專利名稱：咔唑生物堿類抗癌藥物及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑或抗癌劑的咔唑生物堿類衍生物的藥物及其制備方法。
已有人對某些結(jié)構(gòu)類型的咔唑類化合物進行了部分生物活性的研究，如文獻Tian-Shmng Wm，et al，Carbazole alkaloids from Clamsena excavata and their biological作用Phytochemistry，Vol.43.No.1.pp133-140，1996及文獻A.Chakraborty，et al，Carbazole alkaloidwith antimicrobial activity from Clamsena heptaphyllaPhytochemistry，Vol.38.No.3.pp787-789，1995曾報道這類化合物具有抗菌作用和血小板聚集抑制作用。但有關(guān)天然咔唑生物堿類化合物的生物活性至今未見有細胞周期抑制及細胞凋亡誘導等抗癌作用的研究報道。
本發(fā)明從黑果黃皮分離出具有細胞周期抑制或細胞凋亡誘導或直接殺傷癌細胞等體外以及體內(nèi)抗癌作用的29個咔唑類生物堿，所述咔唑類生物堿衍生物包括簡單取代咔唑(化合物1～13)、二氫或四氫吡喃并咔唑(化合物14～22，29)、1，4-醌咔唑(化合物23～25，)和咔唑二量體(化合物26～28)等咔唑生物堿骨架結(jié)構(gòu)類型，其化學結(jié)構(gòu)如下式所述 1R3＝CH3，R1＝R2＝R4＝R5＝R6＝H2R3＝CH2OCH3，R1＝R2＝R4＝R5＝R6＝H3R3＝CHO，R1＝R2＝R4＝R5＝R6＝H4R1＝OCH3，R3＝CH3，R2＝R4＝R5＝R6＝H5R1＝OCH3，R3＝CH2OCH3，R2＝R4＝R5＝R6＝H6R1＝OCH3，R3＝CHO，R2＝R4＝R5＝R6＝H7R1＝OH，R3＝CHO，R2＝R4＝R5＝R6＝H8R1＝OCH3，R3＝COOH，R2＝R4＝R5＝R6＝H9R2＝OH，R1＝CH3，R1＝R4＝R5＝R6＝H10R1＝OH，R3＝CHO，R4＝OCH3，R2＝R5＝R6＝H11R1＝OH，R3＝CHO，R5＝OCH3，R2＝R4＝R6＝H12R1＝R4＝H，R2＝OH，R3＝CH3，R5＝OCH3，R6＝CHO13R1＝OH，R2＝R4＝H，R3＝CHO，R5＝OCH3，R6＝CH2CH＝C(CH3)2 20R1＝CH3，R2＝R3＝H21R1＝CH3，R2＝H，R3＝OH22R1＝R3＝H，R2＝CHO 23R＝H 26R＝H24R＝OH27R＝CH325R＝OCH3 上述咔唑類生物堿衍生物中優(yōu)選的是化合物4～8和化合物14～22。
在制備抗癌藥物和制備細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑時，可使用一種或二種以上所述咔唑類生物堿衍生物或其鹽的組合物，組合物優(yōu)選的為化合物4與14的組合物和化合物4與29的組合物。
本發(fā)明的咔唑生物堿類化合物加入藥物可接受的酸可制成其鹽。所述的鹽是鹽酸鹽、檸檬酸鹽等。
上述咔唑類生物堿衍生物的制備方法是用乙醇或含水乙醇溶液提取黑果黃皮干燥的莖皮或枝葉，得粗浸膏，用有機溶劑萃取所得粗浸膏，得到提取物。將上述有機溶劑提取物經(jīng)反復的硅膠和Sephadex LH-20柱層析、反復的制備硅膠薄層層析、反相制備HPLC和重結(jié)晶等分離純化操作，分離出浸膏中的各個活性成分，得到上述每一種咔唑類生物堿衍生物活性單體。
將上述咔唑類生物堿衍生物或它們的鹽配之以藥物可接受的輔劑，可制備抗癌藥物或制備細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑。藥物劑型可以是注射劑和口服劑等各種劑型。
本發(fā)明采用流式細胞術(shù)并配以細胞顯微形態(tài)特征觀察、熒光顯微形態(tài)特征觀察及顆粒粒度分析法，以對tsFT210小鼠乳腺癌細胞的細胞周期抑制、細胞凋亡誘導以及對該癌細胞的殺傷作用為主要指標進行了抗癌活性的篩選和測試工作。同時，利用K562、HCT-15等人癌細胞系，采用MTT法、流式細胞術(shù)、細胞形態(tài)學特征檢測法(顆粒粒度分析，熒光顯微檢測)、細胞生化學特征檢測法(瓊脂電泳，Annexin V binding)等細胞生物學手段檢測了活性成分對人癌細胞的增值和細胞周期的影響以及殺傷和凋亡誘導作用，并探討了有關(guān)作用機理。另外，采用小鼠S180荷瘤動物模型檢測了藥物在體內(nèi)的抗癌作用，結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的咔唑類化合物在所測試的抗癌活性模型中均具有很好的相關(guān)活性。
抗癌活性的研究，首先采用MTT法檢測了藥物對腫瘤細胞增殖的影響，結(jié)果表明藥物有明顯的抑制腫瘤細胞增殖的作用，且有良好的劑量依賴關(guān)系。同時利用倒置相差光學顯微鏡觀察到了細胞凋亡時典型的形態(tài)學特征——細胞皺縮、發(fā)芽和形成凋亡小體。采用流式細胞術(shù)檢測了藥物對細胞周期的影響，結(jié)果表明，細胞經(jīng)藥物作用后，在正常的DNA二倍體峰之前出現(xiàn)一明顯的sub-G0峰，且其所占比例與藥物濃度相關(guān)，低濃度時細胞主要被阻斷在G2/M期，當藥物濃度增加時，一部分G2/M期細胞轉(zhuǎn)入sub-G0期。說明細胞受藥物作用后，使DNA部分斷裂，并影響了細胞周期。
繼而采用細胞形態(tài)學和生化學檢測手段來驗證藥物是否有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。在細胞形態(tài)學檢測時采用了顆粒粒度分析法和熒光顯微鏡觀察。Comlter Mmltisizer II顆粒粒度分析儀是根據(jù)微孔兩側(cè)微電壓的變化情況，來測定通過微孔的顆粒的粒度。實驗結(jié)果表明，正常的HCT-15細胞的粒徑是分布在10-20μm范圍之內(nèi)，而藥物作用后細胞粒度主要分布在小于10μm的范圍內(nèi)。這與細胞凋亡時細胞皺縮、體積變小、形成凋亡小體的現(xiàn)象一致。熒光顯微鏡觀察實驗所用熒光染料為Hoechst 33258，它能以非嵌入方式結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)，使細胞核在紫外激發(fā)光下呈藍色熒光。實驗結(jié)果表明，細胞經(jīng)藥物處理后，細胞核破碎，呈現(xiàn)出許多散在的DNA熒光顆粒，而對照組細胞的細胞核內(nèi)熒光強度均一。細胞生化學檢測采用了DNA瓊脂糖電泳和Annexin V binding的方法。從DNA瓊脂糖電泳結(jié)果可見整齊的DNA梯狀條帶，條帶間間隔180-200bp。這與細胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，DNA發(fā)生廣泛的規(guī)律性降解相一致。Annexin V在Ca2+存在時能與磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合。在正常細胞內(nèi)磷脂酰絲氨酸位于細胞內(nèi)膜，無法與染色液中的Annexin V-FITC結(jié)合。在凋亡發(fā)生早期，磷脂酰絲氨酸由細胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細胞外膜，與Annexin V-FITC的結(jié)合率增多。Annexin V binding的實驗結(jié)果正好驗證了這一現(xiàn)象。
以上形態(tài)學和生化學檢測實驗都驗證了本發(fā)明的化合物具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
細胞凋亡過程受多種基因、蛋白質(zhì)的調(diào)控，多條信號傳導途徑相互交錯、相互調(diào)節(jié)，較為復雜。我們采用蛋白質(zhì)印跡的方法檢測了凋亡相關(guān)蛋白的變化情況，發(fā)現(xiàn)PARP蛋白和Rb蛋白被剪切，而其他凋亡和細胞周期蛋白，如CPP32、P21、P53、P27、bax、Bcl-2、c-Myc等未發(fā)生明顯的變化。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物可能通過與CDDP不同的途徑誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
本發(fā)明的咔唑生物堿類的作用特征是或者通過抑制癌細胞的細胞周期周轉(zhuǎn)，或者通過誘導癌細胞發(fā)生凋亡，或者通過直接殺傷癌細胞發(fā)揮抗癌作用。誘導癌細胞凋亡的作用機理研究結(jié)果表明，活性成分可降解PARP，即多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase]，使癌細胞進入凋亡途徑。上述咔唑生物堿類活性化合物也可作為生命科學的研究試劑～細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑用于探索生命現(xiàn)象。
1.粗提物浸膏的制備黑果黃皮莖皮的干燥碎塊5公斤用70％的乙醇回流提取，每次15L回流4小時，共提取三次。合并提取液、減壓濃縮、真空干燥得粗提浸膏300克。
取該浸膏280克分散于2L蒸餾水中，依次用等體積的石油醚、氯仿分別各萃取三次。萃取液分別濃縮干燥后得石油醚提取物25克、氯仿提取物30克。
2.石油醚提取物中活性成分的追蹤分離(化合物1、4、14、20、29的制備)石油醚提取物25克經(jīng)30克硅膠G拌樣，用200克硅膠60H上減壓柱，以石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫分段，得到22個流份。以終濃度為50μg/ml測試各流份活性后，結(jié)合薄層斑點的檢查結(jié)果，合并為A(6.35g)、B(6.25g)、C(1.25g)和D(0.35g)四個活性組份和E(10g)無活性組份。用制備TCL對各活性流份進行活性斑點跟蹤，確定活性斑點后以最有利活性成分分離的方法進行下步分離操作。
A組份經(jīng)8克硅膠G拌樣后，用300克硅膠G濕法上柱，以石油醚/乙酸乙酯(99/1～97/3)混合溶劑梯度洗脫，各流份經(jīng)TCL檢查后，同斑點的流份合并濃縮，然后經(jīng)石油醚重結(jié)晶得到化合物20純品4.5g。
B組份經(jīng)8克硅膠G拌樣后，用300克硅膠G濕法上柱，以石油醚/乙酸乙酯(97/3～95/5)混合溶劑梯度洗脫，各流份經(jīng)TCL檢查后，同斑點的流份合并濃縮，經(jīng)Sephadex LH-20柱層析精制得到化合物14純品3.5g。
C組份經(jīng)1.5克ODS拌樣后，用50克ODS濕法上柱，以乙腈/水(7∶3)的混合溶劑洗脫，各流份經(jīng)TCL檢查后，同斑點的流份合并濃縮，用正己烷精制得化合物4純品0.7g和化合物1純品15mg(不純部分用上述方法反復分離精制)。
D組份用制備TLC分離，以甲醇飽和的正己烷為展開劑展開，主要活性帶刮板分離后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析精制，得到化合物29純品25mg。
經(jīng)上述分離，由石油醚提取物中分離得到的化合物結(jié)構(gòu)如下所示 從黑果黃皮莖皮的石油醚提取物中分離得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)3.氯仿提取物中活性成分的追蹤分離(化合物2～16、20、21、23～27的制備)氯仿提取物30克經(jīng)35克硅膠G拌樣后，用300克硅膠60H干法上減壓柱，以石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫分段，得到24個流份。以終濃度為50μg/ml測試各流份活性，結(jié)合薄層檢查結(jié)果，合并為B(5.0g)、C(4.0g)、D(0.65g)和E(1.35g)四個活性組份及A(1.0g)、F(17g)兩個無活性組份。其中B、C組份與石油醚提取物活性成分相似，按前述方法分離分別得到化合物4純品0.5g、化合物20純品2.7g和化合物14純品2.0g。D、E部位分別上Sephadex LH-20柱層析分離，各流份根據(jù)活性測試和薄層檢查結(jié)果合并為1～11組份。除第11組份無活性外其余組份均具有不同程度活性。各活性組份經(jīng)PTLC及HPLC少量預試確定活性斑點及活性洗脫峰之后，采用針對活性斑點和咔唑類化合物的有效分離方法，交叉利用Sephadex LH-20柱層析、PTLC和制備HPLC等分離純化技術(shù)，從1～10活性組份中分離得到19個咔唑生物堿類單體化合物(2、3、5～13、15、16、21、23～27)。
由氯仿提取物分離得到的咔唑類單體化合物的結(jié)構(gòu)如下所示 從黑果黃皮莖皮的氯仿提取物中分離得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)實施例2 黑果黃皮枝葉中咔唑生物堿的分離制備1.浸膏的提取制備及活性部位的確定取4公斤黑果黃皮的干燥枝葉，粉碎后用95％的醫(yī)用乙醇室溫浸提，每次20L，浸提七天，共提取三次。合并提取液，減壓濃縮，真空干燥，得粗浸膏280克。
取枝葉提取物250克經(jīng)300克硅膠G拌樣，用1000克硅膠60H干法上減壓柱，以石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫分段，得到40個流份。以終濃度為50μg/ml測試各流份的活性，并結(jié)合薄層檢查結(jié)果，合并為B(15g)、C(30g)、E(15g)和F(20g)四個有活性部位及A(10g)、D(20g)和G(50g)三個無活性部位。
2.黑果黃皮枝葉活性成分的追蹤分離(化合物15～22、28的制備)用制備TCL對各活性部位進行活性斑點跟蹤，確定活性斑點后以最有利于活性成分分離的方法進行下步分離。
B部位經(jīng)反復減壓硅膠柱層析、制備薄層和Sephadex LH-20柱層析分離精制以及重結(jié)晶純化等操作，得到化合物20(2.1g)和16(120mg)。
C部位經(jīng)硅膠及Sephadex LH-20柱層析分離以及制備HPLC精制，分別得到化合物17(180mg)、18(140mg)和22(100mg)。
E部位經(jīng)硅膠及Sephadex LH-20柱層析的反復分離和制備HPLC精制，分別得到化合物15(500mg)和19(110mg)。
F部位用ODS柱層析和制備HPLC分別精制得到化合物21(200mg)和28(150mg)。
通過上述分離操作，從黑果黃皮枝葉中分離得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)如下所示。 從黑果黃皮枝葉中分離得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)所得29個化合物的理化常數(shù)見說明書后附表。
實施例3 藥物對癌細胞的細胞周期抑制及細胞凋亡誘導作用研究1.實驗方法溫敏型小鼠乳腺癌tsFT210細胞用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃、通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)?；钚詼y試時，取對數(shù)生長期的tsFT210細胞，用新鮮的培養(yǎng)基配制成密度為2×105cells/ml的細胞懸液，分別按0.5ml/well加至24孔板中，每孔加入5μl不同濃度的樣品甲醇溶液，32℃下培養(yǎng)17h。取藥物作用下培養(yǎng)后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學變化，判斷有無細胞凋亡或細胞壞死的形態(tài)學特征，然后將細胞分別從24孔板轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf離心管中，4℃下3000rpm離心3min，吸去上清液，加0.5μl磷酸緩沖溶液震蕩洗滌一次，相同條件下收集細胞，加150μl碘化丙啶(PI)水溶液(5mg PI，100mg Sodimm citrate and 200mg NP-40 in 100mlH2O)，4℃下染色30min后，用流式細胞儀分析測定細胞中DNA的含量分布。另外，必要時取藥物處理后的細胞，用Hoechst 33258熒光試劑將細胞染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學特征變化，判斷有無細胞凋亡的形態(tài)學特征或細胞周期是被抑制在G2期還是在M期。
2.實驗結(jié)果活性測試中tsFT210癌細胞經(jīng)各種咔唑類生物堿衍生物處理后，在光學顯微鏡下可觀察到各種典型的細胞形態(tài)學變化，抑制于G2/M期的細胞均勻變大而且形態(tài)飽滿，產(chǎn)生凋亡的細胞發(fā)生皺縮、出芽或形成凋亡小體，有細胞毒作用時細胞膨大、形成黑色囊泡呈現(xiàn)壞死細胞的形態(tài)特征。
本實驗在上述形態(tài)學觀察的同時，采用流式細胞術(shù)檢測了藥物的有關(guān)作用，所得數(shù)據(jù)用Wincycle分析軟件進行分析，結(jié)果歸納如下表。
化合物1～29對tsFT210細胞的最低有效濃度(MEC)MEC(μg/ml)化合物 細胞凋亡誘導作用 G2/M抑制作用細胞毒活性Taxol 1.56 0.78＜MIC＜＝1.56DCC 50 25＜MIC＜＝501 ＞200 ＞200 ＞2002 ＞200 ＞200 ＞2003 ＞200 ＞200 ＞2004 12.5 6.25＜MIC＜＝12.51.56 0.78＜MIC＜＝1.56 10050＜MIC＜＝1005 5025＜MIC＜＝50 12.5 6.25＜MIC＜＝12.5 10050＜MIC＜＝1006 25 12.5＜MIC＜＝25 6.25 3.12＜MIC＜＝6.25 10050＜MIC＜＝1007 25 12.5＜MIC＜＝25 6.25 3.12＜MIC＜＝6.25 10050＜MIC＜＝1008 5025＜MIC＜＝50 12.5 6.25＜MIC＜＝12.5 10050＜MIC＜＝1009 ＞200 ＞200 ＞20010 25 12.5＜MIC＜＝25 12.5 6.25＜MIC＜＝12.5 10050＜MIC＜＝10011 12.5 6.25＜MIC＜＝12.5 50 25＜MIC＜＝50 10050＜MIC＜＝10012＞200 ＞200 ＞20013 5025＜MIC＜＝50 25 12.5＜MIC＜＝25 10050＜MIC＜＝10014 25 12.5＜MIC＜＝25 -50 25＜MIC＜＝5015 3.12 1.56＜MIC＜＝3.12 -50 25＜MIC＜＝5016 25 12.5＜MIC＜＝25 -50 25＜MIC＜＝501712.5 6.25＜MIC＜＝12.5- 5025＜MIC＜＝5018 ＞200 ＞200 ＞200196.25 3.12＜MIC＜＝6.25- 5025＜MIC＜＝5020 25 12.5＜MIC＜＝25 - 5025＜MIC＜＝50213.12 1.56＜MIC＜＝3.12- 5025＜MIC＜＝5022 50 25＜MIC＜＝20 - 5025＜MIC＜＝5023 - - 12.5 6.25＜MIC＜＝12.524 - - 25 12.5＜MIC＜＝2525 - - 12.5 6.25＜MIC＜＝12.52612.5 6.25＜MIC＜＝12.5 12.5 6.25＜MIC＜＝12.5 5025＜MIC＜＝50276.25 3.12＜MIC＜＝6.25 6.25 3.12＜MIC＜＝6.25 5025＜MIC＜＝502812.5 6.25＜MIC＜＝12.5- 5025＜MIC＜＝5029 25 12.5＜MIC＜＝25 - 5025＜MIC＜＝50上表結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的咔唑生物堿類化合物對tsFT210癌細胞具有細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導或直接殺傷作用。實施例4 動物體內(nèi)抗癌實驗1.實驗藥物藥物配方配方受試藥物及用量 NaCl DMSO 無菌雙蒸水加至1 化合物4 400克0.36克2ml40ml2 化合物4 200克0.36克2ml40ml3 化合物4 100克0.36克2ml40ml4 化合物20 200克0.36克2ml40ml5 化合物20 100克0.36克2ml40ml6 化合物20 50克0.36克2ml40ml空白對照劑——0.36克2ml40ml藥物制備方法先將定量稱取的受試藥物用DMSO充分研磨，然后分次加入少量生理鹽水混合研磨至均勻乳化后，用生理鹽水定容至40ml。另外，空白對照劑除不加藥物外，其余配制方法與受試藥物相同。
陽性對照藥物環(huán)磷酰胺粉針劑(山西泰盛制藥有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號19980108)臨用前用注射用水配成濃度為6mg/ml的溶液。
2.實驗方法取健康實驗用昆明種小白鼠，雌雄兼?zhèn)?，體重18-20克，隨機分組，每組10只。抽取腹腔接種S180后6-7天的荷瘤小鼠的腹水，用生理鹽水配成癌細胞密度為1×107cell/ml的細胞懸液，給每只小鼠腋下接種0.25ml(接種癌細胞數(shù)約為1×106個/只)。接種24小時后，空白對照組和藥物組每天分別灌胃空白對照劑和藥液一次，連續(xù)給藥10天。陽性對照組則在接種瘤細胞24小時后，腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液僅一次，劑量為60mg/kg。藥物組給藥10天后，稱取體重并將小白鼠處死，解剖剝離瘤體并稱重，照相紀錄解剖形態(tài)和瘤體外觀。有關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)t-檢驗統(tǒng)計處理。
3.實驗結(jié)果實驗結(jié)束時小鼠體重變化及瘤重的實驗結(jié)果及統(tǒng)計檢驗結(jié)果如下表化合物4和20的動物體內(nèi)抗癌實驗組別 給藥劑量實驗后平均體重 實驗后平均瘤重 抑制率 t-檢驗(p)空白對照液 26.2±3.2g1.377±0.929g 0環(huán)磷酰胺60mg/kg(ip)25.1±1.8g0.276±0.134g 79.36 0.003化合物20 100mg/kg(p.o) 19.5±1.6g0.544±0.302g 60.49 0.021化合物2050mg/kg(p.o) 23.5±1.8g0.579±0.422g 57.95 0.025化合物2025mg/kg(p.o) 24.7±3.5g0.747±0.606g 45.75 0.079空白對照液 31.5±2.9g2.348±1.245g 0環(huán)磷酰胺60mg/kg(ip)30.4±2.3g0.634±0.309g 72.98 0.0002化合物4 50mg/kg(p.o) 30.2±2.8g1.047±0.282g 55.39 0.014化合物4 25mg/kg(p.o) 29.3±2.6g1.178±0.483g 49.83 0.001化合物412.5mg/kg(p.o) 30.2±1.9g1.293±0.405g 44.93 0.041表中結(jié)果表明，化合物4和20對實體瘤具有很好的體內(nèi)抗癌作用，統(tǒng)計學處理結(jié)果與對照組比較具有顯著性差異。
實施例5 對人癌細胞的殺傷作用測試(一)1.細胞培養(yǎng)與受試藥物細胞培養(yǎng)實驗采用人大腸癌細胞HCT-15細胞(固型癌細胞)株及人慢性骨髓性白血病細胞K562細胞株。HCT-15細胞及K562細胞分別用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃，5％二氧化碳的條件下繼代培養(yǎng)。
受試藥物化合物4為淡黃色油狀液體，溶于甲醇，避光、-20℃保存。
2.實驗方法及結(jié)果實驗方法采用MTT法，取對數(shù)生長期的HCT-15和K562細胞按2×105個/ml的濃度分別接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/well，培養(yǎng)24小時后，加入化合物4的甲醇溶液，使4的終濃度分別為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、30μg/ml，另設(shè)陰性對照和溶劑對照組(甲醇組)，每個濃度設(shè)3個復孔。藥物作用24小時后，加入5mg/ml的MTT液，10μl/well，再培養(yǎng)4小時后，離心，吸去上清液，加入二甲基亞砜，100μl/well，振蕩溶解結(jié)晶后，利用酶標儀測定570nm處的吸光值(OD)，根據(jù)如下公式，計算細胞增殖抑制率。
細胞增殖抑制率＝(1-實驗組OD/陰性對照組OD)*100％實驗結(jié)果化合物4從10μg/ml起對K562細胞的增殖有明顯的抑制作用，當濃度達30μg/ml以上時，其抑制率達90％以上，而對HCT-15細胞則從1μg/ml起即已具有明顯的抑制增殖作用，濃度在30μg/ml的以上時，其抑制率在70％以上。有關(guān)結(jié)果歸納如下表所示。

*p＜0.05**P＜0.01***P＜0.001上述結(jié)果表明，咔唑生物堿類化合物4對包括實體瘤在內(nèi)的人癌細胞的增殖有顯著的抑制作用。
實施例6對人癌細胞的殺傷作用測試(二)
實驗方法試驗采用人纖維肉瘤HT-1080細胞系和人慢性骨髓性白血病K562細胞系。HT-1080細胞和K562細胞均用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。測試時，取對數(shù)生長期細胞，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液配制成密度為2×105個細胞/毫升的細胞液，將此細胞液接種到96孔板中，每孔分注100μl，置于5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)4小時，每孔加入不同濃度的受試樣品液或陽性對照順鉑溶液各5μl，每種樣品或順鉑均設(shè)三孔，同時設(shè)三孔空白對照，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時。每孔加入5μg/ml的MTT液10μl，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時，4℃、2000rpm離心5分鐘，吸去上清后，每孔加入100μl DMSO，37℃孵育約10分鐘，待結(jié)晶溶解完全后，用定時微量振蕩器振蕩約1分鐘，利用酶標儀測定各孔于570nm處的光密度(以下稱OD)值。
取三孔OD值的平均值，按如下公式計算細胞增殖抑制率抑制率＝(OD空白-OD樣品)/OD空白×100％取每個樣品在不同濃度下的抑制率，繪制量效曲線，由該曲線計算出半數(shù)抑制有效濃度。
實驗結(jié)果按上述方法測試咔唑類化合物對人癌細胞的殺傷作用，結(jié)果如下表所示。
咔唑類化合物對人癌細胞的殺傷作用(MTT法測得的IC50值，μg/ml)

上述生物活性測試結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的咔唑類生物堿衍生物對癌細胞具有直接抑殺作用。
實施例7 對人癌細胞的細胞周期抑制及細胞凋亡誘導作用的測試實驗方法流式細胞術(shù)檢測取對數(shù)生長期的K562及HCT-15細胞，經(jīng)0.1μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml濃度的化合物4作用24小時后，光學顯微鏡下觀測紀錄形態(tài)學變化，離心收集細胞，用70％乙醇固定，RNA酶A祛除RNA后，加入5％碘化丙啶染色液，4℃反應30分鐘后，利用流式細胞儀測定650nm處熒光強度，分析細胞內(nèi)DNA變化情況。
實驗結(jié)果用流式細胞術(shù)檢測經(jīng)藥物作用后的細胞，可在正常的DNA二倍體峰之前檢測到明顯的sub-G0峰，該峰的出現(xiàn)與顯微鏡下觀察到的凋亡細胞的形態(tài)學特征相吻合。形態(tài)學觀察和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，化合物4在低濃度時主要呈現(xiàn)對細胞周期的G2/M期抑制活性和較弱的凋亡誘導作用；隨著濃度的增高，對癌細胞的誘導凋亡作用逐漸增強，細胞周期抑制作用逐漸被凋亡作用所替代。流式細胞術(shù)檢測并經(jīng)Wincycle軟件分析所得結(jié)果見下表。受試藥物及濃度 細胞系 sub-G0％ G0/G1％ S％G2/M％化合物4 0.1mg/ml k5624.52 46.226.616.9HCT-15 3.16 38 16.827.9化合物4 1mg/ml k562 13 39.817.724.8HCT-15 6.48 31.416.530.4化合物4 3mg/ml k56230.7 21.913.7 27HCT-1525 19.711.633.6化合物4 10mg/ml k56215.5 10.710.754.5HCT-1518 8.427.5850.69化合物4 30mg/ml k56251.7 15.910.917.4HCT-15 28.8 17.411.435.1空白對照 k562 3.7 47.829.210.1HCT-15 2.27 44.318.226.8順鉑 50mg.ml k562 20 36.725.815.2HCT-15 23.9 43.6 15 14.6實施例8對人癌細胞的凋亡誘導作用及其作用機理的實驗研究(一)實驗方法顆粒粒度分析儀檢測取對數(shù)生長期的HCT-15細胞，經(jīng)0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、30μg/ml濃度的化合物4作用24小時，離心收集細胞，用PBS漂洗一次，利用Comlter Mmltisizer II型顆粒粒度分析儀分析細胞大小分布，測定藥物對細胞體積大小的影響。
實驗結(jié)果空白對照組HCT-15的細胞粒徑主要分布在10-20μm之間，經(jīng)1μg/ml、10μg/ml、30μg/ml濃度的化合物4作用后，此區(qū)間的細胞分布明顯減少，而直徑小于10μm的細胞顆粒顯著增加，以上結(jié)果表明，HCT-15細胞經(jīng)藥物作用后發(fā)生了凋亡，產(chǎn)生了凋亡小體。有關(guān)數(shù)據(jù)見下表。
細胞含量(％)受試藥物及濃度 細胞直徑＜10mm 10＜細胞直徑＜20空白對照 36.19±11.14 63.71±11.18順鉑50μg.ml 78.03±16.22 21.95±16.20化合物4 0.1μg/ml49.57±8.71 50.36±8.60化合物4 1μg/ml 61.99±14.37 37.94±14.37化合物4 10μg/ml 68.69±4.19 31.23±4.13化合物4 30μg/ml 77.90±18.19 22.03±18.13n＝3實施例9 對人癌細胞的凋亡誘導作用及其作用機理的實驗研究(二)實驗方法熒光顯微鏡檢測取對數(shù)生長期的K562及HCT-15細胞，經(jīng)0.1μg/ml、1μg/ml、3μg/ml濃度的化合物4作用24小時后，離心收集細胞，加0.5％的KCl室溫放置15分鐘，加入固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)，4℃固定10分鐘，用5μg/ml的Hoechst 33258染色，利用熒光顯微鏡觀察，激發(fā)濾光片選用紫外激發(fā)濾光片(352nm)，阻斷濾光片為400-500nm，照相。
實驗結(jié)果實驗觀察到，細胞經(jīng)1μg/ml、3μg/ml的化合物4作用后，即可見細胞核斷裂，染色質(zhì)濃縮，表現(xiàn)出致密的顆粒狀強熒光，與細胞凋亡時的DNA變化現(xiàn)象一致，而正常細胞細胞核熒光較弱，強度均一。
實施例10 對人癌細胞的凋亡誘導作用及其作用機理的實驗研究(三)實驗方法DNA瓊脂糖電泳取對數(shù)生長期的K562及HCT-15細胞，經(jīng)1μg/ml、10μg/ml、30/μg/ml濃度的化合物4作用24小時后，離心收集細胞，加入適量細胞裂解液(5mM EDTA、100mM Tris-ClpH8.5、0.2％SDS、0.2M氯化鈉)、RNA酶，37℃反應過夜，再加入氯化鈉使終濃度為1.5M，高速離心去除蛋白質(zhì)沉淀。取上清液中加入無水乙醇，至終濃度為70％，-20℃放置2小時，高速離心，沉淀即為總DNA。將總DNA用適量TE緩沖液(10mM Tris-Cl，1mMEDTA)溶解后，加入RNA酶，37℃反應2小時祛除RNA。利用2％的瓊脂糖凝膠，1*TBE緩沖液，10V/cm電泳分離DNA，凝膠經(jīng)溴化乙啶染色后，紫外燈下觀察，照相。
實驗結(jié)果實驗結(jié)果表明，細胞經(jīng)1μg/ml、10μg/ml、30μg/ml濃度的化合物4作用后，DNA均被降解成180-200bp的斷片，在照片上表現(xiàn)為典型的細胞凋亡時的整齊的DNA梯狀條帶。
實施例11 對人癌細胞的凋亡誘導作用及其作用機理的實驗研究(四)實驗方法Annexin V binding實驗取對數(shù)生長期的K562及HCT-15細胞，經(jīng)20μg/ml濃度的化合物4作用24小時后，離心收集細胞，加入適量Annexin V-FITC染色液，4℃放置10分鐘，利用流式細胞儀測定534nm處的熒光強度。
實驗結(jié)果實驗結(jié)果表明，細胞經(jīng)20μg/ml濃度的化合物4處理后，Annexin V結(jié)合率明顯增加，說明藥物作用后，細胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸由膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)至膜外，這一現(xiàn)象是細胞凋亡時的一重要事件。
上述實施例5～11中，MTT法、顆粒粒度計數(shù)儀、流式細胞儀、熒光顯微鏡觀察、瓊脂糖電泳和Annexin V binding等實驗結(jié)果表明，化合物4通過抑制癌細胞的細胞周期周轉(zhuǎn)并誘導癌細胞發(fā)生凋亡來發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖及抗癌的作用。
實施例12 對癌細胞的凋亡誘導作用及其作用機理的實驗研究(五)實驗方法蛋白印跡轉(zhuǎn)移實驗取對數(shù)生長期的K562及HCT-15細胞，經(jīng)20μg/ml濃度的化合物4作用24小時后，用刮板收集細胞，加入62.5mM的Tris-HCl(pH6.8)和等體積的細胞裂解液(50mM Tris-HClpH6.8、25％甘油、5％SDS、5％2-ME)，100℃加熱5分鐘，所得溶液即為總蛋白提取液。按Lowery法測定總蛋白含量，取500μg總蛋白，利用不連續(xù)緩沖體系的聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，濃縮膠5％，20V/cm，分離膠12％，30V/cm。再利用電轉(zhuǎn)移的方法，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上。室溫下將醋酸纖維素膜用封阻液(4％脫脂奶粉-PBST)封閉非特異性結(jié)合位點1小時之后，向醋酸纖維素膜上加1‰的anti-momse PARP抗體，37℃反應2小時，用洗脫液(1‰PBST)漂洗3次，每次15分鐘。再向醋酸纖維素膜上加1％的anti-momse antibody，37℃反應2小時，用洗脫液漂洗，加入ECL顯色試劑，顯色1分鐘，照相。
實驗結(jié)果顯示K562和HCT-15細胞經(jīng)20μg/ml濃度的化合物4作用后，細胞內(nèi)116KD的PARP蛋白被切割為85KD和31KD的片段。PARP即多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)ploymerase]是一種與DNA斷裂修復、基因完整性監(jiān)護有關(guān)的酶，能抑制Ca2+-Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶，若116KD的PARP被切割，細胞便進入凋亡途徑。本實驗中用化合物4處理癌細胞可引起PARP被切割，表明4的誘導細胞凋亡作用可能是通過干擾PARP相關(guān)信號傳導系統(tǒng)而實現(xiàn)的。
另外，K562及HCT-15細胞經(jīng)20μg/ml化合物4作用后，115KD的Rb蛋白被切割成46KD和30KD的片段，這一現(xiàn)象進一步說明，化合物4可能啟動了某種凋亡蛋白使PARP和Rb被切割。
取對數(shù)生長期的K562及HCT-15細胞，經(jīng)20μg/ml濃度的化合物4作用24小時后，檢測了P53、P21、Bcl-2、Bax、c-Myc、p27等與凋亡和細胞周期相關(guān)蛋白的表達情況，結(jié)果表明化合物4處理組與對照組相比未發(fā)現(xiàn)明顯變化。CPP32是凋亡過程中重要的半胱氨酸水解酶，當CPP32從32KD的非活化形式，被剪切為17KD和11KD的活化形式后，可使其下游底物PARP、Rb等凋亡相關(guān)蛋白被水解。將20μg/ml的化合物4作用于K562及HCT-15細胞24小時后，檢測CPP32被剪切情況，結(jié)果化合物4處理組的CPP32蛋白未被剪切，而CCDP處理組的CPP32蛋白發(fā)生了水解，說明化合物4誘導凋亡的途徑與CDDP不同。
實施例13 化合物4與14組合物以及化合物4與29組合物的生物活性實驗受試藥物及方法取適量化合物4與14(1∶3)的組合物及化合物4與29(1∶3)的組合物，配制成適宜濃度的甲醇溶液，按實施例3中活性測試的方法進行測試。受試藥物的活性測試終濃度如下表所示。

實驗結(jié)果受試樣品1～4均顯示出很強的誘導tsFT210細胞變形(棒狀，橄欖狀，啞鈴狀及拐角棒狀等)的作用，同時顯著地抑制該癌細胞的增殖。而化合物4單獨作用時，主要表現(xiàn)為細胞周期M期抑制作用，化合物14或化合物29單獨作用時，主要表現(xiàn)為細胞凋亡誘導作用。本實施例實驗結(jié)果表明，當把本發(fā)明的兩種不同藥物按一定的比例組合使用時，會產(chǎn)生單獨使用某一種時不曾有的生物學效應，通過與單獨作用時不同的方式發(fā)揮抑制或殺傷癌細胞的作用。附表1 化合物1～3的理化常數(shù)1 23外觀 無色棱晶淡紅色棱晶 淡黃色棱晶熔點℃178～179 182～183 173～174分子式C13H11NC14H13NO C13H9NO分子量 181 211 195ESI-MS[M+H]+(m/z) 182 212 196HR-EI-MS[M]+--- 211.0990 ---Calcd(m/z) 211.0991341(3.67)，328(3.71)338(3.71)，324(3.80)342(3.70)，328(3.74)UVλmaxMeOHnm(logε) 291(4.19)，250(4.57)295(4.45)，259(4.64)295(4.46)，258(4.42)241(4.75)，228(4.64) 236(4.92) 246(4.53)，235(4.80)3320，2975，2931 3289，2924，2853， 3339，2828，2754IRνmaxKBrcm-11642，1460，1146 1609，1498，1454， 1673，1600，14961058，882 1245，1092，8121243，813附表2 化合物4～6的理化常數(shù)4 5 6外觀 黃色油狀物棕色油狀物 無色針晶熔點℃ --- --- 165-166分子式 C14H13NOC15H15NO2C14H11NO2分子量 211 241 225ESI-MS m/z[M+H]+212 242 226HR-EI-MS[M+] --- 241.1102---Calcd(m/z)241.1103UVλmaxnm(logε)228(4.64)，241(4.75)226(4.76)，241(4.90)213(4.65)，232(4.83)in MeOH 250(4.57)，291(4.19)252(4.61)，259(4.61)245(4.67)，272(4.86)328(3.71)，341(3.67)290(4.22)，324(3.82)288(4.84)，325(4.41)IRνmaxcm-13422，2918，28523415，3285，29343170，1662，1608KBr 1588，1503，14532849，1588，15031502，1344，11411262，828 1453，1231，769 847，824附表3 化合物7～9的理化常數(shù)7 8 9外觀淡黃色棱晶 棕色棱晶 淡黃色針晶熔點℃236(分解) 176(分解) 246-247分子式C13H9NO2C14H11NO3C13H11NO分子量 211241197ESI-MS m/z[M+H]+212242198UVλmaxnm(logε)221(4.25)，239(4.38)227(4.68)，240(4.70)211(4.62)，236(4.80)in MeOH 250(4.28)，272(4.49)252(4.63)，259(4.56)259(4.41)，303(3.35)387(4.31)，333(4.06)289(4.24)，322(3.97)IRνmaxcm-13400，3344，2815 3215，2920，2850 3530，3404，2925KBr 1670，1581，1503 1656，1637，1604 2853，1636，16111455，1251，7271452，1268，8111458，1312，724附表4 化合物10和11的理化常數(shù)10 11外觀無色棱晶 淡黃色無定型粉末熔點℃ 229(分解) ---分子式 C14H11NO3C14H11NO3分子量 241241ESI-MS m/z [M+H]+242242HR-EI-MS[M+] --- 241.0735Calcd(m/z) 241.0733UVλmaxnm(logε)223(4.19)，242(4.18)，278(4.32) 203(4.64)，242(4.85)in MeOH 296(4.27)，340(3.91)，353(3.95) 285(4.84)，340(4.44)IRνmaxcm-13391，3360，2829，1670，1637，3409，2927，2841，1671，1655KBr1584，1501，1459，1216，806 1618，1581，1491，1347，1158附表5 化合物的理化常數(shù)12和1312 13外觀淡黃色棱晶 淡黃色棱晶熔點℃251-252 197-198分子式 C15H13NO3C19H19NO3分子量 255 309ESI-MSm/z[M+H]+256 310HR-EI-MS[M+] --- 309.1365calcd.309.1365UVλmaxnm(logε) 223(4.82)，256(4.27)243(4.79)，2.54(4.63)in MeOH 302(4.62)，381(4.13)288(4.78)，343(4.41)IRνmaxcm-13448，3369，2922，2875，1650 3433，3318，2929，2837，1667KBr 1629，1590，1476，1248，807 1618，1578，1486，1241，791附表6 化合物14～16的理化常數(shù)14 1516外觀 無色方晶白色針晶 淡黃色棱晶熔點℃176-177 178-179 201-202分子式C18H17NO C19H19NO3C20H21NO3分子量 263 309 323ESI-MS m/z[M+H]-264 310 324UVλmaxnm(logε)236(4.84)，287(4.94) 224(4.90)224(4.83)in MeOH 327(4.07)，342(4.10) 300(4.79) 238(4.82)，299(4.76)357(4.04) 344(4.24)342(4.22)IRνmaxcm-13320，2975，2930 3411，2974，2925 3425，2977，2837KBr 1642，1494，1460 1631，1492，1475 1627，1493，14751321，882，742 1281，843，769 1277，880，769附表7 化合物的理化常數(shù)17～191718 19外觀 淡黃色方晶 白色棱晶白色棱晶熔點℃ 176-177256-257 175-176分子式 C19H19NO2C19H9/19NO2C18H17NO2分子量 293293 279ESI-MS m/z[M+H]-294294 280UVλmaxnm(logε)230(5.02)，236(5.03)220(4.72)，240(4.79)221(4.81)，240(4.86)in MeOH 295(4.86)，336(4.30)294(4.65)，324(4.15)294(4.77)，340(4.20)IRνmaxcm-13407，2974，2833 3385，2971，29233419，2976，2922KBr 1646，1586，1492 1465，1497，14451626，1497，14581295，1212，809，720 1269，1212，830，782 1208，836，808附表8 化合物20～22的理化常數(shù)20 21 22外觀 無色針晶 棕色無定型粉末物棕色無定型粉末物熔點℃ 95.5-96.5--- ---分子式 C23H25NOC23H25NO2C23H11NO3分子量 331 347 345ESI-MS m/z[M+H]-332 348 346UVλmaxnm(logε) 238(4.97)，287(4.87) 222(4.92)，241(4.97) 204(4.76)，245(4.85)in MeOH 329(4.19)，342(4.22) 295(4.86)，340(4.28) 267(4.89)，312(4.82)IRνmaxcm-13325，2967，2926 3422，2969，2922，2856 3329，2969，2923，2855KBr2858，1647，1611，1460 1627，1498，1440 1667，1573，14741445，1218，846，747 1994，1210，828，1420，1323，813附表9 化合物23～25的理化常數(shù)23 2425外觀 磚紅色針晶 棕色針晶 淡紅色無定型粉末熔點℃ 238(分解) 226(分解)---分子式 C13H9NO2C13H9NO3C14H11NO3分子量 211227 241ESI-MS m/z[M+H]-212228 242UVλmaxnm(logε)224(4.39)，258(4.19) 227(4.58)，252(4.48) 227(4.37)，252(4.31)in MeOH 268(4.11)，286(3.84) 260(4.56)，289(4.20) 260(4.36)，289(4.02)382(2.18) 373(3.80) 345(3.06)，381(3.19)IRνmaxcm-13220，2921，28533387，3218，2919，2850 3227，2927，2854KBr 1664，1637，1602 1658，1632，1604 1662，1635，16041536，1468，1383，747 1535，1259，7461531，1458，1251，740附表10 化合物26～28的理化常數(shù)26 27 28外觀 棕色無定型粉末 棕色無定型粉末 棕色無定型粉末熔點℃ --- --- ---分子式C26H18N2O3C27H20N2O3C38H36N2O6分子量 406 420 616ESI-MS m/z[M+H]-407 421 617HR-EI-MS m/z[M+]406.1304 ---616.2574Calcd(m/z) 406.1311 ---616.2573UVλmaxnm(logε)225(5.26)，245(5.15) 226(5.02)，245(4.93) 225(5.30)in MeOH 292(4.62)，332(4.27) 293(4.43)，334(4.09) 300(5.10)345(4.28) 346(4.08)，390(3.84) 344(4.78)IRνmaxcm-13388，2921，28583398，2924，2855 3500，3465，2972KBr 1638，1589，1536，1469 1644，1560，1508，1459 2854，1642，16101396，1324，1230，747 1396，1304，1230，749 1459，1284，1202，728附表11 化合物29的理化常數(shù)29外觀 無色棱晶熔點℃ 146.5-147.5分子式C23H25NO分子量 331ESI-MS m/z[M+H]-332218(4.76)，241(4.85)，UVλmaxnm(logε) 254(4.66)in MeOH 304(4.44)，332(3.85)3478，2953，2932，IRνmaxcm-12859，1613，1492KBr 1458，1306，1215，873附表12 化合物1～3的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)1 (in CDCl3) 2(in CD3COCD3) 3(in CD3COCD3)Positions HMBC HMBC HMRCδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCH1 7.32d(8.0) 110.2 3，4a 7.47d(7.0) 110.2 3，4a7.64d(8.5) 112.1 3，4a2 7.24dd(8.0，1.0) 127.2 1 4，9a，3-CH37.37d(7.O) 127.2 4，9a，3-CH27.95dd(d.5，1.5) 127.2 1 4，9a，3-CHO3 -128.8-128.8 - 1304 7.88d(1.0) 120.2 2，9a，3-CH31 8.06s120.2 2，9a，4b，3-CH28.69d(1.5) 124.8 4b，2，9a，3-CHO 14a -123.6-123.6 - 124.14b -123.3-123.3 - 123.95 8.05d(8.0) 120.2 7，8a，4a8 8.11d(7.O) 120.27，8a，4a 8.24 dd(7.5，1.0) 127.2 7.8a，4a 86 7.22m119.3 5，74b，8 7.16dd(7.0，7.0) 119.3 4b，87.27ddd(7.5，7.5，1.0) 120.9 5，7 8，4b7 7.40AB type 125.7 8 5，8a 7.35dd(7.0，7.0) 125.7 5，8a7.46ddd(7.5，7.5，1.0) 127.58 5，8a8 7.40AB type 110.6 6，4b 7.49d(7.0) 110.6 6，4b7.58dd(7.5，1.0) 112.4 6，4b8a -139.9-139.9 - 141.69a -137.8-137.8 - 144.7N-H 7.91brs- 10.32brs ---3-CH32.54s21.4 3 2，4 - ---3-CHO - -10.07 192.23 2，4CH2OCH34.56 2H s75.6 2，4CH2OCH33.33 3H s57.5 3-CH2附表13 化合物4～6的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)4(in CDCl3) 5(in CD3COCD3)6 HL-2(in CDCl3)Positions HMBC HMBC HMBCδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCH1 -145.6 - 145.9- 146.1 -2 6.87(s) 108.1 1 4，9a，3-CH26.84(d1.0) 106.2 1 4，9a，3-CH27.46(d1.0) 103.6 14，9a，3-CHO3 -129.8 - 130.1- 130.24 7.66(s) 112.9 2，9b 1 7.53(d1.0) 112.1 4b，2，9a，3-CH21 8.19(d1.0) 120.34b，2，9a，3-CHO4a -124.7 - 123.7 - 123.74b -123.9 - 123.4 - 123.65 8.19(d8.0) 120.8 7，8a 8 7.94(d7.0) 120.1 4b 7，8a，4a8 8.11(d8.0) 120.7 7，8a，4a 86 7.38(dd8.0，7.5) 119.5 4b，8 7.03(dd7.0，7.0) 118.8 7 4b，8 7.32(dd8.0，8.0) 120 77 8，4b7 7.54(dd7.5，8.0) 125.8 5，8a 7.24(dd7.0，7.0) 125.3 5，8a 7.48(dd8.0，8.0) 126.6 5，8a8 7.49(d8.0) 111.3 6，4b 7.43(d7.0) 111.4 6，4b 7.51(d8.0) 111.5 6，4b8a -139.9 -140.2 - 139.49a -128.4 -129.6 - 134.1N-H 8.30(br s) -10.21(br s)-8.63(br s) -8a，9a 4a，4b1-OCH34.07(s) 55.7 13.87(s) 55.0 1 4.06(s) 55.8 13-CHO- -- - 10.06(s) 191.83 2，413-CH3 2.70(s) 22.23 2，4- - - -CH2OCH34.43 2H(s) 75.13 2，4，-OCH3CH2OCH3 3.21 3H(s) 56.83-CH2附表14 化合物7～9的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)(in CD3COCD3)7 89PositionsHMBC HMBCHMBCδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCH1 -143.7 - 146.4 6.83(s)972，9a 3，4a2 7.42(d1.5) 107.51 4，9a，3-CH37.61(s) 107.6 1 4，9a，3-COOH - 155.63 -130.2 - 112.5 - 117.64 8.24(d1.5) 118.2 2，9a，3-CH31 8.50(s) 116.9 4b，2，9a，3-COOH 1 7.64(s) 122.1 4b，2，9a，3-CH314a -124.1 - 124.4- 116.94b -123.6 - 122.9- 124.45 8.17(d8.0) 120.47，8a，4a 8 8.20(d 7.5) 121.3 7，8a，4a 8 7.91(d7.0) 119.6 7，8a，4a 86 7.24(dd8.0，8.0) 119.9 5，74b，87.25(dd7.5，7.5)120.7 5，7 8，4b 7.06(dd7.0，7.0)119.3 5，7 8，4b7 7.45(dd8.0，8.0) 126.28 5，8a7.44(dd7.5，7.5)127.1 85，8a 7.21(dd7.0，7.0)124.485，8a8 7.63(d8.0) 111.8 6，4b7.62(d7.5) 112.6 6，4b 7.36(d7.0) 111.1 6，4b8a - 140.3- 141.4 - 140.89a - 134 - 134.1 - 140.9N-H - - -- 9.79(br s)-1-OCH3- 4.07(s) 56.1 1 - -1-OH 7.34(br s) - - - -3-CHO 9.98(br s) 22.2 3 2，4 -- - -3-COOH - 21.410.72 168.4- -2-OH 8.10(br s)- 21，33-CH32.21(s) 16.732，4附表15 化合物10～11的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)10(in CD3COCD3)11(in CD3COCD3)PositionsHMBC HMBCδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCH1 - 143.7 - 144.1 -2 7.39(s) 106.9 3 4，9a，3-CHO7.35(d1.5) 107.8 1 4，9 a，3-CHO3 - 129.8 - 131.34 8.23(s) 118.7 4b，2，9a，3-CHO 3 8.13(d1.5) 118.1 4b，2，9 a，3-CHO4a - 124.1 - 125.44b - 124 - 118.25 7.75(d2.0) 102.7 64a，7，8a 8 8.04(d7.5) 1226 7，8a，4a 86 - 154.5 6.88(dd7.5，2.0)110.1 78，4b7 7.09(dd9.0，2.0)115.8 6 5，8a - 160.68 7.54(d9.0) 112.5 8a 6，4b 7.14(d2.0) 96.1 8a 6，4b8a - 135.1 - 142.89a - 134.6 - 134.6N-H -10.65(br s) -1-OH - - -3-CHO 9.96(s) 191.3 3 2，4， 1 9.97191.9 32，4 16-OCH33.88(s) 55.26 -7-OCH3-3.8855.8 7附表16 化合物12～13的600MHz1H和150MHz13CNMR數(shù)據(jù)12(in CD3COCD3)13(in CD3COCD3)Positions HMBC HMBCδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCH17.07(s) 98.4 2，9a 3，4a -144.12 - 155.3 7.22(d1.5)108.3 14，9a，3-CHO3 - 118.9-131.247.60(s) 121.6 2，4b，9a，3-CH3 1 8.01(d1.5)118.0 4a 4b，2，9a，3-COH 14a- 115.7-126.04b- 119.5-119.058.03(d7.0) 127.6 7，8a，4a7.86(d7.0) 119.4 7，8 a，4a 866.76(d7.0) 103.074b，8 6.89(d7.0) 106.5 5，78，4b7 - 161.5-157.38 - 109.4-113.48a- 140.2-141.59a- 141.5-135.0N-H 10.65(br s) - 10.05(s) -1 or 2-OH - - -3or8-CHO 10.45(s) 190.232，4 9.85(s) 191.83 2，47-OCH33.90(s) 56.873.81(s) 56.8 73-CH3 2.20(s) 16.7 8 8a- -10 3.61 2H(d5.5)24.4 8，11 7，8a，1211 5.21 1H(d5.5)123.510 14，1512 -132.213 1.71 3H(s) 18.0 12 1114 1.54 3H(s) 25.8 12 11附表17 化合物14～16的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)14(in CDCl3)15(in DMSO-d6) 16(DMSO-d6)Positions HMBC HMBC HMBCδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCHδH(J in HzδC2JCH3JCH4JCH1 - 104.5 - 104.1 3，4a - 104.22 - 149.9 - 147.3 1 4，9a，3-CHO - 147.63 - 116.8 - 115.6 - 116.14 7.69(s) 121.2 2，9b，3-CH37.52(s) 119.7 4b，2，9a，3-CHO 7.58(s) 120.12，4b，9a，3-CH314a - 118.7 - 116.8 - 116.64b - 124 - 114.3 - 114.95 7.93(d8.5) 119.37，9a7.43(s) 103 7，8a，4a7.49(s)102.9 6 7，8a，4a 86 7.20(dd8.5，7.0)119.64b，8 - 142.6 5，7 8，4b - 143.67 7.33(dd7.0，8.0)124.35，9a - 145.5 8 5，8a - 1488 7.37(d8.0) 110.44b，66.81(s) 119.7 6，4b 6.93(s)94.9 7，8a 4b，658a - 139.6 - 134.9 - 134.49a - 134.9 - 134.7 - 134.8N-H7.83(br s)- 10.67(br s) - 8a，9a 4a，4b 10.87(br s) - 8a，9a 4a，4b10 6.60(d10) 117.2 12 6.83(d10)117.9 1 2，9a，12 6.86(d8.0) 117.9 1 12，9a，2 13，1411 5.69(d10) 129.4 12 1 5.74(d10)128.7 121，13，14 5.75(d8.0) 128.9 1213，14，1212 - 75.9- 75.1 - 75.413 1.50(s) 27.7 12 11 1.40 6H(s) 27.312 11，14 1.40(s)27.41211，14 1014 1.50(s) 27.7 12 11 1.40 6H(s) 27.312 11，13 1.40(s)27.41211，13 103-CH32.36(s) 16 3 2，42.21 3H(s) 15.7 3 2，4 2.22(s)15.93 2，4 16-OCH33.81 3H(s) 56.4 6 3.80(s)56.2 67-OH 8.82(br s)- 7 6，87-OCH33.82(s)55.7 7附表18 化合物17～19的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)17(DMSO-d6) 18(DMSO-d6)19(DMSO-d6))Positions HMBC HMBCHMBCδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCH1 - 104.1 - 104.2 -104.22 - 148.8 - 147.8 -147.53 - 116- 116.3 - 1164 7.68(s) 120.8 4b，2，9a，3-CHO 1 7.57(s) 120.14b，2，9a，3-CH31 7.51(s) 119.7 4b，2，9a，3-CH314a - 116.1 - 116.2 -116.54b - 123.2 - 116.7 -115.65 7.48(d 2.0) 102.3 6 7，8a，4a 8 7.76(d8.5) 119.7 7，9a，4a 8 7.64(d8.5) 119.6 7，9a，4a 86 - 1536.70(dd8.5，1.5)107.1 7 4b，8 6.55(d8.5) 107.9 7 4b，87 6.89(dd2.0，9.0)112.7 6 5，8a - 157.4 -155.38 7.28(d9.0) 110.9 6，4b 6.88(d 1.5) 94.77 4b，6 6.76(s) 96.47 4b，68a - 134.5 - 141- 141.39a - 135.8 - 135- 134.8N-H 10.87(br s) -8a，9a 4a，4b 11.00(br s) -8a，9a 4a，4b 10.82(br s)- 8a，9a4a，4b10 6.87(d10) 117.7 1 2，9a，126.67(d9.5) 117.8 1 2，9a，12 6.84(d 9.5) 117.9 1 2，9a，1211 5.75(d10) 128.6 12 1，13，145.76(d9.5) 129 12 1，13，14 5.75(d9.5) 128.9 12 1，13，1412 - 75.4 - 75.4 -75.213 1.41 6H(s) 27.3 12 11，14 1.40(s) 27.312 11，141.40 6H(s)27.3 12 11，1414 1.41 6H(s) 27.3 12 11，13 1.40(s) 27.312 11，131.40 6H(s)27.3 12 11，133-CH32.22 3H(s) 15.732，4 2.22(s) 15.832，4 2.20 3H(s)15.8 3 2，46-OCH33.81 3H(s) 55.46 - -7-OCH3- 3.81(s) 55.2 7 - -7-OH 9.18(br s) - 7 6，8附表19 化合物20～22的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)20(in CDCl3) 21(in DMSO-d6)22(in DMSO-d6)Positions HMBC HMBC HMBCδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCH1 - 104.2 - 104.9 - 112.12 - 150- 151.8 - 127.23 - 118.5 6.70(d8.0)109.7 - 1304 7.68(s) 121.2 2，9b，3-CH3 1 7.94(d8.0)120.94b，2，9a，3-CHO 1 7.50(s) 124.84b，2，9a，3-CHO 14a 116.7 116.5 - 124.14b - 124- 123.1 - 123.95 7.92(d8.5) 119.2 7，9a 8 8.56(s) 122.8 7，8a，4a 8 7.66(d8.5) 127.2 7，8a，4a 86 7.19(dd8.5，8.0)119.3 4b，8 - 128.46.60(dd8.5，1.5)120.9 5，7 8，4b7 7.32(dd8.0，8.0)124.2 5，9a 7.85(d8.0)125.58 5，8a - 127.5 85，8a8 7.36(dd8.0) 110.4 4b，6 7.56(d8.0) 111 6，4b6.83(d1.5) 112.46，4b8a - 139.5 - 143.7- 141.69a - 134.9 - 137.2- 144.7N-H 7.80(br s) - 11.87(br s) - 8a，9a4a，4b 10.86(br s) -8a，9a 4a，4b3-CH3 2.37(s) 16 32，4 --2.25(s) 15.73 2，410 6.63(d10.0) 117.5 1 2，12，9b 6.70(d10) 117.412，12，9b 6.92(d10) 118.3 1 2，12，9b11 5.65(d10.0) 128.5 1215.81(d10) 128.812 1 5.70(d10) 127.9 12112 - 78.2 78.3 - 77.413 1.79(m) 40.9 12，14 11，1512-CH3 1.70(m) 40.3 12，14 11，1512-CH3 1.66(m) 40.1 12，14 11，1512-CH314 2.20(m) 22.8 2.08(m) 22.2 2.09(m) 22.215 5.14(t7.0) 124.3 17 5.08(t7.0) 124 175.07(t7.0) 124.1 1716 - 131.7 130.8- 130.617 1.69(s) 25.6 16 15，18 1.60(s) 25.3 16 15，18 1.59(s) 25.316 15，1818 1.61(s) 17.5 16 15，17 1.55(s) 17.4 16 15，17 1.51(s) 17.216 15，1712-CH31.46 3H(s) 25.9 12 11，1311.39(s) 25.8 12 11，13 1 1.37(s) 25.412 11，13 16-CHO 10.01(s) 191.86 5，7- -7-OH 9.22(br s) - 76，8附表20 化合物23～25的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)23(in DMSO-d6) 24(in CD3COCD3) 25(in CD3COCD3)Positions HMBCHMBC HMBCδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCH1 - 180.1- 180 - 180.12 6.62(d1.0) 131.6 4，9a，3-CH36.46(q 1.5) 132.2 4，9a，3-CHO 6.48(q1.5) 132.4 4，9a，3-CHO3 -148 - 148.1- 148.44 - 183.1- 184.1 184.24a - 115.4- 117.4- 117.24b - 123.6- 118.5- 119.15 8.04(d8.0) 121.6 7，8a，4a 8 7.94(d7.5) 123.7 7，8a，4a8 7.99(d7.5) 123.7 7，8a6 7.30(dd8.0，8.0)123.8 7 4b，8 6.46(dd7.5，1.5)115.78，4b 6.97(dd7.5，2.0)115.9 7 8，4b7 7.38(dd8.0，8.0)126.2 5，8a - 157.9- 160.58 1.52(d8.0) 113.8 7 6，4b 6.99(d1.5) 98.3 7 6，4b 7.06(d2.0) 95.9 7 6，4b8a - 137.4- 140.1- 145.19a - 135.9- 135.8- 140N-H12.8(br s) - 8a 4a，4b11.23(br s) - 11.42(br s) -3-CH32.06(d1.0) 15.6 3 2，4 2.08(d1.5) 15.7 3 2，4 2.08(d1.5) 15.8 3 2，47-OH -- 8.67(br s) - - -7-OCH34.09(s) 55.8 7附表21 化合物26～27的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)(in CD3COCD3)2627Positions HMBCHMBCδH(J in Hz) δC2JCH3JCH4JCHNOE｀s δH(J in Hz)δC2JCH3JCH4JCH1- 180- 179.92- 143- 142.83- 146.4 - 146.44- 184- 183.94a - 117.3 - 117.44b - 125.1 - 125.25 8.16d(7.0)123.2 4b7，8a，4a 8 68.28d(6.5)123.2 4b7，8a，4a 86 7.28dd(7.0，6.0) 124.6 5，7 4b，8 8a 5，7 7.41dd(6.5，6.5) 124.7 5，7 4b，8 8a7 7.34dd(6.0，7.0) 127.3 6，8 5，8a 4b 6，8，57.47d(6.5，6.5) 127.4 6，8 5，8a 4b8 7.56d(7.0) 114.46，4b 57，6 7.69d(6.5)114.5 6，4b 58a- 138.8 -138.89a- 137.1 -137N-H - 11.76(br s)-3-CH31.74 3H s13.5 32，41，2｀，4a 4，3｀-CH31.85s13.5 32，41，2｀，4a1｀ - 143.5 -146.42｀ - 119.4 6.98 109.14，9a，3-CH33｀ - 127.6 -127.64｀ 6.77s 113.2 2，9a，3-CH3 3-CH3-120.34a｀ - 123.3 -122.74b｀ - 123.8 -123.65｀ 7.63d(7.0) 121.6 4b｀ 7｀，8a｀，4a｀ 8｀ 6｀7.76dd(6.5，1.0) 121.5 4b｀7｀，8a｀，4a｀ 8｀6｀ 6.79dd(7.0，6.5)119.6 5｀，7｀ 8｀，4b｀ 8a｀5｀，7｀6.93dd(6.5，6.5，1.0)119.8 5｀，7｀ 8｀，4b｀ 8a｀7｀ 7.14dd(6.5，6.5)128.9 8｀ 5｀，8a｀ 4b｀6｀，8｀7.28dd(6.5，6.5，1.0)125.9 8｀ 5｀，8a｀ 4b｀8｀ 7.41d(6.5) 112.2 6｀，4b｀ 7｀，6｀7.54dd(6.5，1.0) 112.26｀，4b｀8a｀ - 141.3- 141.29a｀ - 129 - 129.4N｀-H11.5br s10.43 br s-1｀-OH(OCH3) - 4.05s55.93｀-CH32.10 3H s 19.2 3｀ 2｀，4｀ 1｀，23-CH32.30s19.53｀ 2｀，4｀1｀，2附表22 化合物28的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)(in DMSO-d6)HMBCPositions δH(J in Hz)δC2JCH3JCH3JCHNOE′s1，1′ - 104.52，2′ - 147.23，3′ - 115.44，4′ 7.61s 119.4 2，9a，4b，3-CH31 3-CH34a，4a′ - 117.54b，4b′ - 113.65，5′ 7.55s 101.2 7，8a，4a，8′ 66，6′ - 104.9 5，77，7′ - 143.3 6，8，58，8′ - 142.6 7，68a，8a； - 134.99a，9a′ - 134.7NH，NH′ 9.82br s - 8a、9a4a、4b3-CH3，3′-CH32.23s 15.9 3 2，41 4，3′-CH37-OH，7′-OH 7.99br s -7 6，88-OCH3，8′-OCH33.93s 56.4 810，10′ 7.05d(9.5) 119.11 2，9a，1211，11′ 5.56d(9.5) 127.7121，13，1412，12′ - 74.813，13′ 1.36s 27.4 1214，11 1014，14′ 1.35s 27 1213，11 10附表23 化合物29的600MHz1H和150MHz13C NMR數(shù)據(jù)(in CDCl3)PositionsHMBCδH(J in Hz) δC2JCH3JCH3JCH1-108.72-151.73-120.447.64 s 119.82.9a4a -117.54b -125.157.88d(8.0) 119.77，8a，4a67.07dd 8.0，7.5) 119.64b，877.23dd(7.5，8.0) 124.75，8a87.44d(8.0) 111.86，4b8a-141.79a-139.5N-H --3-CH32.32 3H s16.8 2，410 3.46d(9.5) 38.1 1，11，16 211 2.71dd(9.0，9.0) 40.5 1312-8512-CH31.38 3H s26.7 12 11，1313，13′ 1.66m，2.09m 40.814，14′ 1.73m，1.80m 26.315 2.54m48.116 -40.917 1.58 3H s34.9 16 11，15，1818 0.64 3H s19.1 16 11，15，1權(quán)利要求
1.可作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑或抗癌劑的藥物，其特征是該藥物的活性成分是咔唑類生物堿衍生物或其鹽，所述咔唑類生物堿衍生物為如下所示29個化合物。
2.權(quán)利要求1所述的可作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑或抗癌劑的藥物，其特征是所述咔唑類生物堿衍生物中優(yōu)選的是化合物4～8和化合物14～22，或這些化合物的鹽。
3.權(quán)利要求1所述的可作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑或抗癌劑的藥物，其特征是該藥物中含有一種或二種以上所述咔唑類生物堿衍生物或其鹽的組合物。
4.權(quán)利要求3所述的可作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑或抗癌劑的藥物，其特征是所述含有一種或二種以上咔唑類生物堿衍生物或其鹽的組合物優(yōu)選的為化合物4與14的組合物和化合物4與29的組合物。
5.權(quán)利要求1所述的可作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑或抗癌劑的藥物的制備方法，其特征為用乙醇或60-70％的乙醇提取黑果黃皮的莖皮或枝葉，得粗浸膏；用有機溶劑萃取該浸膏，得到提取物；將該提取物經(jīng)反復的硅膠和Sephadex LH-20柱層析、反復的制備硅膠薄層層析、反相制備HPLC和重結(jié)晶，分離出浸膏中的咔唑類生物堿衍生物，配之以藥物可接受的輔劑，制備而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及可作為細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑或抗癌劑的咔唑生物堿類藥物及其制備方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)從植物黑果黃皮中分離出的29個咔唑類生物堿衍生物或它們的鹽可用于制備抗癌藥物或制備細胞周期抑制劑或細胞凋亡誘導劑。本發(fā)明的咔唑生物堿類藥物的制備方法是用乙醇或含水乙醇提取黑果黃皮的干燥莖皮或枝葉,得粗浸膏,用有機溶劑萃取,經(jīng)反復的柱層析、制備硅膠薄層層析、反相制備HPLC和重結(jié)晶等操作,分離出浸膏中的咔唑類生物堿衍生物,配之以藥物可接受的輔劑,制備而成。
文檔編號C07D209/00GK1357327SQ01123988
公開日2002年7月10日 申請日期2001年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月9日
發(fā)明者崔承彬, 蔡兵, 閻少羽, 趙慶春, 張冬云, 姚新生, 曲戈霞 申請人:崔承彬