專利名稱：人重組軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的純化與應(yīng)用的制作方法
透明軟骨是一種特殊的結(jié)締組織，其在關(guān)節(jié)分散負(fù)荷中起重要作用。其提供了光滑，低摩擦力的滑動表面，對壓力和沖擊力有緩沖和抵抗作用。它由包埋在由細(xì)胞自身產(chǎn)生，合成及供養(yǎng)的胞外基質(zhì)中的終末分化的軟骨細(xì)胞組成。軟骨的胞外基質(zhì)由三類分子組成。第一類是高度交聯(lián)的三螺旋II型膠原纖維，其與其它軟骨特異的膠原包括XI型和IX型膠原相互作用。第二類包括豐富的大聚集的聚集蛋白聚糖以及一些小蛋白聚糖如雙鏈蛋白聚糖和核心蛋白聚糖。這些蛋白聚糖含有硫酸軟骨素作為它們的糖胺聚糖側(cè)鏈。第三類蛋白質(zhì)是非膠原蛋白，包括軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP；有時(shí)也稱為鈣結(jié)合糖蛋白-5)和連接蛋白。軟骨胞外基質(zhì)的合適組成和排列對基質(zhì)中保留適當(dāng)水分和電解質(zhì)，從而賦予其機(jī)械性能是非常重要的。表面上軟骨是穩(wěn)定的并能耐受巨大的物理應(yīng)力，但軟骨可被各種機(jī)械性，化學(xué)性和微生物因子破壞，通常導(dǎo)致疼痛，腫脹，活動喪失，及最后導(dǎo)致傷殘性關(guān)節(jié)炎。軟骨的最大限制是其不能愈合。這種固有的不能修復(fù)性是由于其沒有血管，軟骨細(xì)胞的固定性，及成熟軟骨細(xì)胞對增殖和改變其合成模式的限制性所致。已經(jīng)使用的各種刺激軟骨修復(fù)的方法取得不同程度的成功。治療骨關(guān)節(jié)炎的主要外科方法包括組織移植，軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞移植，及移植人工基質(zhì)包括膠原凝膠，碳纖維墊，和多孔聚乳酸和其它可生物降解的合成基質(zhì)。由于可用于移植的軟骨組織的來源有限，治療努力主要集中于移植細(xì)胞和基質(zhì)，以產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)及生物化學(xué)和機(jī)械性能上類似于關(guān)節(jié)軟骨的再生組織。然而，盡管許多研究實(shí)驗(yàn)室和公司作了大量努力，這些方法的成果通常是混雜的，且不是非常令人滿意的。需要研究出一種更有效的軟骨修復(fù)的方法。
重組人軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)在哺乳動物系統(tǒng)中已經(jīng)產(chǎn)生并純化。此純化的人COMP比先前報(bào)道的純化的COMP有更多的優(yōu)點(diǎn)。人COMP以鈣充滿(calcium replete)構(gòu)象純化，其維持了3型鈣結(jié)合重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)與功能，并從而維持蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)與功能。人COMP是一種糖胺聚糖(GAG)結(jié)合蛋白。它與GAG如肝素和硫酸軟骨素結(jié)合。硫酸軟骨素是軟骨中發(fā)現(xiàn)的蛋白聚糖的主要成分。肝素結(jié)合性還提供了一種從條件培養(yǎng)基中純化人COMP的非常便利的方式。這與先前在存在EDTA情況下純化的COMP不能與肝素結(jié)合的報(bào)道相反。人COMP被證實(shí)在鈣充滿的形式下具有與GAG更好的親和力。COMP被證實(shí)毫無疑問是軟骨細(xì)胞的粘著蛋白，無論軟骨細(xì)胞是分化的還是未分化的。數(shù)據(jù)還表明COMP需要在鈣充滿形式下使其細(xì)胞粘著活性最大。COMP還示出作為能動因子促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移。COMP的這些性質(zhì)，與其結(jié)合膠原，及分化調(diào)節(jié)試劑視黃酸和維生素D3及其代謝物的能力，使COMP成為用于軟骨修復(fù)研究中的非常好的引誘劑。COMP可用于軟骨修復(fù)中軟骨細(xì)胞移植和人工基質(zhì)移植，依靠的是COMP能作為細(xì)胞的化學(xué)引誘物和粘著底物，并作為輸送視黃酸和維生素D3及其代謝物的試劑，促進(jìn)和維持軟骨細(xì)胞分化及正確軟骨基質(zhì)的產(chǎn)生。
本發(fā)明包括純化的CMOP，如人COMP(hCOMP)，包括通過在存在鈣的情況下表達(dá)和/或純化hCOMP而制備的hCOMP，本發(fā)明還包括在存在鈣的情況下純化COMP(如hCOMP)的方法。COMP可在鈣充滿的環(huán)境中純化，例如鈣以毫摩爾范圍(水平)存在，如至少300μM(0.3毫摩爾)。在一實(shí)施方案中，將hCOMP導(dǎo)入例如能表達(dá)及分泌hCOMP的細(xì)胞中，培養(yǎng)細(xì)胞，如在適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)；并在存在鈣的情況下純化hCOMP。hCOMP克隆可通過用編碼全長hCOMP的DNA(“hCOMP DNA)(Newton等，1994)轉(zhuǎn)染合適細(xì)胞而產(chǎn)生。hCOMP可在鈣充滿條件下例如毫摩爾水平(即在毫摩爾范圍)下純化。細(xì)胞可在鈣充滿培養(yǎng)基中培養(yǎng)。hCOMP可在特征在于鈣濃度至少為300μM的環(huán)境(如溶液)中表達(dá)和/或純化。能表達(dá)COMP的細(xì)胞包括某些成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，肌腱，韌帶，平滑肌細(xì)胞，周細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞，或用編碼COMP的DNA轉(zhuǎn)染的其它細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的hCOMP當(dāng)被胰蛋白酶酶解時(shí)，消化為50kDa或55kDa的條帶。在另一實(shí)施方案中，純化的hCOMP可被胰蛋白酶消化為62kDa或67kDa的條帶。
本發(fā)明也包括COMP(例如人COMP，如由本發(fā)明方法純化的hCOMP)的片段，突變體和其它衍生物和類似物，以及生產(chǎn)和使用這種片段，突變體和其它衍生物和類似物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種衍生物包括COMP的，尤其鈣充滿構(gòu)象中的COMP的結(jié)合位點(diǎn)(如鈣結(jié)合位點(diǎn))。本發(fā)明還涉及包括COMP和/或COMP衍生物的組合物。
本發(fā)明也包括在存在鈣的情況下純化的hCOMP的抗體，例如本發(fā)明方法純化的hCOMP的抗體。在一實(shí)施方案中，抗體是純化的hCOMP的抗體，制備該純化的hCOMP是通過將hCOMP克隆導(dǎo)入能表達(dá)和分泌hCOMP的細(xì)胞，在適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并在存在鈣的情況下純化hCOMP。在另一實(shí)施方案中，抗體是在鈣充滿環(huán)境下，例如鈣以毫摩爾范圍(水平)如至少300μM(或0.3毫摩爾)存在的情況下純化的hCOMP的抗體。此抗-COMP抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明還包括包含純化的hCOMP的ELISA的試劑盒，該純化的hCOMP的制備是通過將hCOMP克隆導(dǎo)入能表達(dá)和分泌hCOMP的細(xì)胞，在適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并在存在鈣的情況下純化hCOMP。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明包含這種hCOMP的抗體。
本發(fā)明還包括組合物(如植入體)，其包含含有COMP(如hCOMP的基質(zhì)。本發(fā)明的基質(zhì)可以是生物學(xué)或非生物學(xué)的。它們可以是人工的。它們可以包含處理的軟骨和骨基質(zhì)，膠原，透明質(zhì)酸，血纖蛋白凝膠，碳纖維，多孔聚乳酸，I型膠原凝膠和II型膠原凝膠。在一實(shí)施方案中，基質(zhì)包含I型或II型膠原凝膠?；|(zhì)可用細(xì)胞例如軟骨發(fā)生細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞種植(例如包埋)。一種分化劑(即分化因子)可與hCOMP結(jié)合。分化劑可以是例如維生素D3或至少一種維生素D3的代謝物(如1，25-二羥基維生素D3和24R，25-二羥基維生素D3)或視黃酸。植入體可包含至少一種蛋白聚糖，例如硫酸軟骨素。在一實(shí)施方案中，基質(zhì)包含純化的hCOMP，此純化的hCOMP是通過將hCOMP克隆導(dǎo)入細(xì)胞例如能表達(dá)和分泌hCOMP的細(xì)胞，在例如適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并在存在鈣的情況下純化hCOMP而生產(chǎn)的。此COMP可以是重組人COMP，例如由在鈣充滿環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞分泌的，并在存在鈣的情況下純化的人COMP。此COMP可以是在鈣充滿環(huán)境中純化的hCOMP。基質(zhì)也可包括生長因子。
本發(fā)明還包括例如在軟骨缺損區(qū)域修復(fù)(或產(chǎn)生)軟骨的方法，包括在缺損區(qū)域植入包含與分化劑相聯(lián)(如結(jié)合)的COMP的組合物。此缺損區(qū)域可以是需要軟骨修復(fù)的部位。分化劑可以是維生素D3或維生素D3代謝物(如1，25-二羥基維生素D3，和24R，25-二羥基維生素D3)或視黃酸。一或多種蛋白聚糖如硫酸軟骨素蛋白聚糖可在植入前加入組合物中。hCOMP可作為膠原和蛋白聚糖之間的橋梁。組合物可以是基質(zhì)。COMP可以是人COMP。COMP可以由在鈣充滿環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞分泌，并在存在鈣的情況下純化。在一實(shí)施方案中，COMP是純化的hCOMP，是通過將hCOMP克隆導(dǎo)入細(xì)胞例如能表達(dá)和分泌hCOMP的細(xì)胞，在適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并在存在鈣的情況下純化hCOMP而生產(chǎn)的。COMP可以是重組的。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)用于修復(fù)軟骨的植入體的方法，包括將分化劑與hCOMP結(jié)合，并向基質(zhì)中加入與hCOMP結(jié)合的分化劑。此hCOMP可介導(dǎo)分化劑的輸送(如輸送至細(xì)胞)和分化劑的釋放，并作為軟骨細(xì)胞的化學(xué)引誘劑(遷移因子)。一個(gè)實(shí)施方案還另外包括在基質(zhì)中添加(如種植)軟骨發(fā)生細(xì)胞。hCOMP介導(dǎo)分化劑輸送至細(xì)胞和分化劑的釋放，有助于維持和促進(jìn)軟骨發(fā)生細(xì)胞成熟與分化，從而產(chǎn)生天然發(fā)生的非創(chuàng)傷性軟骨基質(zhì)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括移植細(xì)胞(例如軟骨發(fā)生細(xì)胞如軟骨細(xì)胞如自身軟骨細(xì)胞)的方法，包括在存在hCOMP(其可以與分化劑結(jié)合)的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞可分離自動物如哺乳動物如人(例如病人)。hCOMP可介導(dǎo)擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞的附著，并輸送和釋放分化劑。細(xì)胞可以在用與分化劑結(jié)合的hCOMP包被的組織培養(yǎng)平板上培養(yǎng)。分化劑可以是維生素D3或維生素D3的代謝物或視黃酸。細(xì)胞例如軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞可與結(jié)合的分化劑一起在存在hCOMP時(shí)注射入缺損區(qū)域，從而有助于維持軟骨細(xì)胞分化并通過軟骨細(xì)胞刺激II型膠原和其它軟骨成分在缺損區(qū)域產(chǎn)生。細(xì)胞可以是在存在hCOMP(其可與分化劑結(jié)合)情況下培養(yǎng)的。hCOMP可以是通過本發(fā)明方法純化的。本發(fā)明還包括用這些方法生產(chǎn)自身移植的軟骨細(xì)胞，及通過這些方法生產(chǎn)軟骨細(xì)胞。
本發(fā)明還包括在移植(非自身或自身移植)中，介導(dǎo)細(xì)胞例如軟骨發(fā)生細(xì)胞(如軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞)附著的方法，包括將細(xì)胞在存在結(jié)合分化劑的COMP時(shí)注入缺損區(qū)，從而產(chǎn)生及有助于維持細(xì)胞分化階段，并刺激細(xì)胞在缺損區(qū)產(chǎn)生II型膠原和其它軟骨成分。
本發(fā)明還包括制備修復(fù)軟骨的組合物(如植入體)的方法，包括在存在鈣的情況(如鈣充滿環(huán)境)下培養(yǎng)及純化COMP，并將其加入基質(zhì)例如本發(fā)明所述基質(zhì)中。基質(zhì)可在植入前用細(xì)胞如軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞種植。COMP可表達(dá)自用COMP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并在適于加工和分泌COMP的條件下在鈣充滿環(huán)境中培養(yǎng)。軟骨發(fā)生細(xì)胞可在體外在存在所述COMP的情況下增殖，并且軟骨發(fā)生細(xì)胞可加入(如種植在)基質(zhì)中。這些細(xì)胞可與COMP一起種植于基質(zhì)中。
本發(fā)明還包括例如在樣品中檢測及定量COMP(如降解的COMP和未降解的COMP，包括片段)和COMP抗體的分析和方法。樣品可以是生物學(xué)樣品如血清或滑液。COMP可以是hCOMP，如由本發(fā)明方法生產(chǎn)或純化的hCOMP?？笴OMP抗體可以是本發(fā)明所述的抗體。樣品可以是連續(xù)稀釋的。COMP可以用標(biāo)記的試劑檢測如酶綴合的二級抗體。分析中結(jié)合的COMP或結(jié)合的抗COMP抗體或降解的COMP(如COMP的降解片段)可通過ELISA測定，如競爭性ELISA。
在一實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品可在適于抗COMP抗體與生物學(xué)樣品中hCOMP結(jié)合的條件下，與抗COMP抗體(如本發(fā)明所述的抗體)接觸，從而產(chǎn)生結(jié)合的hCOMP?？蓹z測結(jié)合的hCOMP，并將樣品中結(jié)合的hCOMP的量與形成標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)合的hCOMP的已知量相對比，從而測定樣品中hCOMP的量。在另一實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品中存在的hCOMP可通過在適于抗COMP抗體與生物學(xué)樣品中hCOMP結(jié)合的條件下，用抗COMP抗體保溫生物學(xué)樣品而測定。生物學(xué)樣品可加入已用本發(fā)明所述純化的hCOMP包被的平板中，沖洗之后，可檢測生物樣本中與平板結(jié)合的hCOMP，可將樣品中結(jié)合的hCOMP量與形成標(biāo)準(zhǔn)曲線的hCOMP的已知量相對比，從而測定hCOMP的量。另一實(shí)施方案包含一種檢測生物樣本中抗COMP抗體的分析，包括將純化的hCOMP包被在平板上，連續(xù)稀釋樣本，將連續(xù)稀釋液與hCOMP接觸，并用與hCOMP特異結(jié)合的標(biāo)記試劑檢測結(jié)合的抗hCOMP抗體的存在情況。哺乳動物(如人，例如病人)是否患有關(guān)節(jié)炎或其進(jìn)展(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎)可通過本發(fā)明方法檢測。降解的COMP可以相似方式，用識別COMP降解片段的抗體檢測。
本發(fā)明還包括檢測COMP降解的方法，包括用免疫印跡分析檢測COMP，例如用本發(fā)明所述的識別COMP降解形式(如降解的片段)的抗COMP抗體進(jìn)行免疫印跡分析?？笴OMP抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。由免疫印跡方法產(chǎn)生的條帶的常規(guī)強(qiáng)度可被掃描，且可以計(jì)算降解的條帶的百分率。COMP可以是例如由本發(fā)明所述方法純化的hCOMP。一種分子量標(biāo)準(zhǔn)可用于鑒別COMP的完整及降解形式。這些免疫印跡分析可用于檢測炎癥性關(guān)節(jié)疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎，其是通過將測定的降解的COMP的量與其它哺乳動物中COMP的量相對比而檢測的，其它哺乳動物例如是具有這種關(guān)節(jié)疾病或不具有這種關(guān)節(jié)疾病的。


圖1是純化的重組COMP的SDS-PAGE圖。由人胚胎腎293細(xì)胞表達(dá)的重組人COMP純化自條件培養(yǎng)基。純化的hCOMP在非還原(NR)或還原(R)條件下，在SDS中經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。用大小標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)記。TSP1是人血小板反應(yīng)蛋白1。MUT3是COMP的突變體形式。
圖2是人重組COMP的旋轉(zhuǎn)投影電子顯微鏡圖象。(A)為在含有CaCl2的Tris緩沖鹽水中的純化的COMP，(B)在噴涂前調(diào)整為5mM EDTA的COMP。Bar等于50nm。
圖3是在不同鈣濃度下，胰蛋白酶對COMP的限制性消化圖。分子大小標(biāo)準(zhǔn)物如所指示的。ND為未消化的蛋白質(zhì)。
圖4是在單層細(xì)胞中培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞系TCla與COMP或包含COMP的3型重復(fù)的融合蛋白的吸附圖。COMP(上欄)或3型重復(fù)融合蛋白(下欄)存在CaCl2(/C，三角形)或EDTA(/E，空心圓)或存在EDTA，并用DTT處理(/E/R，實(shí)心圓)處理。進(jìn)行吸附分析。結(jié)果為四次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5是在用藻酸鹽培養(yǎng)后的軟骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞系TCla與COMP的吸附圖。結(jié)果為四次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖6是軟骨細(xì)胞向COMP的遷移圖。COMP，TSP1或Vitrogen(Cohesion；PaloAlto，CA)包被在轉(zhuǎn)孔膜的下面。確定已遷移的軟骨細(xì)胞量，并在此以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。
軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)是一種五聚體胞外基質(zhì)蛋白，它主要位于軟骨細(xì)胞基質(zhì)中，且也發(fā)現(xiàn)于滑膜，肌腱和韌帶中(Hedbom等，1992；DiCesare等，1994；DiCesare等，1997；Hecht等，1998)。COMP是血小板反應(yīng)蛋白(TSP)家族的第5個(gè)成員。與其它TSP相對比，COMP是缺失NH2-末端肝素結(jié)合功能域的唯一成員，且已報(bào)道其不與肝素-瓊脂糖結(jié)合(DiCesare等，1994；Hauser等，1995)。與其它TSPs相類似，COMP具有一個(gè)負(fù)責(zé)多聚化和鏈內(nèi)二硫鍵的卷曲螺旋區(qū)，4個(gè)類EGF2型重復(fù)，7個(gè)由13個(gè)鈣結(jié)合環(huán)組成的高保守的3型重復(fù)，和一個(gè)COOH端球狀結(jié)構(gòu)域(Oldberg等，1992；Newton等，1994)。COMP突變導(dǎo)致人體骨骼發(fā)育異常，包括假性醛甾統(tǒng)發(fā)育不全(Pseudoachondroplasia)，和多發(fā)性骨后發(fā)育異常，F(xiàn)airbanks型。大多數(shù)突變位于3型重復(fù)中，有一些位于C-球狀區(qū)域中(Briggs等，1995；Hecht等，1995)。
大量相連續(xù)的鈣結(jié)合共有序列重復(fù)是TSPs所獨(dú)有的。富含天冬氨酸的序列類似于一類鈣結(jié)合蛋白包括鈣調(diào)蛋白，小白蛋白和血纖蛋白原的鈣結(jié)合位點(diǎn)中的序列(Lawler和Hynes，1986)。鈣結(jié)合共有序列DXDXDGXXDXXDX的變化在TSP亞單位內(nèi)發(fā)生13次，并已提示形成鈣結(jié)合環(huán)(Lawler和Hynes，1986；Sun等，1992；Misenheimer和Mosher，1995)。對TSP1的平衡透析，圓二色性和限制性胰蛋白酶消化的研究推測，每個(gè)TSP1亞單位以協(xié)同方式結(jié)合11-12個(gè)鈣離子。大部分鈣結(jié)合活性可歸因于3型重復(fù)。這些研究還推測當(dāng)TSP1與鈣結(jié)合時(shí)有一個(gè)構(gòu)象變化(Lawler和Simons，1983；Misenheimer和Mosher，1995)。3型重復(fù)在所有TSP分子中是高保守的。根據(jù)COMP中存在3型重復(fù)和對TSP1的研究，推定COMP與鈣結(jié)合并在有或無鈣的情況下呈現(xiàn)不同構(gòu)象。然而，在存在EDTA情況下最初純化的COMP不與鈣結(jié)合，并不能示出由于鈣的功能所致的明顯構(gòu)象差異(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。
如實(shí)施例1所示，全長人COMP序列被克隆，并且所得全長序列被克隆入哺乳動物表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染至人胚胎腎細(xì)胞中。分離并擴(kuò)增穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的集落。當(dāng)用全長人COMP cDNA轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞時(shí)，它們能加工和分泌hCOMP(圖1)。
另外，如實(shí)施例2所示，COMP是一種鈣結(jié)合蛋白。根據(jù)COMP中存在3型重復(fù)和對TSP1的研究，推定COMP與鈣結(jié)合。然而，最初在EDTA中純化的COMP不與鈣結(jié)合，并不能由于鈣功能而示出明顯的構(gòu)象差異(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。在此，直接鈣結(jié)合，旋轉(zhuǎn)投影電子顯微鏡(EM)及限制性胰蛋白酶消化用于顯示，COMP是一種鈣結(jié)合蛋白，并在不同鈣濃度下顯示不同構(gòu)象。
hCOMP的旋轉(zhuǎn)投影EM圖(圖2)示出重組hCOMP是五聚體。在存在鈣的情況下，hCOMP具有一緊湊外觀，使其難以分解5個(gè)亞單位。在存在EDTA的情況下，hCOMP采取伸展的構(gòu)象。這些結(jié)果推測，在飽合鈣的情況下純化的COMP，當(dāng)鈣與分子螯合時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化。這個(gè)觀測結(jié)果不同于以前發(fā)表的關(guān)于COMP在EDTA中純化的報(bào)道(Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。然而，在此觀測的構(gòu)象變化與先前關(guān)于TSP1，TSP3和TSP4的發(fā)現(xiàn)及在COMP上存在高度同源的3型鈣結(jié)合重復(fù)序列是一致的(Lawler等，1982；Qabar等，1995；Lawler等，1995；Oldberg等，1992；Newton等，1994)。
為進(jìn)一步示出hCOMP是鈣結(jié)合蛋白，在各種鈣濃度下進(jìn)行hCOMP的限制性胰蛋白酶消化。在低鈣濃度下，hCOMP易于被胰蛋白酶酶解為2個(gè)小片段，27kDa和36kDa(圖3)。當(dāng)鈣濃度升高時(shí)，hCOMP被消化為中度等大小條帶，50kDa和55kDa。當(dāng)鈣濃度更高時(shí)，開始出現(xiàn)62kDa和67kDa的條帶。67kDa的條帶在鈣濃度在毫摩爾范圍內(nèi)成為主要的條帶。這些結(jié)果表明hCOMP依賴于鈣濃度對胰蛋白酶消化有不同敏感性，且推測存在與3型鈣結(jié)合重復(fù)相關(guān)的構(gòu)象差異。
鈣與COMP的直接結(jié)合用45CaCl2通過平衡透析測定。簡而言之，將TSP1和COMP在Slide-A-Lyzer透析裝置(Pierce，Rockford，IL)中對含有0.3mM CaCl2和10μCi/ml45CaCl2的透析緩沖液透析。在透析結(jié)束時(shí)，取10μl蛋白質(zhì)樣本和透析緩沖液進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)和蛋白質(zhì)測定計(jì)算結(jié)合的鈣離子數(shù)。在0.3mM游離鈣濃度，每個(gè)TSP1亞單位結(jié)合10±2個(gè)鈣離子(4個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值±SD)。這與先前報(bào)道相一致，即據(jù)報(bào)道11-12個(gè)鈣離子與每個(gè)TSP1亞單位結(jié)合(Lawler和Simons，1983；Misenheimer和Mosher，1995)。在相同條件下，每個(gè)COMP亞單位結(jié)合11±1個(gè)鈣離子。這是首次示出COMP與鈣離子結(jié)合，且此結(jié)果與COMP及其它TSP家族成員中存在高度同源3型鈣結(jié)合重復(fù)序列相一致。
另外，如實(shí)施例3所示，COMP是一種糖胺聚糖(GAG)結(jié)合蛋白，其最大結(jié)合依賴于其鈣充滿構(gòu)象。為探查hCOMP除了缺失NH2端肝素結(jié)合功能域之外，是否是GAG結(jié)合蛋白，及3型鈣結(jié)合重復(fù)序列的構(gòu)象是否影響hCOMP的功能，在存在鈣或EDTA的情況下，測試hCOMP與軟骨中發(fā)現(xiàn)的常見GAGs的相互作用。
親和共電泳(ACE)用于確定hCOMP與肝素及其它GAGs包括軟骨中硫酸軟骨素的結(jié)合。這些分析結(jié)果示于表1。單位是nM，且在報(bào)道有標(biāo)準(zhǔn)偏差情況下，代表兩次測定結(jié)果的平均值。當(dāng)數(shù)據(jù)比給定值高時(shí)，表明在任何蛋白質(zhì)濃度均觀測不到結(jié)合。
表1hCOMP與糖胺聚糖的結(jié)合
COMP與低分子量的肝素結(jié)合。這與我們觀測的hCOMP與肝素-瓊脂糖凝膠結(jié)合相一致。盡管與肝素的結(jié)合可提示COMP中存在有功能的GAG-結(jié)合位點(diǎn)，但肝素是HS的高硫酸鹽形式，只在肥大細(xì)胞中產(chǎn)生，因而不能真正代表大多數(shù)組織中的GAG。為更好查明GAG和蛋白聚糖在COMP功能中的潛在作用，用ACE在存在鈣的情況下，測試硫酸肝素，硫酸角質(zhì)素和3種硫酸軟骨素(6-硫酸軟骨素，C6S；4-硫酸軟骨素，C4S；和硫酸皮膚素，DS)與hCOMP的結(jié)合(表1)。數(shù)據(jù)證明hCOMP與三種硫酸軟骨素的結(jié)合親和性較高，而與HS的結(jié)合較弱(1.2μM)。hCOMP不結(jié)合硫酸角質(zhì)素。
為進(jìn)一步確定鈣結(jié)合3型重復(fù)的構(gòu)象是否對GAG結(jié)合是至關(guān)重要的，在存在EDTA時(shí)測試hCOMP與肝素和C6S的結(jié)合。這些結(jié)果表明鈣的消耗降低hCOMP與GAGs的結(jié)合。而通過EDTA處理，肝素結(jié)合只降低3～5倍，C6S結(jié)合似乎被此處理破壞，因此推測構(gòu)象依賴于3型重復(fù)和/或C端結(jié)構(gòu)域中的CS結(jié)合位點(diǎn)。這表明COMP需要在其鈣充滿構(gòu)象中才可與具有硫酸軟骨素側(cè)鏈的軟骨細(xì)胞蛋白聚糖糖明顯結(jié)合。
另外，如實(shí)施例4所示，COMP是一種在鈣充滿形式中與人軟骨細(xì)胞具有最大粘著性的粘著蛋白。先前的研究已報(bào)道軟骨細(xì)胞根本不粘附COMP(Sommarin等，1989；Oldberg等，1992)，或者只在非常高的COMP濃度下才能觀測到明顯的附著(DiCesare等，1994)。COMP支持細(xì)胞附著的能力在短時(shí)附著分析中確定，以及確定3型構(gòu)象是否對其粘著性有影響。
用一種軟骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞系TCla測試COMP是否是一種粘著蛋白。在單層細(xì)胞和在藻酸鹽中培養(yǎng)系中均生長的細(xì)胞用于此分析。
就在單層細(xì)胞中生長的Tcla細(xì)胞而言，鈣充滿構(gòu)象中hCOMP支持細(xì)胞以劑量依賴方式附著(圖4)。在蛋白質(zhì)包被濃度為5μg/ml和更高時(shí)，細(xì)胞也在蛋白質(zhì)包被的孔上鋪展。在包被前用EDTA處理hCOMP，未觀測到對附著的明顯作用(圖4)。根據(jù)先前報(bào)道，TSP1和TSP2的還原有助于曝露RGD序列，該序列可能隱蔽在3型鈣結(jié)合重復(fù)中復(fù)雜的胞內(nèi)二硫鍵的內(nèi)部(Sun等，1992；Chen等，1994)。鑒于所有TSPs中的3型重復(fù)的高度同源及hCOMP中存在RGD序列，對hCOMP進(jìn)行測試。確實(shí)，在包被之后hCOMP的還原提高了其粘著性，尤其在低COMP包被濃度(圖4)。細(xì)胞附著并鋪展于以1μg/ml包被的二硫蘇糖醇處理的COMP上。為鑒別細(xì)胞附著于COMP上的區(qū)域，對在大腸桿菌中表達(dá)和純化的三種不同融合蛋白的粘著活性進(jìn)行測試。融合蛋白質(zhì)是通過從含有插入物的pGEX載體(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)表達(dá)而產(chǎn)生的，這些融合蛋白包含日本血吸蟲的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和COMP2型重復(fù)區(qū)(Leu 88-Arg 268)，或COMP的3型重復(fù)區(qū)(Arg 268-Ile 517)或COMP和COOH末端區(qū)。TCla細(xì)胞未能示出與任何這些重組融合蛋白有明顯附著。然而，當(dāng)在包被之后3型重復(fù)融合蛋白被還原時(shí)，細(xì)胞能附著并在平板上良好鋪展。RGD肽有效地抑制TCla細(xì)胞對hCOMP的附著。此數(shù)據(jù)表明COMP是一種粘著蛋白，且3型重復(fù)可能通過RGD序列部分負(fù)責(zé)此粘著活性。
當(dāng)軟骨細(xì)胞在單層細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)，它們隨著時(shí)間推移而去分化，且喪失一些軟骨細(xì)胞的特點(diǎn)(van der Mark等，1997)。在單層細(xì)胞中延長培養(yǎng)之后，軟骨細(xì)胞從產(chǎn)生II型膠原和豐富的蛋白聚糖的分化表型轉(zhuǎn)換為產(chǎn)生I型膠原和少量蛋白聚糖的去分化的成纖維細(xì)胞表型。此去分化的過程可通過將軟骨細(xì)胞在懸浮液例如在藻酸鹽培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)而逆轉(zhuǎn)(Robbins和Goldring，1998；Goldring，1998；Hauselmann等，1994；Bonaventure等，1994)。為解決這個(gè)問題，用藻酸鹽系統(tǒng)再分化TCla細(xì)胞，并測試hCOMP對這些再分化細(xì)胞附著的支持作用。鈣充滿形式的野生型hCOMP在藻酸鹽珠中培養(yǎng)7-10天后，也能支持TCla細(xì)胞的附著(圖5)。在包被之前鈣的螫合使附著水平降低大約50％(圖5)。這些數(shù)據(jù)提示hCOMP的鈣充滿的野生型構(gòu)象是支持在藻酸鹽系統(tǒng)中培養(yǎng)的分化的TCla細(xì)胞最大附著所需的。此發(fā)現(xiàn)還解釋了先前對COMP粘著活性研究的爭論。當(dāng)COMP以鈣耗竭的構(gòu)象純化時(shí)，它的粘著活性對分離自分化階段的組織的軟骨細(xì)胞而言是低的(Sommarin等，1989；Oldberg等1992；DiCesare等，1994)。
當(dāng)COMP以鈣充滿形式中純化與先前報(bào)道的在EDTA中純化相對比時(shí)，COMP示出不同的表現(xiàn)(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992DiCesare等，1994)。這些結(jié)果表明鈣結(jié)合對保持COMP的正確結(jié)構(gòu)構(gòu)象是至關(guān)重要的，該構(gòu)象反過來又對其功能是至關(guān)重要的，包括其最佳GAG結(jié)合性及其支持細(xì)胞附著的能力。
另外，如實(shí)施例5所示，COMP是軟骨細(xì)胞遷移的促動因子。人costochondral軟骨細(xì)胞被用于測試COMP在促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移中是否起作用。將不同濃度的COMP以及TSP1和Vitrogen(Cohesion；Palo Alto，CA)包被在轉(zhuǎn)孔遷移分析孔的膜下面。將如在附著分析中制備的軟骨細(xì)胞加樣于孔中。在37C進(jìn)行遷移4小時(shí)。存留在孔內(nèi)的未遷移細(xì)胞用棉簽除去。遷移至膜下的細(xì)胞用CyQuant試劑盒定量。
數(shù)據(jù)(圖6)示出COMP是一種軟骨細(xì)胞遷移的良好化學(xué)引誘劑。包被在膜下的，低如10mg/ml濃度的COMP即可促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移至其附近。 TSP1也促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移。然而，在10mg/ml的相同濃度下，COMP似乎是比TSP1更強(qiáng)的化學(xué)引誘物。Vitrogen(Cohesion；Palo Alto，CA)實(shí)際上是一種膠原，與先前報(bào)道相一致，也促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移(Shimizu，M.，K.Minakuchi，S.Kaji和J.Koga，“軟骨細(xì)胞遷移至纖連蛋白，I型膠原和II型膠原，”細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，22309-315(1997))。
此數(shù)據(jù)與COMP支持軟骨細(xì)胞附著的數(shù)據(jù)提示，COMP是包含在用于軟骨修復(fù)的人工基質(zhì)中的一個(gè)良好候選物。人工基質(zhì)中的COMP可作為軟骨細(xì)胞遷移至基質(zhì)的良好化學(xué)引誘物，并作為良好的附著因子。另外，通過結(jié)合的維生素D3，其代謝物或視黃酸，COMP可有助于進(jìn)一步啟動軟骨細(xì)胞分化，并產(chǎn)生正確類型的胞外基質(zhì)。
本發(fā)明所述的研究結(jié)果提供了一些關(guān)于COMP結(jié)構(gòu)和功能的重要觀察。與最初方法純化的COMP相比，本發(fā)明揭示的重組表達(dá)和純化的hCOMP有一些令人驚喜的優(yōu)點(diǎn)。這是首次如果按比率擴(kuò)大培養(yǎng)，人COMP可以不限量地純化。在此新的純化方案中，在各個(gè)步驟中均保持鈣的存在，以維持鈣依賴性結(jié)構(gòu)。此方案基于如下事實(shí)，即在生物合成期間及在胞外環(huán)境中，COMP應(yīng)存在于毫摩爾水平的鈣環(huán)境中。到目前為止，大多數(shù)廣泛應(yīng)用的COMP由于它們的可得性，是純化自牛軟骨或鼠纖維肉瘤的。然而，牛或鼠的物質(zhì)不能用于人體，因?yàn)樗鼈兡軡撛诘匾鹈庖邞?yīng)答。也有報(bào)道純化自人軟骨的人COMP(DiCesare等，1995；Neidhart等，1997)，然而，人體物質(zhì)的來源是有限的。另外，所報(bào)道的COMP純化方法也對其應(yīng)用有一定限制性。有兩種已公布的純化COMP的方法，最早的方法是用含有鹽酸胍和EDTA的溶液提取(Hedbom等，1992)，這使蛋白質(zhì)變性。另一種方法是以“天然”狀態(tài)純化COMP，然而此方法利用EDTA提取，EDTA處理從COMP中螫合鈣和/或其它二價(jià)陽離子，并使COMP處于鈣耗竭狀態(tài)。有數(shù)據(jù)示出此構(gòu)象變化可能是不可逆的，因?yàn)檫@樣純化的COMP在含有鈣的EM下不能折成緊湊的鈣充滿狀態(tài)。已報(bào)道在含有EDTA的情況下純化的COMP與本發(fā)明所述在鈣充滿狀態(tài)下純化的COMP相比，不能進(jìn)行一些功能，例如，COMP不能與肝素-瓊脂糖凝膠結(jié)合，且對COMP能否支持軟骨細(xì)胞附著是有爭論的。如本發(fā)明所述實(shí)施例所示，鈣充滿狀態(tài)對于COMP的最大GAG結(jié)合活性及最大細(xì)胞粘著活性是至關(guān)重要的。
1、純化的COMP本發(fā)明包括純化的軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)，如人COMP(hCOMP)，如通過在含有鈣的情況下表達(dá)和/或純化hCOMP而制備的hCOMP，本發(fā)明還包括在鈣存在下純化COMP(如hCOMP)的方法。COMP可在高鈣濃度環(huán)境中純化，例如鈣的濃度在毫摩爾范圍(水平)，如至少300μm(0.3毫摩爾)。本文所用“鈣充滿條件”是指鈣濃度至少為0.3毫摩爾。在一實(shí)施方案中，hCOMP克隆可被導(dǎo)入例如能表達(dá)和分泌hCOMP的細(xì)胞中；在例如適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)此細(xì)胞；并在含有鈣的情況下純化hCOMP。hCOMP克隆可通過克隆全長hCOMP而產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知重組技術(shù)，例如參見Ausubel，F(xiàn).N.等，分子生物學(xué)的通用方案，Greene出版協(xié)會，和JohnWiley&Sons，Inc.(1998)。將蛋白質(zhì)如hCOMP導(dǎo)入細(xì)胞的方法包括但非限于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化和電穿孔。本領(lǐng)域也已熟知適于表達(dá)的條件。細(xì)胞可在鈣充滿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。hCOMP可在毫摩爾水平的溶液中表達(dá)和/或純化(例如鈣的濃度至少為300μM)。能表達(dá)COMP的細(xì)胞包括軟骨，肌腱和韌帶細(xì)胞，和人胚腎細(xì)胞，或用例如COMP DNA(編碼COMP的DNA)轉(zhuǎn)染的其它細(xì)胞。
本發(fā)明還涵蓋了在不同鈣濃度中純化的COMP。這種COMP可被胰蛋白酶不同酶解。在一實(shí)施方案中，由此方法產(chǎn)生的hCOMP，當(dāng)被胰蛋白酶酶解時(shí)，被消化為50kDa或55kDa的條帶。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)被胰蛋白酶酶解時(shí)，純化的hCOMP被消化為62kDa或67kDa的條帶。
本發(fā)明還涵蓋了COMP(如人COMP，如通過本發(fā)明的方法純化的hCOMP)的片段，突變體及其它衍生物和類似物，本發(fā)明還包括生產(chǎn)和使用這種片段，突變體和其它衍生物和類似物的方法。在一實(shí)施方案中，這種衍生物包括COMP尤其鈣充滿構(gòu)象的COMP的結(jié)合位點(diǎn)(如鈣結(jié)合位點(diǎn))。本文所用的“鈣充滿構(gòu)象”指已在鈣充滿條件下純化的COMP的形式。本發(fā)明還包括包含COMP和/或COMP衍生物的組合物。
2、抗COMP抗體及ELISA試劑盒本發(fā)明還涵蓋了在含有鈣的情況下純化的COMP(包括hCOMP)的抗體，例如在本發(fā)明方法下純化的hCOMP的抗體。此抗COMP抗體可以是單克隆或多克隆的，它們可以是嵌合的。它們可以是特異于COMP衍生物如COMP片段或突變體的抗體。它們可以是與降解的COMP(包括COMP片段)結(jié)合而不與未降解的COMP結(jié)合的抗體?；蛘?，它們可結(jié)合未降解的(完整全長)COMP，但不結(jié)合降解的COMP。本領(lǐng)域熟知生產(chǎn)抗體的方法。在一實(shí)施方案中，抗體是純化的hCOMP的抗體，hCOMP是通過將hCOMP克隆導(dǎo)入能表達(dá)和分泌hCOMP的細(xì)胞中，在適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞，并在含有鈣的情況下純化hCOMP而制備。在一實(shí)施方案中，抗體是在鈣充滿情況下例如鈣的濃度在毫摩爾范圍(水平)，如至少300μM(或0.3毫摩爾)中純化的hCOMP的抗體。本發(fā)明還包括本文所述的抗體的片段。如本文所用，“抗體”可指任一種類型的抗體，如具有一定特異性和親和性的單克隆抗體，或在抗血清中的多克隆抗體制備物，或一種分析中的多個(gè)抗體，即術(shù)語“抗體”包含多種含義。
本發(fā)明還涵蓋了ELISA試劑盒，其包含純化的hCOMP和/或這種hCOMP的抗體，該hCOMP是通過將hCOMP克隆導(dǎo)入能表達(dá)和分泌hCOMP的細(xì)胞，在適于表達(dá)hCOMP的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞，并在含有鈣的情況下純化hCOMP而制備的。
3、COMP在破壞性關(guān)節(jié)疾病中作為標(biāo)記的應(yīng)用在一實(shí)施方案中，COMP在破壞性關(guān)節(jié)疾病中用作標(biāo)記。骨關(guān)節(jié)炎(OA)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的關(guān)節(jié)通常引起患者疼痛和傷殘。在這些炎性和機(jī)械性關(guān)節(jié)疾病中，軟骨基質(zhì)進(jìn)入負(fù)平衡，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性破壞及不同程度的骨破壞。OA是一種從初始的關(guān)節(jié)損害發(fā)展為進(jìn)一步破壞的慢性過程。OA的臨床診斷是基于關(guān)節(jié)疼痛的病史和放射線檢查。通常在診斷階段，組織已經(jīng)被破壞且病人需要手術(shù)。近年來，針對RA的進(jìn)攻性早期藥物治療希望可以阻止或延緩疾病進(jìn)展并改善最終結(jié)果。這種進(jìn)攻性早期治療只保證疾病是否已具有嚴(yán)重預(yù)后。因而，簡便的及非侵害的及可靠的檢測亞臨床狀態(tài)的關(guān)節(jié)炎及確定疾病進(jìn)展結(jié)果的方法將是非常有意義的。
有人體滑液(SF)和血清中，已有報(bào)道在膝關(guān)節(jié)損傷后COMP量增加。在早期OA中，在血清及SF中已經(jīng)觀測到COMP水平升高(Neidhart等，1997；Petersson等，1998a；Petersson等；1998b)。在具有臨床膝關(guān)節(jié)疼痛的病人體內(nèi)，COMP水平升高與隨后的對OA的放射線檢測相關(guān)，而COMP水平在隨后對正常人進(jìn)行放射線檢測則無變化(Pertersson等，1998a，Pertersson等，1998b)。在損傷性膝關(guān)節(jié)中，一些產(chǎn)生抗COMP自身抗體的患者發(fā)生損傷后骨關(guān)節(jié)炎的危險(xiǎn)性增加(Kuhne等，1998)。在具有侵害性RA及隨后產(chǎn)生進(jìn)一步大關(guān)節(jié)損壞的早期RA患者中，COMP水平也提高(Saxne等，1993；Forslind等，1992；Wollheim等，1997)。隨后，隨著RA的進(jìn)展，COMP水平降低。然而在SF中，較高百分率的RA患者(84％)和其它炎癥性關(guān)節(jié)炎的患者(60％)示出COMP高度降解(Neidhart等，1997)。簡而言之，血清中COMP濃度增加可作為早期OA和RA的有效預(yù)測標(biāo)記。另外COMP在SF中降解增加這一指標(biāo)則可用作RA和其它炎癥性關(guān)節(jié)疾病的標(biāo)記。
本領(lǐng)域熟知本發(fā)明所述分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見Ausebel，前述)。例如，可使用相同或相似于1997年8月8日申請的專利申請WO98/07095中所述方法。
現(xiàn)已經(jīng)示出血清中的COMP水平與SF中COMP水平正相關(guān)。血清可無損害地及輕微痛覺地易于自病人獲取，且血清中COMP水平通過競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)而易于測定。迄今為止，還未研制出一種診斷試劑盒，可能是由于hCOMP及其抗體的來源有限。使用本發(fā)明純化COMP的方法，在含有鈣優(yōu)選在鈣充滿條件下可純化大量的COMP。也可包括這種hCOMP的抗體。使用本發(fā)明純化的COMP的競爭性ELISA可在例如96孔微量滴定板或適合蛋白附著的其它基質(zhì)中進(jìn)行。此ELISA分析和試劑盒中使用人COMP比使用純化自其它動物來源的COMP優(yōu)選，因?yàn)橐咽境鍪褂门OMP的ELISA產(chǎn)生不精確的測定結(jié)果(Neidhart等，1997)。在ELISA分析中，平板可用1μg/ml純化的hCOMP包被。平板上過量的結(jié)合位點(diǎn)可例如用牛血清白蛋白封閉?；颊叩难蹇蛇B續(xù)稀釋，并與標(biāo)準(zhǔn)的即已知數(shù)量的純化的hCOMP及特異抗COMP抗體一起，在4℃保溫過夜。然后將此溶液加入平板并在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。沖洗之后，可向孔中加入酶綴合的二級抗體，并如標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析進(jìn)行分析?；颊哐逯械腃OMP濃度可源自標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)的線性范圍。在此分析中，優(yōu)選單克隆抗體用作初級抗體。然而，也可使用多克隆抗體。多克隆抗COMP抗體已經(jīng)研制出(Hecht等，1998)，單克隆抗COMP抗體正在研制。使用本發(fā)明所提供的技術(shù)可為ELISA提供來源無限制的純化的重組hCOMP。
標(biāo)準(zhǔn)ELISA分析可用于檢測損傷性膝關(guān)節(jié)外傷的患者是否出現(xiàn)抗COMP抗體，從而指導(dǎo)診斷與治療。在此分析中，hCOMP包被在96孔微量滴定板上，連續(xù)稀釋的患者血清用于檢測抗COMP自身抗體的存在與否。在此分析中，hCOMP比其它動物來源的COMP具有更大優(yōu)勢，因?yàn)樽陨砜贵w可識別只存在于人COMP的表位，因而使用hCOMP更靈敏和精確。
免疫印跡可用于檢測SF中COMP是否降解。簡而言之，SF中蛋白質(zhì)可例如通過乙醇沉淀，將此沉淀物在含有不具有還原劑的SDS電泳緩沖液的溶液中重懸浮。蛋白質(zhì)可例如在SDS中在3-15％聚丙烯酰胺凝膠上分離，并經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移至一片硝基纖維素紙上。通過標(biāo)準(zhǔn)免疫印跡方法，使用識別未降解的和降解的COMP的多克隆抗COMP抗體或單克隆抗體，對COMP進(jìn)行檢測。對條帶的相對強(qiáng)度進(jìn)行掃描并計(jì)算降解條帶的百分比。在此，純化的hCOMP和商購的分子量標(biāo)準(zhǔn)物可用于鑒別COMP的完整及降解形式。
4、COMP在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用在軟骨修復(fù)領(lǐng)域，已嘗試進(jìn)行軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的移植，及人工基質(zhì)的移植，或組合這二種方法。然而，結(jié)果都是不令人滿意的，尤其遠(yuǎn)期效果。據(jù)信修復(fù)的組織應(yīng)具有相同或相似的透明軟骨的組成和結(jié)構(gòu)，以經(jīng)得起時(shí)間與使用的考驗(yàn)。因此，修復(fù)的組織的組織學(xué)性質(zhì)是鑒定修復(fù)步驟是否適當(dāng)及結(jié)果是否較好的一個(gè)重要因素。在透明軟骨中，主要成分是II型膠原和大量聚集的蛋白聚糖的聚集蛋白聚糖。在長期跟蹤中，許多軟骨修復(fù)步驟的主要問題是修復(fù)的組織是含有I型膠原而不是II型膠原，且與透明軟骨相比具有較少蛋白聚糖的纖維軟骨。纖維性修復(fù)在一段時(shí)間之后趨于退化。先前的研究已經(jīng)示出軟骨細(xì)胞產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的能力依賴于細(xì)胞的分化狀態(tài)。COMP在解決這個(gè)問題中可起重要作用。
維生素D3和視黃酸已示出在軟骨和骨的形態(tài)形成和修復(fù)中是重要因素。視黃酸具有影響肢形成和刺激負(fù)重生長的軟骨細(xì)胞中基質(zhì)鈣化和膠原合成。維生素D3及其二種主要活性代謝產(chǎn)物1，25-二羥基維生素D3[1，25(OH)2D3]，和24R，25-二羥基維生素D3[24R，25(OH)2D3]發(fā)現(xiàn)是正常軟骨細(xì)胞發(fā)育和分化所必需的。此代謝物促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞分化接近形態(tài)上肥大的表型。l，25(OH2)D3尤其刺激II型膠原的轉(zhuǎn)錄及提高肢芽間充質(zhì)細(xì)胞中軟骨形態(tài)發(fā)生。視黃酸的調(diào)節(jié)功能已部分歸因于骨形態(tài)形成蛋白-7水平的刺激，其接著刺激軟骨細(xì)胞的成熟(Grimsrnd等)，維生素D3代謝物的作用是通過調(diào)節(jié)包含cAMP和蛋白激酶C的胞內(nèi)信號途徑而進(jìn)行的(Schwartz等，1998a；Schwartz等，1998b)。
維生素D3代謝物及視黃酸在水溶液中基本是不溶的，且需要載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)并在生理?xiàng)l件下貯存。最近已報(bào)道COMP是天然發(fā)生的結(jié)合蛋白(Guo等，1998)，因此，COMP可作為這些信號分子的貯存和輸送蛋白。
除了視黃酸和維生素D3的代謝物，COMP還示出也與膠原結(jié)合(Rosenberg等，1998)。根據(jù)我們的研究，與軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的不同GAG結(jié)合的COMP是一種去分化的和分化的軟骨細(xì)胞的粘著蛋白，并可作為軟骨細(xì)胞遷移的化學(xué)引誘物。本發(fā)明的實(shí)施例表明COMP的鈣充滿構(gòu)象是其發(fā)揮最大GAG結(jié)合和支持細(xì)胞附著活性的關(guān)鍵。COMP的這些性質(zhì)使其成為軟骨修復(fù)的一個(gè)理想候選物。
COMP可用于軟骨修復(fù)的各種步驟中，可作為軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞的促動因子(如化學(xué)引誘劑)和粘著因子，也可作為分化因子(與視黃酸或維生素D3代謝物結(jié)合)。
例如，自身軟骨細(xì)胞移植已成為膝關(guān)節(jié)軟骨全部損傷的普及外科治療方法。此方法有一定預(yù)期效果，但遠(yuǎn)期效果有一定問題(Koh等，1998；Brittberg等，1990；Brittberg等，1994)。此方法包括分離病人的軟骨細(xì)胞，體外擴(kuò)展軟骨細(xì)胞，并將培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞注入缺損部位，用取自近關(guān)節(jié)的中段胚骨骨膜瓣縫合覆蓋。此方法利用在單層細(xì)胞中體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞。如以前報(bào)道所述，在單層細(xì)胞培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，軟骨細(xì)胞趨于去分化。去分化的軟骨細(xì)胞從II型膠原表達(dá)表型轉(zhuǎn)換為I型膠原表達(dá)，并產(chǎn)生較少的聚集蛋白聚糖，類似成纖維細(xì)胞表型。
例如，COMP，如本發(fā)明所述純化的hCOMP可用于移植軟骨發(fā)生細(xì)胞的方法中，包括在存在COMP下培養(yǎng)細(xì)胞。本文所用的“軟骨發(fā)生細(xì)胞”是指能產(chǎn)生軟骨的細(xì)胞，包括軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。軟骨發(fā)生細(xì)胞可以是自身的。本文所用的“自身的”是指細(xì)胞是取自將要移植入內(nèi)的相同個(gè)體的。COMP可與分化劑結(jié)合。分化劑可以是維生素D3或維生素D3代謝物或視黃酸。細(xì)胞可分離自個(gè)體，例如動物如哺乳動物，例如人(如病人)。hCOMP可介導(dǎo)細(xì)胞吸附(如擴(kuò)展的軟骨細(xì)胞)，并為細(xì)胞輸送分化劑及釋放分化劑。細(xì)胞可以在用與分化劑結(jié)合的hCOMP包被的組織培養(yǎng)平板上培養(yǎng)。細(xì)胞例如軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞可以與結(jié)合分化劑的hCOMP一起注入缺損部位，從而有助于維持軟骨細(xì)胞分化和刺激II型膠原和其它軟骨成分在缺損部位產(chǎn)生。細(xì)胞可在hCOMP存在下培養(yǎng)(hCOMP可與分化劑結(jié)合)。hCOMP可通過本發(fā)明所述方法純化。本發(fā)明還涵蓋了用這些方法生產(chǎn)用于自身移植的軟骨細(xì)胞，及通過這些方法生產(chǎn)的軟骨細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，軟骨細(xì)胞可以在用與維生素D3代謝物結(jié)合的hCOMP包被的組織培養(yǎng)平板上培養(yǎng)。在此，COMP作為附著因子并也可提供分化因子。擴(kuò)展的軟骨細(xì)胞也與結(jié)合維生素D3代謝物的COMP一起注入缺損部位。這也應(yīng)有助于在缺損部位維持軟骨細(xì)胞分化和刺激II型膠原產(chǎn)生。人COMP比其它動物來源COMP優(yōu)選，從而避免了潛在的宿主免疫應(yīng)答這一問題。
另一項(xiàng)研究是針對研制軟骨修復(fù)的人工基質(zhì)。人工基質(zhì)可用于在缺損部位輸送和穩(wěn)定細(xì)胞及試劑的方法中，且在一些情況中，這些基質(zhì)還可使得或刺激宿主細(xì)胞向內(nèi)生長和基質(zhì)形成以及新細(xì)胞和基質(zhì)與宿主組織的結(jié)合(Buckwalte和Mankin，1998；Silver和Glasgold，1995；Newman，1998)。人工基質(zhì)包括各種生物學(xué)及非生物學(xué)物質(zhì)，包括處理的軟骨和骨基質(zhì)，膠原，膠原和透明質(zhì)酸，纖維蛋白凝膠，碳纖維，多孔聚乳酸，等。不同的基質(zhì)已由不同的實(shí)驗(yàn)室研制，且每一種都有其優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。評價(jià)移植物的關(guān)鍵是其可提供一個(gè)多孔結(jié)構(gòu)，細(xì)胞可遷移至其中，貼附并生長，以及其促進(jìn)并保持所移植的細(xì)胞的分化的軟骨細(xì)胞表型，且其在體內(nèi)不引起炎癥和毒性。在人工基質(zhì)中，在修復(fù)和再生關(guān)節(jié)軟骨中也可使用可刺激軟骨細(xì)胞生長和分化的生長因子，包括類胰島素生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子，和轉(zhuǎn)化生長因子。然而，它們對除了軟骨之外其它組織的多重作用，及對它們的體內(nèi)作用的有限了解，使得研究者對它們在臨床中的應(yīng)用很謹(jǐn)慎?，F(xiàn)在還未有關(guān)于移植物中使用COMP的報(bào)道，因?yàn)橹两駥OMP的了解有限。
本發(fā)明包括用于軟骨修復(fù)的移植物。本文所用的“移植物”是指一種組合物，其可被移植入個(gè)體中?！靶迯?fù)”是指改善或部分或全部恢復(fù)至未受損狀態(tài)。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，膠原凝膠如I型膠原和II型膠原用于基質(zhì)中。研究表明II型膠原比I型膠原具有更好的維持軟骨細(xì)胞表型和基質(zhì)合成的作用(Nehrer等，1997)。在一實(shí)施方案中，將與分化劑如維生素D3或其代謝物或視黃酸結(jié)合的COMP，加入作為移植物的II型膠原凝膠中。凝膠中也可包括蛋白聚糖包括硫酸軟骨來。血液或骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞可代替軟骨細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兿鄬σ子讷@取。在此移植中，鑒于hCOMP的GAG和膠原結(jié)合活性及其五聚體結(jié)構(gòu)，hCOMP可作為膠原纖維和蛋白聚糖之間的橋粱以更好地?fù)饺牖|(zhì)。COMP還可作為移植的軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞的粘著物。在基質(zhì)中不包括細(xì)胞的情況下，COMP可作為促動劑，促使細(xì)胞進(jìn)入基質(zhì)。由于維生素D3可在COMP置入基質(zhì)之前與其結(jié)合，因此COMP還作為輸送和緩釋此分化劑的手段，從而有助于保持和促進(jìn)軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞成熟與分化，產(chǎn)生在軟骨未遭受損傷、無病理變化或其它損害的個(gè)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的軟骨基質(zhì)類型。這種軟骨在此稱作天然發(fā)生的未損傷的軟骨(即“正常”軟骨)。
實(shí)施例1人重組COMP(hCOMP)的表達(dá)與純化將編碼全長人COMP的DNA(Newton等，1994)克隆入pcDNA3.1+載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。將所得克隆用Lipotectin試劑(Life Technologies，Gaithersburg，MD)轉(zhuǎn)染至人胚腎細(xì)胞(293細(xì)胞)中。在G418的選擇下分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物的單一集落并擴(kuò)展。細(xì)胞在加入10％胎牛血清(FBS)的Dulbeceo’s修改的Eagle’s培養(yǎng)基(DME)(Life Technologies)中生長直至接近鋪滿。然后將細(xì)胞用DME沖洗2次，并在加入2mML-谷氨酰胺的DME中生長48小時(shí)。收集條件培養(yǎng)基進(jìn)行純化。為純化hCOMP，將條件培養(yǎng)基加樣于肝素-瓊脂糖凝膠層析柱中，并用含有≥2mM CaCl2的Tris緩沖鹽水充分沖洗。然后通過高鹽溶液從層析柱洗脫結(jié)合物，高鹽溶液是在含有2mM CaCl2的10mMTris，pH7.5中溶液緩沖的，濃度高于0.5M的NaCl溶液?；蛘?，將條件培養(yǎng)基通過30％硫酸銨在4℃沉淀過夜。將沉淀物重懸浮于含有2mMCacl2的TBS中，并加樣于在含有2mM CaCl2的TBS中的10-20％線性蔗糖梯度上，并通過在BeckmanSW 41 Ti轉(zhuǎn)子中以38,000rpm離心20-24小時(shí)而分離。集合含有COMP的部分。將該部分在-80℃貯存直至進(jìn)一步使用。
當(dāng)人胚腎293細(xì)胞用全長人COMP cDNA轉(zhuǎn)染時(shí)，它們能加工和分泌hCOMP(圖1)。此分泌和純化的hCOMP是五聚體。未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞通過用抗COMP的多克隆抗體F8(Hecht等，1998)免疫印跡鑒定，其不能合成任何內(nèi)源性COMP。此純化的蛋白質(zhì)與人軟骨和肌腱的COMP在SDS-PAGE中一起遷移。
實(shí)施例2 COMP作為鈣結(jié)合蛋白的分析根據(jù)COMP存在3型重復(fù)序列及對TSP1的研究，COMP推定為與鈣結(jié)合。然而，最初在EDTA存在下純化的COMP不與鈣結(jié)合，且不能由于鈣的功能而示出明顯的構(gòu)象差異(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。直接鈣結(jié)合，旋轉(zhuǎn)投影電子顯微鏡(EM)和限制性胰蛋白酶消化用于顯示COMP是鈣結(jié)合蛋白，并在不同鈣濃度下呈現(xiàn)不同構(gòu)象。
將在含有2mM CaCl2的Tris緩沖鹽水中的純化的COMP用70％甘油，0.15M乙酸銨和0.2mM CaCl2稀釋。將未用CaCl2制備的等價(jià)的蛋白質(zhì)樣品在與70％甘油和0.15M乙酸銨混合之前，調(diào)節(jié)到含5mM EDTA。然后將樣品噴涂至新鮮切割的云母片上并用鉑旋轉(zhuǎn)投影。hCOMP的旋轉(zhuǎn)投影EM圖象(圖2)示出重組hCOMP是五聚體。在存在鈣下，hCOMP具有緊湊的結(jié)構(gòu)使其難以分解為五個(gè)亞單位。在EDTA下，hCOMP采取一延伸的構(gòu)象。從鏈間二硫鍵至C-球末端的hCOMP的未校正臂長，在鈣存在下是19.9±2.6nm，在EDTA存在下是30.4±3.3nm(各為20次測量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。這些結(jié)果提示在鈣充滿狀態(tài)下純化的hCOMP，當(dāng)鈣被從分子中螯合時(shí)，hCOMP將經(jīng)歷構(gòu)象變化。
在各種鈣濃度下進(jìn)行hCOMP的限制性胰蛋白酶消化。在hCOMP的消化中觀測到分子量為27，36，50，55，62和67kDa的6個(gè)胰蛋白酶消化的片段。在低鈣濃度下(在1-25μM范圍)，hCOMP易于被胰蛋白酶消化為27kDa和36kDa的兩個(gè)小片段(圖3)。純化的重組COMP用含有2mM或0.5mMCaCl2的Tris緩沖鹽水透析。將EDTA加入16μg每種蛋白質(zhì)中以使最終游離Ca2+濃度為μM級。在0℃以酶底物為1∶100的比率進(jìn)行胰蛋白酶消化20小時(shí)。加入還原SDS樣品緩沖液終止消化，并通過SDS-PAGE分離多肽。當(dāng)鈣濃度提高至50-100μM時(shí)，hCOMP被消化為50kDa和55kDa的中等條帶。當(dāng)鈣濃度高于150μM時(shí)，隨著鈣深度的增加，hCOMP開始出現(xiàn)62kDa和67kDa的條帶。此67kDa的條帶成為在毫摩爾鈣濃度下的主要條帶。此條帶不存在于影響其鈣結(jié)合活性的COMP突變體中。
COMP與鈣的直接結(jié)合用45CaCl2通過平衡透析而測定。簡而言之，將TSP1和COMP在Slide-A-Lyzer透析裝置(Pierce，Rockford，IL)中，用含有0.3mM CaCl2和10mCi/ml45CaCl2的透析液透析。在透析結(jié)束時(shí)，取10ml蛋白質(zhì)樣品和透析液進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)和蛋白質(zhì)測定。計(jì)算鈣離子結(jié)合數(shù)。在0.3mM游離鈣濃度下，每個(gè)TSP1亞單位結(jié)合10±2個(gè)鈣離子(4組數(shù)據(jù)的平均值±SD)。這與前述報(bào)道中11-12個(gè)鈣離子與每個(gè)TSP1亞單位結(jié)合相一致(Lawler和Simons，1983；Misenheimer和Mosher，1995)。在相同條件下，每個(gè)COMP亞單位結(jié)合11±1個(gè)鈣離子。這是第一次顯示出COMP結(jié)合鈣離子，且此結(jié)果與在COMP及其它TSP家族成員中存在高度同源的3型鈣結(jié)合重復(fù)序列相一致。
實(shí)施例3COMP作為糖胺聚糖(GAG)結(jié)合蛋白的分析為探查hCOMP盡管缺失NH2端肝素結(jié)合功能域是否仍可以是GAG結(jié)合蛋白，及3型鈣結(jié)合重復(fù)序列的構(gòu)象是否影響hCOMP功能，我們在鈣或EDTA存在下測試了hCOMP與軟骨中發(fā)現(xiàn)的常見GAGs的相互作用。
用親和共電泳(ACE)(San Antonio等，1993)確定hCOMP與肝素及其它商購的衍生自組織來源的GAGs，包括來自軟骨的硫酸軟骨素的結(jié)合，并測定Kd值。這些分析結(jié)果示于表1。COMP結(jié)合低分子量的肝素，Kd為89nM。這與我們所觀測到的hCOMP與肝素-瓊脂糖凝膠結(jié)合相一致。盡管與肝素結(jié)合可提示COMP中存在有功能的GAG結(jié)合位點(diǎn)，但肝素是高度硫酸化的HS，只在肥大細(xì)胞中產(chǎn)生，因而不能真正代表大多數(shù)組織中的GAG。為更好地確定GAGs和蛋白聚糖在COMP功能中的作用，用ACE測試硫酸肝素，硫酸角質(zhì)素和三種硫酸軟骨素(軟骨素-6-硫酸，C6S；軟骨素-4-硫酸，C4S；硫酸皮膚素，DS)在含有2mM鈣的情況下與hCOMP的結(jié)合情況(表1)。數(shù)據(jù)表明hCOMP與三種硫酸軟骨素親和結(jié)合，Kd在328-583nM范圍，而與HS結(jié)合較弱(1.2μM)。hCOMP不與硫酸皮膚素結(jié)合。
為進(jìn)一步確定鈣結(jié)合3型重復(fù)序列的構(gòu)象是否是與GAG結(jié)合的關(guān)鍵，測試hCOMP在存在5mMEDTA時(shí)與肝素和C6S的結(jié)合情況。這些結(jié)構(gòu)表明鈣的耗竭降低了hCOMP與GAG的結(jié)合。盡管通過EDTA處理，與肝素結(jié)合只下降3-5倍，但與C6S結(jié)合被此處理破壞。
實(shí)施例4COMP作為粘著蛋白的分析一種軟骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞系，TCla用于測試COMP是否是粘著蛋白。在單層細(xì)胞和藻酸鹽培養(yǎng)系統(tǒng)中生長的細(xì)胞用于此分析。
為制備進(jìn)行附著分析的在單層細(xì)胞中生長的細(xì)胞，將生長在10cm組織培養(yǎng)平板中的細(xì)胞用HEPES緩沖鹽水(HBS)沖洗2次，并在37℃用1ml在HBS中的0.1mg/mlTPCK處理的胰蛋白酶(Worthington，Lakewood，NJ)處理5分鐘。胰蛋白酶消化用2ml在含有1mMCaCl2的HBS(HBS/C)中的0.5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma)終止。將細(xì)胞從平板上沖洗下成為單細(xì)胞懸浮液，沉降并用胰蛋白酶抑制劑溶液沖洗2次。接下來，將細(xì)胞以終濃度為2-2.5×105個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮于含有1％熱滅活的小牛血清白蛋白的HBS/C(HI-BSA)中，用于附著分析。
用一種藻酸鹽培養(yǎng)系統(tǒng)再分化軟骨細(xì)胞(Robbins和Goldring，1998；Goldring，1998；Hauselmann等，1994；Bonaventure等，1994)。簡而言之，將單層細(xì)胞中培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶消化并用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗。將細(xì)胞以終濃度為4×106個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮于在0.15M NaCl中的1.2％Keltone，LVCR藻酸鹽溶液(Monsanto，St.Louis，MO)中。然后將此細(xì)胞懸浮液穿經(jīng)一個(gè)22號針注入102mMCaCl2中。在膠凝作用之后10分鐘，用0.15MNaCl沖洗珠，并在含有10％FBS和25μg/ml抗壞血酸鹽的1∶1DME/F-12中培養(yǎng)。為制備進(jìn)行附著分析的在藻酸鹽培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的細(xì)胞，將7-10天藻酸鹽珠培養(yǎng)物用55mM檸檬酸鹽/0.15MNaCl，pH6.0溶液溶解(Robbins和Goldring，1998)。釋放的細(xì)胞用PBS沖洗1次并用HBS/C沖洗1次，之后以終濃度為2-2.5×105個(gè)細(xì)胞/ml將細(xì)胞重懸浮于含有1％BSA的HBS/C中。
Immulon II 96孔平板(DYNEX，Cantilly，VA)用在HBS/C或含有5mM EDTA的HBS(HBS/E)中的各種濃度的COMP，在4℃包被過夜。然后將此平板在37℃分別用在HBS/C或HBS/E中的1％HI-BSA封閉30分鐘。封閉之后，一些用在HBS/E中的蛋白質(zhì)包被的孔用在HBS/E中的20mM二硫蘇糖醇(DTT)在22℃還原30分鐘。將孔用HBS/C沖洗4次，之后在每孔中加入100μl細(xì)胞，并在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在相差顯微鏡的觀測后，將平板用HBS/C沖洗3次。貼附于每孔的細(xì)胞數(shù)量用CyQuant試劑盒(MolecularProbes，Eugene，OR)確定。
就生長于單層細(xì)胞中的TCIa細(xì)胞而言，鈣充滿構(gòu)象的hCOMP以依賴劑量方式支持細(xì)胞附著(圖4)。在5μg/ml或更高的蛋白質(zhì)包被濃度，細(xì)胞也鋪布于蛋白質(zhì)包被的孔上。在包被前用EDTA處理hCOMP對吸附?jīng)]有明顯的影響(圖4)。在包被后還原h(huán)COMP提高其粘著活性，尤其在低COMP包被濃度(圖4)。細(xì)胞附著并鋪布于以1μg/ml包被的二硫蘇糖醇處理的COMP上。為鑒別COMP上細(xì)胞所附著的區(qū)域，測試了融合蛋白的粘著活性，融合蛋白是通過表達(dá)具有插入序列的pGEX載體(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)而產(chǎn)生的，如此融合蛋白包含日本血吸蟲的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和COMP的2型重復(fù)區(qū)(Leu 88-Arg 268)或COMP的3型重復(fù)區(qū)(Arg 268-Ile 517)或COMP的COOH末端區(qū)(Asp 518-Ala 957)。TCla細(xì)包未顯示出與任何這些重組融合蛋白有明顯附著。然而，當(dāng)3型重復(fù)融合蛋白在包被之后被還原時(shí)，細(xì)胞能附著并良好地鋪布于平板上(圖4，未示出)。RGD肽有效地抑制TCla細(xì)胞對hCOMP的附著。
采用再分化TCla細(xì)胞的藻酸鹽系統(tǒng)，并如在單層細(xì)胞中相同方式測試hCOMP支持這些再分化的細(xì)胞附著作用。鈣充滿形式下的野生型hCOMP在藻酸鹽珠中培養(yǎng)7-10天后也能支持TCla細(xì)胞的附著(圖5)。包被前鈣的螯合使附著水平降低大約50％(圖5)。當(dāng)COMP在鈣耗竭構(gòu)象中純化時(shí)，其粘著活性就分離自分化狀態(tài)組織的軟骨細(xì)胞而言是低的(Sommarin等，1989；Oldberg等，1992；Dicesare等，1994)。
實(shí)施例5 COMP作為軟骨細(xì)胞遷移的化學(xué)引誘物的分析人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用于測試COMP在促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移中是否起作用。將COMP以及TSP1和Vitrogen(Cohesion，Palo Alto，CA)在不同濃度，在轉(zhuǎn)孔遷移分析孔(Costar，Camuridge，MA)的膜下面包被。將如附著分析中制備的軟骨細(xì)胞加樣于孔中。在37℃進(jìn)行遷移分析4小時(shí)。用棉簽拭去未遷移的殘留在孔內(nèi)的細(xì)胞。遷移至膜下的細(xì)胞用CyQuant試劑盒(Molecular Probes)定量。
數(shù)據(jù)(圖6)表明COMP是軟骨細(xì)胞遷移的良好化學(xué)引誘物。以低至10μg/ml包被在膜背側(cè)的COMP即促進(jìn)軟骨細(xì)胞向其遷移。TSP1也促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移，但是在10μg/ml的相同濃度，COMP看起來是比TSP1更強(qiáng)的化學(xué)引誘物?；旧鲜悄z原的Vitrogen(Cohesion；Palo Alto，CA)也促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移。
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權(quán)利要求
1.純化的hCOMP，其通過如下方法制備a)將編碼hCOMP的DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，從而產(chǎn)生表達(dá)hCOMP的細(xì)胞；b)將該細(xì)胞在適于表達(dá)hCOMP的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而產(chǎn)生表達(dá)的hCOMP；及c)在鈣存在下純化hCOMP。
2.權(quán)利要求1純化的hCOMP，其中hCOMP是在鈣充滿條件下純化的。
3.權(quán)利要求1純化的hCOMP，其中b)步驟中的細(xì)胞是在鈣充滿培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。
4.權(quán)利要求1純化的hCOMP，其中hCOMP是在鈣濃度為至少300μM的溶液中純化的或者表達(dá)及純化的。
5.一種純化hCOMP的方法，包括a)獲得編碼全長hCOMP的DNA；b)將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，從而產(chǎn)生表達(dá)hCOMP的細(xì)胞；c)將該細(xì)胞在適于表達(dá)hCOMP的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而產(chǎn)生表達(dá)的hCOMP；及d)在鈣存在下純化hCOMP。
6.權(quán)利要求5的方法，其中hCOMP是在鈣充滿條件下純化的。
7.權(quán)利要求5的方法，其中hCOMP是在鈣濃度為至少300μM的溶液中純化的或者表達(dá)及純化的。
8.抗權(quán)利要求1的hCOMP或由權(quán)利要求6的方法純化的hCOMP的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
9.包含選自如下一組的一種物質(zhì)的ELISA試劑盒，所述的組為(a)權(quán)利要求1的hCOMP；(b)抗權(quán)利要求1的hCOMP的至少一種抗體；(c) 由權(quán)利要求5的方法產(chǎn)生的hCOMP；(d)抗由權(quán)利要求5的方法產(chǎn)生的hCOMP的至少一種抗體。
10.權(quán)利要求1的hCOMP在制備用于修復(fù)軟骨缺損區(qū)軟骨的植入物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及純化的軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)如人COMP(hCOMP),包括通過在鈣存在下(例如在鈣充滿條件下)純化的hCOMP。本發(fā)明還涉及在鈣存在條件下純化COMP的方法,抗純化的hCOMP的抗體,以及包含純化的hCOMP的ELISA試劑盒。本發(fā)明純化的hCOMP可用于制備軟骨修復(fù)用的植入物。
文檔編號C07K14/435GK1340548SQ0112264
公開日2002年3月20日 申請日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者陳暉 , 約翰·W·勞勒 申請人:陳暉 , 約翰·W·勞勒