專利名稱：呋喃丹半抗原、抗原和抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜環(huán)化合物及其制備方法，尤其涉及一種呋喃丹半抗原、抗原和抗體及其制備方法。
農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物傳統(tǒng)的殘留分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)，液相色譜(HPLC)或質(zhì)譜等物化分析手段，但由于農(nóng)藥使用規(guī)模不斷擴(kuò)大，農(nóng)藥殘留造成環(huán)境影響和對人類健康的慢性和長期效應(yīng)日益受到人們關(guān)注和擔(dān)憂，對農(nóng)藥殘留的限制也因此越來越嚴(yán)格，對分析測定對象、種類、數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸方面都提出了新的要求和更高的標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的理化分析方法通常繁瑣復(fù)雜，樣品前處理過程復(fù)雜、工作量大、儀器昂貴、要求有熟練的技術(shù)人員及較長的分析周期。因此人們迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及價廉的檢測技術(shù)能在野外和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行大批量的篩選試驗(yàn)。免疫分析法正具備這些優(yōu)點(diǎn)，所以盡管免疫分析應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析的時間很短，但已很快用于環(huán)境樣品和食品中農(nóng)藥殘留的分析。
1958年Berson S.A和Yallow創(chuàng)立了放射免疫分析法(RIA)，并首先在生物醫(yī)學(xué)和臨床藥物定量測定得到廣泛應(yīng)用。由于農(nóng)藥殘留分析對象的復(fù)雜性，直到八十年代免疫分析才被逐漸應(yīng)用于這一領(lǐng)域，免疫分析技術(shù)可達(dá)到傳統(tǒng)理化分析技術(shù)無法達(dá)到的選擇性和靈敏度，并且，快速、簡便，適于檢測生物大分子，也可以檢測復(fù)雜樣本中小分子如農(nóng)藥等痕量組分。
第一個農(nóng)藥免疫分析的報(bào)道是1967年Centen等人制備的農(nóng)藥馬拉硫磷的抗血清，通過抗原抗體沉淀反應(yīng)，證明了抗血清與馬拉硫磷的可反應(yīng)性。從1967年到70年代末的10余年間，由于技術(shù)上的局限，盡管已開發(fā)出了幾個農(nóng)藥的免疫分析方法，但仍未受到普遍重視，發(fā)展相當(dāng)緩慢。進(jìn)入80年代以來，由于人們對分析方法的選擇性和靈敏度的要求越來越高，同時對分析對象的種類和環(huán)境樣品的數(shù)量要求也在不斷增加，具有高度特異性、靈敏性、快速性的免疫檢測技術(shù)在農(nóng)藥分析領(lǐng)域得到了較快的發(fā)展。進(jìn)入90年代以來，農(nóng)藥的免疫檢測技術(shù)發(fā)展迅速，到目前為止，已有60多種農(nóng)藥開發(fā)了免疫檢測技術(shù)，其中除草劑和殺蟲劑較多，殺菌劑較少。國內(nèi)這方面的研究也漸漸起步，已有關(guān)于對硫磷、三唑酮、禾大壯、甲胺磷、莠去津均三氮苯類等農(nóng)藥的半抗原合成的報(bào)道。
呋喃丹(Carbofuran，2，3，-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)自1969年由FMC公司和Mobay化學(xué)公司開發(fā)生產(chǎn)后即作為一種高效、廣譜的殺蟲、殺線蟲劑，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于糧食、蔬菜、水果及經(jīng)濟(jì)作物等害蟲的防治。但是由于呋喃丹的毒性大，在酸性土壤中不易降解，極易污染土壤和地下水源。近年來，由于呋喃丹造成的環(huán)境生物毒害，屢見不鮮。尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，形成農(nóng)藥殘留，對人體健康造成極大的危害，這已引起人們的關(guān)注。因此開發(fā)一種簡單、快速，適于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
檢測呋喃丹殘留量常規(guī)方法有氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。由于呋喃丹在通常氣相色譜條件下易分解成酚類，用GC分析易產(chǎn)生較大誤差，當(dāng)然這個問題可通過改變操作條件或?qū)⑥r(nóng)藥衍生化來解決。目前指定的檢測N-甲基氨基甲酸酯類農(nóng)藥的較靈敏的方法是用帶熒光檢測器的HPLC柱后衍生化法。然而這些方法的靈敏度受樣品的凈化，濃縮，衍生化等步驟的影響很大；再者這些方法需要大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所不具備的復(fù)雜的儀器，且過程繁瑣，不適合大批量樣品的檢測與分析。免疫分析為呋喃丹殘留研究提供了一個新的分析檢測途徑。
本發(fā)明的目的是提供一種特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度高，精確度好、操作方法簡單快速的呋喃丹半抗原、抗原和抗體及其制備方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取下列措施呋喃丹半抗原的分子結(jié)構(gòu)為 n為從1至20的任意自然數(shù)呋喃丹抗原的分子結(jié)構(gòu)為 呋喃丹抗體是能與呋喃丹發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白。
一種呋喃丹半抗原的制備方法的步驟為1)呋喃酚1份溶解在1～4份甲苯中，通入光氣1～2份，加氫氧化鈉至溶液呈堿性，反應(yīng)溫度為-10～10℃，反應(yīng)得到一混合物；2)將上述混合物進(jìn)行液-液分配，然后經(jīng)減壓濃縮得呋喃酚和產(chǎn)物的油狀混合物，此油狀混合物待冷卻后析出一無色結(jié)晶，即為2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)將1份2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯與1～2份氨基丁酸或氨基己酸在堿性二噁烷溶液中反應(yīng)可得4-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸(BFNB)或6-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸(BFNH)。
另一種呋喃丹半抗原的制備方法的步驟為1)呋喃酚1份溶解在4～9份甲苯中，恒量通入光氣，加入催化劑，反應(yīng)溫度為80～150℃，反應(yīng)得到一混合物；2)將上述混合物進(jìn)行液-液分配，然后經(jīng)減壓濃縮得呋喃酚和產(chǎn)物的油狀混合物，此油狀混合物待冷卻后析出一無色結(jié)晶，即為2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)將1份2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯與1～2份氨基丁酸或氨基己酸在堿性二噁烷溶液中反應(yīng)可得4-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基](BFNB)或丁酸6-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸(BFNH)。
在呋喃丹殘留檢測技術(shù)上采用本發(fā)明能使農(nóng)藥殘留分析在方法上獲得更大的生命力。將半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備成免疫原后免疫動物，可得到呋喃丹特異性抗體，利用抗原抗體免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)或同位素標(biāo)記可建立的酶聯(lián)免疫分析法和放射免疫分析法。在檢測樣品中呋喃丹殘留時具有很高的特異性和靈敏度，最低檢測限可達(dá)到0.005ppm，準(zhǔn)確度高，回收率可達(dá)96.12％，精確度好，批內(nèi)變異系數(shù)CV％＝7.32％，批間系數(shù)CV％＝10.90％，同時操作方法簡單快速，不需要復(fù)雜的前處理過程，一次可同時檢測大批樣品、成本低廉，對操作人員的要求低，通過簡單的培訓(xùn)即可進(jìn)行操作。這項(xiàng)技術(shù)對快速分析缺乏檢測活性或樣本基質(zhì)過于復(fù)雜，因而用普通理化方法難以分析的農(nóng)藥殘留，具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用價值。因此，可快速準(zhǔn)確地分析檢測呋喃丹在樣本中的殘留量，便于進(jìn)行大量樣品的檢測和現(xiàn)場樣品分析。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
實(shí)施例1呋喃丹半抗原(n＝3)的冷法制備方法的步驟為
1)在120ml甲苯中，通入光氣75克，然后加入呋喃酚63克進(jìn)行反應(yīng)，同時緩慢加入氫氧化鈉至溶液呈微堿性，停止反應(yīng)，得到一混合物，反應(yīng)溫度為-8℃；2)將上述混合物進(jìn)行液液分配，去除光氣，然后減壓濃縮得呋喃酚和產(chǎn)物的油狀混合物，此油狀混合物待冷卻后析出一無色結(jié)晶，這種物質(zhì)為2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)將5克2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯與8克氨基丁酸在含有氫氧化鈉的二噁烷溶液中反應(yīng)可得4-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸，1H HMR(acetone-ds)δ1.43(s，6H，CH3)，1.86(m，2H，CH2)，2.42(t，2H，CH2COOH)，3.05(s，2H，CH2)，3.26(q，2H，CH2-NH)，6.72-6.99(m，3H，aromatic)。
2)4周后用生理鹽水將抗原稀釋到所需濃度，再與等體積的弗式不完全佐劑與其完全乳化，用皮下多點(diǎn)注射法進(jìn)行加強(qiáng)免疫免疫。
3)2周后生理鹽水將抗原稀釋到所需濃度，再與等體積的弗式不完全佐劑與其完全乳化，用皮下多點(diǎn)注射法進(jìn)行再次加強(qiáng)免疫免疫，并在免疫后第8天測抗體效價。
4)此后每隔2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，一直到抗體的效價達(dá)到要求為止，兔頸動脈采全血，分離血清，純化后即得抗體。
權(quán)利要求
1.一種呋喃丹半抗原，其特征在于分子結(jié)構(gòu)為 n為從1至20的任意自然數(shù)
2.一種呋喃丹抗原，其特征在于分子結(jié)構(gòu)為
3.一種呋喃丹抗體，其特征在于它是能與呋喃丹發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白。
4.一種呋喃丹半抗原的制備方法，其特征在于它的步驟為1)呋喃酚1份溶解在1～4份甲苯中，通入光氣1～2份，加氫氧化鈉至溶液呈堿性，反應(yīng)溫度為-10～10℃，反應(yīng)得到一混合物；2)將上述混合物進(jìn)行液-液分配，然后經(jīng)減壓濃縮得呋喃酚和產(chǎn)物的油狀混合物，此油狀混合物待冷卻后析出一無色結(jié)晶，即為2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)將1份2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯與1～2份氨基丁酸或氨基己酸在堿性二噁烷溶液中反應(yīng)可得4-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸或6-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸。
5.一種呋喃丹半抗原的制備方法，其特征在于它的步驟為1)呋喃酚1份溶解在4～9份甲苯中，恒量通入光氣，加入催化劑，反應(yīng)溫度為80～150℃，反應(yīng)得到一混合物；2)將上述混合物進(jìn)行液-液分配，然后經(jīng)減壓濃縮得呋喃酚和產(chǎn)物的油狀混合物，此油狀混合物待冷卻后析出一無色結(jié)晶，即為2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)將1份2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯與1～2份氨基丁酸或氨基己酸在堿性二噁烷溶液中反應(yīng)可得4-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]或丁酸6-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種呋喃丹半抗原。它的分子結(jié)構(gòu)如式:n為從1至20的任意自然數(shù)。方法為呋喃酚溶解在甲苯中,通入光氣,反應(yīng)得到中間體,將中間體與氨基丁酸或氨基己酸在堿性二噁烷溶液中反應(yīng)可得半抗原BFNB或BFNH,將半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)得免疫原,免疫原免疫動物后可制得能與呋喃丹特異性反應(yīng)的抗體。本發(fā)明具有特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度高,精確度好、操作簡單快速等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07D307/86GK1384103SQ01117639
公開日2002年12月11日 申請日期2001年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月30日
發(fā)明者朱國念, 吳銀良, 程敬麗, 胡秀卿, 楊挺 申請人:浙江大學(xué)