專利名稱：咔唑生物堿類細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的用于細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的組合物，特別是一類含咔唑生物堿衍生物的組合物及其制備。
咔唑類生物堿雖然有一些化合物已人工合成，但大多還主要來(lái)源于天然產(chǎn)物，而且對(duì)某些結(jié)構(gòu)類型的咔唑類化合物已有人進(jìn)行了部分生物活性的研究，如文獻(xiàn)Tian-Shung Wu,et al,Carbazole alkaloids from Clausena excavata and their biological activity:Phytochemistry,Vol.43.No.1.pp133-140,1996及文獻(xiàn)A.Chakraborty,et al,Carbazole alkaloid with antimicrobial activity from Clausena heptaphylla:Phytochemistry,Vol.38.No.3.pp787-789,1995曾報(bào)道這類化合物具有抗菌作用和血小板聚集抑制作用。但有關(guān)天然咔唑生物堿類化合物的生物活性至今未見有細(xì)胞周期抑制及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)等抗癌作用的研究報(bào)道。
天然咔唑類生物堿很多都來(lái)源于蕓香科(Rutaceae)黃皮屬(Clausena)植物。迄今該屬植物化學(xué)成分的研究報(bào)道很多，主要成分為咔唑類生物堿和香豆素類化合物。同屬植物黑果黃皮Clausena dunniana Levl在我國(guó)局部地區(qū)民間用于治療癌癥，但其化學(xué)成分特別是有關(guān)該植物抗癌活性成分的研究至今未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的是研制一類新的用于細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的物質(zhì)，特別是一類咔唑生物堿衍生物及其制備。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)黑果黃皮的粗提物有很好的細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)及一定的細(xì)胞毒等抗癌活性，遂對(duì)其相關(guān)抗癌活性成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并發(fā)現(xiàn)了下述四種結(jié)構(gòu)類型的咔唑類生物堿，具有細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，其結(jié)構(gòu)如下 用上述化合物作為主要活性成分，配之以藥物可接受的輔劑、賦形劑，可以制成一類新型的細(xì)胞周期抑制劑和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
上述化合物的制備方法是用適量乙醇或含水乙醇溶液提取黑果黃皮莖皮的干燥碎塊，得粗浸膏，將所得粗浸膏依次用有機(jī)溶劑萃取，得到提取物。將上述有機(jī)溶劑提取物經(jīng)反復(fù)的硅膠和Sephadex LH20柱層析、反復(fù)的制備硅膠薄層層析和重結(jié)晶等分離純化操作，分離出浸膏中的活性成分，得到上述四種結(jié)構(gòu)類型的咔唑類生物堿活性單體。
本發(fā)明采用流式細(xì)胞術(shù)并配以細(xì)胞顯微形態(tài)特征觀察、熒光顯微形態(tài)特征觀察及顆粒粒度分析法，以對(duì)tsFT210小鼠乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)以及對(duì)該癌細(xì)胞的殺傷作用為主要指標(biāo)進(jìn)行了抗癌活性的篩選和測(cè)試工作。同時(shí)，采用HT-1080、K562等人癌細(xì)胞系，用MTT法檢測(cè)了活性成分對(duì)人癌細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表明，本專利所提供的上述四種結(jié)構(gòu)類型的咔唑類生物堿在所測(cè)試的抗癌活性模型中均具有很好的相關(guān)活性。
本發(fā)明的咔唑生物堿類的作用特征是或者通過(guò)抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期周轉(zhuǎn)，或通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，或者通過(guò)直接殺傷癌細(xì)胞發(fā)揮作用，上述咔唑生物堿類活性化合物也可作為生命科學(xué)的研究試劑～細(xì)胞周期抑制劑或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑用于探索生命現(xiàn)象。
實(shí)施例1分離制備1．藥材的提取及活性部位的制備黑果黃皮莖皮的干燥碎塊5公斤每次用70％的乙醇15L回流浸提，共提取三次，每次4小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮，得粗浸膏300克。
將該浸膏用2500ml水分散，依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，分別收集各萃取液并濃縮。分別得石油醚提取物25克、氯仿提取物30克、乙酸乙酯提取物35克、正丁醇提取物60克和水溶部分150克。2．石油醚提取物中活性成分的追蹤分離取石油醚提取物25克，用30克硅膠G拌樣，上減壓柱(250克硅膠H干法裝柱)層析，用石油醚(PE)-乙酸乙酯(EA)梯度洗脫分段，按極性粗分為20個(gè)流份，經(jīng)活性測(cè)試及薄層檢測(cè)后合并，得到6個(gè)組分A組分1.5g(PE洗脫)，B組分6.35g[PE-EA(99∶1～97∶3)洗脫]，C組分6.25g[PE-EA(96∶4～95∶5)洗脫]，D組分1.25g[PE-EA(95∶5～93∶7)洗脫]，E組分0.35g[PE-EA(93∶7～92∶8)洗脫]，F(xiàn)組分9g[PE-EA(90∶10～50∶50)洗脫]。其中B、C組分活性以誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞毒為主，D、E組份活性以細(xì)胞周期抑制為主，A和F組分無(wú)活性。
B、C組分用硅膠G(1∶50)上常壓柱，正已烷/丙酮95∶5洗脫，得到化合物7和8粗品5g和4.0g。
D組分用LH-20(1∶50)柱層析分離，常壓濕法上樣，甲醇洗脫，得到化合物1和2粗品0.6g和25mg。
E組分經(jīng)LH-20柱層析分離，取活性組份，再經(jīng)制備薄層層析分離得到化合物9粗品35mg。
取B～E組分經(jīng)上述柱層析分離得到的活性化合物粗品，經(jīng)反復(fù)ODS柱層析(70％乙腈/水洗脫)精制，得到純品化合物1(0.7g)、2(15mg)、7(4.5g)、8(3.5g)、9(25mg)。3．氯仿提取物中活性成分的追蹤分離取氯仿提取物30克，用36克硅膠G拌樣，上減壓柱(300克硅膠H干法裝柱)，用石油醚(PE)-乙酸乙酯(EA)梯度洗脫分段，按極性粗分為20個(gè)流份，經(jīng)活性測(cè)試及薄層檢測(cè)后合并，得到6個(gè)組分G組分1g(PE洗脫)，H組分5.0g[PE-AE(97∶3)洗脫]，I組分4.0g[PE-AE(93∶7)洗脫]，J組分0.65g[PE-AE(9∶1)洗脫]，K組分1.35g[PE-AE(9∶1～8∶2)洗脫]，L組分16g[PE-EA(7∶3～1∶1)洗脫]。其中H、I組分主要含與石油醚層相同的成分，J、K組分含新的活性成分，G和L組分無(wú)活性。
H、I組分參照分離石油醚提取物的方法分離，分別得到化合物1(0.5g)、7(2.7g)、8(2g)。
J、K組分分別上LH-20柱，經(jīng)甲醇洗脫層析后，取活性流份，經(jīng)薄層檢查相似者合并，得到12個(gè)活性組分。從這些活性組分中，經(jīng)反復(fù)的LH-20柱層析、制備薄層層析分離精制，分別得到化合物3(25mg)、4(12mg)、5(8mg)和6(10mg)。 4．活性化合物1 ～9的理化常數(shù)及光譜數(shù)據(jù)化合物1淡黃色油狀物。ESI-MS(m/z):212[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:341(3.67),328(3.71),291(4.19),250(4.57),241(4.75),228(4.64).IR νmaxcm-1(KBr):3422,3056,2918,2852,1588,1503,1394,828。1H NMRδ(CDCl3):8.30(brs,NH),8.20(d,J=8Hz),7.66(s),7.55(t,J=8Hz),7.49(d,J=8Hz),7.37(t,J=8Hz),6.87(s),4.07(s,3H),2.70(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):145.4,139.5,129.5,128.1,125.5,124.4,123.6,120.4,119.2,112.5,110.9,107.7,55.5,21.9?；衔?無(wú)色柱狀結(jié)晶，mp178-179℃.ESI-MS(m/z):264[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:342(3.70),328(3.74),295(4.46),258(4.42),246(4.53),235(4.80),229(4.78).IRνmaxcm-1(KBr):3405,3050,2917,2858,1607,1460,1243,847。13CNMRδ(CDCl3):139.9,137.8,128.8,127.2,125.7,123.6,123.3,120.2,120.2,119.3,110.6,110.2,21.4?；衔?無(wú)色細(xì)針柱狀結(jié)晶，mp236-237℃.ESI-MS(m/z):212.3[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:344(4.06),333(4.06),287(4.31),274(4.49),250(4.28),239(4.38),221(4.25).IRνmaxcm-1(KBr):3400,3047,2917,2815,1670,1473,1251,851。1H NMRδ(Acetone):9.98(s),8.24(d,J=1.5),8.17(d,J=8Hz),7.63(d,J=8Hz),7.45(dd,J=8.0,8.0Hz),7.42(t,J=1.5Hz),7.24(dd,J=8.0,8.0Hz),13C NMRδ(CDCl3):191.4,143.7,140.3,134.0,130.2,126.2,124.1,123.6,120.4,119.9,118.2,111.8,107.5。化合物4無(wú)色針狀結(jié)晶，mp165-166℃.ESI-MS(m/z):224[M-H].UVλmaxnm(logε)in MeOH:339(4.10),330(4.10),386(4.31),273(4.50),248(4.25),237(4.46),222(4.24).IRνmaxcm-1(KBr):3177,3103,2918,1661,1501,1344,1141,846。1HNMRδ(CDCl3):10.06(s,CHO),8.19(brs),8.11(d,J=8Hz),7.51(d,J=8Hz),7.48(dd,J=8.0,8.0Hz),7.46(d,J=1.0Hz),7.32(dd,J=8.0,8.0Hz),4.06(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):191.8,146.1,139.4,134.1,130.2,126.6,123.7,123.6,120.7,120.7,120.3,111.5,103.6,55.8。化合物5白色粒狀結(jié)晶，mp229-230℃.ESI-MS(m/z):242[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:353(3.95),340(3.91),296(4.27),278(4.32),255(4.14),242(4.18),223(4.19).IRνmaxcm-1(KBr):3391,3360,2927,2829,1670,1459,1216,842。1HNMRδ(CDCl3):9.96(s,CHO),8.23(s),7.75(d,J=2Hz)7.54(d,J=9Hz),7.39(s),7.09(dd,J=9.0,2.0Hz),3.88(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):191.3,154.5,143.7,135.0,134.6,129.8,124.1,124.0,118.7,115.8,112.5,106.9,102.7,55.2?；衔?橘紅色針晶。ESI-MS(m/z):211[M-1]+.UVλmaxnm(logε) in MeOH:286(3.84),258(4.19),224(4.39).IRνmaxcm-1(KBr):3220,2921,2853,1664,1637,1468,887,747。1H NMRδ(CDCl3):8.04(d,J=8Hz),7.52(d,J=8Hz),7.38(dd,J=8,8Hz),7.30(dd,J=8,8Hz),6.62(d,J=1Hz),2.06(d,J=1Hz)。13C NMRδ(CDCl3):183.1,180.1,148.0,137.4,135.9,131.6,126.2,123.8,123.6,121.6,115.4,113.8,15.6?；衔?無(wú)色片狀結(jié)晶，mp176-177℃.ESI-MS(m/z):264[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:357(4.04),342(4.10),327(4.07),287(4.80),236(4.84).IRνmax cm-1(KBr):3320,2975,2931,1642,1460,1146,1058,882。1H NMRδ(CDCl3):7.83(brs,NH),7.93(d,J=8Hz),7.69(s),7.37(d,J=8Hz),7.33(t,J=8Hz),7.20(t,J=8Hz),6.60(d,J=10Hz),5.69(d,J=10Hz),2.36(s,3H)1.51(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):149.9,139.6,134.9,129.4,124.3,124.0,121.2,19.6,119.3,118.7,118.7,117.2,116.8,110.4,104.5,75.9,27.7,27.7,16.0。化合物8白色針絮狀結(jié)晶，mp95.5-96.5℃.[α]D25+55.9°(c1.8,MeOH).ESI-MS(m/z):332[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:357(4.18),342(4.22),329(4.19),287(4.94),238(4.97).IRνmaxcm-1(KBr):3325,2965,2926,2856,1647,1460,1218,846.1H NMRδ(CDCl3):7.93(brd,J=8Hz),7.81(brs,NH),7.67(m),7.37(brd,J=8Hz),7.32(td,J=8,1Hz),7.19(td,J=8,1Hz),6.63(d,J=10Hz),5.66(d,J=10Hz),5.14(brt,J=7Hz),2.36(s,3H),2.20(m,2H),1.79(m,2H,),1.69(s,3H),1.61(s,3H),1.47(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):150.0,139.5,134.9,131.7,128.5,124.3,124.2,124.0,121.2,119.5,119.3,118.5,117.5,116.7,110.4,104.2,78.2,40.9,25.9,25.6,22.8,17.6,16.0?；衔?無(wú)色柱狀結(jié)晶，mp146.5-147.5℃.[α]D25+9.0°(c1.0,MeOH).ESI-MS(m/z):332[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:332(3.85),304(4.44),254(4.66),241(4.85),218(4.76).IRνmaxcm-1(KBr):3478,3062,2953,2859,1613,1458,1145,873.1H NMRδ(CD3OD):7.88(brd,J=8Hz),7.65(s),7.4(brd,J=8Hz),7.23(td,J=8Hz),7.08(rd,J=8,0.5Hz),3.46(d,J=9.5Hz),2.71(t,J=9Hz),2.54(m),2.33(s,3H),2.09(m),1.80(m),1.74(m),1.66(m),1.59(s,3H),1.38(s,3H)。13C NMRδ(CD3OD):151.7,141.7,139.5,125.1,124.7,120.4,119.8,119.7,119.6,117.5,111.8,108.7,85.0,48.1,40.9,40.8,40.5,38.1,34.9,26.7,26.2,19.1,16.8。
1)細(xì)胞周期抑制及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性溫敏型小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃、通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)?；钚詼y(cè)試時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的tsFT210細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)基配制成密度為2×105cells/ml的細(xì)胞懸液，分別按0.5ml/well加至24孔板中，每孔加入5μl不同濃度的樣品甲醇溶液，32℃下培養(yǎng)17h。取藥物作用下培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無(wú)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，然后將細(xì)胞分別從24孔板轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf離心管中，4℃下3000rpm離心3min，吸去上清液，加0.5μl磷酸緩沖溶液震蕩洗滌一次，相同條件下收集細(xì)胞，加150μl碘化丙啶(PI)水溶液(5mg PI,100mg Sodium citrate and 200mg NP-40in 100ml H2O),4℃下染色30min后，用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞中DNA的含量分布。另外，必要時(shí)取藥物處理后的細(xì)胞，用Hoechst 33258熒光試劑將細(xì)胞染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)特征變化，判斷有無(wú)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征或細(xì)胞周期是被抑制在G2期還是在M期。
2)對(duì)人癌細(xì)胞的殺傷活性人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080和人慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562均用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成密度為2×105個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞液，將此細(xì)胞液接種到96孔板中，每孔分注100μl，置于5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)4小時(shí)，每孔加入不同濃度的受試樣品液或陽(yáng)性對(duì)照順鉑溶液各5μl，每種樣品或順鉑均設(shè)三孔，同時(shí)設(shè)三孔空白對(duì)照，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。每孔加入5mg/ml的MTT液10μl，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時(shí)，4℃、2000rpm離心5分鐘，吸去上清后，每孔加入100μl DMSO,37℃孵育約10分鐘，待結(jié)晶溶解完全后，用定時(shí)微量振蕩器振蕩約1分鐘，利用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔于570nm處的光密度(以下稱OD)值。
取三孔OD值的平均值，按如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率抑制率=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100％取每個(gè)樣品在不同濃度下的抑制率，繪制量效曲線，由該曲線計(jì)算出半數(shù)抑制有效濃度。
2．生物活性測(cè)試結(jié)果1)細(xì)胞周期抑制及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性化合物1在濃度高時(shí)對(duì)tsFT210細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，隨著濃度降低凋亡誘導(dǎo)作用逐漸減弱，代之逐漸呈現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期很強(qiáng)的M期抑制活性；化合物3、4、5對(duì)細(xì)胞周期有很強(qiáng)的G2/M抑制作用；化合物6對(duì)tsFT210細(xì)胞呈現(xiàn)很強(qiáng)的殺傷作用；化合物7、8、9對(duì)tsFT210細(xì)胞均有很強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用和殺傷作用；而化合物2在小于400/μg/ml的測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)tsFT210細(xì)胞無(wú)明顯活性。這些化合物對(duì)tsFT210細(xì)胞的最小有效濃度(MEC)分別為1,1.25μg/ml(0.85μg/ml＜MEC＜=1.25μg/ml)；2,MEC＞400μg/ml；3,9.38μg/ml(4.69μg/ml＜MEC＜=9.38μg/ml)；4,16.50μg/ml(8.25μg/ml＜MEC＜=16.50μg/ml)；5,8.25μg/ml(4.12μg/ml＜MEC＜=8.25μg/ml)；6,30.0μg/ml(15.0μg/ml＜MEC＜=30.0μg/ml)；7,25.0μg/ml(12.5μg/ml＜MEC＜=25.0μg/ml)；8,15.0μg/ml(12.5μg/ml＜MEC＜=15.0μg/ml)；9,20.0μg/ml(12.5μg/ml＜MEC＜=20.0μg/ml)。2)對(duì)人癌細(xì)胞的殺傷活性采用MTT法，測(cè)試部分化合物對(duì)人癌細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果如表1所示。
表1部分化合物對(duì)人癌細(xì)胞的殺傷作用(MTT法測(cè)得的IC50值，μg/ml)
上述生物活性測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的咔唑生物堿類化合物可作為細(xì)胞周期抑制劑或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑用于探索生命現(xiàn)象，也可以通過(guò)配之以藥物可接受的輔劑、賦形劑，制成一類新的抗癌治療藥物，該類藥物的特征是咔唑生物堿類活性成分通過(guò)抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期周轉(zhuǎn)或通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡或者通過(guò)直接殺傷癌細(xì)胞發(fā)揮抗癌治療的藥物作用。
權(quán)利要求
1．一種可作為細(xì)胞周期抑制劑及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的組合物，其特征是該組合物的活性成分是一種咔唑類生物堿衍生物或其鹽，所述咔唑類生物堿衍生物的結(jié)構(gòu)包括如下式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ和式Ⅳ所示的結(jié)構(gòu)。
2．權(quán)利要求1所述的咔唑類生物堿衍生物，其中優(yōu)選的化合物為R1=OCH3,R2=CH3,R3=H,R=CH2CH2CH=C(CH3)2。
3．權(quán)利要求2所述的咔唑類生物堿的制備方法是用乙醇或60-70％的乙醇提取黑果黃皮莖皮的干燥碎塊，得粗浸膏；用有機(jī)溶劑萃取該浸膏，得到提取物；將該提取物經(jīng)反復(fù)的硅膠和Sephadex LH20柱層析、反復(fù)的制備硅膠薄層層析和重結(jié)晶，分離出浸膏中的活性成分。
全文摘要
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了可作為細(xì)胞周期抑制劑及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的四種不同結(jié)構(gòu)類型的咔唑類生物堿。這些化合物可通過(guò)抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期周轉(zhuǎn)或通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡或者通過(guò)直接殺傷癌細(xì)胞發(fā)揮作用,也可單獨(dú)作為生命科學(xué)的研究試劑～細(xì)胞周期抑制劑或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。制備方法是用乙醇或含水乙醇提取黑果黃皮莖皮的干燥碎塊,得粗浸膏,用有機(jī)溶劑萃取,經(jīng)反復(fù)的柱層析、反復(fù)的制備硅膠薄層層析和重結(jié)晶等操作,分離出浸膏中的活性成分。
文檔編號(hào)C07D491/00GK1309964SQ0110367
公開日2001年8月29日 申請(qǐng)日期2001年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月9日
發(fā)明者崔承彬, 蔡兵, 閆少羽, 趙慶春, 姚新生, 曲戈霞 申請(qǐng)人:崔承彬