專利名稱：一種純化鲀毒素的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物產品提取技術領域，更具體涉及一種純化鲀毒素的方法。
鲀毒素(tetrodotoxin)，俗稱河鲀毒素是一種毒性很強的麻痹性神經毒素，最先發(fā)現于鲀形目(tetraodontiformes)魚類，故稱鲀毒素(tetrodotoxin)。后來在爬行類，如鯢(俗稱娃娃魚)；甲殼類，如蟹；以及微生物中的細菌與藻類中，均有發(fā)現。經檢索中國專利，CN1058717C，“脫水河豚毒素的提取方法”，該發(fā)明的步驟是(1)純化河豚毒素母液制備先將粗品河豚毒素加5-20％醋酸溶解，加無水乙醇1-10倍，離心除去不溶物，然后將上清液移到小燒杯、貯藏在密閉的容器中，并另放一杯乙醚，控制溫度5-35℃、12-72小時，最后將醇醚溶液經離心分離出河豚毒素母液，母液經濃縮，加氨水調節(jié)PH 7-10，收集其沉淀物；(2)高壓液相色譜分離提取脫水河豚毒素；將上述沉淀物，用1-30％磷酸溶解，用流動相組成含有0.1-10％甲醇的0.01-0.2M磷酸鹽緩沖液，調PH為5.7，流動相流速1-20ml/min，用示差檢測器進行檢測，分離過程按記錄儀上出峰圖，收集脫水豚毒餾份；(3)脫水河豚毒素餾份有脫鹽、回收選用填料為酸性陽離子交換樹脂和生物凝膠，洗脫劑用1-20％的醋酸，收集PH 4-7餾份，加氨水調節(jié)PH 7.5-10，可沉淀出脫水豚毒素，經反復脫鹽，可得到純品脫水河豚毒素結晶，設備昂貴，產量很低。還有一種制備(純化)鲀毒素的方法，均以日本人T.后藤等(1965)的方法為經典，(Tetrahedron，1965，Vol.212059-2088).然而，在實踐中發(fā)現，上述方法中有些步驟很難實施，而且步驟太多，每個步驟都有損失，總得率為50％，繁雜。一般技術工人難以操作，難于工廠化。
本發(fā)明的目的是提供了一種純化鲀毒素的方法，方法簡單，操作方便，所得純鲀毒素的純度符合藥用劑型的需要，又能生產色譜試劑。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施，一種純化鲀毒素的方法，其步驟是A、離子交換層析，使用弱酸性陽離子交換樹脂中適于工業(yè)規(guī)模生產用的型號裝柱，轉換成銨型或氫型，將pH調整為4.0-6.5，將經過澄清的鲀毒素粗提液上柱，先以純水或緩沖液或低于0.4N濃度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N濃度的乙酸一步或分步洗脫，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脫，收集這一部分含鲀毒素的洗脫液，減壓蒸發(fā)至干，然后重溶于少量0.01-0.15N乙酸中B、凝膠過濾層析，選用排阻分子量在1500-4000Da，且適于充填大柱的凝膠裝柱，將第一步驟所得鲀毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脫，收集含鲀毒素的洗脫液，得純鲀毒素的乙酸鹽溶液，或者再減壓蒸發(fā)至干，得純鲀毒素的乙酸鹽固體。
若須獲得極純粹的鲀毒素，可將第二步驟所得純鲀毒素等當量地溶于苦味酸中，使成為苦味酸鹽。冷卻后形成苦味酸鹽的沉淀，分離沉淀，然后在熱水中溶解，加NH4OH使pH上升至9，讓純毒素沉淀下來，過濾收集沉淀，再重新溶于少量稀乙酸溶液中。即獲得極純粹的毒素乙酸鹽溶液。
第二步驟所得的純鲀毒素的乙酸鹽固體，重溶于鹽酸溶液中，再減壓蒸發(fā)至干，即或得鲀毒素的鹽酸鹽固體。重溶于檸檬酸溶液中，再減壓蒸發(fā)至干，即或得鲀毒素的檸檬酸鹽固體。重溶于苦味酸溶液中，再減壓蒸發(fā)至干，即或得鲀毒素的苦味酸鹽固體。制備過程中，可根據藥用劑型的需要，依上述法轉換為所需要的鹽。鲀毒素在酸溶液中相當穩(wěn)定，如使用液體劑型，則不必干躁。
如果鲀毒素粗提液含有相當多的大分子干擾純化，可采用配置截留分子量500-5000Da的超濾膜的切向流超濾系統(tǒng)，過濾一次，作為預處理步驟。濾液即可用于第一步驟離子交換柱純化。
本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果經過澄清的鲀毒素粗提液，只要經過本發(fā)明的純化方法的第一、二兩個步驟的處理，即能成為純鲀毒素。用薄層層析法檢測，本方法所得到的純鲀毒素與西格瑪化學品公司(SIGMA Chemical Co.)的色譜純鲀毒素一樣，只產生一個帶，RF值完全相同，均為0.535。本發(fā)明方法簡單，操作方便，步驟少，得率高，尤其是凝膠過濾層析這工序幾乎沒有損失，得率在70-90％，易于工業(yè)化生產。
收集的鲀毒素分部經減壓蒸發(fā)至干，然后重溶于少量0.1N乙酸中。如有沉淀，離心除去。然后上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝膠過濾柱(100×2cm)。凝膠以0.1N乙酸漲發(fā)并平衡。上樣1.5mL(含鲀毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脫，洗脫速度為0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脫液，此分部為鲀毒素峰。減壓蒸發(fā)至干，重溶于少量0.1N鹽酸中。再減壓蒸發(fā)至干，即得到與西格瑪化學品公司(SIGMA Chemical Co.)的色譜純鲀毒素一樣的產品。
收集的鲀毒素分部經減壓蒸發(fā)至干，然后重溶于少量0.1N乙酸中。如有沉淀，離心除去。然后上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝膠過濾柱(100×2cm)，以0.1N乙酸漲發(fā)并平衡。上樣1.5mL(含鲀毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脫，洗脫速度為0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脫液，此分部為鲀毒素峰。減壓蒸發(fā)至干，重溶于少量0.1N鹽酸中。再減壓蒸發(fā)至干，即得到與西格瑪化學品公司(SIGMA Chemical Co.)的色譜純鲀毒素一樣的產品。
權利要求
1.一種純化鲀毒素的方法，其步驟是A、離子交換層析，使用弱酸性陽離子交換樹脂柱，轉換成銨型或氫型，將pH調整為4.0-6.5，將澄清的鲀毒素粗提液上柱，先以純水或緩沖液或低于0.4N濃度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N濃度的乙酸一步或分步洗脫，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脫，收集含鲀毒素的洗脫液，減壓蒸發(fā)至干，然后溶于0.01-0.15N乙酸中；B、凝膠過濾層析，選用排阻分子量在1500-4000Da，充填大柱的凝膠裝柱，將第一步所得鲀毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脫，收集含鲀毒素的洗脫液，得純鲀毒素的乙酸鹽溶液，減壓蒸發(fā)至干，得純鲀毒素的乙酸鹽固體。
2.如權利要求1所述的一種純化鲀毒素的方法，其特征在于將第二步驟所得純鲀毒素溶于苦味酸中，成為苦味酸鹽，冷卻后形成苦味酸鹽的沉淀，分離收集沉淀，然后在熱水中溶解后加NH4OH使pH上升至9，讓純毒素沉淀下來，過濾收集沉淀，再溶于乙酸溶液中，獲得純粹的毒素乙酸鹽溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種純化鲀毒素的方法。首先是離子交換層析,使用弱酸性陽離子交換樹脂柱,轉換成銨型或氫型,將經過澄清的鲀毒素粗提液上柱,以0.1－2N濃度的乙酸一步或分步洗脫,或使用乙酸梯度洗脫,收集含鲀毒素的洗脫液,減壓蒸發(fā)至干,然后重溶于乙酸中;其次是凝膠過濾層析,將第一步所得液上柱,用乙酸洗脫,收集含鲀毒素的洗脫液,減壓蒸發(fā)至干,得純鲀毒素的乙酸鹽固體。將上述固體溶于所需鹽的相應酸中,蒸干后得所需鹽。溶于苦味酸中,制成苦味酸鹽,水溶后用NH
文檔編號C07D491/00GK1385432SQ0111420
公開日2002年12月18日 申請日期2001年5月15日 優(yōu)先權日2001年5月15日
發(fā)明者金傳蔭, 劉永定, 宋立榮, 朱家明 申請人:中國科學院水生生物研究所