1H)，5.69(dd，1H)，5.46(dd，1H)，4.40(m，1H)，4.01(m，1H)，3.46(m，1H)，2.81(m，2H)，2.68(m，1H)，2.42-2.28(m，4H)，2.20(m，1H)，1.73-1.59(m，4H)，1.42(m，4H)，1.25(m，2H)；MS 375(M+1).
步驟B7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循實(shí)施例4步驟C所述工藝，在10％披鈀碳(60mg)的存在下，使7-{2R-[3S-羥基-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(536mg)在EtOH(30ml)中氫化3.5小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc至含有20％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(440mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.22(m，3H)，7.08(m，1H)，3.83(m，1H)，3.59(m，2H)，2.90(m，1H)，2.77(dd，1H)，2.66(dd，1H)，2.39-2.29(m，4H)，2.11(m，1H)，1.78(m，1H)，1.68-1.39(m，11H)，1.29(m，2H)；MS 377.2(M+1).
步驟CS-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循實(shí)施例3步驟D所述工藝，將7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(420mg，1.114mmol)、三甲基疊氮化硅(257mg，2.23mmol)與氧化二丁錫(56mg)在甲苯(30ml)中的混合物在回流下加熱16小時(shí)。在真空中除去揮發(fā)物，將殘余物溶于MeOH，與3N HCl攪拌3小時(shí)。反應(yīng)系用水和CH2Cl2稀釋，分離各層。有機(jī)層用水、再用鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有7％MeOH的CH2Cl2)，得到5S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(311mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.22(m，3H)，7.08(m，1H)，3.86(m，1H)，3.66(m，1H)，3.52(m，1H)，2.96(m，3H)，2.82-2.68(m，2H)，2.45(m，2H)，2.17(m，1H)，1.88-1.22(m，14H)；MS 420.2(M+1)，418.3(M-1).
實(shí)施例97-{2R-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步驟A7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循實(shí)施例1步驟A所述工藝，將從[2-氧代-3-(3-苯氧基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯(633mg，1.98mmol)和NaH(60％油懸液，70mg，1.74mmol)衍生的陰離子與7-(2R-甲?；?5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(假定1.58mmol)反應(yīng)24小時(shí)。中壓色譜法(EtOAc)得到7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(215mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.28(m，3H)，7.08(m，1H)，6.97(m，2H)，6.89(m，2H)，6.83(m，1H)，6.62(dd，1H)，6.19(d，1H)，4.13(m，1H)，4.08(q，2H)，3.79(s，2H)，3.51(m，1H)，2.68(m，1H)，2.35(m，2H)，2.24(m，3H)，2.24(m，3H)，1.75(m，1H)，1.54(m，2H)，1.43-1.20(m，9H).
步驟B7-{2R-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循實(shí)施例3步驟C所述工藝，在0℃下，使7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(215mg，0.451mmol)與NaBH4(17mg，0.45mmol)在EtOH(3ml)中反應(yīng)4小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(EtOAc)，得到7-{2R-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(167mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.33(m，2H)，7.25(m，1H)，7.10(m，1H)，6.99(m，2H)，6.93(m，1H)，6.86(m，2H)，5.72(m，1H)，5.45(m，1H)，4.37(m，1H)，4.10(q，2H)，3.47(m，1H)，2.82(m，3H)，2.35(m，2H)，2.26(t，2H)，2.15(m，1H)，1.70-1.21(m，13H).
步驟C7-{2R-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。遵循實(shí)施例1步驟D所述工藝，在室溫下，將7-{2R-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(29mg，0.060mmol)用2M NaOH的EtOH溶液(4.0ml)水解24小時(shí)，得到標(biāo)題化合物(20mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.33-7.21(m，3H)，7.08(m，1H)，6.98-6.84(m，5H)，5.70(m，1H)，5.44(m，1H)，4.36(m，1H)，4.00(m，1H)，3.44(m，1H)，2.85-2.51(m，3H)，2.32(m，4H)，2.14(m，1H)，1.68-1.18(m，10H).
實(shí)施例107-{2S-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步驟A7-{2S-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循實(shí)施例1步驟C所述工藝，將7-{2R-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(139mg，0.290mmol)、MeOH(30ml)與10％披鈀碳(14mg)的混合物在50psi Parr搖動(dòng)器上氫化18小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(1∶1己烷∶EtOAc)，得到7-{2S-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(86mg)。1HNMR(CDCl3)δ7.35-7.24(m，3H)，7.10(m，1H)，6.99(m，2H)，6.93(m，1H)，6.87(m，2H)，4.09(q，2H)，3.80(m，1H)，3.58(m，2H)，2.82(m，2H)，2.64(m，1H)，2.42-2.24(m，4H)，2.10(m，1H)，1.77(m，1H)，1.66-1.21(m，16H).
步驟B7-{2S-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。遵循實(shí)施例1步驟D所述工藝，將7-{2S-[3-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(86mg，1.79mmol)用2N NaOH的MeOH溶液(4ml)水解18小時(shí)，得到標(biāo)題化合物(62mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.33-7.23(m，3H)，7.09(m，1H)，6.98(m，2H)，6.91(m，1H)，6.86(m，2H)，3.80(m，1H)，3.56(m，2H)，2.88(m，1H)，2.77(m，1H)，2.64(m，1H)，2.38-2.28(m，4H)，2.09(m，1H)，1.77(m，1H)，1.64-1.21(m，13H).
制備例17-(2R-羥甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈步驟A7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈。向NaH(60％油懸液，3.836 g，0.0959mmol，用25ml DMF洗滌)在DMF(250ml)中的混合物中加入5R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-吡咯烷-2-酮(TetrahdedronAsymmetry(四面體不對(duì)稱)，1996，7，2113)(20.00g，87.19mmol)的DMF溶液(50ml)。將反應(yīng)系在室溫下攪拌1.5小時(shí)，加入2-溴庚腈(16.574g，87.19mmol)的DMF(50ml)溶液。將反應(yīng)系在90C下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)系冷卻至室溫，加入水(750ml)。水溶液用EtOAc洗滌(4×250ml)。合并有機(jī)溶液，用水洗滌(2×250ml)，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(9∶1己烷∶EtOAc至7∶3己烷∶EtOAc至1∶1己烷∶EtOAc)洗脫，得到7-[2R-(叔丁基-二甲基硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(22.46g)。1H NMR(CDCl3)δ3.69-3.55(m，4H)，2.99(m，1H)，2.42(m，1H)，2.34-2.24(m，3H)，2.05(m，1H)，1.81(m，1H)，1.67-1.42(m，6H)，1.31(m，2H)，0.86(s，9H)，0.03(s，6H)；MS 339.3(M+1).
步驟B7-(2R-羥甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈。在0℃下，將氟化四丁銨(1M THF溶液，100.0ml，100.0mmol)緩慢加入到7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(22.39g，66.13mmol)的THF(400ml)溶液中。使反應(yīng)系溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢?小時(shí)。加入飽和NaHCO3水溶液(250ml)，在真空中除去揮發(fā)物。其余水溶液用CHCl3洗滌(4×200ml)。合并有機(jī)溶液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(9∶1己烷∶EtOAc至4∶1己烷∶EtOAc至7∶3己烷∶EtOAc至6∶4己烷∶EtOAc至1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至9∶1EtOAc∶MeOH)洗脫，得到7-(2R-羥甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(14.922g)。1H NMR(CDCl3)δ3.78(dd，1H)，3.71-3.58(m，3H)，3.00(m，1H)，2.46(m，1H)，2.36-2.27(m，3H)，2.08(m，1H)，1.93(m，1H)，1.77(m，1H)，1.68-1.43(m，6H)，1.32(m，2H)；MS 225.1(M+1).
制備例27-(2R-羥甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯步驟A7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯。遵循制備例1步驟A所述工藝，在90℃下，使從5R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-吡咯烷-2-酮(30.000g，130.8mmol)和NaH(60％油懸液，5.756g，143.9mmol)衍生的陰離子在DMF(600ml)中與7-溴庚酸乙酯(32.559g，137.3mmol)反應(yīng)3小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(9∶1己烷∶EtOAc至4∶1己烷∶EtOAc至7∶3己烷∶EtOAc至6∶4己烷∶EtOAc)洗脫，得到7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯(39.46g)。1HNMR(CDCl3)δ4.10(q，2H)，3.62(m，4H)，2.95(m，1H)，2.42(m，1H)，2.27(m，3H)，2.04(m，1H)，1.81(m，1H)，1.65-1.26(m，8H)，1.23(t，3H)，0.86(s，9H)，0.03(s，6H)；MS 386.2(M+1).
步驟B7-(2R-羥甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯。遵循制備例1步驟B所述工藝，將7-[2R-(叔丁基-二甲基硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯(39.46g，102.3mmol)用TBAF(1M THF溶液，154.0ml，154.0mmol)去保護(hù)，反應(yīng)時(shí)間為2.5小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(9∶1己烷∶EtOAc至6∶4己烷∶EtOAc至1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至19∶1 EtOAc∶MeOH)洗脫，得到7-(2R-羥甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(25.41g)。
1H NMR(CDCl3)δ4.10(q，2H)，3.77(dd，1H)，3.64(m，3H)，2.96(m，1H)，2.46(m，1H)，2.35-2.25(m，3H)，2.08(m，1H)，1.93(m，1H)，1.71(m，1H)，1.63-1.27(m，8H)，1.23(t，3H)；MS 272.2(M+1).
制備例3[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯步驟AN-甲氧基-N-甲基-2-(3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺。在0℃下，向鹽酸N，O-二甲基羥胺(1.577g，16.2mmol)的DMF(25ml)與CH2Cl2(25ml)溶液中加入三乙胺(2.25ml)。攪拌5分鐘后，加入3-三氟甲基苯乙酸(3.0g，14.7mmol)、HOBT(3.177g，23.5mmol)和DEC(鹽酸2-二乙氨基乙基氯，3.10g，16.2mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)，在真空中濃縮。殘余物用EtOAc稀釋，將有機(jī)溶液連續(xù)用1N NaOH(2次)、水和鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，在真空中濃縮。中壓色譜法(含有20％EtOAc的己烷至含有50％EtOAc的己烷)得到N-甲氧基-N-甲基-2-(3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺。
步驟B[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯。在-78℃下，向甲基膦酸二甲酯(9.4g，75.8mmol)的甲苯(80ml)溶液中緩慢加入正丁基鋰(2.5M己烷溶液，28ml，70mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)，緩慢加入N-甲氧基-N-甲基-2-(3-三氟甲基苯基)-乙酰胺(14.39g)的甲苯(50ml)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌2.5小時(shí)，加入AcOH(40ml)。使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?，加入水。有機(jī)層用水、再用鹽水洗滌。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，過(guò)濾，在真空中濃縮。中壓色譜法(CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2)得到制備例3的標(biāo)題化合物(9.37g)。1H NMR(CDCl3)δ7.52(m，1H)，7.44(m，2H)，7.37(m，1H)，3.96(s，2H)，3.87(s，3H)，3.76(s，3H)，3.12(d，2H).
制備例4[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯遵循類似于制備例3所述工藝，取代適當(dāng)?shù)脑?，制得制備?的標(biāo)題化合物。
制備例5[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯在-78℃下，向甲基膦酸二甲酯(17.93g，144mmol)的THF(270ml)溶液中緩慢加入正丁基鋰(2.5M，64.2ml，160.6mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)，緩慢加入(3-氯-苯基)-乙酸甲酯(26.93g，146mmol)。使反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢?4小時(shí)。加入AcOH(15ml)，在真空中除去揮發(fā)物。殘余物用CH2Cl2稀釋，將有機(jī)溶液小心地用飽和NaHCO3水溶液洗滌(3次)。將有機(jī)層干燥(MgSO4)，過(guò)濾，在真空中濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(含有20％EtOAc的己烷至EtOAc)，得到標(biāo)題化合物(9.28g)。
制備例6四氫-吡咯烷(pyrrolizine)-3，5-二酮遵循美國(guó)專利No.4,663,464所述工藝制得制備例6的標(biāo)題化合物。
制備例77-(2R-甲?；?5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯向7-(2R-羥甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(1.63g，6.0lmmol)的苯(50ml)溶液中加入鹽酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(3.46g，18.03mmol)和DMSO(1.5ml，24.04mmol)。將溶液冷卻至0℃，加入吡啶鎓三氟乙酸鹽(1.28g，6.61mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌2小時(shí)。從油性殘余物中潷析溶液。殘余物用苯洗滌(3x)，合并苯洗滌液，在真空中濃縮，得到7-(2R-甲?；?5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯，無(wú)需進(jìn)-步純化即可使用。
制備例84-(3-{2-(4-聯(lián)苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-丙基)-苯甲酸甲酯步驟A5-(3-溴-3-氧代-丁基)-吡咯烷-2-酮。在0℃下，向四氫吡咯烷-3，5-二酮(5g，36mmol)的CH2Cl2(320ml)溶液中滴加3-溴芐基溴化鎂(0.25M Et2O溶液，155ml，38.8mmol)。將溶液在0℃下攪拌2小時(shí)，用飽和氯化銨水溶液猝滅。加入1N HCl水溶液至達(dá)到pH＝3。溫?zé)嶂潦覝睾?，水溶液用CH2Cl2萃取(3x)。合并有機(jī)萃取液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有5％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-(3-溴-3-氧代-丁基)-吡咯烷-2-酮(7.84g)。1H NMR(CDCl3)δ7.41-7.11(m，4H)，6.24(bs，1H)，3.67(s，2H)，3.60(m，1H)，2.52(t，2H)，2.32(m，2H)，2.20(m，1H)，1.88-1.60(m，3H).
步驟B5-(3-溴-3-羥基-丁基)-吡咯烷-2-酮。在0℃下，向5-(3-溴-3-氧代-丁基)-吡咯烷-2-酮(7.84g，25.3mmol)的EtOH(130ml)溶液中加入NaBH4(480mg，12.6mmol)，將反應(yīng)系在0℃下攪拌2.5小時(shí)。用飽和氯化銨水溶液猝滅反應(yīng)。加入水和CH2Cl2。含水層用CH2Cl2洗滌(3x)，合并有機(jī)萃取液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-(3-溴-3-羥基-丁基)-吡咯烷-2-酮(6.76g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.36-7.09(m，4H)，6.27(d，1H)，3.78(m，1H)，3.63(m，1H)，2.75(m，1H)，2.62(m，1H)，2.32-2.18(m，3H)，1.88(m，1H)，1.73-1.42(m，5H)；MS 312.2，314.1(M+).
步驟C5-[3-溴-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。向5-(3-溴-3-羥基-丁基)-吡咯烷-2-酮(6.76g，21.6mmol)的DMF(86ml)溶液中加入叔丁基二甲代甲硅烷基氯(3.59g，23.8mmol)，再加入咪唑(2.95g，43.3mmol)和DMAP(264mg，2.16mmol)。將反應(yīng)系攪拌24小時(shí)，用飽和氯化銨水溶液猝滅。水溶液用EtOAc洗滌(3x)，合并有機(jī)萃取液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-[3-溴-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(7.45g)。1H NMR(CDCl3)δ7.30(m，2H)，7.12(m，1H)，7.04(m，1H)，5.71(m，1H)，3.81(m，1H)，3.56(m，1H)，2.66(m，2H)，2.32-2.17(m，3H)，1.70-1.35(m，5H)，0.82(s，9H)，-0.06(d，3H)，-0.24(d，3H)；MS 426.2，428.2(M+).
步驟D5-[4-聯(lián)苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。向5-[3-溴-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(750mg，1.76mmol)的DME(15ml)溶液中加入苯基代硼酸(236mg，1.93mmol)。加入乙酸鈀(26.8mg，0.088mmol)和三鄰甲苯基膦(39.5mg，0.176mmol)，再加入Na2CO3(37.3mg，3.52mmol)的水(1.8ml)溶液。將反應(yīng)系在回流下加熱24小時(shí)。將反應(yīng)系冷卻，在真空中除去揮發(fā)物。殘余物用鹽水和EtOAc稀釋。水溶液用EtOAc洗滌(3x)，合并有機(jī)萃取液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-[4-聯(lián)苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(717.3mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.57(m，2H)，7.43(m，2H)，7.33(m，3H)，7.11(m，2H)，5.78(m，1H)，3.91(m，1H)，3.59(m，1H)，2.76(m，2H)，2.27(m，3H)，1.73-1.38(m，5H)，0.83(s，9H)，-0.03(d，3H)，-0.16(d，3H)；MS 424.3(M+1).
制備例95-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮步驟A5-[4-(3-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制備例8步驟A所述工藝，使四氫-吡咯烷-3，5-二酮(2g，14mmol)與3-氟芐基氯化鎂(0.25M Et2O溶液，62ml，15.5mmol)反應(yīng)2.5小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(1∶1己烷∶EtOAc至2∶1 EtOAc∶己烷至EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-[4-(3-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.1730g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.32-7.27(m，1H)，7.00-6.90(m，3H)，6.12(bs，1H)，3.69(s，2H)，3.59(m，1H)，2.52(t，2H)，2.30(m，2H)，2.19(m，1H)，1.75(m，2H)，1.65(m，1H).
步驟B5-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制備例8步驟B所述工藝，將5-[4-(3-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.17g，8.71mmol)用NaBH4(165mg，4.35mmol)還原。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有6％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.23g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.27(m，1H)，6.94(m，3H)，6.38(m，1H)，3.82(m，1H)，3.66(m，1H)，2.79(m，1H)，2.67(m，1H)，2.33-2.21(m，3H)，1.92(d，J＝4.15Hz，1H)，1.75-1.40(m，5H)；MS 252.2(M+1).
步驟C5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制備例8步驟C所述工藝，使5-[4-(3-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.23g，8.87mmol)與叔丁基二甲代甲硅烷基氯(1.47g，9.76mmol)反應(yīng)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.84g)。1H NMR(CDCl3)δ7.23(m，1H)，6.88(m，3H)，5.75(m，1H)，3.85(m，1H)，3.57(m，1H)，2.71(m，2H)，2.30(m，2H)，2.25(m，1H)，1.70-1.38(m，5H)，0.84(s，9H)，0(s，3H)，-0.2(s，3H).
制備例105-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]]-吡咯烷-2-酮步驟A5-[4-(4-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制備例8步驟A所述工藝，使四氫-吡咯烷-3，5-二酮(1.41g，10.1mmol)與4-氟芐基氯化鎂(0.25M Et2O溶液，50ml，12.5mmol)反應(yīng)5小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(含有2％MeOH的CH2Cl2)，得到5-[4-(4-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.64g)。1H NMR(CDCl3)δ7.18(m，2H)，7.03(m，2H)，6.34(m，1H)，3.70(s，2H)，3.62(m，1H)，2.54(t，2H)，2.34-2.15(m，3H)，1.82-1.61(m，3H).
步驟B5-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制備例8步驟B所述工藝，在室溫下，將5-[4-(4-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.64g，mmol)用NaBH4(400mg，mmol)還原14時(shí)。加入另外的NaBH4(150mg)，將反應(yīng)系攪拌20小時(shí)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化，用溶劑梯度(CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)洗脫，得到5-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.01g)。1H NMR(CDCl3)δ7.14(m，2H)，6.98(m，2H)，6.78(m，1H)，3.76(m，1H)，3.65(m，1H)，2.76(m，1H)，2.64(m，1H)，2.32-2.18(m，4H)，1.72-1.47(m，5H).
步驟C5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制備例8步驟C所述工藝，使5-[4-(4-氟-苯基)-3-羥基-丁基]-吡咯烷-2-酮(1.95g，7.79mmol)與叔丁基二甲代甲硅烷基氯(1.47g，9.76mmol)反應(yīng)。經(jīng)過(guò)中壓色譜法純化(含有1％MeOH的CH2Cl2)，得到5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。1H NMR(CDCl3)δ7.12(m，2H)，6.97(m，2H)，5.75(m，1H)，3.83(m，1H)，3.60(m，1H)，2.71(m，2H)，2.36-2.24(m，3H)，1.70-1.38(m，5H)，0.84(s，9H)，-0.05(d，3H)，-0.2(d，3H).
制備例11[2-氧代-3-(3-苯氧基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯按照類似于制備例5化合物所述的方式，取代適當(dāng)?shù)脑?，制得制備?1的標(biāo)題化合物。
權(quán)利要求
1.治療哺乳動(dòng)物呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病的方法，包含對(duì)所述哺乳動(dòng)物給以EP4受體選擇性激動(dòng)劑、其前體藥物或所述EP4受體選擇性激動(dòng)劑或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述疾病是骨質(zhì)疏松、虛弱、骨質(zhì)疏松性骨折、骨缺陷、兒童自發(fā)性骨損失、牙槽骨損失、下頜骨損失、骨折、骨切開(kāi)術(shù)、與牙周炎有關(guān)的骨損失或假體向內(nèi)生長(zhǎng)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述組合物是全身給藥的。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述組合物是局部給藥的。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述疾病是虛弱。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述疾病是骨質(zhì)疏松。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述疾病是骨折或骨質(zhì)疏松性骨折。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述EP4選擇性激動(dòng)劑是式I化合物 其前體藥物或所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽，其中Q是COOR3、CONHR4或四唑-5-基；A是單鍵或順式雙鍵；B是單鍵或反式雙鍵；U是 或 R2是α-噻吩基、苯基、苯氧基、單取代的苯基和單取代的苯氧基，所述取代基是氯、氟、苯基、甲氧基、三氟甲基或(C1-C3)烷基；R3是氫、(C1-C5)烷基、苯基或?qū)?聯(lián)苯基；R4是COR5或SO2R5；R5是苯基或(C1-C5)烷基。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述EP4受體選擇性激動(dòng)劑是其中Q是5-四唑基、U是 的式I化合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是5R-(3S-羥基-4-苯基-丁-1-烯基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是5S-(3R-羥基-4-苯基-丁基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基)-]-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物是5S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-]-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述EP4受體選擇性激動(dòng)劑是其中Q是COOH、U是 的式I化合物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是7-(2S-(3R-羥基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-]-基)-庚酸。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是7-[2R-(3S-羥基-4-苯基-丁-1-烯基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[3R-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
21.權(quán)利要求8的方法，其中所述化合物選自7-{2S-[3R-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；和5S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
22.化合物，選自7-{2S-[3R-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；和5S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
23.權(quán)利要求22的化合物，它是7-{2S-[3R-羥基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
24.權(quán)利要求22的化合物，它是5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮。
25.權(quán)利要求22的化合物，它是7-(2S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸。
26.權(quán)利要求22的化合物，它是7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羥基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
27.權(quán)利要求22的化合物，它是5S-(3R-羥基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療呈現(xiàn)低骨質(zhì)量的疾病的方法，特別是骨質(zhì)疏松、虛弱、骨質(zhì)疏松性骨折、骨缺陷、兒童自發(fā)性骨損失、牙槽骨損失、下頜骨損失、骨折、骨切開(kāi)術(shù)、與牙周炎有關(guān)的骨損失或假體向內(nèi)生長(zhǎng)，包含將前列腺素激動(dòng)劑給藥，它們是EP
文檔編號(hào)C07D403/06GK1413190SQ00817566
公開(kāi)日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2000年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月22日
發(fā)明者K·O·卡梅倫, 柯華珠, B·A·萊福科, D·D·湯普森 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司