專利名稱：編碼rplk基因的核苷酸序列及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明提供了編碼rplK基因的核苷酸序列，及用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵制備氨基酸，尤其L-賴氨酸的方法，其中棒狀細菌中rplK基因是弱化的。
L-氨基酸，尤其L-賴氨酸，用于動物營養(yǎng)、人用藥及制藥工業(yè)。
已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進行改良生產(chǎn)方法的嘗試，為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此獲得對抗代謝物如賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術的方法也用于棒桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株改良，其通過擴增各個氨基酸生物合成基因，并研究對L-氨基酸生產(chǎn)的作用而進行改良。此方面的綜述文章見Kinoshita(“谷氨酸細菌”，工業(yè)微生物的生物學，Demain和Soloman編輯，Benjamin Cummings，英國倫敦，1985,115-142),Hilliger(生物技術2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技術的關鍵回顧15,73-103(1995))，及Sahm等(紐約科學協(xié)會年報782,25-39(1996))。
rplK蛋白(核糖體大亞基蛋白K)是細菌核糖體的一組成成份，它是第一個闡述的大腸桿菌(E.coli)細胞的翻譯裝置，在其上發(fā)生蛋白質(zhì)合成。
核糖體是由3種核糖核酸(RNA)分子和特定數(shù)目的蛋白質(zhì)組成的細胞顆粒。核糖體大部分經(jīng)超離心得自細胞提取物。剩余細胞成分的進一步純化通常以蔗糖梯度通過沉降梯度分離進行。此制備技術使得通常使用直接涉及沉降性質(zhì)的核糖體組分的名稱。因此，一個有功能細菌核糖體通常稱為70S核糖體，其由小(小亞基)30S亞基和大(大亞基)50S亞基組成。E.coli的小30S亞基由21個不同的多肽和長度為1542個核苷酸的RNA分子組成，該RNA已知為16S-rRNA；除了rplK蛋白，大50S亞基還含有另外31個不同的多肽和長度分別為120和2904個核苷酸的2個RNA，分別稱為5S或23S rRNA分子。另外還有一種核糖體蛋白的命名方式。小30S亞基的多肽稱為S1-S21，而大50S亞基稱為L1～L32。本文rplK蛋白相當于核糖體L11蛋白(Noller和Nomura，在Neidhardt等，大腸桿菌和鼠傷寒桿菌細胞和分子生物學，美國微生物學會，華盛頓特區(qū)，167-186,1996)。近年來，類L11蛋白在其它生物體中也已鑒別出，如Borrelia burgdorferi(Fraser等，自然390,580-586,1997),Helicobacter pylori(Tomb等，自然388,539-547,1997),Serratia marcescens(Sor和Nomura，分子和普通遺傳學210,52-59,1987),Haemophilus influenzae(Fleischmann等，科學269,496-512,1995)及革蘭氏陽性菌Bacillus subtilis(Jeong等，分子微生物學10,133-142,1993)。
翻譯過程發(fā)生在核糖體，因此信使RNA控制的多肽的生物合成是復雜的。除核糖體之外，稱為蛋白質(zhì)合成因子的其它蛋白質(zhì)(Noller，生物化學關鍵回顧，60,191-227,1991)也是翻譯過程所必需的。L11蛋白介導核糖體和一些蛋白質(zhì)合成因子間的相互作用，可提及的例如是延伸因子G(EF-G)和終止因子1(RF-1)。E.coli L11突變體的核糖體中沒有L11蛋白，因此導致翻譯速度降低(Xing和Draper，生物化學35,1581-1588,1996)。
L11蛋白對于RelA蛋白與核糖體結(jié)合與活化也是必需的。RelA在氨基酸缺陷的條件下，通過將一個焦磷酸基團從ATP移至GDP而催化鳥苷四磷酸(ppGpp)的合成。在E.coli中，ppGpp負性或正性影響許多基因的表達。一般地，在生物合成途徑中有作用的基因產(chǎn)物的表達是被刺激的。有分解代謝作用的基因產(chǎn)物通常相應地被負調(diào)節(jié)的。在氨基酸生物合成中起中心作用的大量基因和操縱子在E.coli中是通過ppGpp調(diào)節(jié)的。這些基因中目前已知在E.coli中被正性影響的基因是arg F,arg I,arg ECBH(精氨酸生物合成)，gltB,glnA,gdh(谷氨酰胺/谷氨酸生物合成)，ilvB,IlvA(異亮氨酸生物合成)，metC,metF metK(甲硫氨酸生物合成)，thrA,thrB,thrC(蘇氨酸生物合成)，lysA,lysC,dapB,asd(賴氨酸生物合成)(Cashel等，Neidbvardt等，大腸桿菌和鼠傷寒桿菌細胞和分子生物學，美國微生物學會，華盛頓特區(qū)，1458-1496,1996)。ppGpp作為氨基酸生物合成的正調(diào)節(jié)因子的功能也在其它細菌中證實，如鼠傷寒桿菌(Rudd等，細菌學雜志163,534-542,1985),Vibrio sp.(Flardh等，細菌學雜志176,5949-5957,1994)和B.subtilis(Wendrich和Marahiel，分子微生物學26,65-79,1997)。
從現(xiàn)有技術可以明白，令人感興趣的是了解棒狀細菌rplK基因的核苷酸序列，是否可以促進這些細菌生產(chǎn)氨基酸。
因此本發(fā)明的目的是提供改良的經(jīng)發(fā)酵制備氨基酸，尤其L-賴氨酸的新措施。
L-氨基酸，尤其賴氨酸用于人用藥物及制藥工業(yè)，食品工業(yè)以及特別是動物營養(yǎng)。因此提供生產(chǎn)氨基酸，尤其L-賴氨酸的新改良方法總是令人感興趣的。
本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，其包括選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)編碼含有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了根據(jù)上述a)～d)所述的多核苷酸，其優(yōu)選是能復制的DNA，含有(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，并任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變體。
本發(fā)明還提供了能復制的優(yōu)選為重組DNA的多核苷酸，含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，能復制的優(yōu)選為重組DNA的多核苷酸，其編碼含有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽，如上述a)-d)尤其d)所述的多核苷酸，含有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，如上述a)-d)尤其d)所述的多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽，含有如上述a)-d)尤其d)所述的SEQ ID NO:3所示的突變的多核苷酸的載體，如

圖1所示(Δ=deHa)，并根據(jù)布達佩斯條約保藏在E.coli DH5α/pΔrplK中，保藏號DSM13158，其在1999年11月26日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不論瑞克，德國)，及作為宿主細胞的棒狀細菌，其含有rplK基因的插入或缺失。
本發(fā)明還提供了多核苷酸，其基本上含有一多核苷酸序列，其可通過用含有SEQ ID NO:1所述多核苷酸序列或其片段的序列的探針雜交相應的基因文庫，并分離所述的DNA序列來篩選獲得，所述文庫包括具有相應于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列適用作RNA,cDNA和DNA的雜交探針，以分離編碼核糖體蛋白L11的全長cDNA，以及分離與rplK基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本發(fā)明的多核苷酸序列還適用作通過聚合酶鏈反應(PCR)制備編碼rplK基因產(chǎn)物或產(chǎn)生核糖體蛋白L11的基因的DNA的引物。
作為探針或引物的這種寡核苷酸包括至少30個，優(yōu)選至少20個，特別優(yōu)選至少15個連續(xù)堿基。具有至少40個或50個堿基對的寡核苷酸也是合適的。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應理解為含有經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽。特別是具有rplK基因產(chǎn)物生物學活性的多肽，以及與SEQ ID NO:2的多肽至少70％相同的多肽，優(yōu)選地與SEQ ID NO:2的多肽至少80％，特別是至少90％-95％相同并具有所述活性的多肽。
本發(fā)明另外還提供了用尤其已生產(chǎn)氨基酸的棒狀細菌生產(chǎn)氨基酸尤其L-賴氨酸的發(fā)酵方法，在該棒狀細菌中編碼rplK基因的核苷酸序列是弱化的。
文中術語“弱化”是指微生物中由相應DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或功能的降低或關閉，例如通過用弱啟動子或編碼低活性相應酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)氨基酸，尤其賴氨酸。所述微生物可以是棒狀細菌的代表菌，尤其是棒狀菌屬，在棒狀菌屬中尤其應提及的谷氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
本發(fā)明通過參考附圖將進一步得以闡述，附圖只是舉例說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。
圖1是質(zhì)粒pΔrplK圖。
所用縮寫及符號有如下含義pdeltarplK:pΔrplKsacB基因編碼果聚糖酶的枯草芽胞桿菌的sacB基因。
lacZ-α:β-半乳糖苷酶基因的5’端部分oriV復制源點KmR卡那霉素抗性RP4mob質(zhì)粒RP4的mob區(qū)BamHⅠ限制酶BamHⅠ的酶切位點EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ的酶切位點ΔrplK在N末端區(qū)缺失12bp的rplK等位基因序列數(shù)據(jù)簡述SEQ ID NO:1是編碼rplK基因的新核苷酸序列SEQ ID NO:2是rplK基因產(chǎn)物(L11蛋白)的氨基酸序列SEQ ID NO:3是rplK基因的等位基因SEQ ID NO:4是由ΔrplK等位基因編碼的L11蛋白的變異體SEQ ID NO:5是基于SEQ ID NO:1衍生的P1正向引物SEQ ID NO:6是基于SEQ ID NO:1衍生的P2反向引物SEQ ID NO:7是基于SEQ ID NO:1衍生的P1反向引物SEQ ID NO:8是基于SEQ ID NO:1衍生的P2正向引物以下已知野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC17965黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變體或菌株，如L-賴氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464谷氨酸棒桿菌DSM5715谷氨酸棒桿菌DSM12866，和谷氨酸棒桿菌DM58-1是棒桿菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌菌株的適當實例。
本發(fā)明人已成功地分離谷氨酸棒桿菌的新rplK基因。
為分離谷氨酸棒桿菌的rplK基因或其它基因，首先在大腸桿菌中建立這一微生物的基因文庫?？筛鶕?jù)通常已知的教材和手冊建立基因文庫。例如由Winnacker所著教材基因與克隆，基因工程入門(Verlag Chamie,Weinheim，德國，1990)，或Sambrook等所著手冊分子克隆實驗手冊(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。-非常熟知的基因文庫是由Kohara等(細胞50,495-508(1987))在λ載體中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文庫。Bathe等(分子及普通遺傳學，252:255-265,1996)闡述了借助于粘粒載體SuperCosⅠ(Wahl等，1987，美國科學院院刊84,2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。Bormann等(分子微生物學6(3),317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。
為在大腸桿菌中制備谷氨酸棒桿菌的基因文庫，也可使用質(zhì)粒如pBR322(Bolivar，生命科學25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因19:259～268)。合適的宿主尤其是限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，一個例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美國科學院院報87(1990)4645～4649)所述。
借助于粘粒克隆的長DNA片段隨后可亞克隆在適于測序的通用載體中。
DNA測序方法如Sanger等(美國科學院院報74:5463-5467，1977))所述。
以此方式可獲得編碼rplK基因的谷氨酸棒桿菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1，是本發(fā)明的一部分。另外，用前述方法從此DNA序列中也已衍生出相應蛋白質(zhì)的氨基酸序列。所得rplK基因產(chǎn)物或L-11蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。
通過遺傳密碼的簡并性產(chǎn)生自SEQ ID NO:1的編碼DNA序列也是本發(fā)明的一部分。同樣，與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分雜交的DNA序列也是本發(fā)明的一部分。以相應方式產(chǎn)生自SEQ ID NO:1的氨基酸序列也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在rplK基因弱化后，棒狀細菌以改良方式生產(chǎn)L-氨基酸，尤其L-賴氨酸。
為獲得弱化，可降低rplK基因的表達或優(yōu)選地降低蛋白質(zhì)功能?？扇芜x地組合這兩種方法。
降低基因表達可通過適當培養(yǎng)或通過遺傳改變(突變)基因表達的信號結(jié)構而進行?；虮磉_的信號結(jié)構例如是阻抑物基因，激活物基因，操縱子，啟動子，弱化子，核糖體結(jié)合位點，起始密碼子和終止子。技術人員例如從以下文獻中可發(fā)現(xiàn)對此的信息專利申請WO96/15246,Boyd和Murphy(細菌學雜志170:5949(1988))，Voskuil和Chambliss(核酸研究26:3548(1998)),Jensen和Hammer(生物技術及生物工程58:191(1998)),Patek等(微生物學142:1297(1996))，以及熟知的遺傳學及微生物學教材如Knippers所著《分子遺傳學》第6版，Georg Thieme Verlag,Stuttgart，德國，(1995)，或由Winnacker所著《基因與克隆》，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國(1990)。
本領域已知導致改變或降低蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的突變。例如可提及的是Qiu和Goodman(生物化學雜志272:8611-8617(1997))，Sugimoto等(生物科學生物技術及生物化學61:1760-1762(1997))，Mockel(“谷氨酸棒桿菌的蘇氨酸脫水酶消除別構調(diào)節(jié)及酶的結(jié)構”，由Julich研究中心報道，Jul-2906,ISSN09442952,Julich，德國，1994)所進行的研究工作。熟知的遺傳學及分子生物學教材如Hagemann(普通遺傳學，Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)對此也作了概括。
轉(zhuǎn)換，顛換，插入及缺失是突變的可能方式。所述錯義突變或無義突變是根據(jù)對氨基酸活性的影響而定。在基因中插入或缺失至少一個堿基對導致讀框移位(移碼突變)，因此摻入錯誤的氨基酸或翻譯過早中止。本領域已知產(chǎn)生這種突變的方法并可參見遺傳及分子生物學教材如Knippers所著《分子遺傳》第6版，Georg ThiemeVerlag,Stuttgart，德國，1995，及由Winnacker所著《基因與克隆》，VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim，德國，1990，或由Hagemann所著《普通遺傳學》，Gustav Fischer Verlag,Stuttagart,1986。借助于聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)生突變的方法見于C.R.Newton和A.Graham，PCR，第2版，Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,1997所述。
用其可進行rplK基因缺失誘變的質(zhì)粒例如是由圖1所示質(zhì)粒pΔrplK。
質(zhì)粒pΔrplK是由Jager等所述的質(zhì)粒pK18mobsacB(細菌學雜志，1992,174:54-65)組成，其中插入SEQ ID NO:3所示rplK基因的等位基因。稱為ΔrplK的該等位基因在基因的5’區(qū)缺失12bp。由ΔrplK等位基因編碼的L11蛋白變體由SEQ ID NO:4所示。所示L-11蛋白變體與野生型L-11蛋白不同之處在于在相當于SEQ ID NO:2的30-33位氨基酸的四肽脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸處的錯誤。
質(zhì)粒pΔrplK在同源重組后，導致染色體rplK基因與ΔrplK等位基因的置換。關于插入誘變的方法例如可參Schwarzer和Puhler(生物/技術9,84-87(1991))或Fitzpatrick等(應用微生物學與生物技術42,575-580(1994))。
另外，除弱化rplK基因之外，增強尤其過表達相關生物合成途徑的一或多種酶，對L-氨基酸尤其L-賴氨酸的生產(chǎn)可以是有益的。
因此，例如以下基因可被同時增強特別是過表達以生產(chǎn)L-賴氨酸·編碼二氫-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遺傳學224:317-324)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174,6076-6086),
·編碼賴氨酸輸出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學雜志254,395-403)，·zwal基因(DE19959328.0,DSM13115)。
除弱化rplK基因之外，同時弱化以下基因?qū)-氨基酸的生產(chǎn)也可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸磷酸激酶的pck基因(DE19950409.1,DSM13047)，·編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因(US09/396478,DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7,DSM13114)·zwa2基因(DE19959327.2,DSM13113)。
·編碼PPGPP合成酶Ⅰ(EC2.7.6.5)的rel A基因。
除過表達6-葡糖酸磷酸脫氫酶之外，排除非所需的二級反應對L-氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(編輯)，學術出版社，倫敦英國，1982)。
含有上述(a-d)特別是(d)的突變的多核苷酸的微生物也是本發(fā)明的一個方面，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)或非連續(xù)通過分批，補料分批法或重復補料發(fā)批法培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸尤其L-賴氨酸。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(生物方法技術學1，生物工程入門，Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(生物反應器及外周設備，Vieweg Verlag,Brannschweig/Wiesbaden,1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合各菌株的需要。關于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(華盛頓D.C..USA,1981)?？墒褂玫奶荚窗ㄌ羌疤妓衔?，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨或混合使用?？墒褂玫牡窗ê挠袡C化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿?，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。引外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當補加。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至所需產(chǎn)物形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍內(nèi)達到。
L-氨基酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)過如Spackman等(分析化學30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用進行，或如Lindroth等(分析化學(1979)51:1167-1174)所述反相HPLC進行。
以下微生物根據(jù)布達佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)大腸桿菌菌株DH5α/pΔrplK，保藏號DSM13158。
實施例1制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘粒文庫如Tauch等(1995，質(zhì)粒33:168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AⅠ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Jolla,USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等，(1987)美國科學院院報84:2160-2164)的DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaⅠ，編碼27-0948-02)酶切，并也用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的內(nèi)切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHⅠ，編碼27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC13032DNA混合，并用T4DNA連接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用GigapackⅡXL包裝提取物(Stratagene,La Jolla,USA，產(chǎn)品描述GigapackⅡXL包裝物提取物，編碼200217)包裝進噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，將細菌置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox.1955，病毒學，1:190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。
實施例2rplK基因的分離與測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106,Qiagen,Hilden，德國)根據(jù)廠商指導分離單個菌落的粘粒DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau 3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau 3AⅠ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche分子生物化學品公司，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。經(jīng)凝膠電泳分離后，用QiaExⅡ凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021,Qiagen,Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。將得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZer0-1的DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHⅠ，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biobech,Freiburg,德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物學通信，123:343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美國科學院院報87:4645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB瓊脂(Lennox,1955，病毒學，1:190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200,Qiagen,Hilden，德國)進行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美國科學院院報74:5463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應用生物系統(tǒng)公司的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”(產(chǎn)品號403044,Weiterstadt，德國)，在帶有購自PE應用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(29:1)(產(chǎn)品號A124.1,Roth,Karlsruhe，德國)中，進行凝膠電泳分離和序列分析。
所得原始數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)進行計算機輔助編碼區(qū)分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)對“國家生物技術信息中心”(NCBI，Bethesda,MD,USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行進一步分析。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，對該核苷酸序列的分析顯示438堿基對的開放讀框，其被稱為rplK基因。rplK基因編碼145個氨基酸的多肽，如SEQ ID NO:2所示。
實施例3制備具有rplK基因拷貝的載體利用PCR克隆含有谷氨酸棒桿菌rplK基因的染色體1200bp的DNA片段。
此染色體DNA如Tauch等所述(1995，質(zhì)粒33:168-179)分離自谷氨酸棒桿菌ATCC13032。含有rplK基因的一個1200bp的DNA片段通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增。另外，以下引物是基于SEQ ID NO:1衍生的P1正向引物(SEQ ID NO:5)5’-AGG AGC AGG CTG TTG TCA CC-3’P2反向引物(SEQ ID NO:6)5’-GCG GAT AGC TAC TGC GAT GG-3’通過ARK科技公司(ARK科技有限公司系統(tǒng)，Darmstadt，德國)合成所示的寡核苷酸，并用Pfu-DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla,美國)和PTC100熱循環(huán)儀(MJ Research Inc.,Waltham，美國)進行PCR。
PCR進行35次循環(huán)，每次循環(huán)包括熱變性(94℃,90秒)，退火(58℃,90秒)和聚合酶反應(72℃,90秒)。所得1200bp的DNA片段然后通過Qiagen PCR純化自旋試劑盒(Qiagen,Hilden，德國)純化。
為將含有rplK基因的DNA擴增物克隆在能在谷氨酸棒桿菌中復制的質(zhì)粒中，制備Tauch等所述質(zhì)粒pECM2(FEMS微生物學通信23,343-347(1994))的缺失衍生物pECM3。為此質(zhì)粒pECM2用限制酶BamHⅠ(Amersham-Pharmacia,Freiburg，德國)和BglⅡ(Amersham-Pharmacia,Freiburg，德國)消化，并用T4連接酶(Amersham-Pharmacia,Freiburg，德國)處理，如Sambrook等所述(分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室(1989))，這樣產(chǎn)生質(zhì)粒pECM3。用pECM3根據(jù)Tauch等所述(FEMS微生物學通信23,343-347(1994))轉(zhuǎn)化Grant等所述(Proceedings of National Academy ofScience USA87,4645-4649(1990))的大腸桿菌菌株DH5α MCR。在已加入氯霉素(Merck,Darmstadt，德國)(50mg/l)的LBG瓊脂(10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，2g葡萄糖，15g瓊脂/升)上選擇轉(zhuǎn)化體。
然后將含rplK基因的1200bp DNA擴增物與質(zhì)粒pECM3混合并用T4DNA連接酶(Amersham-Pharmacia,Freiburg，德國)處理而產(chǎn)生質(zhì)粒prplK，質(zhì)粒pECM3已預先用限制酶SmaⅠ(Amersham-Pharmacia,Freiburg，德國)線性化。用質(zhì)粒prplK如Tauch等所述(FEMS微生物學通信23,343-347(1994))轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5αMCR，并在已加入氯霉素(Merck,Darmstadt，德國)(50mg/l)的LBG瓊脂上轉(zhuǎn)擇轉(zhuǎn)化體。質(zhì)粒prplK因此攜帶谷氨酸棒桿菌的完整rplK基因，且能在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中自主復制。
實施例4在rplK基因中引入缺失通過PCR制備缺失12bp長并稱為ΔrplK的rplK基因的等位基因。rplK基因中缺失12bp導致谷氨酸棒桿菌L11蛋白N末端缺失四肽脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸。
作為產(chǎn)生rplK缺失等位基因的引物，除實施例3中所述的P1正向引物和P2反向引物之外，還使用以下通過ARK科技(ARK科技有限公司生物系統(tǒng)，Darmstadt，德國)制備的寡核苷酸P1反向引物(SEQ ID NO:7)5’-延伸-CGC CGT GAG C-5’-側(cè)-GCC AAC TGG AGGAGC AGG GT-3’P2正向引物(SEQ ID NO:8)5’-延伸-TCC AGT TGG C-5’-側(cè)-GCT CAC GGC GTCAAC ATC AG-3’。
用于PCR的引物衍生自己知DNA序列。每種引物均具有10bp的5’延伸，其精確地互補于P1正向引物和P2反向引物的5’側(cè)。染色體DNA提取自谷氨酸棒桿菌ATCC13032，首先使用該DNA在獨立的PCR反應中生產(chǎn)二個600bp的DNA片段，PCR使用寡核苷酸P1正向引物，P1反向引物，P2正向引物和P2反向引物，Pfu DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla，美國)和PTC100熱循環(huán)儀(MJ ResearchInc.,Waltham，美國)進行。每個PCR進行35次循環(huán)，每次循環(huán)包括熱變性(94℃,90秒)，退火(58℃,90秒)和聚合酶反應(72℃,90秒)。
第一個600bp DNA擴增物稱為rplK部分1，是使用寡核苷酸P1正向和P1反向引物獲得的。其含有rplK基因的5’區(qū)(1-87位核苷酸)，及衍生自寡核苷酸P1反向引物并相當于rplK基因(SEQ IDNO:1)的100-109位核苷酸的10bp延伸。因此此擴增的rplK基因區(qū)與使用的染色體DNA模板相對比有一個12bp的間隔。第二個600bp DNA片段稱為rplK部分2，是使用寡核苷酸P2反向和P2正向引物獲得的，其含有rplK基因的3’區(qū)(78-435位核苷酸)并在擴增在的rplK基因區(qū)中攜帶相同的間隔(88-99位核苷酸)。這二個600bp PCR產(chǎn)物rplK部分1和rplK部分2因此具有一個20bp的重疊DNA區(qū)。這兩個600bp的PCR產(chǎn)物rplK部分1和rplK部分2一起用于第一PCR反應作為DNA模板，其中由于重疊互補DNA區(qū)，rplK部分1的引導鏈可與rplK部分2的后隨鏈結(jié)合。此重疊DNA區(qū)的延伸或寡核苷酸引物P1正向和P2反向引物的加入可形成1200bp的PCR擴增物，其含有谷氨酸棒桿菌rplK基因的12bp缺失衍生物。每個PCR進行35次循環(huán)，每次循環(huán)包括熱變性(94℃,90秒)，退火(58℃,90℃)，及聚合酶反應(72℃,90秒)。
ΔrplK等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，由此等位基因編碼的L11蛋白的變體如SEQ ID NO:4所示。此L11蛋白變體缺失相當于SEQ ID NO:2所示野生型L11蛋白的30～33位氨基酸的四肽脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸。
實施例5ΔrplK等位基因插入染色體含有rplK基因中12bp缺失的ΔrplK等位基因，通過Schafer等所述的sacB系統(tǒng)(基因14,69-73(1994))經(jīng)整合誘變插入谷氨酸棒桿菌的染色體中。此系統(tǒng)能鑒別或選擇通過同源重組產(chǎn)生的等位基因置換。
1、構建置換載體pΔrplK實施例4中獲得的1200bp的rplK缺失等位基因ΔrplK用QiagenPCR純化自旋試劑盒(Qiagen,Hilder，德國)純化，并用于與Schafer等所述的可活動克隆載體pK18mobsacB(基因14,69-73(1994))連接。此載體預先用限制酶SmaⅠ(Amersham-Pharmacia,Freiburg，德國)線性化，與rplK缺失等位基因混合并用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia,Freiburg，德國)處理。
所得質(zhì)粒為p/ΔrplK。
如Tauch等所述(FEMS微生物學通信23,343-347(1994))，用質(zhì)粒pΔrplK轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在已加入50mg/l卡那霉素(Merck,Darmstadt，德國)的LBG瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。以此方式獲得菌株DH5α/pΔrplK。
選擇并鑒定的克隆為ATCC13032ΔrplK。
2、進行等位基因置換用Schafer等所述的sacB系統(tǒng)(基因14,69-73(1994))經(jīng)整合誘變獲得谷氨酸棒桿菌rplK基因的染色體12bp缺失體。此系統(tǒng)能鑒別或選擇通過同源重組產(chǎn)生的等位基因置換。
可活動的質(zhì)粒pΔrplK然后用Schafer所述接合法(細菌學雜志172,1663-1666(1990))插入受體谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032中，如Simon等所述(生物/技術1,784-794(1993))的大腸桿菌菌株S17-1作為供體。由于質(zhì)粒pΔrplK不能在谷氨酸酸桿菌中復制，建立其只能通過在質(zhì)粒編碼的rplK缺失片段與相同染色體rplK基因區(qū)之間同源重組而整合入谷氨酸棒桿菌染色體中。在已加入25mg/l卡那霉素(Merck,Darmstadt，德國)和50mg/l萘啶酮酸(Merck,Darmstadt，德國)的LBG瓊脂上選擇轉(zhuǎn)接合物。
選擇借助于sacB系統(tǒng)質(zhì)粒pΔrplK的隨后切除可只用rplK的野生型等位基因進行。將實施例3中構建的含有完整rplK基因的質(zhì)粒prplK，通過Liebl所述方法(FEMS微生物學通信65,299-304(1989))經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)移至整合菌株中。在已加入25mg/l卡那霉素(Merck,Darmstadt，德國)和10mg/l氯霉素(Merck,Darmstadt，德國)的LBG瓊脂上選擇菌株。
將選擇的轉(zhuǎn)化菌落轉(zhuǎn)接種于100ml LGB液態(tài)培養(yǎng)基(在具有擋板的250ml Erlenmeyer燒瓶中)，并在30℃，以300rpm培養(yǎng)24h。然后將2×106個細胞/ml的此液體培養(yǎng)物施加于含有10％蔗糖(Merck,Darmstadt，德國)的LBG瓊脂上，并在30℃培養(yǎng)48h。在此培養(yǎng)基上能生長的谷氨酸棒桿菌細胞由于rplK缺失等位基因與天然rplK區(qū)之間的第二次重組已喪失整合的質(zhì)粒pΔrplK。此第二次重組導致重新形成天然染色體rplK基因排列或產(chǎn)生12bp N末端DNA片段缺失的谷氨酸棒桿菌pΔrplK突變體。自選擇的“有蔗糖抗性的”及攜帶潛在pΔrplK的谷氨酸棒桿菌細胞提取染色體DNA。用其作基質(zhì)，用rplK序列衍生寡核苷酸Pdel正向和Pdel反向2引物(ARK ScientificGmbH Biosystems,Darmstadt，德國)。用此引物，Pfu DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla,USA)和PTC100熱循環(huán)儀(MJ Research Inc.,Waltham,USA)和PTC100熱循環(huán)儀(MJ Research Inc.,Waltham.USA)進行PCR。PCR進行35次循環(huán)，每次循環(huán)包括熱變性(94℃，90秒)，退火(58℃，90秒)和聚合酶反應(72℃，90秒)。然后所得DNA擴增物用Qiagen PCR純化自旋試劑盒(Qiagen,Hilden，德國)純化。如上所述分析純化的DNA擴增物的核苷酸序列，示出43％情況中缺失12bp DNA區(qū)的DNA擴增物已產(chǎn)生。因此，在相關攜帶pΔrplK的轉(zhuǎn)接合物中，第二次重組導致rplK基因中形成成染色體12bp缺失體。
然后通過Schafer所述的質(zhì)粒清除法(細菌學雜志176,7309-7319(1994))，將質(zhì)粒prplK從選擇的具有缺失體的轉(zhuǎn)接合物中除去。所得菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032ΔrplK因此攜帶rplK基因中的染色體12bp缺失，其導致喪失L11蛋白的四肽脯氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸。
實施例6制備賴氨酸將實施例5中所得的谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032ΔrplK在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
為此，首先在33℃在瓊脂板(腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgⅢ(10g/Lbacto肽胨，10g/L酵母膏，2.5g/LNaCl,20g/L葡萄糖，pH7.4)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩預培養(yǎng)物24小時。此預培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/l
FeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
48小時后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH,Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結(jié)果示于表1。
表1
序列表<110>德古薩股份公司<120>編碼rplK基因的核苷酸序列及其使用方法<130>990178 BT<140><141><160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>835<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(201)..(635)<223>rplK-基因<400>1ttgcgtgtag ggtagacaat cgcgtgtttt ttaagcatgc tcaaaatcat tcatccccgg 60tggcccggtt acgtaaagat cagcaaagat gatcaactaa agcgatcatc tgaagttgta 120gcgggaccga gcatccggac ggttactagt ggggtttcat cgtcccagtt gtggccggta 180acaaggaagc aggtttaacg atg gct cct aag aag aag aag aag gtc act ggc 233Met Ala Pro Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Gly1 5 10ctc atc aag ctc cag atc cag gca gga cag gca aac cct gct cct cca 281Leu Ile Lys Leu Gln Ile Gln Ala Gly Gln Ala Asn Pro Ala Pro Pro15 20 25gtt ggc cca gca ctt ggt gct cac ggc gtc aac atc atg gaa ttc tgc 329Val Gly Pro Ala Leu Gly Ala His Gly Val Asn Ile Met Glu Phe Cys30 35 40aag gct tac aac gct gcg act gaa aac cag cgc ggc aac gtt gtt cct 377Lys Ala Tyr Asn Ala Ala Thr Glu Asn Gln Arg Gly Asn Val Val Pro45 50 55gtt gag atc acc gtt tac gaa gac cgt tca ttc gac ttc aag ctg aag 425Val Glu Ile Thr Val Tyr Glu Asp Arg Ser Phe Asp Phe Lys Leu Lys60 65 70 75act cct cca gct gca aag ctt ctt ctg aag gct gct ggc ctg cag aag 473Thr Pro Pro Ala Ala Lys Leu Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Gln Lys80 85 90ggc tcc ggc gtt cct cac acc cag aag gtc ggc aag gtt tcc atg gct 521Gly Ser Gly Val Pro His Thr Gln Lys Val Gly Lys Val Ser Met Ala95 100 105cag gtt cgt gag atc gct gag acc aag aag gaa gac ctg aac gct cgc 569Gln Val Arg Glu Ile Ala Glu Thr Lys Lys Glu Asp Leu Ash Ala Arg110 115 120gat atc gac gct gct gcg aag atc atc gct ggt acc gct cgt tcc atg 617Asp Ile Asp Ala Ala Ala Lys Ile Ile Ala Gly Thr Ala Arg Ser Met125 130 135ggc atc acc gtc gaa ggc taaaagcttt cacaccggtt agtggctcat 665Gly Ile Thr Val Glu Gly140 145tcaaaatgaa tggccaccaa ccaattttca ccaaagtttt atgtggcagg gccagctccg 725gcccgttaaa ccacagaatt ccatgaaagg gaatttctaa tgagcaagaa ctctaaggcg 785taccgcgagg ccgctgagaa gatcgacgct ggtcgcatct actccccact835<210>2<211>145<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>2Met Ala Pro Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Gly Leu Ile Lys Leu Gln1 5 10 15Ile Gln Ala Gly Gln Ala Asn Pro Ala Pro Pro Val Gly Pro Ala Leu20 25 30Gly Ala His Gly Val Asn Ile Met Glu Phe Cys Lys Ala Tyr Asn Ala35 40 45Ala Thr Glu Asn Gln Arg Gly Asn Val Val Pro Val Glu Ile Thr Val50 55 60Tyr Glu Asp Arg Set Phe Asp Phe Lys Leu Lys Thr Pro Pro Ala Ala65 70 75 80Lys Leu Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Gln Lys Gly Ser Gly Val Pro85 90 95His Thr Gln Lys Val Gly Lys Val Ser Met Ala Gln Val Arg Glu Ile100 105 110Ala Glu Thr Lys Lys Glu Asp Leu Asn Ala Arg Asp Ile Asp Ala Ala115 120 125Ala Lys Ile Ile Ala Gly Thr Ala Arg Set Met Gly Ile Thr Val Glu130 135 140Gly145<210>3<211>825<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(200)..(622)<223>delta rplK<400>3tgcgtgtagg gtagacaatc gcgtgttttt taagcatgct caaaatcatt catccccggt 60ggcccggtta cgtaaagatc agcaaagatg atcaactaaa gcgatcatct gaagttgtag 120cgggaccgag catccggacg gttactagtg gggtttcatc gtcccagttg tggccggtaa 180caaggaagca ggtttaacg atg gct cct aag aag aag aag aag gtc act ggc 232Met Ala Pro Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Gly1 5 10ctc atc aag ctc cag atc cag gca gga cag gca aac cct gct cct cca 280Leu Ile Lys Leu Gln Ile Gln Ala Gly Gln Ala Ash Pro Ala Pro Pro15 20 25gtt ggc gct cac ggc gtc aac atc atg gaa ttc tgc aag gct tac aac 328Val Gly Ala His Gly Val Asn Ile Met Glu Phe Cys Lys Ala Tyr Asn30 35 40gct gcg act gaa aac cag cgc ggc aac gtt gtt cct gtt gag atc acc 376Ala Ala Thr Glu Asn Gln Arg Gly Asn Val Val Pro Val Glu Ile Thr45 50 55gtt tac gaa gac cgt tca ttc gac ttc aag ctg aag act cct cca gct 424Val Tyr Glu Asp Arg Ser Phe Asp Phe Lys Leu Lys Thr Pro Pro Ala60 65 70 75gca aag ctt ctt ctg aag gct gct ggc ctg cag aag ggc tcc ggc gtt 472Ala Lys Leu Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Gln Lys Gly Ser Gly Val80 85 90cct cac acc cag aag gtc ggc aag gtt tcc atg gct cag gtt cgt gag 520Pro His Thr Gln Lys Val Gly Lys Val Ser Met Ala Gln Val Arg Glu95 100 105atc gct gag acc aag aag gaa gac ctg aac gct cgc gat atc gac gct 568Ile Ala Glu Thr Lys Lys Glu Asp Leu Asn Ala Arg Asp Ile Asp Ala110 115 120gct gcg aag atc atc gct ggt acc gct cgt tcc atg ggc atc acc gtc 616Ala Ala Lys Ile Ile Ala Gly Thr Ala Arg Ser Met Gly Ile Thr Val125 130 135gaa ggc taaaagcttt cacaccggtt agtggctcat tcaaaatgaa tggccaccaa 672Glu Gly140ccaattttca ccaaagtttt atgtggcagg gccagctccg gcccgttaaa ccacagaatt 732ccatgaaagg gaatttctaa tgagcaagaa ctctaaggcg taccgcgagg ccgctgagaa 792gatcgacgct ggtcgcatct actccccact cga 825<210>4<211>141<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400> 4Met Ala Pro Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Gly Leu Ile Lys Leu Gln1 5 10 15Ile Gln Ala Gly Gln Ala Asn Pro Ala Pro Pro Val Gly Ala His Gly20 25 30Val Asn Ile Met Glu Phe Cys Lys Ala Tyr Asn Ala Ala Thr Glu Asn35 40 45Gln Arg Gly Asn Val Val Pro Val Glu Ile Thr Val Tyr Glu Asp Arg50 55 60Ser Phe Asp Phe Lys Leu Lys Thr Pro Pro Ala Ala Lys Leu Leu Leu65 70 75 80Lys Ala Ala Gly Leu Gln Lys Gly Ser Gly Val Pro His Thr Gln Lys85 90 95Val Gly Lys Val Ser Met Ala Gln Val Arg Glu Ile Ala Glu Thr Lys100 105 110Lys Glu Asp Leu Asn Ala Arg Asp Ile Asp Ala Ala Ala Lys Ile Ile115 120 125Ala Gly Thr Ala Arg Ser Met Gly Ile Thr Val Glu Gly130 135 140<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物P1-up<220><223>人工序列的描述引物<400>aggagcaggc tgttgtcacc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>P2-down<220><223>人工序列的描述引物<400>6gcggatagct acgtcgatgg20<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>P1-down<220><223>人工序列的描述引物<400>7cgccgtgagc gccaactgga ggagcagggt 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>P2-up<220><223>人工序列的描述引物<400>8tccagttggc gctcacggcg tcaacatcag
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.權利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是能復制的優(yōu)選重組的DNA。
3.權利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.權利要求2的多核苷酸，包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
5.權利要求2的多核苷酸，含有編碼包含SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。
6.權利要求1的特別是d)的多核苷酸，含有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
7.權利要求1的特別是的d)的多核苷酸，含有編碼包含SEQID NO:4氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。
8.權利要求2的能復制的DNA，含有(ⅰ)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或(ⅲ)與互補于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列雜交的至少一個序列，和任選地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有義突變。
9.含有權利要求1的多核苷酸的載體，此載體以在大腸桿菌DH5α/ΔrplK中的形式保藏，保藏號DSM13158，所述多核苷酸含有SEQ ID NO:3的序列，所述載體如圖1所示。
10.作為宿主細胞的棒狀細菌，其rplK基因含有一缺失或插入。
11.一種制備L-氨基酸特別是L-賴氨酸的方法，包括a)發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的細菌，該細菌中至少rplK基因是弱化的，b)富集培養(yǎng)基或細菌細胞中的L-氨基酸，和c)分離L-氨基酸。
12.權利要求11的方法，其中該細菌中L-氨基酸生物合成途徑中的其它基因是增強的。
13.權利要求11的方法，其中該細菌中降低L-氨基酸形成的代謝途徑至少被部分關閉。
14.權利要求11的方法，其中該細菌中權利要求1特別是a)-d)的多核苷酸的表達是降低的。
15.權利要求11的方法，其中該細菌中由權利要求1特別是a)-d)的多核苷酸編碼的多肽(酶蛋白)的催化活性是降低的
16.權利要求11的方法，其中使用的細菌中，由圖1所示的保藏號為DSM13158的質(zhì)粒pΔrplK經(jīng)插入誘變產(chǎn)生弱化。
17.權利要求11的方法，其中發(fā)酵如下的細菌，該細菌中-或多個以下基因是過表達的17.1編碼二氫-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，17.2反饋抗性天冬氨酸激酶基因，17.3賦予S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性的DNA片段，17.4編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，17.5編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，17.6編碼賴氨酸輸出的lysE基因，17.7 zwal基因。
18.權利要求11的方法，其中發(fā)酵如下的細菌，該細菌中-或多個以下基因是弱化的18.1編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，18.2編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因，18.3編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，18.4 zwa2基因，或18.5編碼ppGpp合成酶Ⅰ的rela基因。
19.權利要求11的方法，其中所用細菌是谷氨酸棒桿菌的微生物。
20.權利要求1的多核苷酸序列作為引物以通過聚合酶鏈反應制備缺失相應于rplK基因功能的基因DNA的應用。
21.權利要求1的多核苷酸序列作為雜交探針的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自棒狀細菌的分離的多核苷酸，其含有選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQID NO∶2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQID NO∶2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。本發(fā)明還涉及經(jīng)弱化rplK基因發(fā)酵制備L－氨基酸的方法。
文檔編號C07K14/34GK1316516SQ0111245
公開日2001年10月10日 申請日期2001年4月4日 優(yōu)先權日2000年4月5日
發(fā)明者盧茨·韋邁爾, 安德烈亞斯·托奇, 阿爾弗雷德·普爾勒, 約恩·卡利諾夫斯基, 貝蒂娜·默克爾 申請人:德古薩股份公司