專利名稱：從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從紅豆杉植物細胞培養(yǎng)液濾液中提取紫杉醇的方法。
紫杉醇是一種臨床上治療乳腺癌、卵巢癌、肺癌等癌癥的抗癌藥，具有良好療效，而毒副作用較小，我國及世界多國已批準(zhǔn)生產(chǎn)和應(yīng)用，需求量日增。但目前，其主要來源為植物，植物資源量極為有限，且得到保護，與需要量相距甚遠。為開辟紫杉醇的新來源，我們利用植物生物技術(shù)，進行了紅豆杉植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究，取得預(yù)期進展，顯示了實現(xiàn)生產(chǎn)的可能性。通過試驗證明，在我們設(shè)定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，紅豆杉細胞在培養(yǎng)過程中合成的紫杉醇不斷釋放到培養(yǎng)液中，約80％的量被吸附在培養(yǎng)液的膠體微粒上。在此情況下，若用有機溶劑CH2CL2對其中的紫杉醇進行提取，不僅消耗大量CH2CL2溶劑，萃取效率低，而且需要大型設(shè)備，消耗大量能源。我們使用絮凝劑對培養(yǎng)液進行快速絮凝澄清、過濾，有效地解決了吸附大量紫杉醇的微粒固形物與液體的分離問題(本所已申請專利，申請?zhí)枮?0122083.7)。處理小體積的高度富集紫杉醇的固體物要比萃取大量培養(yǎng)液方便、經(jīng)濟得多。由于進行固液分離后的大量濾液尚含一定量的紫杉醇，但體積大，含量低。使用常規(guī)的有機溶劑萃取方法，就會遇到上述所提及的同樣的不利情況。
本發(fā)明的目的就是提供一種從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，也就是說，用大孔吸附樹脂從含紫杉醇的紅豆杉細胞培養(yǎng)液的過濾液中或者其他含紫杉醇的水溶液以及含紫杉醇的紅豆杉細胞培養(yǎng)液提取物的甲醇水溶液中吸附提取紫杉醇的方法。
本發(fā)明可由如下方式來實現(xiàn)將大孔吸附樹脂放入含紫杉醇的試液中，搖動吸附5～6小時，試液的PH值為5.5～6.5，吸附完成后，用有機溶劑洗脫被樹脂吸附的紫杉醇，濃縮后可得到高含紫杉醇濃縮物。也可以將大孔吸附樹脂裝柱，讓試液流經(jīng)柱中的大孔吸附樹脂進行吸附，吸附完成后，用有機溶劑洗脫被樹脂吸附的紫杉醇，濃縮后同樣可得到高含紫杉醇的濃縮物。大孔吸附樹脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9(南開大學(xué)化工廠)、LD605(中國藍星晨光化工研究院)、XAD-4(進口分裝)。LD605樹脂用甲醇或50％乙醇洗脫被大孔吸附樹脂吸附的紫杉醇。S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或XAD-4樹脂用無水乙醇洗脫被大孔吸附樹脂吸附的紫杉醇。試液為含紫杉醇的50％甲醇溶液，或者含紫杉醇的紅豆杉細胞培養(yǎng)液的濾液，PH值為5.6～5.8。紅豆杉細胞培養(yǎng)液包括中國紅豆杉、東北紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、短葉紅豆杉或雜種紅豆杉植物的細胞培養(yǎng)液。
本發(fā)明簡化了工藝，降低了提取分離紫杉醇的成本，具有簡便、高效和易于工業(yè)化的優(yōu)點，可以節(jié)省大量的有機溶劑，減少大型設(shè)備費用和節(jié)約能源，避免污染環(huán)境。
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的描述。
本發(fā)明的方法是①大孔吸附樹脂先后用蒸餾水、1mol的NaoH和1mol的HCL溶液、蒸餾水、無水乙醇、蒸餾水等處理洗滌去雜。②將定量已處理好的大孔吸附樹脂放入定量的含紫杉醇的紅豆杉植物細胞培養(yǎng)液的濾液中或含紫杉醇的紅豆杉植物細胞培養(yǎng)液提取物的甲醇水溶液中或其他含紫杉醇的水溶液中，搖動吸附5～6小時，試液PH值為5.5～6.5，或?qū)⒋罂孜綐渲b填層析柱后，使上述試液通過層析柱對紫杉醇進行吸附。③過濾，分別收集已吸附紫杉醇的大孔吸附樹脂與被吸附過紫杉醇的試液。④用無水乙醇或甲醇洗脫吸附了紫杉醇的大孔吸附樹脂并用CH2CL2萃取吸附過紫杉醇的試液，將無水乙醇或甲醇洗脫液定容備測；回收CH2CL2至干，用甲醇溶解洗滌并定容。⑤HPLC檢測已定容的無水乙醇或甲醇洗脫液中的紫杉醇量。⑥由上述檢測的被大孔吸附樹脂吸附的紫杉醇的洗脫量及試液中的紫杉醇殘留量和試液中的紫杉醇原有含量，計算出大孔吸附樹脂的吸附量、單位重量樹脂的吸附量、洗脫率等。
實施例一大孔吸附樹脂對中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液的紫杉醇提取物的50％甲醇溶液的吸附性能試驗。其操作為量取一定體積含定量紫杉醇(用HPLC檢測)的中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液紫杉醇提取物的甲醇溶液加入三角瓶中，再加入等量蒸餾水(PH值為6)，搖勻，使其成為含紫杉醇的50％甲醇溶液，再加入經(jīng)過稱量預(yù)先處理好的大孔吸附樹脂(所試大孔吸附樹脂完全按照其醫(yī)藥使用技術(shù)要求進行處理)，本試驗的大孔吸附樹脂有S-8、AB-8、X-5、XAD-4、D4020、NKA-9、LD605等。加入樹脂的試液放置于搖床上搖動吸附5小時。過濾，分離吸附了紫杉醇的樹脂，除了LD605是用甲醇或50％乙醇洗脫其紫杉醇外，其他吸附了紫杉醇的樹脂均采用無水乙醇洗脫5次，定容后用HPLC檢測紫杉醇的洗脫量；被樹脂吸附過紫杉醇的試液用CH2CL2萃取3次，濃縮至干，甲醇溶解并洗滌，定容后用HPLC檢測該試液中的紫杉醇殘留量，由試液中紫杉醇原始含量，計算出大孔吸附樹脂的吸附量、洗脫率。
①吸附量=試液原含量-試液殘留量②洗脫率=洗脫量/吸附量×100％試驗結(jié)果如表一
從表一數(shù)據(jù)看出，7種大孔吸附樹脂在中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液的紫杉醇提取物的甲醇溶液(50％)中均能夠吸附紫杉醇，但每克干樹脂的吸附量存在差異；其中S-8和AB-8兩種樹脂每克的吸附量較其他樹脂為高，分別為8.9mg和8.4mg。LD605、NKA-9、XAD-4等3種樹脂每克的吸附量較低，分別是4.08mg、5.79mg和5.66mg。而7種大孔吸附樹脂所吸附紫杉醇的洗脫率除S-8為84％以外，其余樹脂均在93％以上。X-5為98％，LD605為96.44％，XAD-4為95.59％。
實施例二大孔吸附樹脂用于富集提取中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液的絮凝澄清過濾后的濾液中的紫杉醇。其操作過程如下量取中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液經(jīng)絮凝澄清的過濾液(HPLC方法測定其紫杉醇含量)加入三角瓶中，PH值為5.8，再加入稱量的濕基大孔吸附樹脂，放在搖床搖動吸附5小時，過濾，所得濾液用CH2CL2萃取3次，回收CH2CL2至干，用甲醇溶解洗滌并定容，HPLC方法檢測紫杉醇含量，即為試液中經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后紫杉醇的殘留量；吸附了紫杉醇的樹脂用無水乙醇洗脫5次，定容。用HPLC方法檢測被吸附紫杉醇的洗脫量。由以上數(shù)據(jù)計算出大孔吸附樹脂在中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液的絮凝澄清過濾后的濾液中對紫杉醇的吸附量、洗脫量、洗脫率以及回收率。
回收率=洗脫量/試液原含量×100％試驗結(jié)果如表二
從表二數(shù)據(jù)看出，在實施例一試驗基礎(chǔ)上，7種大孔吸附樹脂用于富集提取中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中的紫杉醇時，在樹脂稍過量情況下，半數(shù)以上試液中紫杉醇可被完全吸附；被樹脂吸附紫杉醇的洗脫率，除X-5為84.2％以外，其余均在93.5％以上，S-8高達99.2％；被樹脂吸附并洗脫紫杉醇相對試液中原有紫杉醇的回收率，除XAD-4和X-5分別為65.9％和84.2％，NKA-9為82.69％以外，其余回收率都高達95.2％～97.6％之間，說明適宜的大孔吸附樹脂能夠高效富集提取并回收試液中的紫杉醇。
實施例三量取2份各5ml中國紅豆杉細胞培養(yǎng)液的紫杉醇提取物甲醇溶液，(HPLC方法測定其紫杉醇含量為0.76mg/5ml)加入三角瓶中，再加入5ml蒸餾水，搖勻備用，PH值為5.8。另外分別稱取已處理好的濕基大孔吸附樹脂X-5及AB-8各1g(0.4g干重)。分別裝入2根40cm×0.8cm的玻璃柱中，用蒸餾水平衡后，使上述備好的2份試液分別5次通過柱子中的大孔吸附樹脂進行吸附，HPLC檢測流出液不含紫杉醇為止。用無水乙醇洗脫解吸被樹脂吸附的紫杉醇6次，乙醇洗脫液定容50mml，用HPLC檢測其中紫杉醇洗脫量。
試驗結(jié)果如表三
從表三數(shù)據(jù)看出，利用大孔吸附樹脂對試液中紫杉醇進行吸附和洗脫，在樹脂稍過量的情況下將試液中紫杉醇完全吸附，洗脫量和回收率均在92％以上。與實施例一、二中利用大孔吸附樹脂分散在試液中搖動吸附和洗脫的效果基本一致。
權(quán)利要求
1.從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于將大孔吸附樹脂放入含紫杉醇的試液中，搖動吸附5～6小時，試液的PH值為5.5～6.5，吸附完成后，用有機溶劑洗脫被樹脂吸附的紫杉醇，濃縮后可得到高含紫杉醇的濃縮物。
2.從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于將大孔吸附樹脂裝柱，讓試液流經(jīng)柱中的大孔吸附樹脂進行吸附，吸附完成后，用有機溶劑洗脫被樹脂吸附的紫杉醇，濃縮后可得到高含紫杉醇的濃縮物。
3.依權(quán)利要求1或2所述的從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于大孔吸附樹脂是S-8、AB-8、X-5、XAD-4、D4020、NKA-9或LD605。
4.依權(quán)利要求1或2所述的從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于試液為含紫杉醇的50％甲醇溶液。
5.依權(quán)利要求1或2所述從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于試液為含紫杉醇紅豆杉細胞培養(yǎng)液的濾液，PH為5.5～6.5。
6.依權(quán)利要求3所述的從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于用甲醇或50％乙醇洗脫被LD605樹脂吸附的紫杉醇。
7.依權(quán)利要求3所述的從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于用無水乙醇洗脫被S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或XAD-4等大孔吸附樹脂吸附的紫杉醇。
8.依權(quán)利要求1或2所述的從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于紅豆杉細胞培養(yǎng)液包括中國紅豆杉、東北紅豆杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉、西藏紅豆杉、短葉紅豆杉或雜種紅豆杉植物的細胞培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法,其技術(shù)要點是將大孔吸附樹脂與試液充分混合進行吸附富集,或讓試液多次通過裝有大孔吸附樹脂的柱子進行吸附富集,有機溶劑洗脫被樹脂吸附的紫杉醇,濃縮可得到高含紫杉醇的濃縮物。本發(fā)明簡化了工藝、降低了提取分離紫杉醇的成本,簡便、高效、易于工業(yè)化并可節(jié)省大量有機溶劑、減少設(shè)備費用、節(jié)約能源,避免污染環(huán)境。
文檔編號C07D305/14GK1305999SQ01107410
公開日2001年8月1日 申請日期2001年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月3日
發(fā)明者王國亮, 駱雪蘭, 謝維權(quán), 黃巧明, 侯嵩生 申請人:梅縣梅雁生物工程研究所