專利名稱：Hla結(jié)合肽及其用途的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的參考本發(fā)明申請(qǐng)為USSN 08/205,713(1994年3月4日遞交)的部分繼續(xù)申請(qǐng)。本申請(qǐng)還涉及USSN09/017,735、USSN08/753,622、USSN08/822,382、USSN60/013,980、USSN08/589,108、USSN08/454,033、USSN08/349,177、USSN08/073,205和USSN08/027,146。本發(fā)明申請(qǐng)還涉及USSN09/017,524、USSN08/821,739、USSN60/013,833、USSN08/758,409、USSN08/589,107、USSN08/451,913以及USSN08/347,610、USSN08/186,266、USSN08/159,339、USSN09/116,061、USSN08/103,396、USSN08/027,746和USSN07/926,666。本發(fā)明申請(qǐng)還涉及USSN09/017,743、USSN08/753,615、USSN08/590,298、USSN08/452,843、USSN09/115,400、USSN08/344,824和USSN08/278,634。本發(fā)明申請(qǐng)還涉及USSN08/197,484和USSN08/815,396。本文將上述各項(xiàng)申請(qǐng)全部納入作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防、治療或診斷多種病理狀況如，病毒性疾病和癌癥的組合物和方法。特別是，本發(fā)明提供了能與選定的主組織相容性復(fù)合基因(MHC)分子結(jié)合并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的一些新穎的肽。
MHC分子可分為I類或II類分子。II類MHC分子主要在參與引發(fā)和維持免疫應(yīng)答的細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)上表達(dá)。II類MHC分子可被輔助(helper)T淋巴細(xì)胞識(shí)別，并可誘導(dǎo)輔助T淋巴細(xì)胞的增殖和放大對(duì)該特異的免疫原性肽的免疫反應(yīng)。I類MHC分子在幾乎所有的有核細(xì)胞中都可表達(dá)，并可被各種細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)所識(shí)別，后者再摧毀帶有抗原的細(xì)胞。CTL類在排斥腫瘤和對(duì)抗病毒感染方面尤為重要。
CTL識(shí)別抗原的方式是通過(guò)結(jié)合于I類MHC分子的肽片段，而不是其本身直接接觸外來(lái)抗原?？乖ǔ１仨毷怯杉?xì)胞內(nèi)源性合成的、而且一部分蛋白質(zhì)抗原在細(xì)胞質(zhì)中被降解成小的肽片段。這種小型肽片段有的被轉(zhuǎn)移至前-高爾基分隔內(nèi)并與I類重鏈發(fā)生作用，以便形成專門的折疊，并和亞單位β2微球蛋白相連。接著肽-I類MHC分子復(fù)合物被傳送至細(xì)胞表面，以供表達(dá)并可能被特定的CTL識(shí)別。
對(duì)人的I類MHC分子HLA-A2.1的晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，通過(guò)I類重鏈的α1和α2區(qū)域的折疊產(chǎn)生了肽結(jié)合槽(groove)(Bjorkman等人，Nature329506(1987))。然而，在這些研究中尚未確定與該槽結(jié)合的肽的同一性。
Buus等人(Science2421065(1988))首先描述了從MHC將結(jié)合的肽洗脫的酸洗脫法。隨后，Rammensee及其同仁(Falk等人，Nature351290(1991))開發(fā)了一種對(duì)天然加工的與I類分子結(jié)合的肽的鑒定方法。其他一些研究者利用質(zhì)譜儀法對(duì)從B型(Jardetzky等人，Nature 353326(1991))和A2.1型(Hunt等人，Science 2251261(1992))的I類分子洗脫的肽的常規(guī)自動(dòng)測(cè)序法，對(duì)各種HPLC組分中較豐富的肽成功地實(shí)現(xiàn)了直接的氨基酸測(cè)序。Rotzschke和Falk已對(duì)I類MHC中天然加工的肽的特性作了綜述(Rotzschke和Falk，Immuno1.Today12447(1991))。
Sette等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA863296(1989))證明MHC等位基因的特異性基序能用來(lái)預(yù)測(cè)MHC的結(jié)合能力。Schaeffer等人(Proc.Natl.Acad.SciUSA 864649(1989))證明，MHC的結(jié)合作用與免疫原性相關(guān)。另幾個(gè)作者(DeBruijn等人，Eur.J.Immunol.，212963-2970(1991)；Pamer等人，991Nature353852-955(1991))已提供了有關(guān)I類的結(jié)合基序在動(dòng)物模型中能用于鑒別潛在的免疫原性肽的初步證據(jù)。但對(duì)某給定的I類同型的一些人的等位基因特異的I類基序還有待加以描述。最好是這些不同的等位基因的結(jié)合頻率足夠高，以至能覆蓋相當(dāng)大一部分或幾乎是大多數(shù)遠(yuǎn)系婚配人群。
盡管在本領(lǐng)域中已有所進(jìn)展，但是此前還沒(méi)有在這些研究的基礎(chǔ)上開發(fā)出有用的基于人體肽的疫苗或治療劑。而本發(fā)明提供了這些和其他方面的好處。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有攜帶HLA-A2.1分子的結(jié)合基序的免疫原性肽的組合物。結(jié)合于適當(dāng)?shù)腗HC等位基因的免疫原性肽最好是長(zhǎng)度為9-10個(gè)殘基，并且在某些位置上有保守性的殘基，比如，在2位和9位上。此外，該肽在其他位置上，比如，當(dāng)肽長(zhǎng)為9個(gè)氨基酸時(shí)在1，3，6，和/或7位；當(dāng)肽長(zhǎng)為10個(gè)氨基酸時(shí)在1，3，4，5，7，8，和/或9位上，則不含有如本文所述的起負(fù)結(jié)合作用的結(jié)合殘基。本發(fā)明限定了基本模式中的位置，從而能夠選擇那些能與HLA A2.1有效結(jié)合的肽。
本發(fā)明的基序包括9個(gè)氨基酸的肽，其在N-端的第二位置上包含第一個(gè)保守的殘基(選自I、V、A和T)，和在C端上包含第二個(gè)保守的殘基(選自V、L、I、A和M)。此外，該肽還可能在N端的第二位點(diǎn)包含第一個(gè)保守的殘基(選自L、M、I、V、A和T)；且在C端包含第二個(gè)保守的殘基(選自A和M)。如果該肽包含10個(gè)殘基，則其在N端的第二位點(diǎn)包含第一個(gè)保守的殘基(選自L、M、I、V、A和T)；且在C端位置包含第二個(gè)保守的殘基(選自V、I、L、A和M)；其中第一與第二個(gè)保守的殘基間距7個(gè)殘基。
用本發(fā)明的肽能鑒別出若干免疫原性靶蛋白質(zhì)上的表位。適當(dāng)?shù)目乖睦影ǎ傲邢侔┨禺愋钥乖?PSA)，前列腺特異性膜抗原(PSM)，乙型肝炎病毒髓芯及表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，I型人類免疫缺陷病毒(HIV1)，皮膚多發(fā)性生血性肉瘤皰疹病毒(KSHV)，人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，拉薩熱病毒、結(jié)核分枝桿菌(MT)，p53和鼠p53(mp53)，CEA，錐蟲表面抗原(TSA)，酪氨酸酶相關(guān)蛋白質(zhì)(TRP)家族的成員和Her2/neu。因此，這些肽對(duì)在活體內(nèi)和在活體外用于治療和診斷的各種藥物組合物是有用的。
本發(fā)明還提供了包含具有可供I類MHC分子結(jié)合的一些基序的免疫原性肽的組合物。通常這種免疫原性肽的長(zhǎng)度為約8-11個(gè)殘基之間，且包含參與與由適當(dāng)MHC等位基因編碼的蛋白質(zhì)相結(jié)合的保守性殘基。已確定了若干等位基因特異性基序。
例如，HLA-A3.2的基序，從N端到C端，在2位包含L、M、I、V、S、A、T和F的第一個(gè)保守的殘基，在C端包含K、R或Y的第二個(gè)保守的殘基。另外第一個(gè)保守的殘基是C、G或D或E。其它第二個(gè)保守的殘基是E或F。第一個(gè)和第二個(gè)保守的殘基宜間隔6-7個(gè)殘基。
為HLA-A1提供的基序從N端到C端包含第一個(gè)保守的殘基是T、S或M，第二個(gè)保守的殘基是D或E和第三個(gè)保守的殘基是Y。其它第二個(gè)保守的殘基是A、S或T。第一個(gè)和第二個(gè)保守的殘基相鄰接，且宜與第三個(gè)保守的殘基間隔6-7個(gè)殘基。第二個(gè)基序包含的第一個(gè)保守的殘基是E或D和第二個(gè)保守的殘基是Y，其中第一和第二個(gè)保守的殘基間隔5-6個(gè)殘基。
供HLA-A11的基序，從N端到C端包含在第2位的第一個(gè)保守的殘基是T、V、M、L、I、S、A、G、N、C、D或F，和K、R、C端的保守的殘基是Y或H。第一和第二個(gè)保守的殘基宜間隔6-7個(gè)殘基。
供HLA-A24.1的基序，從N端到C端包含在第2位的第一個(gè)保守的殘基是Y、F或W和C端保守的殘基是F、I、W、M或L。第一和第二個(gè)保守的殘基宜間隔6-7個(gè)殘基。
可用這種方式鑒定若干潛在的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表位。適合的抗原實(shí)例包括，前列腺特異性抗原(PSA)，前列腺特異性膜抗原(PSM)，乙型肝炎病毒髓核芯及表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，惡性黑色素瘤抗原(MAGE-1)，EB病毒抗原，I型人類免疫缺陷病毒(HIV1)，乳頭瘤病毒抗原，拉薩熱病毒、結(jié)核分枝桿菌(MT)，p53和鼠p53(mp53)，CEA和Her2/neu，以及酪氨酸酶相關(guān)蛋白質(zhì)(TRP)家族的成員。因此，這些肽可用作在活體內(nèi)和在活體外治療和診斷應(yīng)用的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了包含具有可供各種非-A HLA等位基因結(jié)合的一些基序的免疫原性肽的組合物。這種免疫原性肽的長(zhǎng)度較佳地為約9-10個(gè)殘基，且在有些位置包含保守的殘基，如在2位的脯氨酸和在羧基端的芳族殘基(如Y、W、F)或疏水性殘基(如L、I、V、M或A)。特別是，本發(fā)明的肽的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們能結(jié)合于兩種或多種不同的HLA等位基因。
可用這種方式鑒定若干潛在目標(biāo)蛋白質(zhì)的表位。適合的抗原實(shí)例包括，前列腺特異性抗原(PSA)，乙型肝炎病毒髓核芯及表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，惡性黑色素瘤抗原(MAGE-1)，EB病毒抗原，I型人類免疫缺陷病毒(HIV1)，乳頭瘤病毒抗原，拉薩熱病毒、結(jié)核分枝桿菌(MT)，p53，CEA和Her2/neu。因此，這些肽可用作在活體內(nèi)和在活體外治療和診斷應(yīng)用的藥物組合物。
定義術(shù)語(yǔ)“肽”與“寡肽”在本說(shuō)明書中可互換使用，指一系列互相連接的殘基，通常為L(zhǎng)-氨基酸，通常是通過(guò)相鄰氨基酸的各α-氨基與羧基之間的肽鍵相互相連。本發(fā)明的寡肽的長(zhǎng)度小于約15個(gè)殘基，通常為約8-11個(gè)殘基，最好為9或10個(gè)殘基。
“免疫原(性)肽”是含有等位基因特異性基序的肽，從而該肽會(huì)與MHC分子結(jié)合并誘導(dǎo)CTL應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性肽能結(jié)合適當(dāng)?shù)腍LA-A2.1分子并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)產(chǎn)生免疫原性肽的抗原的應(yīng)答反應(yīng)。
用本發(fā)明的算法能方便地鑒別出各種免疫原性肽。該算法是一套數(shù)學(xué)程序，以產(chǎn)生能用于選擇各種免疫原性肽的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。通常，人們是將“結(jié)合閥”與該算法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)一起使用，從而能夠選擇出具有一定親和力的高結(jié)合概率的，并因此產(chǎn)生免疫原性的肽。該算法或是以MHC可與含肽的基序的特定位點(diǎn)上的特定氨基酸相結(jié)合的效應(yīng)為基礎(chǔ)，或中以可與該基序上的特定替代物相結(jié)合的效應(yīng)為基礎(chǔ)。
“保守性殘基”是指在某肽的特定位點(diǎn)上以遠(yuǎn)大于預(yù)期隨機(jī)分布的頻率存在的氨基酸。保守的殘基一般是在MHC結(jié)構(gòu)上可為免疫原性肽提供接觸點(diǎn)的一個(gè)殘基。限定在位免疫原性肽的一個(gè)基序上的限定長(zhǎng)度的肽內(nèi)至少有1-3個(gè)或更多，保守的殘基宜為2個(gè)。這些殘基通常緊密接觸與肽相結(jié)合的槽(groove)，以其關(guān)于側(cè)鏈埋在槽(groove)的特異包(pocket)中。免疫原肽一般最多具有3個(gè)保守的殘基，更常見(jiàn)的是2個(gè)保守的殘基。
本文所用的“負(fù)結(jié)合性殘基”是指如果存在于一定位點(diǎn)(如，九聚物的1，3，和/或7位)上時(shí)會(huì)導(dǎo)致肽不能結(jié)合(非結(jié)合物)或結(jié)合性差(差的結(jié)合物)，從而不能產(chǎn)生免疫原性，即不能誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的一些氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“基序”是指在限定長(zhǎng)度(通常為約8-11個(gè)氨基酸)的肽上的能被特定的MHC等位基因識(shí)別的殘基基本模式。對(duì)于每個(gè)人的MHC等位基因的肽基序一般都不相同，而且在各高度保守的殘基和各負(fù)性殘基的模式上都有差別。
供等位基因結(jié)合的基序能越來(lái)越準(zhǔn)確地加以限定。在一種情況下，所有的保守殘基都位于肽上的正確位點(diǎn)，而且在位點(diǎn)1，3和/或7上沒(méi)有負(fù)作用殘基。
詞語(yǔ)“分離的”或“生物學(xué)純的”是指物質(zhì)大致或基本上不含有那些在原生狀態(tài)下常與其伴隨的成分的材料。因此，本發(fā)明的肽不含有在其原生環(huán)境中通常與其相伴的物質(zhì)，如含有抗原的細(xì)胞上的各種MHC I分子。即使在蛋白質(zhì)已被分離成均質(zhì)的或主要條帶的情況下，但仍有5-10％的原生蛋白質(zhì)等痕量污染物與所需蛋白質(zhì)一起被純化。本發(fā)明的分離的肽都不含有這種內(nèi)源性的一起純化的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“殘基”指通過(guò)酰胺鍵或擬酰胺鍵摻入寡肽的氨基酸或模擬氨基酸。
優(yōu)選例子的描述I.HLA-A2.1基序本發(fā)明涉及確定對(duì)人I類MHC(有時(shí)也可稱為HLA)各等位基因亞型提供的各種等位基因特異性的肽基序，尤其是，能被HLA-A2.1各等位基因識(shí)別的各種肽基序。這些基序以后就可被用于對(duì)來(lái)自任何所期望的抗原的T細(xì)胞表位進(jìn)行定義，尤其是那些與人的病毒性疾病、癌癥或自體免疫疾病(對(duì)于這些疾病的各種潛在的抗原靶或自體抗原靶的氨基酸序列都已經(jīng)知道)相關(guān)的表位。
位于一些潛在的靶蛋白質(zhì)上的表位都能用這種方式鑒別。合適的抗原的例子包括，前列腺特異性抗原(PSA)，乙型肝炎病毒髓芯和表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如，MAGE-1)，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原，人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，拉薩熱病毒，結(jié)核分枝桿菌(MT)，p53，CEA，錐蟲表面抗原(TSA)和Her2/neu。
含有來(lái)自這些抗原的表位的肽已被合成，并已在一系列試驗(yàn)中測(cè)試它們與適當(dāng)?shù)腗HC分子結(jié)合的能力，其中使用例如，純化的I類分子和放射性碘標(biāo)記的肽和/或表達(dá)空白I類分子的細(xì)胞，并通過(guò)例如，免疫螢光染色法和流式顯微螢光分析法，肽依賴性I類集合試驗(yàn)法(assembly assays)以及利用肽競(jìng)爭(zhēng)作用而抑制CTL的識(shí)別能力。對(duì)于那些與I類分子結(jié)合的肽進(jìn)一步評(píng)估了其作為感染的或免疫過(guò)的個(gè)體產(chǎn)生的CTL的靶目標(biāo)的能力，以及它們作為潛在治療劑在活體外或在活體內(nèi)誘導(dǎo)原發(fā)性CTL應(yīng)答的能力，這種CTL應(yīng)答能導(dǎo)致能與病毒感染性靶細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的CTL群的增加。
MHC I類抗原由HLA-A、B和C位點(diǎn)編碼。HLA-A和B抗原以大致相同密度在細(xì)胞表面表達(dá)，而HLA-C的表達(dá)則低得多(也許可低10倍之多)。這些位點(diǎn)的每一個(gè)都具有若干等位基因。本發(fā)明的各種肽結(jié)合基序?qū)τ诿糠N等位基因亞型都具有相對(duì)特異性。
對(duì)于肽基疫苗，本發(fā)明的肽最好具有能被在人群中廣泛分布的一種MHCI類分子識(shí)別的基序。因?yàn)樵诓煌娜朔N和亞種中，MHC等位基因發(fā)生的頻率不同，所以對(duì)靶MHC等位基因的選擇取決于選定的靶人群。表1顯示了在不同的人亞種中位于一些HLA-A位點(diǎn)產(chǎn)物的各種等位基因的頻率。例如，大部分白種人群可以被與四種HLA-A等位基因亞型(具體指HLA-A2.1，A1，A3.2，和A24.1)結(jié)合的肽所覆蓋。同樣，大部分亞洲人群則還可以加上與第五種等位基因HLA-A11.2結(jié)合的肽就可概括。
表1A等位基因/亞型N(69)*A(54) C(502)A110.1(7)1.8(1) 27.4(138)A2.1 11.5(8)37.0(20)39.8(199)A2.2 10.1(7)0 3.3(17)A2.3 1.4(1) 5.5(3) 0.8(4)A2.4 - - -A2.5 - - -A3.1 1.4(1) 0 0.2(0)A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108)A11.1 0 5.5(3) 0A11.2 5.7(4) 31.4(17)8.7(44)A11.3 0 3.7(2) 0A23 4.3(3) - 3.9(20)A24 2.9(2) 27.7(15)15.3(77)A24.2 - --A24.3 - --A25 1.4(1) -6.9(35)A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30)A26.2 7.2(5) -1.0(5)A26V - 3.7(2) -A28.1 10.1(7)-1.6(8)A28.2 1.4(1) -7.5(38)A29.1 1.4(1) -1.4(7)A29.2 10.1(7)1.8(1) 5.3(27)A30.1 8.6(6) -4.9(25)A30.2 1.4(1) -0.2(1)A30.3 7.2(5) -3.9(20)A31 4.3(3) 7.4(4) 6.9(35)A32 2.8(2) -7.1(36)Aw33.18.6(6) -2.5(13)Aw33.22.8(2) 16.6(9) 1.2(6)Aw34.11.4(1) --Aw34.214.5(10) -0.8(4)Aw36 5.9(4) -
表中數(shù)據(jù)得自B.DuPont，“HLA的免疫學(xué)”，第I卷，Histocompatibility Testing 1987，Springer-Verlag，New York 1989。
*N＝黑種人；A＝亞洲人；C＝白種人。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為列入分析的人數(shù)。
用于描述各種肽化合物的術(shù)語(yǔ)按照慣例，其中在每個(gè)氨基酸殘基的左側(cè)(N-端)是氨基，而在右側(cè)(C-端)是羧基。在表示選定的本發(fā)明的一些特殊例子的式子中，盡管沒(méi)有特別標(biāo)出)其氨基端和羧基端基團(tuán)假定都處于生理pH值范圍的形式(除非另加說(shuō)明)。在氨基酸結(jié)構(gòu)式中，各殘基通常用標(biāo)準(zhǔn)的三字符或單字符表示。L型的氨基酸殘基用大寫的單個(gè)字母或第一個(gè)字母大寫的三字母符號(hào)表示。D型的氨基酸的D型殘基用小寫的單個(gè)字母或小寫的三字符表示。甘氨酸沒(méi)有不對(duì)稱碳原子，則直接用“Gly”或“G”表示。
用于鑒別本發(fā)明的肽的程序，一般按照Falk等人，Nature 351290(1991)公開的方法(本文將其納入作為參考)。簡(jiǎn)言之，該方法包括從適當(dāng)?shù)募?xì)胞或細(xì)胞系中，一般是通過(guò)免疫沉淀法或親和層析法，大規(guī)模分離MHC I類分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍熟知的用于分離所需的MHC分子的其他方法的例子包括，離子交換層析法，外源凝集素層析法，分子大小分離法，高效液相色譜法，以及所有上述技術(shù)的組合形式。
在典型情況下，是用免疫沉淀法分離所需的等位基因?？梢砸罁?jù)使用的抗體的特異性而采用幾種技術(shù)方案。例如，對(duì)于HLA-A，HLA-B1和HLA-C分子的親和純化處理，可以使用等位基因特異性單克隆抗體(mAb)試劑。已有數(shù)種用于分離HLA-A分子的mAb試劑。單克隆BB7.2適用于分離HLA-A2分子。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用這種mAb制備的親和層析柱可以成功地分別純化各HLA-A等位基因產(chǎn)物。
除了各種等位基因特異性mAb，可以在上述申請(qǐng)所述的另外的各種親和純化處理方案中使用具有廣泛反應(yīng)性的各種抗-HLA-A、B、C mAb，例如W6/32和一種B9.12.1，和抗-HLA-B、C mAb，B1.23.2。
一般可使用酸處理來(lái)洗脫結(jié)合于分離的MHC分子的肽結(jié)合槽上的肽。還可用各種標(biāo)準(zhǔn)的變性方法使肽與I類分子解離，例如通過(guò)熱、pH、洗滌劑、鹽類、離液序列高的試劑或其組合。
再用反相高效液相色譜法(HPLC)可將肽部分與MHC分子分開，并測(cè)序?？梢杂眉夹g(shù)人員熟知的其他各種標(biāo)準(zhǔn)方法分離肽，其中包括過(guò)濾法，超濾法，電泳法，分子大小分離色譜法，用特異性抗體沉淀法，離子交換層析法，等電聚焦法等。
可以用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)分離的肽進(jìn)行測(cè)序，例如，用Edman降解法(Hunkapiller，M.W等人，Method Enzymol 91，399(1983))。其他適用于測(cè)序的方法包括，上述的對(duì)個(gè)別肽的質(zhì)譜分析法測(cè)序法(Hunt等人，Science 2251261(1992))，本文將其納入作為參考)。對(duì)來(lái)自不同的I類分子的大量異源肽(如混合的HPLC組分)的氨基酸測(cè)序，表明各種I類等位基因都各有特征性的序列基序。
確定了不同的I類等位基因特異性基序，就能夠鑒別已知氨基酸序列的抗原蛋白質(zhì)的潛在的肽表位。潛在的肽表位的鑒別，一般是先使用計(jì)算機(jī)對(duì)所需的抗原的氨基酸序列進(jìn)行掃描，以確定是否存在基序。然后合成表位序列。并用各種不同方法測(cè)量結(jié)合MHC I類分子的能力。一種方法是，在上述的相關(guān)申請(qǐng)中描述的I類分子結(jié)合試驗(yàn)法。其他在文獻(xiàn)中描述過(guò)的方法包括抗原表現(xiàn)抑制法(Sette等人，J.Immunol.1413893(1991))，在活體外裝配試驗(yàn)法(Townsend等人，Cell 62285(1990))，和使用突變細(xì)胞如RMA.S的基于FACS的試驗(yàn)法(Melief等人，Eur.J.Imminol.212963(1991))。
接著，對(duì)在I類MHC結(jié)合試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的肽測(cè)試其在活體外誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答的能力。例如，對(duì)已和某肽一起培育的表現(xiàn)抗原的細(xì)胞，可測(cè)試其誘導(dǎo)各種應(yīng)答細(xì)胞群中的CTL應(yīng)答的能力。表現(xiàn)抗原的細(xì)胞可以是正常細(xì)胞(如，外周血單核細(xì)胞)或樹突細(xì)胞)(Inaba等人，J.Exp.Med.166182(1987)；Boog，Eur.J.Immunol 18219(1988))。
或者，可以按常規(guī)使用的各種突變性哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(在負(fù)載帶有內(nèi)源加工的肽的能力方面有缺陷I類分子)，比如小鼠細(xì)胞系RMA-S(Karre等人，Nature319675(1986)；Ljunggren等人，Eur.J.Immunol.212963-2970(1991))，和人的體細(xì)胞T細(xì)胞雜交細(xì)胞，T-2(Cerundolo等人，Nature 345449-452(1990))以及已用適當(dāng)?shù)娜薎類基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，當(dāng)向它們加入肽時(shí)，測(cè)試該肽在活體外誘導(dǎo)初級(jí)CTL應(yīng)答的能力。其他可供使用的真核生物細(xì)胞系包括各種昆蟲細(xì)胞系如，蚊幼蟲(各種ATCC細(xì)胞系CCL125，126，1660，1591，6585，6586)，蠶(ATCCCRL8851)，黏蟲(ATCC CRL1711)，蛾(ATCC CCL80)，和果蠅屬細(xì)胞系如Schneider細(xì)胞系(參見(jiàn)Schneider J.Embryol.Exp.Morphol.27353-356(1927))。
在對(duì)正常供血者或病人進(jìn)行簡(jiǎn)易的靜脈穿刺或白細(xì)胞提取法之后，很容易分離出外周血淋巴細(xì)胞，用作CTL前體的應(yīng)答細(xì)胞源。在一個(gè)例子中，將適當(dāng)?shù)谋憩F(xiàn)抗原的細(xì)胞與10-100uM的肽在無(wú)血清培養(yǎng)基中以適宜的培養(yǎng)條件孵育4小時(shí)。然后將負(fù)載肽的表現(xiàn)抗原的細(xì)胞于最優(yōu)化培養(yǎng)條件下與應(yīng)答細(xì)胞群進(jìn)行活體外孵育7-10天。測(cè)試培養(yǎng)物中是否存在能殺死放射標(biāo)記的靶細(xì)胞的CTL，就可確定陽(yáng)性的CTL激活作用，其中的靶細(xì)胞包括各種特異性的受肽脈沖調(diào)節(jié)的(peptide-pulsed)靶以及表達(dá)相關(guān)病毒或腫瘤抗原(肽序列來(lái)自這些抗原)的內(nèi)源加工形式的各種靶細(xì)胞。
通過(guò)對(duì)表達(dá)適當(dāng)或不適當(dāng)?shù)娜薎類MHC分子的不同的肽的靶細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，就可確定CTL的特異性和MHC限制性。在MHC結(jié)合試驗(yàn)中呈陽(yáng)性并導(dǎo)致特異性CTL應(yīng)答的肽，在此處被稱為免疫原性肽。
免疫原性肽可以用合成法或重組DNA技術(shù)制備，或從天然原料如完整的病毒或腫瘤中制備。盡管肽最好基本上不含其他天然存在的宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)或其片段，但在某些實(shí)施例中肽可以通過(guò)合成而與原生的片段或粒子相結(jié)合。
多肽或肽都可以有各種長(zhǎng)度，或以中性(不帶電荷)形式或以鹽形式存在，或者不經(jīng)修飾(如糖基化，側(cè)鏈氧化或磷酸化)或者經(jīng)過(guò)這類修飾而如此處所述的該修飾并不破壞該多肽生物活性的情況。
理想的是，肽應(yīng)盡可能小同時(shí)仍能維持大肽的基本上所有生物活性。若在可能條件下，本發(fā)明優(yōu)化的肽的理想長(zhǎng)度為約9或10個(gè)氨基酸殘基，這在大小上相當(dāng)于在細(xì)胞表面上結(jié)合于I類MHC分子的內(nèi)源性加工的病毒肽或腫瘤細(xì)胞肽的長(zhǎng)度。
具有所需活性的肽可以按需要進(jìn)行修飾，以提供某些需要的特性，如，改進(jìn)藥理學(xué)特性，并同時(shí)提高或至少基本保守未修飾的肽結(jié)合于所需的MHC分子并激活適當(dāng)T細(xì)胞的全部生物活性。例如，肽可以經(jīng)過(guò)各種改變，比如，保守性或不保守性的替代作用，這些改變?cè)谑褂蒙峡赡軙?huì)提供某些好處，比如改進(jìn)MHC的結(jié)合。保守性替代是指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)在生物學(xué)和/或化學(xué)上相似的氨基酸殘基替代，如，用憎水性殘基替代另一個(gè)憎水性殘基，或用極性殘基替代另一個(gè)極性殘基。替代作用包括某些組合形式如，Gly，Ala；Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。單一氨基酸替代的效果也可以使用D-氨基酸類進(jìn)行探測(cè)。這些修飾可以利用公知的肽合成方法進(jìn)行，比如在本文引用作為參考的下列文獻(xiàn)中描述的方法例如Merrifield，Science 232341-347(1986)，Barany和Merrifield，“肽”，Gross and Meienhofer編輯(N.Y.，Academic Press)，第1-284頁(yè)(1979)；和Stewart和Yong，“固相肽的合成”，(Rockford，I11.，Pierce)，第2版(1984)。
還可以通過(guò)延長(zhǎng)或縮短化合物的氨基酸序列來(lái)修飾肽，例如通過(guò)增加或刪去一些氨基酸。本發(fā)明的肽或類似物還可以通過(guò)改變某些殘基的順序或組合而加以修飾，這很容易理解，某些在生物活性方面必須的氨基酸殘基，比如，位于關(guān)鍵接觸位點(diǎn)的殘基或保守的殘基，通常就不會(huì)改變而不致對(duì)生物活性產(chǎn)生有害影響。非關(guān)鍵性氨基酸不一定局限于那些天然存在于蛋白質(zhì)的種類如，各種L-α-氨基酸或其D-異構(gòu)體，但可包括非天然性氨基酸，如，各種β-γ-δ-氨基酸，以及許多L-α-氨基酸類的衍生物。
一般可用一系列具有單一氨基酸替代的肽來(lái)確定靜電電荷、憎水性等對(duì)結(jié)合的影響。例如，沿肽的長(zhǎng)度方向有一系列帶正電荷(如Lys或Arg)或負(fù)電荷(如Glu)的氨基酸替代物，表明對(duì)各種MHC分子和T細(xì)胞受體的敏感度模式都不同。此外，可以使用小而相對(duì)中性的分子部分如，Ala，Gly，Pro或類似的殘基進(jìn)行多重替代，這類替代物可以是同種寡聚物或異種寡聚物。用于替代或添加的殘基的數(shù)目和類型，取決于關(guān)鍵接觸點(diǎn)間所必須的間隔以及某些所想要達(dá)到的功能特性(如憎水性/親水性)。與親本肽的親和力相比，也可以通過(guò)這樣的替代來(lái)實(shí)現(xiàn)，提高對(duì)MHC分子或T細(xì)胞受體的結(jié)合親和力。無(wú)論如何，這種替代應(yīng)采用那些選定的氨基酸殘基或其他分子片段，以避免例如，可能會(huì)破壞結(jié)合的空間或電荷方面的干擾。
氨基酸替代一般都是單個(gè)殘基。可以通過(guò)替代、缺失、插入的綜合或其任何組合以獲得最終的肽。各種替代性突變體是肽的至少一個(gè)殘基被去除，并且在該位置上插入一個(gè)不同的殘基的突變類型。當(dāng)需要精細(xì)地調(diào)節(jié)肽的特性時(shí)，通?？梢愿鶕?jù)下列表2進(jìn)行這類替代。
表2原來(lái)的殘基替代示例AlaSerArgLys，HisAsnGlnAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisLys；ArgIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；HisMetLeu；IlePheTyr；TrpSerThrThrSerTrpTyr；PheTyrTrp；PheValIle；LeuProGly獲得功能上的重大改變(如對(duì)MHC分子或T細(xì)胞受體的親和力)是通過(guò)選擇那些比表2中列出的較少保守的替代分子，即通過(guò)選擇在對(duì)維持下列各方面的效果差別更大得多的殘基(a)在替代區(qū)域的肽主干的結(jié)構(gòu)，如，片狀或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)的分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。通常，預(yù)期肽的特性會(huì)產(chǎn)生最大改變的替代物是(a)親水性殘基(如絲氨?；?與憎水性殘基(如亮氨酰基、異亮氨酰基、苯丙氨酰基、纈氨酰基或丙氨?；?相互替代；(b)具有正電荷側(cè)鏈的殘基(如賴氨酰基、精氨酰基或組氨?；?與具有負(fù)電荷的殘基(如谷氨?；扉T冬氨?；?相互替代；或(c)側(cè)鏈體積大的殘基(如苯丙氨?；?與沒(méi)有側(cè)鏈的殘基(如甘氨?；?相互替代。
肽還可以包括免疫原性肽中兩個(gè)或多個(gè)殘基的等配物。如此文所定義的一個(gè)等配物是二個(gè)或多個(gè)殘基的某個(gè)序列，它可替代第二序列，因?yàn)榈谝恍蛄械牧Ⅲw構(gòu)象與第二序列的特異性結(jié)合點(diǎn)相適配。該術(shù)語(yǔ)特別包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的肽主干的一些修飾物。這類修飾物包括，酰胺氮原子、α-碳原子、酰胺羰基的修飾、酰胺鍵的完全替換、缺失、延伸或主干交聯(lián)。一般可參見(jiàn)，Spatola，“氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)”，第VII卷(Weinstein編輯，1983)。
含各種氨基酸模擬物或非天然氨基酸的肽的修飾在提高肽在活體內(nèi)的穩(wěn)定性方面特別有效。穩(wěn)定性可用多種方法測(cè)定。例如，可使用各種肽酶和各種生物性介質(zhì)如人血漿和血清來(lái)測(cè)試其穩(wěn)定性。參見(jiàn)，例如，Verhoef等人，Eur.J.Drug Metab Pharmacokin.11291-302(1986)。本發(fā)明的肽的半衰期可用25％人血清(V/V)試驗(yàn)方便地加以測(cè)定。該方案通常如下所述。在使用前將混合的人血清(AB型，來(lái)加熱滅活)經(jīng)離心脫脂。接著用RPMI組織培養(yǎng)基將血清稀釋至25％，用其測(cè)試肽的穩(wěn)定性。按預(yù)定的時(shí)間間隔取出少量反應(yīng)溶液，加入6％三氯乙酸水溶液或乙醇。將混濁的反應(yīng)樣品在4℃冷卻15分鐘，再離心使已沉淀的血清蛋白質(zhì)集聚成塊。再通過(guò)反相HPLC使用穩(wěn)定性-特異性的色譜條件，確定肽的存在與否。
本發(fā)明的具有CTL激活活性的肽或其類似物，可以經(jīng)修飾而提供除了改進(jìn)血清半衰期之外的各種所需的性能。例如，通過(guò)與含有至少一個(gè)能誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞應(yīng)答的表位的序列相連接，可以提高肽誘導(dǎo)CTL活性的能力。特別優(yōu)選的是免疫原性肽/T輔助細(xì)胞結(jié)合物通過(guò)間隔分子相連。間隔分子一般包括較小的中性分子，如氨基酸或氨基酸類似物，它們?cè)谏項(xiàng)l件下基本上不帶電荷。間隔分子一般可選自如Ala，Gly或其他非極性氨基酸或中性極性氨基酸的中性間隔分子。應(yīng)理解，可優(yōu)選地存在的間隔分子不一定含有相同的殘基，因而可以是異種低聚物或同種低聚物。當(dāng)間隔分子存在時(shí)，通常至少含1個(gè)或2個(gè)殘基，更常見(jiàn)含3-6個(gè)殘基?；蛘?，CTL肽也可以不用間隔分子而連于T輔助細(xì)胞肽。
免疫原性肽可以直接或通過(guò)間隔分子在CTL肽的氨基端或羧基端連于T輔助肽。免疫原性肽或T輔助肽的氨基端可以是?；摹Ｊ纠訲輔助肽包括破傷風(fēng)類毒素830-843，流感307-319，瘧疾環(huán)狀子孢子體382-298和378-389。
在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明的藥物組合物中最好是含有至少一種引發(fā)CTL的成分。經(jīng)鑒別，脂質(zhì)類能作為在活體內(nèi)引發(fā)CTL抗病毒抗原的制劑。例如，棕櫚酸殘基可附著于Lys殘基的α和ε氨基，然后例如再通過(guò)一個(gè)或多個(gè)連接殘基如Gly，Gly-Gly，Ser，Ser-Ser等而與免疫原性肽相連接。該脂質(zhì)化的肽就可以直接以膠粒形式用于摻入脂質(zhì)體或在佐劑(如不完全的Freund佐劑)中乳化而注射。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，特別有效的免疫原含有附著于Lys的α和ε氨基團(tuán)的棕櫚酸，它再通過(guò)如Ser-Ser的方式連接于免疫原性肽的氨基端。
作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應(yīng)答的另一例子，是大腸桿菌的脂蛋白類(如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSS))，可用于在共價(jià)附著于適當(dāng)?shù)碾臅r(shí)引發(fā)病毒特異性CTL。參見(jiàn)Deres等人，Nature，342561-564(1989)，本文將其納入作為參考。本發(fā)明的肽能連接于例如P3CSS，然后該脂質(zhì)化肽可以施用于人體以特異性地引發(fā)對(duì)靶抗原的CTL應(yīng)答。此外，因?yàn)檫B接于顯示適當(dāng)表位的肽的P3CSS還可以引發(fā)產(chǎn)生中和性抗體，所以該兩種組合物可以結(jié)合使用以更有效地對(duì)感染引發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)性應(yīng)答。
此外，可以在肽的各種個(gè)經(jīng)端添加額外的氨基酸類，從而使肽容易互相連接，或可連接于支承載體或更大的肽，或可修飾肽或寡肽等的物理或化學(xué)性能等?？蓪⒅T如酪氨酸，半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酸或天門冬氨酸之類的氨基酸引入肽或寡肽的C-或N-端。某些情況下在C端的修飾會(huì)改變肽的結(jié)合性能。此外，可使肽或寡肽的各序列與天然序列不同，例如使末端-NH2酰化，如通過(guò)烷酰基(C1-C20)或巰基形式乙醇?；饔没蚴鼓┒唆然０坊缬冒被蚣谆返鹊榷右孕揎棥Ｔ谀承┣闆r下，這些修飾提供了與支承物或其他分子結(jié)合的位點(diǎn)。
本發(fā)明的肽可以用多種不同的方法進(jìn)行制備。由于其尺寸相對(duì)較小，可以用常規(guī)技術(shù)在溶液或固相載體上合成這些肽。已有各種自動(dòng)合成儀市售供應(yīng)，可以根據(jù)已知的技術(shù)方案使用。參見(jiàn)，例如Steward和Young，“固相肽合成”，第2版，Pierce Chemical Co.(1984)，同上。
或者，也可以使用重組DNA技術(shù)，其方法是將可編碼相關(guān)的免疫原性肽的核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在適宜表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些程序都是本領(lǐng)域通曉的，如一般在Sambrook等人，“分子克隆處理，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1982)中所述，本文將其納入作為參考。因此，包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的肽序列的各種融合蛋白質(zhì)都能用于提供適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞表位。
因?yàn)榇颂幰?guī)定長(zhǎng)度的肽的編碼序列可以用化學(xué)方法如Matteucci等人的磷酸三酯法(J.Am Chem.Soc.1033185(1981))進(jìn)行合成，因此，通過(guò)對(duì)可編碼再生肽序列的核苷酸中的適當(dāng)堿基進(jìn)行替代就可以方便地進(jìn)行修飾。隨后就可給該編碼序列配上合適的接頭而與本領(lǐng)域常備的表達(dá)載體連接，然后使用該載體轉(zhuǎn)化合適的宿主以產(chǎn)生所需的融合蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在已可提供一些這樣的載體和合適的宿主系統(tǒng)。為了表達(dá)融合蛋白質(zhì)，可以給編碼序列配備可操作性連接的起始密碼子和終止密碼子，起動(dòng)子和終止子區(qū)域，以及通常配備一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，為在所需的細(xì)胞宿主中的表達(dá)提供一個(gè)表達(dá)載體。例如，在含有可供插入所需編碼序列合適的的限制性(酶切)位點(diǎn)的質(zhì)粒中，可以提供與細(xì)菌宿主相容的各種起動(dòng)子序列。得到的各種表達(dá)載體就可轉(zhuǎn)化至一些合適的細(xì)菌宿主中。當(dāng)然，若采用合適的載體和調(diào)控序列，也可以使用酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主。
本發(fā)明的肽及其藥用及疫苗用組合物都適用于哺乳動(dòng)物，特別是人使用，以治療和/或預(yù)防病毒性感染和癌癥。可以用本發(fā)明的免疫原性肽治療的疾病例子包括諸如前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、愛(ài)滋病AIDS、腎癌、宮頸癌、淋巴瘤，巨細(xì)胞病毒CMV和尖銳濕疣。
作為藥物組合物，本發(fā)明的免疫原性肽能適用于已罹患癌癥或被相關(guān)的病毒感染的個(gè)體。那些處于感染的潛伏期或急性期的病人可以單獨(dú)地用免疫原性肽進(jìn)行治療，或可結(jié)合其他治療手段(如果合適的話)進(jìn)行治療。在治療中，將組合物施用于病人的用量，須足以引發(fā)有效的對(duì)病毒或腫瘤抗原的CTL應(yīng)答，并且能治愈或至少部分消除癥狀和/或并發(fā)癥。足以實(shí)現(xiàn)該目的的用量被定義為“治療有效劑量”。對(duì)于該用途的有效量取決于，例如，肽組合物，施用方式，被治療的疾病所處的階段和嚴(yán)重性，病人的體重和健康的總體狀況以及處方醫(yī)生的判斷，但是作為初次免疫接種(適用于治療或預(yù)防)，對(duì)于70kg的病人，其用量范圍通常為約1.0μg至約5000μg肽，隨后各次加強(qiáng)劑量為約1.0-1000μg肽，在數(shù)周至數(shù)月內(nèi)按照加強(qiáng)治療方案施用，這種加強(qiáng)方案取決于病人的應(yīng)答及病情(通過(guò)測(cè)量病人血中特異性CTL活性而知)。應(yīng)記住，本發(fā)明的肽和各種組合物通?？捎糜趪?yán)重的疾病狀態(tài)，也就是危及生命或可能危及生命的狀態(tài)。在這種情況下，由于盡可能減少了外來(lái)物質(zhì)及肽的相對(duì)無(wú)毒性，即使是主治療醫(yī)生施用大大過(guò)量的，這類肽組合物還是可行而且可認(rèn)為是合乎需要的。
作為治療用途，應(yīng)當(dāng)在病毒感染首批癥候出現(xiàn)時(shí)、或檢出或手術(shù)去除腫瘤時(shí)，或在剛診斷出急性感染后不久便開始施用。隨后使用加強(qiáng)劑量，直到至少癥狀基本消退并且經(jīng)過(guò)一段時(shí)間。在慢性感染中，需要在負(fù)荷劑量后接著用加強(qiáng)劑量。
用本發(fā)明的組合物治療感染的個(gè)體，可以使急性感染個(gè)體的感染狀態(tài)加速消退。對(duì)于那些容易(或素質(zhì)易于)發(fā)展成慢性感染的個(gè)體，該組合物在防止急性感染向慢性感染演變的方法中特別有用。當(dāng)易感個(gè)體在感染之前或感染中被查出時(shí)，例如，(如本文所述)，便可將是組合物以他們?yōu)槟繕?biāo)，從而可減少對(duì)更大人群施用的需要。
肽組合物還可用于治療慢性感染和刺激免疫系統(tǒng)以消除攜帶者體內(nèi)病毒感染的細(xì)胞。在配方中提供一定量具有免疫增強(qiáng)作用的肽和足以有效激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的施用方式是至關(guān)重要的。因此對(duì)于治療慢性感染的代表性劑量，對(duì)于70kg重的病人的每次劑量為約1.0-5000μg，較佳為5-1000μg。免疫劑量之后，可能需要按規(guī)定間隔(如1-4周)施用加強(qiáng)劑量，有時(shí)可能需要更長(zhǎng)時(shí)間以便有效地使個(gè)體產(chǎn)生免疫。在慢性感染時(shí)，應(yīng)當(dāng)連續(xù)施用直到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室檢查表明，病毒感染已被清除或基本消退并經(jīng)過(guò)一段時(shí)間。
用于治療處理的藥物組合物可以采取非腸道施用、體表施用、口服或局部施用。較好的是，藥物組合物是通過(guò)非經(jīng)腸道施用，如靜脈內(nèi)施用，皮下施用，皮內(nèi)施用或肌肉內(nèi)施用。因此，本發(fā)明提供了非腸道施用的各種組合物，包括溶于或懸浮于可接受的載體，最好是水質(zhì)載體中的免疫原性肽的溶液?？梢允褂酶鞣N水質(zhì)載體，如水、緩沖水、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可以用已知的常規(guī)滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌處理，也可進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。得到的水溶液可以按原樣或凍干包裝以供使用，凍干制劑在施用之前與無(wú)菌溶液進(jìn)行混合。各種組合物還可以含有類似生理狀態(tài)所需的藥學(xué)上可接受的輔助性物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)及緩沖劑，張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。
在藥物配方中本發(fā)明的刺激肽的CTL濃度可以在大范圍中變動(dòng)，從小于約0.1％(通常為或至少為約2％)至高達(dá)20％-50％或更高(按重量計(jì))，而且根據(jù)選用的特定施用方式，可以主要通過(guò)液體的體積、粘度等進(jìn)行選擇。
本發(fā)明的肽還可以通過(guò)脂質(zhì)體形式進(jìn)行施用，脂質(zhì)體將肽定向輸送至特定的組織(如淋巴組織)或選擇性地定向送至受感染細(xì)胞，它還會(huì)提高肽組合物的半衰期。脂質(zhì)體可包括，乳劑、泡沫劑、膠粒、不溶性單分子層、液晶、磷脂質(zhì)分散劑、薄片層等。在這些制劑中，待輸送的肽可以摻入脂質(zhì)體作為其一部分，單獨(dú)或以與如淋巴組織細(xì)胞中普遍存在的受體相結(jié)合的分子(例如，結(jié)合于CD45抗原的單克隆抗體，或者和其他治療性或免疫原性組合物)一起輸送。因此，用本發(fā)明所需的肽填入的或修飾的脂質(zhì)體，可以被導(dǎo)向淋巴組織細(xì)胞所在部位，然后在該部位脂質(zhì)體釋出選定的治療性/免疫原性肽組合物。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可以用標(biāo)準(zhǔn)的成泡性脂質(zhì)類制備，通常包括，中性或帶負(fù)電荷的磷脂類和甾醇，如膽固醇。脂質(zhì)類的選擇依據(jù)通常是考慮如，脂質(zhì)體大小，酸不穩(wěn)定性和在血流中脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。已有各種制備脂質(zhì)體的方法，如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys Bioeng.9467(1980)，美國(guó)專利4,235,871號(hào)、4,501,728號(hào)、4,837,028號(hào)和5,019,369號(hào)所述(本文將它們?nèi)考{入作為參考)。
為了靶向?qū)朊庖呒?xì)胞，摻入到脂質(zhì)體中的配基可以包括例如對(duì)于所期望的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞表面決定簇具有特異性的抗體或其片段。含有肽的脂質(zhì)體懸浮液可以供靜脈內(nèi)施用，局部施用或體表施用等，其用量可以根據(jù)(尤其是)施用方式、被輸送的肽、以及被治療的疾病所處的階段而改變。
對(duì)于各種固體組合物，可以使用常規(guī)的無(wú)毒性的固相載體，包括如，藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服施用，可以通過(guò)摻入任何通常采用的賦形劑(例如，前面列出的那些載體)而形成藥學(xué)上可接受的無(wú)毒性組合物，它通常含有10％-95％活性成分(即一種或多種本發(fā)明的肽)，更佳的是濃度為25％-75％。
對(duì)于氣霧劑施用，免疫原性肽最好以精細(xì)分散的形式和表面活性劑及推進(jìn)劑一起提供。肽的一般百分比為0.01-20％(重量)，更佳的是為1-10％。當(dāng)然，表面活性劑必須無(wú)毒性，而且最好溶于推進(jìn)劑中。這類藥劑的代表形式是含有6-22個(gè)碳原子的脂肪酸(例如，己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸和油酸)與脂族多痙基醇或其環(huán)狀酐形式的酯或部分酯?？梢允褂没旌硝ヮ?，例如混合的或天然的甘油酯類。表面活性劑可占組合物的0.1-20％(重量)，更佳為0.25-5％。組合物的其余部分通常為推進(jìn)劑。如果需要還可包括一種載體例如，用于鼻內(nèi)給藥的卵磷酯。
本發(fā)明另一方面涉及疫苗，它含有致免疫性有效量的本文所述的免疫原性肽作為活性成分?？蓪㈦囊肽乘拗黧w(包括人)，其形式可以是連于其自己的載體或者作為活性肽單元的同源聚合物或異源聚合物。這種聚合物具有下列優(yōu)點(diǎn)可提高免疫反應(yīng)，而且當(dāng)使用不同的肽構(gòu)成聚合物時(shí)，還具有誘導(dǎo)能與病毒或腫瘤細(xì)胞的不同抗原決定簇發(fā)生反應(yīng)的抗體和/或CTL的額外能力。各種有效的載體是本領(lǐng)域公知的，包括例如，甲狀腺球蛋白、各種白蛋白(如人血清白蛋白)，破傷風(fēng)類毒素，各種聚氨基酸(如聚(賴氨酸谷氨酸))，流感、乙型肝炎病毒髓芯蛋白質(zhì)，乙型肝炎病毒重組疫苗等。這類疫苗還可含有生理上可承受的(可接受的)稀釋劑，如水、磷酸鹽緩沖鹽水、或鹽水，一般還可含有佐劑，諸如不完全Freund佐劑，磷酸鋁，氫氧化鋁，或明礬之類的佐劑都是本領(lǐng)域公知的材料。而且，如上所述通過(guò)將本發(fā)明的肽與脂質(zhì)類(如P3CSS)結(jié)合，就可以引發(fā)CTL應(yīng)答。一旦通過(guò)注射、氣霧劑、口服、皮內(nèi)或其他途徑施用，用此處所述的肽組合物進(jìn)行免疫處理，則宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)通過(guò)產(chǎn)生大量針對(duì)所需抗原的特異性CTL而對(duì)該疫苗應(yīng)答，宿主至少對(duì)以后的感染會(huì)產(chǎn)生部分免疫力，或能防止演變?yōu)槁愿腥尽?br> 含有本發(fā)明的肽的疫苗組合物可以施用于易感或處于病毒感染或癌癥威脅的病人，以引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，并因此增強(qiáng)病人自身的免疫應(yīng)答能力。這樣的用量被定義“致免疫性有效劑量”。在這樣應(yīng)用中，精確的用量同樣取決于病人的健康狀況和體重，施用方式，配方的性質(zhì)等，對(duì)于每一體重70kg的病人通常為1.0μg至約5000μg，更常用的為每70kg約10-500μg。
在某些情況下，最好是將本發(fā)明的肽疫苗和能誘導(dǎo)針對(duì)相關(guān)的病毒(尤其是病毒包膜抗原)的中和抗體應(yīng)答的疫苗一起混合使用。
對(duì)于治療或免疫用途，還可將可編碼本發(fā)明的一種或多種肽的核酸類施用于患者。通?？煞奖愕厥褂枚喾N方法將各種核酸送遞給患者。例如，可直接以“裸DNA”的方式送遞核酸。這種方法可參見(jiàn)例如，Wolff等人，Science2471465-1468(1990)以及美國(guó)專利第5,580,859和5,589,466號(hào)。也可用沖擊送遞法(ballistic delivery)施用核酸，參見(jiàn)如美國(guó)專利第5,204,253號(hào)?？梢越o予只包含DNA的粒子。或者，可將DNA附著于粒子(如黃金粒子)。也可將核酸以與陽(yáng)離子化合物(陽(yáng)離子脂質(zhì)類)的復(fù)合物形式施用。脂質(zhì)-介導(dǎo)基因的送遞方法可參見(jiàn)，如，WO96/18372、WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)682-691；Rose美國(guó)專利第5,279,833號(hào)；WO91/06309；和Feigner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7414。本發(fā)明的肽還可以由減毒的病毒宿主(如牛痘或雞痘(fowlpox)病毒)進(jìn)行表達(dá)。這種方法涉及使用牛痘病毒作為載體，來(lái)表達(dá)可編碼本發(fā)明的肽的各種核苷酸序列。一旦引入急性或慢性感染的宿主中或未感染的宿主中，該重組的牛痘病毒便可表達(dá)免疫原性肽，從而引起宿主的CTL應(yīng)答。用于一些免疫方案中的牛痘病毒載體和方法在例如，美國(guó)專利第4,722,848號(hào)中有所描述(本文將其納入作為參考)。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體在Stover等人的著作中(Nature 351456-460(1991))有所描述(本文將其納入作為參考)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員根據(jù)本文所述顯然會(huì)找到可供用于治療或免疫的本發(fā)明的肽使用的大量其他的載體(如，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體等)。
施用可編碼本發(fā)明的肽的各種核酸的優(yōu)選方法，是使用可編碼本發(fā)明多表位的一些小基因構(gòu)建物。為了制備可編碼選定的一些CTL表位(小基因)的DNA序列(用于在人細(xì)胞內(nèi)表達(dá))，要逆向翻譯這些表位的氨基酸序列?？捎萌嗣艽a子查索表來(lái)指導(dǎo)對(duì)各氨基酸的密碼子選擇。將這些編碼表位的DNA序列直接連接，就可產(chǎn)生一個(gè)連續(xù)的多肽序列。為了使表達(dá)和/或免疫原性最優(yōu)化，可將其它元件摻入小基因設(shè)計(jì)中?？赡嫦蚍g且包含在這種小基因序列中的氨基酸序列實(shí)例包括輔助T淋巴細(xì)胞的各種表位、一個(gè)前導(dǎo)(信號(hào))序列和一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保守信號(hào)。另外，通過(guò)在與CTL各表位相鄰處包含一些合成的(如，聚-丙氨酸)或天然存在的側(cè)翼序列，也可改善CTL表位的MHC表現(xiàn)。
通過(guò)裝配可編碼小基因正股和負(fù)股的寡核苷酸類就可將小基因序列轉(zhuǎn)化成DNA。用各種已知的方法在適合的條件下可合成、磷酸化、純化并韌化重疊的寡核苷酸類(長(zhǎng)度為30-100個(gè)堿基)。用T4DNA連接酶連接寡核苷酸的末端。此合成的、可編碼CTL表位多肽的小基因就可經(jīng)克隆成為合適的表達(dá)載體。
在該載體中包含本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)序列，可以確保在靶細(xì)胞中的表達(dá)。還需要一些載體元件具有在下游可克隆供小基因插入的位點(diǎn)的啟動(dòng)子；可供有效轉(zhuǎn)錄終止的聚腺苷酸化信號(hào)；大腸桿菌源復(fù)制作用；和大腸桿菌選擇性標(biāo)記物(如氨芐青霉素或卡那霉素抗性)。在這方面可使用多種啟動(dòng)子，如人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子序列可參見(jiàn)美國(guó)專利第5,580,859和5,589,466號(hào)。
小基因的表達(dá)和免疫原性的最優(yōu)化可能還需要其它載體修飾。在一些情況中，有效的基因表達(dá)需要各種內(nèi)含子，并可將一個(gè)或多個(gè)合成的或天然的內(nèi)含子摻入小基因被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中。也可認(rèn)為mRNA的一些穩(wěn)定序列的包含可增加小基因的表達(dá)。最近已提出各種免疫性刺激序列各種(ISS或CpG)在DNA疫苗的免疫原性中起著作用。如果認(rèn)為需要提高免疫原性，可以在小基因編碼序列外的載體內(nèi)包含這些序列。
在一些實(shí)施例中，可以使用生物同位素分析(bioistronic)表達(dá)載體，以產(chǎn)生小基因編碼的一些表位和所包含的可提高或降低免疫原性的第二種蛋白質(zhì)。如果共同表達(dá)時(shí)能有益地提高免疫應(yīng)答的各種蛋白質(zhì)或多肽的實(shí)例包括各種細(xì)胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)、各種可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分子(如LeIF)或各種輔助刺激分子。各種輔助性(HTL)表位可與各種細(xì)胞內(nèi)的靶信連接并與各CTL表位分開表達(dá)。這就可以將各HTL表位導(dǎo)向至不同各CTL表位的細(xì)胞區(qū)室。如果需要，這還可以更有效地協(xié)助各HTL表位進(jìn)入II類MHC途徑，從而改善CTL的誘導(dǎo)作用。與CTL誘導(dǎo)相反，用一些免疫抑制分子(如TGF-β)的共同表達(dá)特異性地降低免疫應(yīng)答，可能對(duì)一些疾病是有益的。
一旦選定了表達(dá)載體，就可將小基因克隆入啟動(dòng)子的多接頭區(qū)域下游。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入適合的大腸桿菌菌株中，并用標(biāo)準(zhǔn)方法制備DNA。載體中所包含的小基因的定向和DNA序列以及所有其它元件，可用限制性(酶切)繪圖和DNA序列分析進(jìn)行驗(yàn)證?？纱鎯?chǔ)攜帶正確質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞，作為主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)。
通過(guò)由大腸桿菌的發(fā)酵作用以及隨后的純化處理，可制備治療量的質(zhì)粒DNA。將工作細(xì)胞庫(kù)取得的等份細(xì)胞接種發(fā)酵培養(yǎng)基(如Terrific肉湯)，并用熟知的方法在搖瓶或生物反應(yīng)器內(nèi)生長(zhǎng)至飽和。并可以用標(biāo)準(zhǔn)生物分離方法，如固相陰離子交換樹脂(Quiagen提供)純化處理質(zhì)粒DNA。如果需要，可以用凝膠電泳法或其它方法將超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA與開環(huán)和線形DNA分離。
可以用各種配方制備注射用的純化的質(zhì)粒DNA。其中最簡(jiǎn)單的是將冷凍干燥DNA用無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)重建。已描述了多種方法，還有一些新方法也將可供使用。如上所述，各種核酸可方便地用一些陽(yáng)離子脂質(zhì)類配制。另外，還可將糖脂質(zhì)、基因融合脂質(zhì)體、肽和綜合稱為PINC(保護(hù)性、相互作用、非-凝縮性)的化合物類也都可與純化的質(zhì)粒DNA復(fù)合，從而影響對(duì)各種特定器官或細(xì)胞類型的各項(xiàng)變量，如穩(wěn)定性、肌內(nèi)分散和交流。
可使用靶細(xì)胞敏化作用對(duì)小基因編碼的CTL各表位的表達(dá)和I類MHC表現(xiàn)進(jìn)行功能性試驗(yàn)。質(zhì)粒DNA可引入適用于作為標(biāo)準(zhǔn)CTL鉻釋放試驗(yàn)的靶標(biāo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。所用的轉(zhuǎn)染方法取決于最終的制劑。可使用電穿孔去使DNA“暴露”，而陽(yáng)離子脂質(zhì)類則可指導(dǎo)在活體外轉(zhuǎn)染。可用表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GEP)的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染，而使經(jīng)熒光活化的細(xì)胞分選法(FACS)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞富集。然后用鉻-51標(biāo)記這些細(xì)胞，并用作各表位-特異性CTL系的靶細(xì)胞。用51Cr的釋放來(lái)檢測(cè)的細(xì)胞溶解現(xiàn)象就可表明表現(xiàn)MHC的小基因編碼的一些CTL表位的產(chǎn)生。
在活體內(nèi)，免疫原性是小基因DNA制劑功能性測(cè)試的另一種方法。用DNA制品對(duì)可表達(dá)適當(dāng)?shù)娜薓HC分子的轉(zhuǎn)基因小鼠施行免疫接種。施用的劑量和途徑是依制劑而定(如對(duì)PBS制備的DNA采用肌肉IM，對(duì)脂質(zhì)-復(fù)合的DNA采用腹腔內(nèi)IP)。免疫接種后21天，收獲脾細(xì)胞，并在可編碼經(jīng)測(cè)試的各表位的存在下再刺激1周。用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)試這些效應(yīng)細(xì)胞(CTL)的負(fù)載肽的鉻-51標(biāo)記的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解情況。據(jù)相應(yīng)于小基因編碼的各種表位的負(fù)載的MHC肽敏化的靶細(xì)胞發(fā)生的裂解表明了DNA疫苗在活體內(nèi)引發(fā)各種CTL的功能。
抗原肽還可以用來(lái)在活體外引發(fā)CTL。得到的CTL能用于治療病人的慢性感染(病毒性或細(xì)菌性)或腫瘤，這些病人對(duì)其他常規(guī)的治療方法不產(chǎn)生應(yīng)答或者對(duì)于治療用的肽疫苗方法不產(chǎn)生應(yīng)答。通過(guò)在組織培養(yǎng)物中將病人的CTL前體細(xì)胞(CTLp)和存在抗原的細(xì)胞(APC)源及適當(dāng)?shù)拿庖咴噪囊黄鸱跤?，?duì)特定病原(感染因子或腫瘤抗原)的離體CTL應(yīng)答，就可誘導(dǎo)。孵育適當(dāng)時(shí)間后(一般為1-4周)，CTLp被激活并成熟并擴(kuò)張成效應(yīng)CTL，將該細(xì)胞輸回病人，在病人體內(nèi)它們會(huì)摧毀其特異性靶細(xì)胞(感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)。
肽還被發(fā)現(xiàn)可以用作診斷試劑。例如，本發(fā)明的一種肽可以用于確定特定個(gè)體對(duì)采用肽或相關(guān)肽的治療方案的敏感性，因而能夠有助于修改已有的治療方案，或有助于確定受感染的個(gè)體預(yù)后情況。此外，肽還可以用于預(yù)測(cè)哪些個(gè)體會(huì)受到演變?yōu)槁愿腥镜闹卮笪ｋU(xiǎn)。
下面提供實(shí)施例是為了闡述而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例I用如上所述的相關(guān)申請(qǐng)所述的方法進(jìn)行I類抗原的分離。然后用這里所述的方法分離天然加工的肽并對(duì)它們測(cè)序。確定一個(gè)等位基因特異性基序和各種算法，并進(jìn)行一組定量的結(jié)合試驗(yàn)。
利用上述對(duì)來(lái)自若干抗原的HLA-A2.1等位基因氨基酸序列進(jìn)行鑒定的各種基序來(lái)分析是否存在這些基序。表3提供了這些研究的結(jié)果。字母“J”表示正亮氨酸。
提供上面的一些實(shí)施例是用于闡述本發(fā)明，而不是限制其范圍。本發(fā)明的其他一些變體本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易鄰會(huì)，它們包括在附錄權(quán)利要求條款中。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均引入此作為參考。
表3肽AA序列來(lái)源A*020117.03179LQIGNIISI F1u.24 0.013038.01039NLSLSCHAA CEA.432 0.01101233.119YLSGANLNV CEA.605V90.06901295.039SMPPPGTRV p53.149M20.02901295.049SLPPPGTRV p53.149L20.04101317.249KTCPVQLWV p53.139 0.00691323.029KLLPENNVV p53.24V9 0.01301323.049ALNKMFBQV p53.129B7V9 0.02601323.069KLBPVQLWV p53.139L2B3 0.11001323.089BLTIHYNYV p53.229B1L2V90.04301323.1810 LLPPQHLIRV p53.188L20.00611323.2911 YMCNSSCMGGM p53.236 0.00751323.3111 YLCNSSCMGGV p53.236L2V11 0.23001323.3411 KLYQGSYGFRV p53.101L2V11 0.06201324.079CQLAKTCPV p53.135 0.02401325.019RLPEAPPVp53.65L2 0.06401325.029GLAPPQHLV p53.187V90.01301325.049KMAELVHFL MAGE3.112M2 0.2100
表3(續(xù))肽AA序列來(lái)源A*02011325.059 KLAELVHFL MAGE3.112L2 0.25001326.019 CLLAKTCPV p53.135L20.04001326.029 KLSQHMTEV p53.164L20.04101326.049 ELAPVVAPV p53.68L2V9 0.08601326.0610QLAKTCPVQV p53.136 0.03201326.089 HLTEVVRRV p53.168L20.01801329.0111KTYQGSYGFRL 0.00281329.0310VVVPYEPPEV p53.216 0.00811329.149 BQLAKTBPV p53.135B1B7 0.04901329.159 BLLAKTBPV p53.135B1L2B70.11001330.019 QIIGYVIGT CEA.78 0.01601330.029 QLIGYVIGV CEA.78L2V9 0.53001330.059 YVCGIQNSV CEA.569 0.05101330.069 YLCGIQNSV CEA.569L20.10001330.079 ATVGIMIGV CEA.687 0.14001330.089 ALVGIMIGV CEA.687L20.50001330.0910VLYGPDDPTI CEA.411 0.01701330.1010VLYGPDDPTV CEA.411V10 0.03101331.029 DLMLSPDDV p53.42V91331.039 ALMLSPDDI p53.42A11331.049 ALMLSPDDV p53.42A1V91331.059 DLMLSPADI p53.42A71331.069 DLMLSPADV p53.42A7V91331.079 DLMLSPDAI p53.42A81331.089 DLMLSPDAV p53.42A8V938.00079 AILTFGSFV KSHV.89 0.085038.00099 HLRDFALAV KSHV.106 0.018338.00159 ALLGSIALL KSHV.155 0.047038.00189 ALLATILAA KSHV.161 0.049038.00199 LLATILAAV KSHV.162 0.160038.00229 RLFADELAA KSHV.14 0.0150
表3(續(xù))肽AA序列來(lái)源A*020138.00249 YLSKCTLAV KSHV.65 0.200038.00269 LVYHIYSKI KSHV.153 0.045738.00299 SMYLCILSA KSHV.208 0.025038.00309 YLCILSALV KSHV.210 0.350038.00339 VMFSYLQSL KSHV.268 0.500038.00359 RLHVYAYSA KSHV.285 0.027038.00399 GLQTLGAFV KSHV.98 0.011038.00409 FVEEQMTWA KSHV.105 0.038038.00419 QMTWAQTVV KSHV.109 0.011038.D0429 IILDTAIFV KSHV.130 0.680038.00439 AIFVCNAFV KSHV.135 0.091038.00469 AMGNRLVEA KSHV.172 0.020038.00479 RLVEACNLL KSHV.176 0.018038.00599 TLSIVTFSL KSHV.198 0.220038.00639 KLSVLLLEV KSHV.292 0.140038.00649 LLLEVNRSV KSHV.296 0.027038.00689 FVSSPTLPV KSHV.78 0.035038.00709 AMLVLLAEI KSHV.281 0.082038.00759 QMARLAWEA KSHV.11160.099038.013110VLAIEGIFMAKSHV.10 0.073038.013210YLYHPLLSPIKSHV.27 0.140038.013410SLFEAMLANVKSHV.49 0.950038.013510STTGINQLGLKSHV.62 0.071038.013710LAILTFGSFVKSHV.88 0.01.6038.013910ALLGSIALLAKSHV.155 0.036038.014110ALLATILAAVKSHV.161 0.110038.014210LLATILAAVAKSHV.162 0.011038.014310RLFADELAALKSHV.14 0.180038.014810YLSKCTLAVLKSHV.65 0.030038.015010LLVYHIYSKIKSHV.152 0.013038.015110SMYLCILSALKSHV.208 0.0360
表3(續(xù))肽AA序列來(lái)源A*020138.015310HLHRQMLSFVKSHV.68 0.016038.016310LLCGKTGAFLKSHV.1670.010038.016410ETLSIVTFSLKSHV.1970.018039.00639 VMCTYSPPL mp53.1191.400039.00659 KLFCQLAKT mp53.1290.016039.00679 ATPPAGSRV mp53.1460.013039.013310FLQSGTAKSVmp53.1100.018039.016910CMDRGLTVFVKSHV.3110.012039.017010VLLNWWRWRLKSHV.3270.150040.00709 GVFTGLTHI HCV.15650.011040.00729 QMWKCLIRL HCV.16110.062040.00749 IMTCMSADL HCV.16500.012140.00769 ALAAYCLST HCV.16740.250040.00809 VLSGKPAII HCV.16920.015040.00829 FISGIQYLA HCV.17730.100040.013410YIMTCMSADLHCV.16490.030040.013710AIASLMAFTAHCV.17910.058040.013810GLAGAAIGSVHCV.18380.032041.00588 MIGVLVGV CEA.692 0.012041.00619 VLPLAYISL TRP10.011041.00629 SLGCIFFPL TRP10.970041.00639 PLAYISLFL TRP10.022041.00659 LMLFYQVWA TRP10.027041.00719 NISIYNYFV TRP10.230041.00729 NISVYNYFV TRP10.060041.00759 FVWTHYYSV TRP11.500041.00779 FLWHRYHL TRP10.550041.00789 LWHRYHLL TRP10.160041.00829 MLQEPSFSL TRP10.690041.00839 SLPYWNFAT TRP10.011041.00889 RLPEPQDVA TRP10.0180
表3(續(xù))肽AA序列來(lái)源A*020141.00909VTQCLEVRV TRP10.016041.00969LLHTFTDAV TRP10.270041.01009NMVPFWPPV TRP10.620041.01049AVVGALLLV TRP10.021041.01059AVVAALLLV TRP10.039041.01089LLVAAIFGV TRP11.900041.01129SMDEANQPL TRP10.077041.01149VLPLAYISV TRP10.110041.01159SLGCIFFPV TRP13.200041.01169PLAYISLFV TRP10.031041.01179LLLFQQARV TRP10.110041.01189LMLFYQVWV TRP12.400041.01199LLPSSGPGV TRP10.370041.01219NLSTYNYFV TRP10.970041.01229NLSVYNYFV TRP10.870041.01239FLWTHYYSV TRP15.600041.01249SLKKTFLGV TRP10.022441.01259FLTWHRHV TRP10.380041.01299MLQEPSFSV TRP11.600041.01309SLPYWNFAV TRP10.570041.01319ALGKNVCDV TRP10.016041.01329SLLISPNSV TRP10.130041.01339SLFSQWRVV TRP10.074041.01349TLGTLCNSV TRP10.033041.01369RLPEPQDVV TRP10.100041.01379VLQCLEVRV TRP10.036041.01389SLNSFRNTV TRP10.014041.01399SLDSFRNTV TRP10.044041.01419FLNGTGGQV TRP10.022041.01429VLLHTFTDV TRP10.018041.01459ALVGALLLV TRP10.2600
表3(續(xù))肽AA序列來(lái)源A*Q20141.01469 ALVAALLLV TRP1 0.580041.01479 LLVALIFGV TRP1 1.000041.01489 YLIRARRSV TRP1 0.017041.01499 SMDEANQPV TRP1 0.160041.015110SLGCIFPLL TRP1 0.180041.015710GMCCPDLSPV TRP1 0.095041.016010AACNQKILTV TRP1 0.012041.016210FLTWHRYHLL TRP1 0.083041.016610SLHNLAHLFL TRP1 0.390041.017410LLLVAAIFGV TRP1 0.300041.017710LLVAAIFGVA TRP1 0.082041.017810ALIFGTASYL TRP1 0.023041.018010SMDEANQPLL TRP1 0.025041.018110LLTDQYQCYA TRP1 0.032041.018310SLGCIFFPLV TRP1 0.320041.018610FLMLFYQVWV TRP1 0.810041.018910ALCDQRVLIV TRP1 0.053041.019010ALCNQKILTV TRP1 0.077041.019110FLTWHRYHLV TRP1 0.051041.019710SLHNLAHLFV TRP1 0.500041.019810NLAHLFLNGV TRP1 0.410041.019910NMVPFWPPVV TRP1 0.280041.020110ILVVAALLLV TRP1 0.019041.020310LLVALIFGTV TRP1 0.120041.020510ALIFGTASYV TRP1 0.090041.020610SMDEANQPLV TRP1 0.035041.020710LLTDQYQCYV TRP1 0.210041.021211LLIQNIIQNDTCEA.1070.014041.021411IIQNDTGFYTLCEA.1120.013041.022111TFNVTRNDTA CEA.2010.011041.023511LTLLSVTRNDVCEA.3780.0150
表3(續(xù))肽AA序列來(lái)源A*020141.024311GLYTCQANNSACEA.4730.029041.026811ATVGIMIGVLVCEA.6870.016044.007511GLVPPQHLIRVmp53.184.V30.037044.008711GLAPPVHLIRVmp53.184.V60.033044.009211GLAPPEHLIRVmp53.184.E60.16001227.109 ILIGVLVGV CEA.691.L2 0.23001234.2610YLIMVKCWMV Her2/neu.952.L20.3800V101295.069 LLGRDSFEV mp53.261 0.20001319.019 FMYSDFHFI Flu.RRP2.446 0.44001319.069 NMLSTVLGV Flu.RRP2.446 0.17001319.149 SLENFRAYV Flu.RRP2.446 0.04301325.06 KMAELVHFV Mage3.112 0.19001325.07 KLAELVHFV Mage3.112 0.35001334.01 VLIQRNPQV Her2/neu.153.V90.09101334.02 VLLGVVFFGV Her2/neu.665.L22.1000V91334.03 SLISAVVGV Her2/neu.653.L20.7000V91334.04 YMIMVKBWMI Her2/neu.952.B70.27001334.05 YLIMVKBWMV Her2/neu.952.L20.6900B7V101334.06 KLWEELSVV Mage3.220.L2V 0.450091334.08 AMBRWGLLV Her2/neu.5.M2B 0.14003V91345.019 IJIGVLVGV CEA.691.J2 0.05701345.029 ATVGIJIGV CEA.687.J6 0.15951345.039 SJPPPGTRV p53.149.J2 0.05451345.0410LVFGIELJEV MAGE3.160.J8 0.7650918.12 8 ILGFVFTL Flu.M1.59 0.7900
表3(續(xù))肽AA序列來(lái)源A*02.011095.229 KIFGSLAFL Her2/neu.
1090.0110YLQLVFGIEV MAGE21126.019 MMNDQLMFL PSM1126.0210ALVLAGGFFL PSM1126.039 WLCAGALVL PSM1126.059 MVFELANSI PSM1126.0610RMMNDQLMFL PSM1126.099 LVLAGGFFL PSM1126.109 VLAGGFFLL PSM1126.129 LLHETDSAV PSM1126.149 LMYSLVHNL PSM1126.1610QLMFLERAFI PSM1126.179 LMFLERAFI PSM1126.2010KLGSGNDFEV PSM1129.0110LLQERGVAYI PSM1129.0410GMPEGDLVYV PSM1129.0510FLDELKAENI PSM1129.089 ALFDIESKV PSM1129.1010GLPSIPVHPI PSMII.非-HLA-A2基序本發(fā)明還涉及確定人I類MHC(有時(shí)稱為HLA)各等位基因亞型的等位基因特異性的肽基序。這些基序接著被用于定義來(lái)自任何所期望的抗原的各種T細(xì)胞表位，尤其是那些與人的病毒性疾病、癌癥或自體免疫疾病相關(guān)的表位，對(duì)于這些疾病人們已經(jīng)知道潛在的抗原或自體抗原靶的氨基酸順序。
位于若干潛在的靶蛋白質(zhì)上的表位能用這種方式鑒別。合適的抗原的一些例子包括，前列腺特異抗原(PSA)，乙型肝炎病毒髓芯和表面抗原(HBVc，HBVs)，丙型肝炎抗原，EB病毒抗原，黑色素瘤抗原(如MAGE-1)，人類免疫缺陷型病毒(HIV)抗原，人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，拉薩熱病毒，結(jié)核分枝桿菌(MT)，p53，CEA和Her2/neu。
含有來(lái)自這些抗原的表位的肽已被合成，接著在一些試驗(yàn)中測(cè)試了它們與適當(dāng)?shù)腗HC分子的結(jié)合能力，例如使用純化的I類分子和放射性碘標(biāo)記的肽和/或表達(dá)空白I類分子的細(xì)胞，通過(guò)例如，免疫螢光染色法和流式顯微螢光分析法，肽依賴性I類裝配試驗(yàn)法(assembly assays)以及利用肽競(jìng)爭(zhēng)作用對(duì)CTL識(shí)別的抑制試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于那些與I類分子結(jié)合的肽還進(jìn)一步評(píng)估了其作為來(lái)自感染或免疫過(guò)的個(gè)體的各種CTL的靶目標(biāo)的能力，以及它們作為潛在治療劑在活體外或在活體內(nèi)誘導(dǎo)原發(fā)性CTL應(yīng)答的能力，從而導(dǎo)致能與病毒感染的靶細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的CTL群的增加。
各種MHC I類抗原可由HLA-A、B和C位點(diǎn)編碼。HLA-A和B抗原以大致相同密度在細(xì)胞表面表達(dá)，而HLA-C的表達(dá)則低得多(也許可低至10倍之多)。這些位點(diǎn)的每一個(gè)都具有若干等位基因。本發(fā)明的肽結(jié)合的各基序?qū)τ诿糠N等位基因亞型都是相對(duì)特異的。
對(duì)于各種肽基疫苗，本發(fā)明的肽最好具有能被在人群中具有廣泛分布的一種MHC I分子識(shí)別的基序。因?yàn)樵诓煌娜朔N和亞種中，MHC等位基因存在的頻率不同，所以對(duì)靶MHC等位基因的選擇，可能取決于選定的靶人群。表4顯示了在不同亞種中位于HLA-A位點(diǎn)產(chǎn)物的各種等位基因的頻率。例如，大部分白種人群可以被與四種HLA-A等位基因亞型(具體指HLA-A2.1，Al，A3.2，和A24.1)結(jié)合的肽所覆蓋。同樣，大部分亞洲人群可以通過(guò)添加與第五種等位基因HLA-A1 1.2結(jié)合的肽而概括。
表4A等位基因/亞型N(69)*A(54)C(502)A110.1(7) 1.8(1) 27.4(138)A2.1 11.5(8) 37.0(20)39.8(199)A2.2 10.1(7) 0 3.3(17)A2.3 1.4(1) 5.5(3) 0.8(4)A2.4 - - -A2.5 - - -A3.1 1.4(1) 0 0.2(0)A3.2 5.7(4) 5.5(3) 21.5(108)A11.1 0 5.5(3) 0A11.2 5.7(4) 31.4(17)8.7(44)A11.3 0 3.7(2) 0A23 4.3(3) - 3.9(20)A24 2.9(2) 27.7(15)15.3(77)A24.2 - - -A24.3 - - -A25 1.4(1) - 6.9(35)A26.1 4.3(3) 9.2(5) 5.9(30)A26.2 7.2(5) - 1.0(5)A26V - 3.7(2) -A28.1 10.1(7) - 1.6(8)A28.2 1.4(1) - 7.5(38)A29.1 1.4(1) - 1.4(7)A29.2 10.1(7) 1.8(1) 5.3(27)A30.1 8.6(6) - 4.9(25)A30.2 1.4(1) - 0.2(1)A30.3 7.2(5) - 3.9(20)A31 4.3(3) 7.4(4) 6.9(35)A32 2.8(2) - 7.1(36)Aw33.18.6(6) - 2.5(13)Aw33.22.8(2) 16.6(9) 1.2(6)Aw34.11.4(1) - -Aw34.214.5(10)- 0.8(4)Aw36 5.9(4) - -
表中數(shù)據(jù)匯編自B.DuPont，“HLA的免疫學(xué)”，第I卷，HistocompatibilityTesting 1987，Springer-Verlag，New York 1989。
*N＝黑種人；A＝亞洲人；C＝白種人。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為分析中包括的人數(shù)。
用于描述肽化合物的術(shù)語(yǔ)按照慣例，其中氨基在每個(gè)氨基酸殘基的左側(cè)(N-端)而羧基在右側(cè)(C-端)。在闡明本發(fā)明的一些選用的特定例子的配方中，盡管沒(méi)有特別明，其氨基端和羧基端基團(tuán)都假定是處于生理pH值下形式(除非另加說(shuō)明)。在氨基酸結(jié)構(gòu)式中，各殘基通常用標(biāo)準(zhǔn)的三字符或單字符表示。L型的氨基酸殘基用大寫的單個(gè)字母或第一個(gè)字母大寫的三字母符號(hào)表示。那些氨基酸的D型殘基用小寫的單個(gè)字母或小寫的三字符表示。甘氨酸沒(méi)有不對(duì)稱碳原子，則直接用“Gly”或“G”表示。
用于鑒別本發(fā)明的肽的程序，一般按照Falk等人，Nature 351290(1991)公開的方法(本文將其納入作為參考)。該方法的原理是，從適當(dāng)?shù)募?xì)胞或細(xì)胞系中大規(guī)模分離MHC I類分子，一般是通過(guò)免疫沉淀法或親和層析法。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍熟知的用于分離所需的MHC分子的其他一些方法的例子包括，離子交換層析法，外源凝集素層析法，分子大小排除法，高效液相色譜法，以及所有上述技術(shù)的組合形式。
已知大量具有確定的MHC分子(尤其是I類MHC分子)的細(xì)胞，而且容易獲得。例如，已證實(shí)人EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系是制備型分離I類和II類MHC分子的極好來(lái)源?？蓮乃饺嘶蛏虡I(yè)途徑獲得已完全鑒定的細(xì)胞系，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“細(xì)胞系和雜交瘤目錄”，第6版(1988)Rockville，Maryland，U.S.A.)；“國(guó)立綜合醫(yī)學(xué)研究院1990/1991細(xì)胞系(NIGMS)人基因突變細(xì)胞陳列室目錄”，Camden，NJ；和ASHI陳列室，Bingham and Women′s Hospital，75Francis Street，Boston，MA 02115。表5列出了一些可適于用作各種HLA-A等位基因來(lái)源的一些B細(xì)胞系。所有這些細(xì)胞系都能大批量的培養(yǎng)，因此可用于大規(guī)模制備MHC分子。技術(shù)人員應(yīng)理解這些僅僅是示范性的細(xì)胞系，還可以使用許多其它的細(xì)胞來(lái)源。與HLA-B和HLA-C同屬純合子的類似的EBV B細(xì)胞系，也可分別作為HLA-B和HLA-C的等位基因的來(lái)源。
表5人細(xì)胞系(HLA-A源)HLA-A等位基因 B細(xì)胞系A(chǔ)1 MATCOX(9022)STEINLIN(9087)A2.1JYA3.2HEM(9080)H0301(9055)GM3107A24.1 T3(9107)，TISI(9042)A11 BVR(GM6828A)WT100(GM8602)WT52(GM8603)在一般情況下，是用免疫沉淀法分離所需的等位基因。依據(jù)所使用的抗體的特異性可以采用幾種技術(shù)方案。例如，可以使用各種等位基因特異性單克隆抗體(mAb)試劑，對(duì)于HLA-A，HLA-B1和HLA-C分子進(jìn)行親和純化處理。已有數(shù)種mAb試劑可用于分離HLA-A分子(表6)。因此，對(duì)各種目標(biāo)HLA-A等位基因，都各有可用于直接分離HLA-A分子的試劑。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用這類mAb制備的各種親和柱可以成功地分別用于純化各種HLA-A等位基因產(chǎn)物。
除了各種等位基因特異性mAb，可以在下面實(shí)施例一節(jié)中所述的另外一些親和純化方案中使用活性更廣的抗-HLA-A、B、C mAb，例如W6/32和B9.12.1，和一種抗-HLA-B、C mAb，即B1.23.2。
表6抗體試劑抗-HLA名稱HLA-A112/18HLA-A3GAPA3(ATCC，HB122)
HLA-11，24.1A11.1M (ATCC，HB164)HLA-A，B，C W6/32 (ATCC，HB95)單形B9.12.1 (INSERM-CNRS)HLA-B，CB.1.23.2(INSERM-CNRS)單形一般是使用酸處理法來(lái)洗脫結(jié)合于分離的MHC分子的肽結(jié)合槽上的肽。還可用各種標(biāo)準(zhǔn)的變性方法使肽與I類分子解離，例如通過(guò)熱、pH、去污劑、鹽類、離液序列高的試劑或其組合。
再用反相高效液相色譜法(HPLC)可將肽組分與MHC分子分開，并測(cè)序?？梢杂眉夹g(shù)人員熟知的幾種其他標(biāo)準(zhǔn)方法分離肽，其中包括過(guò)濾法，超濾法，電泳法，分子大小排阻色譜法，用特異性抗體沉淀法，離子交換層析法，等電聚焦法等。
可以用一些標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離的肽的測(cè)序工作，例如用Edman降解法(Hunkapiller，M.W等人，Methods Enzymol 91，399(1983))。其他適用于測(cè)序的一些方法包括，上述的個(gè)別肽的質(zhì)譜分析法測(cè)序(Hunt等人，Science 2251261(1992)，本文將其納入作為參考)。來(lái)自不同的I類分子的大量異源性肽(如混合的HPLC餾分)的氨基酸測(cè)序表明，各種I類等位基因都各有特征性的序列基序。
明確了不同的I類等位基因的特異性基序，就能夠鑒別已知氨基酸序列的抗原蛋白質(zhì)的潛在的一些肽表位。潛在的肽表位的鑒別，一般先是使用計(jì)算機(jī)掃描所需的抗原的氨基酸序列，以確定是否存在基序。然后再合成各表位序列。并用各種不同方法測(cè)量其結(jié)合MHC I類分子的能力。一種方法是在上述的相關(guān)申請(qǐng)中描述的I類分子結(jié)合試驗(yàn)法。在文獻(xiàn)中描述的其他方法包括抑制抗原的表現(xiàn)(Sette等人，J.Immunol.1413893(1991))，在活體外裝配試驗(yàn)法(Townsend等人，Cell 62285(1990))，和使用突變細(xì)胞如RMA.S的基于FACS的試驗(yàn)(Melief等人，Eur.J.Imminol. 212963(1991))。
接著，對(duì)在I類MHC結(jié)合試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的肽測(cè)試其在活體外誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答的能力。例如，對(duì)已和某肽一起培養(yǎng)的表現(xiàn)抗原的細(xì)胞可測(cè)試其誘導(dǎo)各應(yīng)答細(xì)胞群中的CTL應(yīng)答的能力。表現(xiàn)抗原的細(xì)胞可以是正常細(xì)胞(如外周血單核細(xì)胞)或樹突細(xì)胞(Inaba等人，J.Exp.Med.166182(1987)；Boog，Eur.J.Immunol 18219(1988))。
另外，可以按常規(guī)使用突變的各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(負(fù)載帶有內(nèi)加工的肽的I類分子的能力方面有缺陷)，比如小鼠細(xì)胞系RMA-S(Karre等人，Nature319675(1986)；Ljunggren等人，Eur.J.Immunol.212963-2970(1991))，和人體T細(xì)胞雜交細(xì)胞，T-2(Cerundolo等人，Nature 345449-452(1990))以及已用適當(dāng)?shù)娜薎類基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞等都很適用，當(dāng)向它們加入肽時(shí)，測(cè)試該肽在活體外誘導(dǎo)初級(jí)CTL應(yīng)答的能力。其他可使用的真核生物細(xì)胞系包括各種昆蟲細(xì)胞系如蚊子幼蟲(ATCC細(xì)胞系CCL125，126，1660，1591，6585，6586)，桑蠶(ATCCCRL 8851)，黏蟲(ATCC CRL 1711)，蛾(ATCC CCL 80)，和果蠅屬細(xì)胞系如Schneider細(xì)胞系(參見(jiàn)Schneider J.Embryol.Exp.Morphol.27353-365(1927))。
在對(duì)正常供血者或病人進(jìn)行簡(jiǎn)易的靜脈穿刺或白細(xì)胞提取法之后，就很容易分離外周血淋巴細(xì)胞，用作CTL前體的應(yīng)答細(xì)胞源。在一個(gè)例子中，將適當(dāng)?shù)谋憩F(xiàn)抗原的細(xì)胞與10-100μM的肽在無(wú)血清培養(yǎng)基中以適宜的培養(yǎng)條件一起孵育4小時(shí)。然后將負(fù)載肽的表現(xiàn)抗原的細(xì)胞于最優(yōu)化培養(yǎng)條件下與應(yīng)答細(xì)胞群進(jìn)行活體外孵育7-10天?？捎蓽y(cè)試培養(yǎng)物中是否存在能殺死放射標(biāo)記靶細(xì)胞的CTL而確定陽(yáng)性CTL激活情況，包括特異性的肽脈沖調(diào)節(jié)的(peptide-pulsed)靶以及表達(dá)相關(guān)病毒或腫瘤抗原(肽序列來(lái)自這些抗原)的內(nèi)源加工形式的靶細(xì)胞。
對(duì)可表達(dá)適當(dāng)或不適當(dāng)?shù)娜薎類MHC分子的不同肽的靶細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，就可確定CTL的特異性和MHC限制性。在MHC結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)試呈陽(yáng)性并導(dǎo)致產(chǎn)生特異性CTL應(yīng)答的肽，在此處被稱為免疫原性肽。
免疫原性肽可以用合成法或重組DNA技術(shù)制備，或從天然來(lái)源如完整的病毒或腫瘤中獲得。盡管這種肽最好基本上不含其他天然存在的宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)或其片段，但在某些實(shí)施例中，這種肽可以通過(guò)合成方法而與各種原性的片段或粒子相結(jié)合。
多肽或肽可以是各種長(zhǎng)度的，以中性(不帶電荷)形式或以鹽類形式存在，可以不烴修飾(如糖基化，側(cè)鏈氧化或磷酸化)，或者含有這些修飾物而如此處所述的經(jīng)受修飾而并不會(huì)破壞多肽生活性。
最好是，該肽應(yīng)盡可能小同時(shí)又盡可能基本上維持大肽的所有生物活性。若可能，最好是將本發(fā)明的肽優(yōu)化為長(zhǎng)度約9或10個(gè)氨基酸殘基，其大小相當(dāng)于在細(xì)胞表面上結(jié)合于I類MHC分子的內(nèi)源加工的病毒肽或腫瘤細(xì)胞肽的長(zhǎng)度。
具有所需活性的肽可以按需要進(jìn)行修飾以提供某些需要的特性，如改進(jìn)藥理學(xué)特性，并同時(shí)提高或至少基本保守未修飾的肽結(jié)合于所需的MHC分子并激活適當(dāng)T細(xì)胞的全部生物活性。例如，肽可以經(jīng)過(guò)各種改變，比如，保守性或非保守性替代，而這些改變?cè)谟猛旧峡赡軙?huì)提供某些好處，比如，改進(jìn)MHC的結(jié)合。保守性替代是指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)在生物學(xué)和/或化學(xué)上相似的氨基酸殘基替代，如，憎水性殘基被另一個(gè)憎水性殘基替代，或一個(gè)極性殘基替代另一個(gè)。替代包括某些組合，如，Gly，Ala；Val，Ile，Leu，Met；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。單一氨基酸替代的效果可以使用D-氨基酸類進(jìn)行探測(cè)。這些修飾可以用公知的肽合成方法進(jìn)行，例如，本文引用作為參考的下列文獻(xiàn)中描述的方法Merrifield，Science232341-347(1986)；Barany和Merrifield，“肽”，Gross and Meienhofer編輯(N.Y.，Academic Press)，第1-284頁(yè)(1979)；和Stewart和Yong，“固相肽合成”，(Rockford，Ill.，Pierce)，第2版(1984)。
還可以通過(guò)擴(kuò)展或縮減化合物的氨基酸序列來(lái)修飾肽，例如通過(guò)增加或刪減一些氨基酸。本發(fā)明的肽或類似物還可以通過(guò)改變某些殘基的順序或組合而加以修飾，很容易理解，某些在生物活性方面必要的氨基酸殘基，比如位于關(guān)鍵接觸點(diǎn)的殘基或保守性殘基，若是在生物活性方面沒(méi)有不良影響通常是不會(huì)改變的。非關(guān)鍵氨基酸類則不限于那些天然存在于蛋白質(zhì)的種類如L-α-氨基酸或其D-異構(gòu)體，而可包括非天然氨基酸類，如β-γ-δ-氨基酸，以及L-α-氨基酸類的許多衍生物。
典型地，具有單一氨基酸替代的肽系列一般可用來(lái)確定靜電電荷、憎水性等對(duì)結(jié)合的影響。例如，沿肽長(zhǎng)度方向形成的一系列帶正電荷(如，Lys或Arg)或負(fù)電荷(如Glu)的氨基酸替代物，對(duì)各種MHC分子和T細(xì)胞受體可顯示不同的敏感度模式。此外，可以使用能利用小而相對(duì)中性的分子部分如，Ala，Gly，Pro或類似的殘基的多重替代物，替代物可以是同種寡聚物或異種寡聚物。用于替代或添加的殘基的數(shù)目和類型，取決于關(guān)鍵接觸點(diǎn)之間所需的間隔以及某些預(yù)期的功能特性(如憎水性/親水性)。與親本肽的親和力相比，通過(guò)這樣的替代還可提對(duì)MHC分子或T細(xì)胞受體的結(jié)合親和力。無(wú)論如何，這類替代應(yīng)采用那些選定的氨基酸殘基或其他分子片段，以避免例如，可能會(huì)破壞結(jié)合的空間的或電荷方面的干擾。
氨基酸替代一般都為單個(gè)殘基的替代。可以綜合替代、缺失、插入或其任何組合以達(dá)到最終的肽。各種替代性變體是去除肽的至少一個(gè)殘基并且在該位置上插入一個(gè)不同的殘基。當(dāng)需要精細(xì)地調(diào)節(jié)肽的特性時(shí)，通?？梢愿鶕?jù)下列表2進(jìn)行這種替代。
表2原來(lái)的殘基 替代示例AlaSerArgLys，HisAsnGlnAspGluCysSerGluAspGlyProHisLys；ArgIleLeu；ValLeuIle；ValLysArg；HisMetLeu；IlePheTyr；TrpSerThrThrSerTrpTyr，PheTyrTrp；PheValIle；LeuProGly功能上的重大改變(如對(duì)MHC分子或T細(xì)胞受體的親和力)是通過(guò)選擇那些比表2中列出的較少保守性替代而形成的，即通過(guò)選擇在對(duì)維持下列性狀的作用方面有更明顯差別的殘基(a)在替代區(qū)域的肽主鏈的結(jié)構(gòu)，如，片狀或螺旋構(gòu)象，(b)在靶位點(diǎn)上的分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。通常，預(yù)期肽的性狀會(huì)產(chǎn)生最大改變的替代是(a)親水性殘基，如絲氨?；膳c憎水性殘基如，亮氨?；?、異亮氨?；?、苯丙氨?；⒗i氨?；虮滨；嗷ヌ娲?；(b)具有正電荷的側(cè)鏈的殘基如賴氨?；⒕滨；蚪M氨酰基可與具有負(fù)電荷的殘基如谷氨?；?，天門冬氨?；嗷ヌ娲?；或(c)側(cè)鏈體積大的殘基如，苯丙氨酰酸基可與沒(méi)有側(cè)鏈的殘基如，甘氨酸相互替代。
肽可以包括免疫原性肽中兩個(gè)或多個(gè)殘基的等配物。如在此所確定的等配物是二個(gè)或多個(gè)殘基的某個(gè)序列，它可用于替代第二個(gè)序列，因?yàn)榈谝粋€(gè)序列的立體構(gòu)象與第二個(gè)序列特異的結(jié)合點(diǎn)相適配。該術(shù)語(yǔ)特別包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的肽主鏈方面的修飾。這類修飾包括酰胺氮原子、α-碳原子、酰胺羰基的修飾、酰胺鍵的完全替換、缺失、延伸或主鏈交聯(lián)。一般可參見(jiàn)，Spatola，“氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)”，第VII卷(Weinstein編輯，1983)。
含各種氨基酸模擬物或非天然氨基酸的肽的修飾在提高肽在活體內(nèi)的穩(wěn)定性方面特別有效。穩(wěn)定性可用多種方法測(cè)定。例如，已使用肽酶類和各種生物介質(zhì)如人血漿和血清測(cè)試穩(wěn)定性。參見(jiàn)，例如，Verhoef等人，Eur.J.Drug MetabPharmacokin.11291-302(1986)。本發(fā)明的肽的半衰期可用25％人血清(V/V)試驗(yàn)方便地加以測(cè)定。該方案通常如下所述。在使用前經(jīng)離心使混合的人血清(AB型，非熱滅活的)脫脂。接著用RPMI組織培養(yǎng)基將血清稀釋至25％，再用其測(cè)試肽的穩(wěn)定性。按預(yù)定的時(shí)間間隔取出少量反應(yīng)溶液，加入6％三氯乙酸水溶液或乙醇。將混濁的反應(yīng)樣品在4℃冷卻15分鐘，再離心使已沉淀的血清蛋白質(zhì)集聚成塊。再使用穩(wěn)定性-特異性的色譜法條件，通過(guò)反相HPLC確定肽的存在與否。
本發(fā)明的具有CTL激活的活性的肽或其類似物可以經(jīng)修飾而不僅能改進(jìn)血清的半衰期，還可提供其他各種所需的特性。例如，通過(guò)連接于含有至少一個(gè)能誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞應(yīng)答的表位的序列，可以提高肽誘導(dǎo)CTL活性的能力。特別優(yōu)選的免疫原性肽/T輔助細(xì)胞結(jié)合物是通過(guò)間隔物分子而相連。間隔物一般包括較小的中性分子，如各種氨基酸或氨基酸模擬物，它們?cè)谏項(xiàng)l件下基本上不帶電荷。這類間隔分子一般選自如Ala，Gly或其他非極性氨基酸類中性氨基酸類的中性間隔分子。應(yīng)理解，任意存在的間隔分子不必含有相同的殘基，因而可以是異種寡聚物或同種寡聚物。當(dāng)該間隔分子存在時(shí)，通常至少為1個(gè)或2個(gè)殘基，更常見(jiàn)為3-6個(gè)殘基。或者，CTL肽也可以不用間隔分子而連于T輔助肽。
免疫原性肽可以直接或通過(guò)在CTL肽的氨基端或羧基端的間隔分子連于T輔助肽。免疫原性肽或T輔助肽的氨基端可以形成酰基化。示例性T輔助肽包括，破傷風(fēng)類毒素830-843，流感307-319，瘧疾環(huán)子孢子狀體382-398和378-389。
在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明的藥物組合物中最好含有至少一種引發(fā)(prime)CTL的成分。據(jù)鑒別，脂質(zhì)類能作為在活體內(nèi)引發(fā)抗病毒抗原的CTL的物質(zhì)。例如，各種棕櫚酸殘基可以隨著于Lys殘基的α和ε氨基，然后再通過(guò)例如一個(gè)或多個(gè)連接殘基如，Gly，Gly-Gly-，Ser，Ser-Ser等連于免疫原性肽。于是這種脂化的肽就可以直接摻入脂質(zhì)體或在佐劑(如不完全的Freund佐劑)中乳化以膠粒形式注射。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，特別有效的免疫原含有連于Lys的α和ε氨基基團(tuán)的棕櫚酸，它再通過(guò)如Ser-Ser的方式附著于免疫原性肽的氨基末端。
作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應(yīng)答的另一例子，可用大腸桿菌的各種脂蛋白(如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨?；z氨?；?絲氨酸(P3CSS))以共價(jià)鍵附著于適當(dāng)?shù)碾亩l(fā)病毒特異性CTL。參見(jiàn)Deres等人，Nature，342561-564(1989)，本文將其納入作為參考。本發(fā)明的肽能偶連于P3CSS，例如，該脂質(zhì)肽可以施用于人體以特異性地引發(fā)對(duì)靶抗原的CTL應(yīng)答。此外，因?yàn)檫€可以用偶連于具有一個(gè)適當(dāng)表位的肽的P3CSS引發(fā)誘導(dǎo)中和抗體，所以兩種組合物可以混合使用從而可對(duì)感染更有效地引發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
此外，在肽的各末端添加額外的氨基酸，就可易于肽互相連接，與支承載體或更大的肽偶連，或修飾肽或寡肽的物理或化學(xué)特性等?？蓪⒅T如，酪氨酸，半胱氨酸，賴氨酸，谷氨酸或天門冬氨酸之類的氨基酸引入肽或寡肽的C-或N-端。某些情況下在C末端的修飾會(huì)改變肽的結(jié)合特性。此外，通過(guò)例如烷?；?C1-C20)或巰乙?；阴；饔檬鼓┒?NH2-?；?，或用氨或甲基胺等使末端-羧基酰胺化等而加以修飾，就可使肽或寡肽的序列可與天然序列不同。在某些情況下，這些修飾可為支承物或其他分子提供結(jié)合的一些位點(diǎn)。
本發(fā)明的肽可以用廣泛不同的方法進(jìn)行制備。由于這些肽相對(duì)較小的尺寸，可以用幾種常規(guī)技術(shù)在溶液或固相載體上合成。已有各種市售的、可以根據(jù)已知的技術(shù)方案使用的自動(dòng)合成儀。參見(jiàn)，例如Steward和Young，“固相肽合成”，第2版，Pierce Chemieal Co.(1984)，同上。
或者，也可以使用重組DNA技術(shù)，其中方法是將可編碼相關(guān)的免疫原性肽的核苷酸序列插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在適宜表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些技術(shù)都是本領(lǐng)域通曉的，一般如在Sambrook等人，“分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1982)中所述，本文將其納入作為參考。因此，包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的肽序列的各種融合蛋白質(zhì)能用于提供適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞表位。
因?yàn)橛糜诖颂帉?duì)預(yù)期長(zhǎng)度的肽的編碼序列可以用各種化學(xué)方法，如，Matteucci等人的磷酸三酯法(J.Am Chem.Soc.1033185(1981))進(jìn)行合成，因此，通過(guò)對(duì)可編碼原生肽序列的核苷酸中的適當(dāng)堿基的替代就可以方便地進(jìn)行修飾。再給該編碼序列配上合適的接頭并連入本領(lǐng)域常用的表達(dá)載體，然后使用該載體轉(zhuǎn)化合適的宿主以產(chǎn)生所需的融合蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在已可供應(yīng)一批這樣的載體和合適的宿主系統(tǒng)。為了表達(dá)各種融合蛋白質(zhì)，可以給編碼順序配備一些可操作連接的起始密碼子和終止密碼子，起動(dòng)子和終止子區(qū)域，而且通常一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，就可提供一個(gè)在所需的細(xì)胞宿主中表達(dá)的表達(dá)載體。例如，在含有可供插入所需編碼序列的合適的限制性酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒中，可以提供與細(xì)菌宿主相容的起動(dòng)子序列。將得到的表達(dá)載體可轉(zhuǎn)化至合適的細(xì)菌宿主中。當(dāng)然，若采用合適的載體和調(diào)控序列，還可以使用酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主。
本發(fā)明的肽及其藥物及疫苗組合物適用于哺乳動(dòng)物，特別是供人使用，以治療和/或預(yù)防病毒性感染和癌癥?？梢杂帽景l(fā)明的免疫原性肽治療的疾病的例子包括巨細(xì)胞病毒，諸如，前列腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、AIDS、腎癌、宮頸癌、淋巴瘤，CMV和尖銳濕疣。
對(duì)于各種藥物組合物，本發(fā)明的免疫原性肽能施用于已得癌癥或被相關(guān)的病毒感染的個(gè)體。那些處于感染的潛伏期或急性期的病人，可以單獨(dú)地用免疫原性肽進(jìn)行治療或結(jié)合其他治療手段(如果合適的話)進(jìn)行治療。在治療用途方面，施用于病人的組合物的用量須足以引發(fā)對(duì)病毒或腫瘤抗原的有效的CTL應(yīng)答，并且可治愈或至少部分抑阻癥狀和/或并發(fā)癥。足以實(shí)現(xiàn)該目的的用量被定義為“治療有效劑量”。用于該用途的有效量取決于，例如肽組合物，施用方式，被治療的疾病所處的階段和嚴(yán)重性，病人的體重和健康的總體狀況以及處方醫(yī)生的判斷，但是作為初次免疫處理(即，用于治療或預(yù)防性施用)，對(duì)于70kg的病人，其用量通常為約1.0μg至約5000μg肽，隨后加強(qiáng)劑量為約1.0-1000μg肽，在數(shù)周至數(shù)月內(nèi)按照加強(qiáng)治療方案施用，這種加強(qiáng)方案取決于病人的應(yīng)答及病情(通過(guò)測(cè)量病人血中特異性CTL活性而知)。應(yīng)記住，本發(fā)明的肽和各種組合物通?？捎糜趪?yán)重的疾病狀態(tài)也就是危及生命或可能危及生命的狀態(tài)。在這種情況下，鑒于已盡可能減少了外來(lái)物質(zhì)以及肽的相對(duì)無(wú)毒性，因而經(jīng)治療醫(yī)生施用大大過(guò)量的這類肽組合物是可行而且也是合理的。
作為治療用途時(shí)，可以在初現(xiàn)病毒感染癥候或檢知或手術(shù)去除腫瘤時(shí)、或在剛診斷出急性感染后不久便開始施用。隨后使用加強(qiáng)劑量，直到至少癥狀基本消退并且經(jīng)過(guò)一段時(shí)間。在慢性感染中，需要在負(fù)荷劑量后接著施用加強(qiáng)劑量。
用本發(fā)明的各種組合物治療感染的個(gè)體，可以加速急性感染個(gè)體的感染狀態(tài)的消退。對(duì)于那些容易(或素質(zhì)易于)發(fā)展成慢性感染的個(gè)體，該類組合物在防止從急性感染向慢性感染的演變的方法中特別有用。當(dāng)易感個(gè)體在感染之前或感染中被診斷出時(shí)(如本文所述)，便可將組合物以他們?yōu)槟繕?biāo)，以減少對(duì)更大人群范圍施用的需要。
各種肽組合物還可用于治療慢性感染，和刺激免疫系統(tǒng)以消除攜帶者體內(nèi)病毒感染的細(xì)胞。在配方中提供一定量具有免疫增強(qiáng)作用的肽和一種足夠有效地激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的施用方式是至關(guān)重要的。因此，在治療慢性感染方面對(duì)于70kg重的病人的代表性的劑量，每次約1.0-5000μg，較佳為5-1000μg。在施用免疫劑量后，可能需要按規(guī)定間隔(如1-4周)施用加強(qiáng)劑量，有時(shí)可能需要更長(zhǎng)時(shí)間以便有效地使個(gè)體產(chǎn)生免疫。在慢性感染情況下，則須連續(xù)施用，直到至少臨床癥狀或?qū)嶒?yàn)室檢查表明，病毒感染已被清除或基本消退并持續(xù)一段時(shí)間。
用于治療處理的各種藥物組合物，可以非腸道施用、體表施用、口服或局部施用。藥物組合物最好是通過(guò)非腸道施用，如靜脈施用，皮下施用，皮內(nèi)施用或肌內(nèi)施用。因此，本發(fā)明提供了非腸道施用的組合物，其中包括溶于或懸浮于可接受的載體中的免疫原性肽溶液，最好是水質(zhì)載體。可以使用各種水質(zhì)載體如水、緩沖液、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可以用已知的滅菌技術(shù)按常規(guī)進(jìn)行滅菌處理或可滅菌過(guò)濾。得到的水溶液可以按原樣進(jìn)行包裝以供使用，或凍干處理，凍干制劑在施用之前與無(wú)菌溶液進(jìn)行混合。組合物還可以含有類似生理狀態(tài)所需的藥學(xué)上可接受的輔助性物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)及緩沖劑，張力調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。
在各種藥物配方中本發(fā)明的CTL刺激性肽的濃度可以在大范圍中變動(dòng)，即，從小于約0.1％(通常為或至少為約2％)至高達(dá)20％-50％或更高(按重量計(jì))，而且根據(jù)選用的特定施用方式，可以主要通過(guò)流體體積、粘度等進(jìn)行選擇。
本發(fā)明的肽還可以以脂質(zhì)體形式進(jìn)行施用，脂質(zhì)體可將肽送至特定的組織(如，淋巴組織)或選擇性地送至感染細(xì)胞，它還會(huì)提高肽組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳劑、泡沫劑、膠粒、不溶性單分子層、液晶、磷脂層分散劑、片狀層等。在這些制劑中，待輸送的肽作為脂質(zhì)體的一部分摻入，或單獨(dú)或連同結(jié)合于如，淋巴組織細(xì)胞中普遍存在的受體的分子，例如，結(jié)合于CD45抗原的單克隆抗體，或者和其他治療或免疫組合物一起使用。因此，填入的或用所需要的本發(fā)明的肽修飾的脂質(zhì)體可以被導(dǎo)向淋巴組織細(xì)胞所在部位，然后在該部位脂質(zhì)體釋出選定的治療/免疫用原性肽組合物。用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可以用標(biāo)準(zhǔn)的成泡脂質(zhì)類制備，其中通常包括，中性或帶負(fù)電荷的磷脂類和甾醇，如膽固醇。脂質(zhì)類的選擇通?？紤]如，脂質(zhì)體大小，酸不穩(wěn)定性和在血流中脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。已有各種制備脂質(zhì)體的方法，如，Szoka等人，Ann.Bey.BiophysBioeng 9467(1980)，美國(guó)專利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369號(hào)所述(本文將它們?nèi)考{入作為參考)。
為了靶向免疫細(xì)胞，摻入到脂質(zhì)體中的配基可以包括例如，對(duì)于所期望的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的細(xì)胞表面決定簇具有特異的抗體或其片段。含有肽的脂質(zhì)體懸浮液可以靜脈內(nèi)施用，局部施用或體表施用等，其用量可以根據(jù)尤其是施用方式、被輸送的肽、以及被治療的疾病所處的階段而改變。
對(duì)于各種固體組合物，可以使用各種常規(guī)的無(wú)毒性固相載體，包括如，藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服，可以通過(guò)摻入任何通常采用的賦形劑(例如前面列出的那些載體)而形成藥學(xué)上可接受的無(wú)毒性組合物，它通常含有10％-95％活性成分(即一種或多種本發(fā)明的肽)，更佳的濃度為25％-75％。
對(duì)于氣霧劑施用，免疫原性肽最好和表面活性劑及推進(jìn)劑一起，以精細(xì)分散的形式施用。肽的一般百分比為0.01-20％(重量)，更佳為1-10％。當(dāng)然，表面活性劑必須無(wú)毒性、而且最好可溶于推進(jìn)劑中。這類制劑的代表是，含有6-22個(gè)碳原子的脂肪酸(例如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸和油酸)與脂族多羥醇或其環(huán)狀酐形式的酯類或部分酯類?？梢允褂没旌硝ヮ?，例如混合的或天然的甘油酯。表面活性劑可占組合物的0.1-20％(重量)，更佳為0.25-5％。組合物的其余部分通常為推進(jìn)劑。如果需要，還可包括一種載體，和例如用于鼻內(nèi)給藥的卵磷酯。
本發(fā)明另一方面涉及疫苗，它含有致免疫有效量的本文所述的免疫原性肽作為活性成分?？蓪㈦囊肽乘拗?包括人)，其形式可以是連于其自己的載體或者作為活性肽單元的同類多聚物或異類多聚物。這種聚合物具有使免疫反應(yīng)增加的優(yōu)點(diǎn)，而且當(dāng)使用不同的肽構(gòu)成聚合物時(shí)還具有誘導(dǎo)能與病毒或腫瘤細(xì)胞的不同抗原決定簇反應(yīng)的抗體和/或CTL的額外能力。可以使用的各種載體是本領(lǐng)域公知的，包括例如，甲狀腺球蛋白、白蛋白(如人血清白蛋白)，破傷風(fēng)類毒素，聚氨基酸(如聚(賴氨酸谷氨酸))，流感、乙型肝炎病毒髓芯蛋白，乙型肝炎病毒重組疫苗等。各種疫苗還可含有生理上可承受的(可接受的)稀釋劑如水、磷酸鹽緩沖鹽水、或鹽水，一般還可包括佐劑。諸如，不完全Freund佐劑，磷酸鋁，氫氧化鋁，或明礬之類的佐劑是本領(lǐng)域公知的材料。而且，如上所述，通過(guò)將本發(fā)明的肽偶連于脂質(zhì)類(如P3CSS)可以引發(fā)CTL應(yīng)答。一旦通過(guò)注射、氣霧劑、口服、皮內(nèi)或其他途徑施用此處所述的肽組合物進(jìn)行免疫，則宿主的免疫系統(tǒng)會(huì)通過(guò)產(chǎn)生大量針對(duì)所需抗原特異性的CTL而對(duì)疫苗應(yīng)答，該宿主至少可對(duì)以后的感染有部分免疫力或能防止演變?yōu)槁愿腥尽?br> 含有本發(fā)明的肽的各種疫苗組合物，可以施用于易感或處于病毒感染或癌癥威脅的病人，可引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，并因此增強(qiáng)病人自身的免疫應(yīng)答能力。這樣的用量被定義“致免疫有效劑量”。在這樣應(yīng)用中，精確的用量同樣取決于病人的健康狀況和體重，施用方式，配方的性質(zhì)等，但對(duì)于每一70kg的病人的用量范圍，通常為1.0μg至約5000μg，更常用的為每70kg體重約10-500μg。
在某些情況下，最好是將本發(fā)明的各種肽疫苗和能誘導(dǎo)針對(duì)相關(guān)的病毒(尤其是病毒包膜抗原)的中和抗體應(yīng)答的疫苗一起混合使用。
對(duì)于治療或免疫用途，還可將可編碼本發(fā)明一種或多種肽的各種核酸施用于患者?？煞奖愕厥褂枚喾N方法將核酸送遞給患者。例如，可直接以“裸DNA”方式送遞核酸。這種方法可參見(jiàn)例如Wolff等人，Science 2471465-1468(1990)以及美國(guó)專利第5,580,859和5,589,466號(hào)。也可用沖擊送遞法施用核酸，參見(jiàn)如，美國(guó)專利第5,204,253號(hào)所述?？梢越o予只包含DNA的粒子?；蛘?，可將DNA附著于粒子(如黃金粒子)。也可將核酸復(fù)合于陽(yáng)離子化合物(陽(yáng)離子脂質(zhì)類)施用。脂質(zhì)-介導(dǎo)的基因送遞方法可參見(jiàn)，如WO96/18372、WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)Bio Techniques 6(7)682-691；Rose美國(guó)專利第5,279,833號(hào)；WO91/06309；和Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7414。本發(fā)明的肽還可以由減毒的病毒宿主(如牛痘或雞痘病毒)進(jìn)行表達(dá)。這種方法涉及使用牛痘病毒作為載體，來(lái)表達(dá)可編碼本發(fā)明的肽的各種核苷酸序列。一旦引入急性或慢性感染的宿主中或未感染的宿主中，重組的牛痘病毒便可表達(dá)免疫原性肽，從而引起宿主的CTL應(yīng)答。用于免疫方案中的牛痘載體和方法在例如美國(guó)專利第4,722,848號(hào)中有所描述(本文將其納入作為參考)。另一種載體是BCG(卡介苗)。各種BCG載體在Stover等人的著作中(Nature 351456-460(1991))有所描述(本文將其納入作為參考)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員將根據(jù)本文的描述能顯而易見(jiàn)領(lǐng)會(huì)和掌握大量其他的能用于治療性施用或免疫施用本發(fā)明的肽的載體(如，鼠傷寒沙門氏菌載體等)。
施用可編碼本發(fā)明的肽的各種核酸的一些優(yōu)選方法是，使用可編碼本發(fā)明多元表位的小基因構(gòu)建物。為了制備可編碼選定的CTL的一些表位(小基因)的DNA序列用于在人細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，須逆向翻譯這些表位的氨基酸序列。利用人密碼子檢索表可指導(dǎo)對(duì)各氨基酸的密碼子選擇。將這些編碼表位的DNA序列直接連接，可產(chǎn)生一個(gè)連續(xù)的多肽序列。為了最優(yōu)化表達(dá)和/或免疫原性，可將其它元件摻入小基因設(shè)計(jì)中?？赡嫦蚍g且包含在這種小基因序列中的氨基酸序列各種實(shí)例包括輔助T淋巴細(xì)胞表位、前導(dǎo)(信號(hào))序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保守信號(hào)。另外，通過(guò)在與CTL表位相鄰處包含合成的(如聚-丙氨酸)或天然存在的一些側(cè)翼序列，就可改善CTL表位的MHC表現(xiàn)。
通過(guò)裝配可編碼小基因的正股和負(fù)股的各種寡核苷酸，就可將小基因序列轉(zhuǎn)化成DNA。用已知的一些方法在適合的條件下合成、磷酸化、純化并韌化各種重疊寡核苷酸(長(zhǎng)度為30-100個(gè)堿基)。再用T4 DNA連接酶連接各寡核苷酸的各末端。然后就能將此合成的可編碼CTL表位多肽的小基因克隆入合適的病毒載體中。
在載體中包含本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)序列，可以確保靶細(xì)胞中的表達(dá)。所需要的一些載體元件具有供小基因插入的下游克隆位點(diǎn)的啟動(dòng)子；用于有效轉(zhuǎn)錄終止的聚腺苷酸化信號(hào)；大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)；和大腸桿菌選擇性標(biāo)記(如，氨芐青霉素或卡那霉素抗性)。有將多種啟動(dòng)子可用于此目的，如人巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子序列可參見(jiàn)美國(guó)專利第5,580,859和5,589,466號(hào)。
可能需要其它一些載體修飾來(lái)最優(yōu)化小基因的表達(dá)和免疫原性。在一些情況中，有效的基因表達(dá)需要一些內(nèi)含子，和可插入小基因被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中的一個(gè)或多的合成的或天然的內(nèi)含子。mRNA穩(wěn)定性序列的包含，也可視為有利于增加小基因的表達(dá)。據(jù)最近提出一些免疫刺激性序列(各種ISS或CpG)可在DNA疫苗的免疫原性中起作用?？梢栽谛』蚓幋a序列外的載體內(nèi)包含這些序列以期提高免疫原性。
在一些實(shí)施例中，可以使用生物同位素分析(bioistronic)病毒載體，以產(chǎn)生小基因編碼的一些表位和所包含的提高或降低免疫原性的第二種蛋白質(zhì)。如果共-表達(dá)能有益地提高免疫應(yīng)答的各種蛋白質(zhì)或多肽的實(shí)例包括細(xì)胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)、可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分子(如LeIF)或一些輔助刺激分子。可輔助細(xì)胞(HTL)的一些表位可結(jié)合入一些細(xì)胞內(nèi)的靶信號(hào)并與各種CTL表位分開表達(dá)。這可以將HTL表位異向于和CTL表位不同的細(xì)胞區(qū)室。如果需要，這還可有利于HTL表位更有效地進(jìn)入II類MHC途徑，從而改善CTL的誘導(dǎo)作用。與CTL誘導(dǎo)相反，通過(guò)一些免疫抑制分子(如TGF-β)的共表達(dá)而特異性降低免疫應(yīng)答可能對(duì)一些疾病是有益的。
一旦選定了表達(dá)載體，小基因就可克隆入啟動(dòng)子下游的多接頭區(qū)域。該質(zhì)?？赊D(zhuǎn)化入適合的大腸桿菌菌株中，并可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備DNA。使用限制性酶切繪圖和DNA測(cè)序試驗(yàn)就可驗(yàn)證。這種小基因的定向作用和DNA序列以及載體中所包含的所有其它元件。可存儲(chǔ)這種攜帶正確質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞，作為母本細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)。
通過(guò)大腸桿菌的發(fā)酵作用以及隨后的純化處理可制備治療用量的質(zhì)粒DNA。將工作細(xì)胞庫(kù)的若干等份細(xì)胞用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基(如Terrific肉湯)，并用熟知的方法使之搖瓶或生物反應(yīng)器內(nèi)生長(zhǎng)至飽和?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)生物分離方法，如固相陰離子交換樹脂(Quiagen提供)純化質(zhì)粒DNA。如果需要，可以用凝膠電泳法或其它方法將超螺旋DNA與開環(huán)和線形DNA分開。
可以用各種配方來(lái)制備注射用的純化的質(zhì)粒DNA。其中最簡(jiǎn)單的方法是在無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中重建冷凍干燥DNA。已描述了多種方法，還有一些新方法也將可供使用。如上所述，各種核酸可方便地用一些陽(yáng)離子脂質(zhì)類配制。另外，還可將糖脂質(zhì)類、基因融合脂質(zhì)體、肽和綜合性的PINC(保護(hù)性、活性、非-凝縮性)的各種化合物與純化的質(zhì)粒DNA復(fù)合，從而影響各種變量，如，穩(wěn)定性、肌內(nèi)分布、向特定的器官或細(xì)胞類型運(yùn)輸。
可將靶細(xì)胞敏化作用用于對(duì)小基因編碼的各種CTL表位的表達(dá)和I類MHC表現(xiàn)的功能性試驗(yàn)。將質(zhì)粒DNA引入適用于作為標(biāo)準(zhǔn)CTL鉻釋放試驗(yàn)的靶標(biāo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。所用的轉(zhuǎn)染方法取決于最終的制劑?！翱墒褂秒姶┛追恪背鯠NA，而用各種陽(yáng)離子脂質(zhì)類指導(dǎo)活體外轉(zhuǎn)染?？捎帽磉_(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GEP)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，使用熒光活化細(xì)胞分選法(FACS)富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。然后用鉻-51標(biāo)記這些細(xì)胞，并用作各種表位-特異性CTL系的靶細(xì)胞。據(jù)51Cr釋放探測(cè)的細(xì)胞溶解情況表明其中有表現(xiàn)小基因編碼的CTL表位的MHC的產(chǎn)生。
在活體內(nèi)，免疫原性是對(duì)小基因DNA制劑功能性測(cè)試的另一種方法。用DNA制品免疫接種可表達(dá)適當(dāng)?shù)娜薓HC分子的轉(zhuǎn)基因小鼠。施用的劑量和途徑是依制劑而定(如PBS DNA配制的采用肌肉注射(IM)，脂類-復(fù)合配制的DNA采用腹膜內(nèi)注射(IP))。免疫接種后21天，收獲脾細(xì)胞，并在可編碼測(cè)試的各表位的肽的存在下再刺激1周。用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)試這些效應(yīng)細(xì)胞(CTL)的負(fù)載肽的以鉻-51標(biāo)記的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解情況。用相應(yīng)于小基因編碼的表位的負(fù)載MHC的肽敏化的靶細(xì)胞的裂解表明DNA疫苗具有在活體內(nèi)誘導(dǎo)CTL的功能。
抗原肽還可以用來(lái)在離體條件下引發(fā)CTL。得到的CTL能用于治療對(duì)其他常規(guī)的治療方法不產(chǎn)生應(yīng)答或者對(duì)于肽疫苗的治療方法不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)答的。病人的慢性感染(病毒性或細(xì)菌性)或腫瘤，而這些病人通過(guò)在組織培養(yǎng)物中將病人的CTL前體細(xì)胞(CTLp)和某來(lái)源的表現(xiàn)抗原的細(xì)胞(APC)及適當(dāng)?shù)拿庖咴噪囊黄鸱跤龑?duì)特定病原(感染因子或腫瘤抗原)的離體CTL應(yīng)答。誘導(dǎo)孵育適當(dāng)時(shí)間后(一般為1-4周)，在此期間CTLp被激活并成熟并擴(kuò)大成效應(yīng)CTL，再將細(xì)胞輸回病人，在病人體內(nèi)它們會(huì)摧毀其特異性靶細(xì)胞(感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)。為了最優(yōu)化在活體外產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的條件，須將刺激細(xì)胞的培養(yǎng)物維持在適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清培養(yǎng)基中。
在將待活化的細(xì)胞(如前體CD8+細(xì)胞)與刺激細(xì)胞一起培養(yǎng)之前，在刺激細(xì)胞培養(yǎng)物中去加入一定量抗原性肽，所加入的肽的量要足以負(fù)載到能在刺激細(xì)胞的表面上表達(dá)的人I類分子上。在本發(fā)明中，肽的足夠量指能讓約200(較佳地為200或更多)個(gè)人I類MHC分子將在各刺激細(xì)胞表面上表達(dá)負(fù)載到的用量。較佳的是，將＞20μg/ml肽與刺激細(xì)胞一起培養(yǎng)。
然后將靜息的或前體CD8+細(xì)胞與合適的刺激細(xì)胞一起在培養(yǎng)物中培養(yǎng)一段足以活化CD8+細(xì)胞的時(shí)間。較佳的是，以抗原特異性方式活化CD8+細(xì)胞。對(duì)于各個(gè)體之間，靜息的或前體CD8+細(xì)胞與刺激細(xì)胞的比例各不相同，取決于各種因素，如個(gè)體的淋巴細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件的順應(yīng)性和疾病善的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，或在所述范圍內(nèi)來(lái)用的治療模式的其它條件。但淋巴細(xì)胞刺激細(xì)胞的比例的范圍宜為約30∶1到300∶1?？梢詫⑿?yīng)細(xì)胞/刺激細(xì)胞培養(yǎng)物盡量維持刺激在治療上產(chǎn)生有效量CD8+細(xì)胞所需的時(shí)間。
在該活體外對(duì)CTL的誘發(fā)需要結(jié)合于APC上的等位基因特異性I類MHC分子的肽的特異性識(shí)別。每個(gè)APC的特異性MHC/肽復(fù)合物的數(shù)量對(duì)刺激CTL(尤其是在初期免疫應(yīng)答中)是關(guān)鍵性的。當(dāng)每個(gè)細(xì)胞僅有少量肽/MHC復(fù)合物時(shí)就細(xì)胞足以使CTL易被(TL)裂解或可刺激二級(jí)CTL應(yīng)答，在初級(jí)應(yīng)答過(guò)程中，CTL前體(pCTL)的成功活化需要有明顯多量的MHC/肽復(fù)合物。細(xì)胞上的空載的主要組織相容性復(fù)合分子在負(fù)載肽后就能誘導(dǎo)初級(jí)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
由于各種突變細(xì)胞系不存在每種人類MHC等位基因，最好是用一種技術(shù)從APC表面除去內(nèi)源性MHC-相關(guān)性肽，隨后用相關(guān)的免疫原性肽負(fù)載到得到的空載的MHC分子上。最好是用患者的未-轉(zhuǎn)化的(非-致腫瘤性)、未-感染的細(xì)胞和較佳的是其自身細(xì)胞作為APC，CTL治療CTL誘導(dǎo)方案來(lái)設(shè)計(jì)開發(fā)對(duì)針對(duì)以指導(dǎo)離體的。本申請(qǐng)公開了從APC表面剔除內(nèi)源性MHC-相關(guān)性肽，隨后再負(fù)載所需的肽的各種方法。
穩(wěn)定的I類MHC分子是由如下一些元件形成的一種三聚復(fù)合物1)通常長(zhǎng)度為8-10個(gè)殘基的肽，2)透膜多形性蛋白質(zhì)重鏈，在它的α1和α2區(qū)域具有肽結(jié)合位點(diǎn)和3)非共價(jià)結(jié)合的非-多形性輕鏈，β2微球蛋白。從復(fù)合物除去結(jié)合的肽和/或?qū)ⅵ?微球蛋白從復(fù)合物上分開，使I類MHC分子失去功能且不穩(wěn)定，從而迅速降解。從各種PBMC分離的所有I類MHC分子都具有結(jié)合于其上的內(nèi)源性肽。因此，第一步驟是除去與APC上I類MHC分子結(jié)合的所有內(nèi)源性肽，并且讓它們不降解以便添加外源肽。
兩種除去結(jié)合肽的I類MHC分子的可能方法包括將培養(yǎng)溫度從37℃降低至26℃過(guò)夜，使β2微球蛋白不穩(wěn)定，然后用溫和的酸處理除去細(xì)胞上的內(nèi)源性肽。這種方法將原先結(jié)合的肽釋放到細(xì)胞外，從而讓新的外源性肽結(jié)合到空載的I類分子中。低溫培養(yǎng)方法能讓外源肽有效地結(jié)合于MHC復(fù)合物，但需要在26℃培養(yǎng)過(guò)夜，而這會(huì)降低細(xì)胞的代謝速度。用這種低溫方法，細(xì)胞可能不能主動(dòng)合成MHC分子(如靜息的PBMC)，也不產(chǎn)生大量表面空載的MHC分子。
可采用該酸洗脫包括用三氟乙酸(pH2)提取肽或酸變性免疫親合純化的I類-肽復(fù)合物。但這些方法對(duì)CTL誘導(dǎo)不適用，因?yàn)橹匾氖且Ａ鬉PC活力和最優(yōu)化代謝狀況(對(duì)抗原表現(xiàn)是關(guān)鍵的)，而只要除去內(nèi)源性肽。已使用pH3的弱酸溶液(如，甘氨酸或檸檬酸-磷酸緩沖液)來(lái)鑒定內(nèi)源性肽和腫瘤相關(guān)性T細(xì)胞表位。這種處理是特別有效的，因?yàn)橹挥蠭類MHC分子失穩(wěn)(并釋放相關(guān)性肽)，而其它表面抗原(包括II類MHC分子)則保持完整。最重要的是，用弱酸溶液處理細(xì)胞不會(huì)影響細(xì)胞的活力和代謝狀況。弱酸處理是迅速的，因?yàn)閮?nèi)源性肽的洗脫在4℃進(jìn)行只要2分鐘，并且在合適的肽負(fù)載后APC易于行使功能。這里用這種方法制備肽特異性的各種APC用于產(chǎn)生初級(jí)抗原特異性CTL。得到的APC能有效地誘導(dǎo)肽特異性CD8+CTL。
用各種已知方法中的一種可有效地將活化的CD8+細(xì)胞與刺激細(xì)胞分開。例如，可用對(duì)刺激細(xì)胞、負(fù)載到刺激細(xì)胞的肽或CD8+細(xì)胞(或其片段)有特異性的單克隆抗體來(lái)結(jié)合它們適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償性配體。隨后可以用合適的手段(如通過(guò)熟知的免疫沉淀性或免疫測(cè)定方法)從刺激細(xì)胞-效應(yīng)細(xì)胞混合物中提取各種抗體標(biāo)記的分子。
活化的CD8+細(xì)胞的有效的細(xì)胞毒性用量在活體外和活體內(nèi)的使用可以不同，且也取決于這些淋巴細(xì)胞最終的靶細(xì)胞的數(shù)量和類型。其用量同樣還取決于患者的體況，并應(yīng)由醫(yī)生考慮所有適合的因素后予以確定。但較佳的是，用于成年人的活化CD8+細(xì)胞用量為約1×106-1×1012，更佳的為1×108-1×1011，尤佳的是1×109-1×1010與之相比，小鼠用量為約5×106-5×107個(gè)細(xì)胞。，較佳地，如上所述，從細(xì)胞培養(yǎng)物收獲活化的CD8+細(xì)胞并將該CD8+細(xì)胞施用于待處理的個(gè)體。但特別要指出的是與其它已有的和擬采用的處理用藥程式不同，本發(fā)明的方法使用的是非致腫瘤的細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)。因此，即使沒(méi)有實(shí)現(xiàn)刺激細(xì)胞和活化CD8+細(xì)胞的完全分離，也不會(huì)出現(xiàn)已知與施用少量刺激細(xì)胞相關(guān)的固有危險(xiǎn)，而施用哺乳動(dòng)物類的腫瘤促進(jìn)細(xì)胞則是非常危險(xiǎn)的。
再引入細(xì)胞成分的各種方法是本領(lǐng)域已知的，包括如，在授予Honsik等人的美國(guó)專利第4,844,893號(hào)和授予Rosenberg的美國(guó)專利第4,690,915號(hào)中示例的一些方法。例如，通過(guò)靜脈灌注施用活化的CD8+細(xì)胞是適用的。
還可將本發(fā)明的免疫原性肽用于制備單克隆抗體。這些抗體可用作潛在的診斷劑或治療劑。
本發(fā)明的肽還可以用于診斷試劑。例如，本發(fā)明的一種肽可以用于確定特定個(gè)體對(duì)采用肽或相關(guān)肽的治療方案的敏感性，因而能夠有助于修改現(xiàn)有的治療方案或有助于對(duì)受染的個(gè)體確定其預(yù)后情況。此外，該肽還可以用于預(yù)測(cè)哪些個(gè)體會(huì)受到演變成慢性感染的真正危險(xiǎn)。
為了鑒定本發(fā)明的肽，如在相關(guān)的申請(qǐng)中所述進(jìn)行I類抗體的分離、以及天然形成的肽的分離和測(cè)序。然后用這些肽來(lái)確定以下各等位基因A3.2、A1、A11和A24.1的特異性結(jié)合基序。在以上說(shuō)明書的第3頁(yè)對(duì)這些基序進(jìn)行了描述。下列表8-11所述的一些基序，是從相關(guān)的申請(qǐng)中所述的天然加工的肽的合并的測(cè)序數(shù)據(jù)中確定的。
表8匯綜HLA-A3，2等位基因-特異性基序位置保守的殘基1-2V，L，M3Y，D4-5-6-7I8Q，N9K10 K表9匯綜HLA-A1等位基因-特異性基序位置保守的殘基1-2S，T3D，E4P5-
6-7L8-9Y10 K表10匯綜HLA-A11等位基因-特異性基序位置保守的殘基1-2T，V3M，F(xiàn)4-5-6-7-8Q9K10 K表11匯綜HLA-A24.1等位基因-特異性基序位置保守的殘基1-2Y3I，M4D，E，G，K，P
5L，M，N67N，V8A，E，K，Q，S9F，L10 F，A實(shí)施例2免疫原性肽的鑒定用上述對(duì)從各種病原體和腫瘤相關(guān)性蛋白質(zhì)的各種I類MHC等位基因氨基酸序列鑒定的基序來(lái)分析是否存在這些基序。按相關(guān)的申請(qǐng)所述進(jìn)行篩選。表12提供了對(duì)這些抗原的檢索結(jié)果。
表12肽 AA 序列 來(lái)源 A*0301 A*110128.071910 ILEQWVAGRK HDV.nuc.16 0.01700.001228.072710 LSAGGKNLSK HDV.nuc.115 0.00970.01501259.0211 STDTVDTVLEK Flu.HA.290.00010.06701259.049 GIAPLQLGK Flu.HA.630.61000.20001259.0610 VTAACSHAGK Flu.HA.149 0.03800.04901259.089 GIHHPSNSK Flu.HA.195 0.13000.01401259.1010 RMNYYWTLLK Flu.HA.243 2.50002.30001259.1211 ITNKVNSVIEK Flu.HA.392 0.02000.06701259.1311 KMNIQFTAVGK Flu.HA.402 0.02800.00921259.149 NIQFTAVGK Flu.HA.404 0.00170.03301259.1611 AVGKEFNKLEK Flu.HA.409 0.02100.04601259.1911 KVKSQLKNNAK Flu.HA.465 0.04700.00311259.2011 SVRNGTYDYPK Flu.HA.495 0.04100.14001259.219 SIIPSGPLK Flu.VMT1.13 0.78008.80001259.2510 RMVLASTTAK Flu.VMT1.178 0.55000.03501259.269 MVLASTTAK Flu.VMT1.179 1.70001.40001259.2810 RMGVQMQRFK Flu.VMT1.243 0.10000.00591259.3310 ATEIRASVGK Flu.VNUC.22 0.14000.30001259.3711 TMVMELVRMIK Flu.VNUC.188 0.08900.03101259.4310 RVLSFIKGTK Flu.VNUC.342 0.80000.0830F119.019 MSLQRQFLR ORF3P0.20000.7200F119.029 LLGPGRPYR TRP.197 0.01900.0091F119.039 LLGPGRPYK TRP.197K92.20000.680034.00198 RVYPELPKCEA.139 0.01300.044034.00208 TVSAELPKCEA.495 0.00370.032034.00218 TVYAEPPKCEA.317 0.01600.022034.00298 TINYTLWRMAGE2.74 0.01400.055034.00308 LVHFLLLKMAGE2.1160.02900.150034.00318 SVFAHPRKMAGE2.2370.14100.081034.00438 KVLHHMVKMAGE3.2850.05800.019034.00508 RVCACPGRp53.273 0.35000.0490
表12肽 AA 序列來(lái)源 A*0301A*110134.00518 KMFCQLAKp53.132 0.3800 0.360034.00628 RAHSSHLKp53.363 0.5500 0.007134.01489 FVSNLATGR CEA.656 0.0019 0.049034.01529 RLQLSNGNK CEA.546 0.0250 0.011034.01539 RNGIPQQKCEA.628 0.0400 0.078034.01549 KIRKYTMRK HER2/neu.6810.0620 0.005534.01559 LVHFLLLKK MAGE2.116 0.5220 1.400034.01569 SMLEVFEGK MAGE2.226 0.0950 1.600034.01579 SSFSTTINK MAGE2.690.1600 2.000034.01589 TSYVKVLHK MAGE2.281 0.5300 0.150034.01599 VIFSKASEK MAGE2.149 0.4900 0.053034.01609 GSVVGNWQK MAGE3.130 0.0040 0.206034.01619 SSLPTTMNK MAGE3.690.6180 0.710034.01629 SVLEVFEGK MAGE3.226 0.1330 0.900034.01719 SSBMGGMNK p53.240 0.5440 1.100034.01729 SSCMGGMNK p53.240 0.0090 0.049034.021110RTLTLFNVTK CEA.554 0.2200 1.300034.021210TISPLNTSYK CEA.241 0.1800 0.033034.021410STTINYTLWK MAGE2.720.0870 0.650034.021510ASSLPTTMNK MAGE3.680.0420 0.027034.022510KTYQGSYGFK p53.101 0.4900 0.420034.022610VVRRBPHHEK p53.172 0.1800 0.210034.022810GLAPPQHLIK p53.187 0.0570 0.016034.022910NSSCMGGMNK p53.239 0.0071 0.029034.023010SSBMGGMNRK p53.240 0.0420 0.160034.023210RVCACPGRDK p53.273 0.0190 0.025034.029511KTITVSAELPK CEA.492 0.3600 0.160034.029611TTITVYAEPPK CEA.314 0.0200 0.028034.029811PTISPSYTYYR CEA.418(0.0002)0.130034.030111GLLGDNQVMPK MAGE2.188 0.0780 0.004734.030611MVELVHFLLLK MAGE2.113 0.0200 0.012034.030811FSTTINYTLWR MAGE2.710.0110 0.0170
表12肽 AA序列 來(lái)源 A*0301 A*110134.031111 GLLGDNQIMPKMAGE3.188 0.13000.057034.031711 RLGFLHSGTAKp53.110 0.04300.000134.031811 ALNKMFCQLAKp53.129 0.44000.042034.032311 RVCACPGRDRRp53.273 0.02900.029034.032411 LSQETFSDLWKp53.14 (0.0009) 0.047034.032811 RAHSSHLKSKKp53.363 0.02700.003834.032911 VTCTYSPALNKp53.122 0.07000.120034.033011 GTRVRAMAIYKp53.154 1.10000.330034.033211 STSRHKKLMFKp53.376 0.31000.130040.01079 LAARNVLVK Her2/neu.8460.05800.028540.01099 MALESILRR Her2/neu.8890.00340.023740.014510 ISWLGLRSLR Her2/neu.4500.04100.002740.014710 GSGAFGTVYK Her2/neu.7270.06600.130040.015310 ASPLDSTFYR Her2/neu.9970.00030.0670實(shí)施例3免疫原性肽的鑒定用在所述相關(guān)的申請(qǐng)中鑒定為B7樣的一些超螺旋基序，分析各種病原體和腫瘤相關(guān)性蛋白質(zhì)的序列是否存在這些基序。用相關(guān)申請(qǐng)所述進(jìn)行篩選。表13提供了對(duì)這些抗原的檢索結(jié)果。
表13肽 序列 來(lái)源40.0013 SPGLSAGI CEA.680I840.0022 KPYDGIPA Her2/neu.92140.0023 KPYDGIPI Her2/neu.921I840.0050 APRMPEAA p53.6340.0051 APRMPEAI p53.63I840.0055 APAAPTPI p53.76I8
表13(續(xù))肽序列來(lái)源40.0057APTPAAPI p53.79I840.0059TPPAAPAPIp53.81I840.0061APAPAPSI p53.84I840.0062SPALNKMF p53.12740.0063SPALNKMI p53.127I840.0117SPSAPPHRICEA.3I940.0119PPHRWCIPICEA.7I940.0120GPAYSGREICEA.9240.0156MPNQAQMRILI Her2/neu.706I1040.0157MPYGCLLDHVI Her2/neu.801I1040.0161APPHRWCIPW CEA.640.0162APPHRWCIPI CEA.6I1040.0163IPWQRLLLTA CEA.1340.0164IPWQRLLLTI CEA.13I1040.0166LPQHLFGYSI CEA.58I1040.0201RPRFRELVSEF Her2/neu.96640.0202RPRFRELVSEI Her2/neu.966I1140.0205PPSPREGPLPA Her2/neu.114940.0206PPSPREGPLPI Her2/neu.1149I1140.0207GPLPAARPAGA Her2/neu.115540.0208GPLPAARPAGI Her2/neu.1155I1140.0231APAPAAPTPAA p53.7440.0232APAPAAPTPAI p53.74I1140.0233APAAPTPAAPA p53.7640.0234APAAPTPAAPI p53.76I1145.0003IPWQRLLI CEA.13.I845.0004LPQHLFGI CEA.58.I845.0007RPGVNLSI CEA.428.I845.0010IPQQHTQI CEA.632.I845.0011TPNNNGTI CEA.646.I845.0016CPLHNQEI Her2/neu.315.I845.0017KPCARVCI Her2/neu.336.I845.0019WPDSLPDI Her2/neu.415.I8
表13(續(xù))肽序列 來(lái)源45.0023 SPYVSRLI Her2/neu.779.I845.0024 VPIKWMAI Her2/neu.884.I845.0026 RPRFRELI Her2/neu.966.I845.0028 APGAGGMI Her2/neu.1036.I845.0031 SPGKNGVI Her2/neu.1174.I845.0037 SPQGASSI MAGE3.64.I845.0038 YPLWSQSI MAGE3.77.I845.0044 SPLPSQAI p53.33.I845.0046 MPEAAPPI p53.66.I845.0047 APAPSWPI p53.86.I845.0051 KPVEDKDAI CEA.155.I945.0054 IPQQHTQVI CEA.632.I945.0060 APPVAPAPI p53.70.I945.0062 APAAPTPAI p53.76.I945.0064 PPGTRVRAI p53.152.I945.0065 APPQLIRI p53.189.I945.0071 IPQQHTQVLICEA.632.I1045.0072 SPGLSAGATICEA.680.I1045.0073 SPMCKGSRCIHer2/neu.196.I1045.0074 MPNPEGRYTIHer2/neu.282.I1045.0076 CPLHNQEVTIHer2/neu.315.I1045.0079 KPDLSYMPIIHer2/neu.605.I1045.0080 TPSGAMPNQIHer2/neu.701.I1045.0084 GPASPLDSTIHer2/neu.995.I1045.0091 APPVAPAPAIp53.70.I1045.0092 APAPAAPTPIp53.74.I1045.0093 APTPAAPAPIp53.79.I1045.0094 APSWPLSSSIp53.88.I1045.0103 APTISPLNTSI CEA.239.I1145.0108 SPSYTYYRPGI CEA.421.I1145.0117 CPSGVKPDLSI Her2/neu.600.I1145.0118 SPLTSIISAVI Her2/neu.649.I1145.0119 IPDGENVKIPI Her2/neu.740.I11
表13(續(xù))肽序列 來(lái)源45.0124 SPLDSTFYRSI Her2/neu.998.I1145.0128 LPAARPAGATI Her2/neu.1157.I1145.0134 HPRKLLMQDLI MAGE2.241.I1145.0135 GPRALIETSYI MAGE2.274.I1145.0139 GPRALVETSYI MAGE3.274.I1145.0140 APRMPEAAPPI p53.63.I1145.0141 VPSQKTYQGSI p53.97.I111145.10 FPHCLAFAY HBVPOL541類似物1145.09 FPVCLAFSY HBVPOL541類似物26.0570 YPALMPLYACI HBV.pol.645提供以上描述用于闡述本發(fā)明而不是限制其范圍。本發(fā)明的其他一些改變對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是容易明了的，它們包括在所附的權(quán)利要求中。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均結(jié)合于此作為參考。
權(quán)利要求
1.一種包含具有HLA-A2.1結(jié)合基序的免疫原性肽的組合物，其特征在于，所述的免疫原性肽選自AILTFGSFV，HLRDFALAV，ALLGSIALL，ALLATILAA，LLATILAAV，RLFADELAA，YLSKCTLAV，LVYHIYSKI，SMYLCILSA，YLCILSALV，VMFSYLQSL，RLHVYAYSA，GLQTLGAFV，F(xiàn)VEEQMTWA，QMTWAQTVV，IILDTAIFV，AIFVCNAFV，AMGNRLVEA，RLVEACNLLTLSIVTFSL，KLSVLLLEV，LLLEVNRSV，F(xiàn)VSSPTLPV，AMLVLLAEI，QMARLAWEA，VLAIFGIFMA，YLYHPLLSPI，SLFEAMLANV，STTGINQLGL，LAILTFGSFV，ALLGSIALLA，ALLATILAAV，LLATILAAYA，RLFADELAAL，YLSKCTLAVL，LLVYHIYSKI，SMYLCILSAL，HLHRQMLSFV，LLCGKTGAFL，ETLSIVTFSL，VMCTYSPPL，KLFCQLAKT，ATPPAGSRV，F(xiàn)LQSGTAKSV，CMDRGLTVFV，VLLNWWRWRL，GVFTGLTHI，QMWKCLIRL，IMTCMSADL，ALAAYCLST，VLSGKPAII，F(xiàn)ISGIQYLA，YIMTCMSADL，AIASLMAFTA，GLAGAAIGSV，MIGVLVGV，VLPLAYISL，SLGCIFFPL，PLAYISLFL，LMLFYQVWA，NISIYNYFV，NISVYNYFV，F(xiàn)VWTHYYSV，F(xiàn)LTWHRYHL，LTWHRYHLL，MLQEPSFSL，SLPYWNFAT，RLPEPQDVA，VTQCLEVRV，LLRTFTDAV，NMVPFWPPV，AVVGALLLV，AVVAALLLV，LLVAAIFGV，SMDEANQPL，VLPLAYISV，SLGCIFFPV，PLAYISLFV，LLLFQQARV，LMLFYQVWV，LLPSSGPGV，NLSIYNYFV，NLSVYNYFV，F(xiàn)LWTHYYSV，SLKKTFLGV，F(xiàn)LTWHRYHV，MLQEPSFSV，SLPYWNFAV，ALGKNVCDV，SLLISPNSV，SLFSQWRVV，TLGTLCNSV，RLPEPQDVV，VLQCLEVRV，SLNSFRNTV，SLDSFRNTVFLNGTGGQVVLLHTFTDVALVGALLLVALVAALLLV，LLVALIFGV，YLIRARRSV，SMDEANQPV，SLGCIFFPLL，GMCCPDLSPV，AACNQKILTVFLTWHRYHLL，SLHNLAHLFLLLLVAAIFGVLLVAAIFGVA，ALIFGTASYL，SMDEANQPLL，LLTDQYQCYA，SLGCIFFPLV，F(xiàn)LMLFYQVWV，ALCDQRVLIV，ALCNQKILLTV，F(xiàn)LTWHRYHLV，SLHNLAHLFV，NLAHLFLNGV，NMVPFWPPVV，ILVVAALLLV，LLVALIFGTV，ALIFGTASYV，SMDEANQPLV，LLTDQYQCYV，LLIQNIIQNDT，IIQNDTGFYTL，TLFNVTRNDTALTLLSVTRNDVGLYTCQANNSA，ATVGIMIGVLV，GLVPPQHLIRV，GLAPPVHLIRV，GLAPPEHLIRV，ILIGVLVGV，YLIMVKCWMV，LLGRDSFEV，F(xiàn)MYSDFHFI，NMLSTVLGVSLENFRAYV，KMAELVHFV，KLAELVHFVVLIQRNPQV，VLLGVVFGV，SLISAVVGV，YMIMVKBWMI，YLIMVKBWMV，KLWEELSVV，AMBRWGLLV，IJIGVLVGV，ATVGIJIGV，SJPPPGTRV，LVFGIELJEV，ILGFVFTL，KIFGSLAFL，YLQLVFGIEV，MMNDQLMFL，ALVLAGGFFL，WLCAGALVL，MVFELANSI，RMMNDQLMFL，LVLAGGFFL，VLAGGFFLL，LLHETDSAV，LMYSLVHNL，QLMFLERAFI，LMFLERAFI，KLGSGNDFEV，LLQERGVAYI，GMPEGDLVYV，F(xiàn)LDELKAENI，ALFDIESKV，和GLPSIPVHPI。
2.一種可引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞針對(duì)患者體內(nèi)表達(dá)HLA-A2.1 MHC產(chǎn)物的預(yù)選定的抗原發(fā)生應(yīng)答的方法，其特征在于，所述的方法包括將患者的細(xì)胞毒性T細(xì)胞與含有選自以下免疫原性肽的組合物相接觸AILTFGSFV，HLRDFALAV，ALLGSIALL，ALLATILAA，LLATILAAV，RLFADELAA，YLSKCTLAV，LVYHWSKI，SMYLCILSA，YLCILSALV，VMFSYLQSL，RLHVYAYSA，GLQTLGAFV，F(xiàn)VEEQMTWA，QMTWAQTVV，IILDTAIFV，AIFVCNAFV，AMGNRLVEA，RLVEACNLLTLSIVTFSL，KLSVLLLEV，LLLEVNRSV，F(xiàn)VSSPTLPV，AMLVLLAEI，QMARLAWEA，VLAIEGIFMA，YLYHPLLSPI，SLFEAMLANV，STTGINQLGL，LAILTFGSFV，ALLGSIALLA，ALLATILAAV，LLATILAAVA，RLFADELAAL，YLSKCTLAVL，LLVYHIYSKI，SMYLCILSAL，HLHRQMLSFV，LLCGKTGAFL，ETLSIVTFSL，VMCTYSPPL，KLFCQLAKT，ATPPAGSRV，F(xiàn)LQSGTAKSV，CMDRGLTVFV，GVFTGLTHI，QMWKCLIRL，IMTCMSADL，ALAAYCLST，VLSGKPAII，F(xiàn)ISGIQYLA，YIMTCMSADL，AIASLMAFTA，GLAGAAIGSV，MIGVLVGV，VLPLAYISL，SLGCIFFPL，PLAYISLFL，LMLFYQVWA，NISIYNYFV，NISVYNYFV，F(xiàn)VWTHYYSV，F(xiàn)LTWHRYHL，LTWHRYHLL，MLQEPSFSL，SLPYWNFAT，RLPEPQDVA，VTQCLEVRV，LLHTFTDAV，NMVPFWPPV，AVVGALLLV，AVVAALLLV，LLVAAIFGV，SMDEANQPL，VLPLAYISV，SLGCIFFPV，PLAYISLFV，LLLFQQARV，LMLFYQVWV，LLPSSGPGV，NLSIYNYFV，NLSVYNYFV，F(xiàn)LWTHYYSV，SLKKTFLGV，F(xiàn)LTWHRYHV，MLQEPSFSV，SLPYWNFAV，ALGKNVCDV，SLLISPNSV，SLFSQWRVV，TLGTLCNSV，RLPEPQDVV，VLQCLEVRV，SLNSFRNTV，SLDSFRNTVFLNGTGGQVVLLHTFTDVALVGALLLVALVAALLLV，LLVALIFGV，YLIRARRSV，SMDEANQPV，SLGCIFFPLL，GMCCPDLSPV，AACNQKILTVFLTWHRYHLL，SLHNLAHLFLLLLVAAIFGVLLVAAIFGVA，ALIFGTASYL，SMDEANQPLL，LLTDDQYQCYA，SLGCIFFPLV，F(xiàn)LMLFYQVWV，ALCDQRVLIV，ALCNQKILTV，F(xiàn)LTWHRYHLV，SLHNLAHLFV，NLAHLFLNGV，NMVPFWPPVV，ILVVAALLLV，LLVALIFGTV，ALIFGTASYV，SMDEANQPLV，LLTDQYQCYV，LLIQNIIQNDT，IIQNDTGFYTL，TLFNVTRNDTALTLLSVTRNDVGLYTCQANNSA，ATVGIMIGVLV，GLVPPQHLIRV，GLAPPVHLIRV，GLAPPEHLIRV，ILIGVLVGV，YLIMVKCWMV，LLGRDSFEV，F(xiàn)MYSDFHFI，NMLSTVLGVSLENFRAYV，KMAELVHFV，KLAELVHFVVLIQRNPQV，VLLGVVFGV，SLISAVVGV，YMIMVKBWMI，YLIMVKBWMV，KLWEELSVV，AMBRWGLLV，IJIGVLVGV，ATVGIJIGV，SJPPPGTRV，LVFGIELJEV，ILGFVFTL，KIFGSLAFL，YLQLVFGIEV，MMNDQLMFL，ALVLAGGFFL，WLCAGALVL，MVFELANSI，RMMNDQLMFL，LVLAGGFFL，VLAGGFFLL，LLHETDSAV，LMYSLVHNL，QLMFLERAFI，LMFLERAFI，KLGSGNDFEV，LLQERGVAYI，GMPEGDLVYV，F(xiàn)LDELKAENI，ALFDIESKV，和GLPSIPVHPI.。
3.一種包含選自以下的免疫原性肽的組合物RVYPELPK，TVSAELPK，TVYAEPPK，TINYTLWR，LVHFLLLK，SVFAHPRK，KVLHHMVK，RVCACPGR，KMFCQLAK，RAHSSHLK，F(xiàn)VSNLATGR，RLQLSNGNK，RINGIPQQK，KIRKYTMRK，LVHFLLLKK，SMLEVFEGK，SSFSTTINK，TSYVKVLHK，VIFSKASEK，GSVVGNWQK，SSLPTTMNK，SVLEVFEGK，SSBMGGMNK，SSCMGGMNK，RTLTLFNVTK，TISPLNTSYK，STTINYTLWK，ASSLPTTMNK，KTYQGSYGFK，VVRRBPHHEK，GLAPPQHLIK，NSSCMGGMNK，SSBMGGMNRK，RVCACPGRDK，KTTTVSAELPK，TTTTVYAEPPK，PTISPSYTYYR，GLLGDNQVMPK，MVELVHFLLLK，F(xiàn)STTINYTLWR，GLLGDNQIMPK，RLGFLHSGTAK，ALNKMFCQLAK，RVCACPGRDRR，LSQETFSDLWK，RAHSSHLKSKK，VTCTYSPALNK，GTRVRAMAIYK，STSRHKKLMFK，LAARNVLVK，MALESILRR，ISWLGLRSLR，GSGAFGTVYK，和ASPLDSTFYR。
4.一種可引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞針對(duì)患者體內(nèi)預(yù)選定的抗原發(fā)生應(yīng)答的方法，其特征在于，所述的方法包括將患者的細(xì)胞毒性T細(xì)胞與含有選自以下免疫原性肽的組合物相接觸RVYPELPK，TVSAELPK，TVYAEPPK，TINYTLWR，LVHFLLLK，SVFAHPRK，KVLHHMVK，RVCACPGR，KMFCQLAK，RAHSSHLK，F(xiàn)VSNLATGR，RLQLSNGNK，RINGIPQQK，KIRKYTMRK，LVHFLLLKK，SMLEVFEGK，SSFSTTINK，TSYVKVLHK，VIFSKASEK，GSVVGNWQK，SSLPTTMNK，SVLEVFEGK，SSBMGGMN，SSCMGGMNK，RTLTLFNVTK，TISPLNTSYK，STTINYTLWK，ASSLPTTMNK，KTYQGSYGFK，VVRRBPHHEK，GLAPPQHLIK，NSSCMGGMNK，SSBMGGMNRK，RVCACPGRDK，KTITVSAELPK，TTITVYAEPPK，PTISPSYTYYR，GLLGDNQVMPK，MVELVHFLLLK，F(xiàn)STTINYTLWR，GLLGDNQIMPK，RLGFLHSGTAK，ALNKMFCQLAK，RVCACPGPDRP，LSQETFSDLWK，RAHSSHLKSKK，VTCTYSPALNK，GTRVRAMAIYK，STSRHKKLMFK，LAARNVLVK，MALESILRR，ISWLGLRSLR，GSGAFGTVYK，和ASPLDSTFYR。
5.一種包含免疫原性肽的組合物，其特征在于，所述的免疫原性肽選自表13所列出的肽。
6.一種可引發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞針對(duì)患者體內(nèi)預(yù)選定的抗原發(fā)生應(yīng)答的方法，其特征在于，所述的方法包括將患者的細(xì)胞毒性T細(xì)胞與包含一種免疫原性肽的組合物相接觸，所述的免疫原性肽選自表13所列出的肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了選擇免疫原性肽的手段和方法，以及能夠特異性地與HLA等位基因編碼的糖蛋白結(jié)合并在受該等位基因限制的T細(xì)胞中誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的免疫原性肽組合物。這些肽能用于引起針對(duì)所需抗原的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)C07K7/04GK1452634SQ00819410
公開日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2000年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月23日
發(fā)明者A·塞特, J·悉尼, W·M·卡斯特, S·索思伍德 申請(qǐng)人:埃皮繆納股份有限公司