專利名稱：一種從動物組織中提取神經(jīng)節(jié)苷脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從動物腦組織及其他組織中提取以神經(jīng)節(jié)苷脂為主要成分的糖脂類物質(zhì)的方法。
上述文獻所報道的方法以牛腦為主要原料，以氯仿和甲醇為提取劑，提取粗品后再進行純化和精制；而上述專利所公開的技術(shù)以乙醇和石油醚為提取劑，提取粗品后再進行純化和精制。上述文獻和專利所述的方法所采用的提取過程和提取劑均沒有顧及神經(jīng)節(jié)苷脂是一種強極性的酸性化合物，它帶有很強的負(fù)性電荷這樣一個基本特點，因此，提取率較低，所獲得的產(chǎn)品的純度較差，且膽固醇、中性脂質(zhì)和其他雜質(zhì)的含量較高，必須經(jīng)過反復(fù)精制才能夠符合食用和藥用的要求，生產(chǎn)成本較高，不能滿足人們?nèi)粘Ｉ?、醫(yī)藥和保健領(lǐng)域的需求。
在神經(jīng)節(jié)苷脂中，鞘糖脂的寡糖鏈上含有唾液酸，表征它是一種強極性的酸性化合物，它帶有很強的負(fù)性電荷；在生物膜結(jié)構(gòu)中，唾液酸及其絲氨酸構(gòu)成了極性頭(區(qū))，其結(jié)構(gòu)內(nèi)部既有親水區(qū)又有疏水區(qū)。
為此，本發(fā)明選用偶極矩在1.84Debye～1.68Debye之間的極性有機溶劑作為提取劑，這些溶劑的極性度使神經(jīng)節(jié)苷脂能夠穩(wěn)定地溶解在其中，而溶劑的非極性部分，破壞膜結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)，從而加速神經(jīng)節(jié)苷脂的增溶。
其次，本發(fā)明根據(jù)提取系統(tǒng)中，液—固，液—液物料化學(xué)結(jié)構(gòu)特性，選用溶解度參數(shù)為7.0～9.2或溶劑強度∑°為0.01～0.42的非極性溶劑，對所獲得的含有神經(jīng)節(jié)昔脂和其他雜質(zhì)的極性溶劑進行反相萃取，使神經(jīng)節(jié)苷脂在反相萃取的多元分配分層中達(dá)到理想的效果。
本發(fā)明需要對生物材料進行預(yù)處理。酮類化合物，特別是丙酮，是生物材料破膜(壁)劑，它能破壞雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，使完整細(xì)胞破損，穿孔，從而加速細(xì)胞內(nèi)含物的溶出，使提取時間和次數(shù)減少。丙酮還能除去生物材料中的膽固醇(腦組織中)，中性脂質(zhì)(胎盤中)，而甲乙酮能除去膽汁酸(膽組織中)。生物材料提取過程中，常因某些酶類的酶解作用，而使目的產(chǎn)物受到破壞，而丙酮的作用，常能抑制這些酶的活性，使提取工作順利進行。
本發(fā)明所述的方法依次包括如下步驟(1)生物材料的預(yù)處理將新鮮的或經(jīng)低溫干燥的或經(jīng)自溶的生物材料，經(jīng)絞碎，勻漿，粉碎后用酮類物質(zhì)及其混合物浸漬處理，處理溫度一般為5℃～25℃，浸漬時間為4～34小時，過濾，收集濾餅。浸漬處理次數(shù)為3～6次，酮類物質(zhì)用量為生物材料體積的1.5～4倍，優(yōu)選的酮類物質(zhì)為丙酮或甲乙酮，所說的生物材料包括動物腦組織、胎盤或血清。
(2)極性溶劑提取在步驟(1)的濾餅中加入極性溶劑進行提取，攪拌，過濾，收集濾液；極性溶劑用量為濾餅的5～10倍，提取次數(shù)為1～3次，提取溫度為10℃～60℃，推薦溫度為20℃～35℃；所說的極性溶劑為偶極矩在1.68Debye～1.84Debye之間的極性溶劑，所述溶劑的極性度使神經(jīng)節(jié)苷脂能夠穩(wěn)定地溶解在其中，而溶劑的非極性部分，破壞膜質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)，從而加速神經(jīng)節(jié)苷脂的增溶；優(yōu)選的極性溶劑包括水、甲醇、四氫呋喃或二甲基甲酰胺等中的一種或一種以上，提取時間為1～4小時；按照本發(fā)明，如以水和上述其他極性溶劑的混合物作為提取劑，其比例為水/其他極性溶劑＝0.5～6。
(3)反相萃取在步驟(2)的濾液中加入非極性溶劑，經(jīng)攪拌、靜置、分相，使濾液中的神經(jīng)節(jié)苷脂分配在極性溶劑相中，雜質(zhì)分配在非極性溶劑相中，從而確保了極性溶劑相中神經(jīng)節(jié)苷脂的純度。下層極性溶劑相經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥得成品神經(jīng)節(jié)苷脂；非極性溶劑的加入量為濾液混合物重量的0.5～2.5倍，進行多元分配的次數(shù)為1～3次，多元分配的溫度為10℃～35℃，推薦溫度為25℃～30℃；按照本發(fā)明，步驟(2)的極性溶劑提取后所獲得的液固混合物，可直接加入非極性溶劑，進行液-液，液-固多元分配，然后進行過濾，獲得濾液，靜置分層，下層極性溶劑相經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥得成品神經(jīng)節(jié)苷脂；減壓濃縮溫度控制在40℃～60℃，推薦溫度在42℃～50℃，時間控制在2～8小時，推薦時間控制在3～5小時左右。時間過長會造成神經(jīng)節(jié)苷脂中重要基團唾液酸的分解，或造成產(chǎn)品氧化破壞；所說的非極性溶劑的溶解度參數(shù)為7.0～9.2或溶劑強度∑°為0.01～0.42，優(yōu)選的為正己烷、庚烷、氯仿、乙醚、石油醚、甲基戊烷或汽油中的一種或一種以上。
采用上述方法所獲得的神經(jīng)節(jié)苷脂，其純度可達(dá)81％，且膽固醇、中性脂質(zhì)、的含量較低。
可采用文獻Svennerholm.L.Methods in Engymology(VI)453.1963對本發(fā)明的產(chǎn)品進行測定，按常規(guī)測定其結(jié)構(gòu)中唾液酸的含量。
由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明的的優(yōu)點是十分明顯的(1)采用生物材料預(yù)處理法，將生物材料特別是腦組織中的大量膽固醇，中性脂質(zhì)，用丙酮處理除去，為后續(xù)工藝帶來方便，所得神經(jīng)節(jié)苷脂的產(chǎn)量和純度均為提高；(2)采用生物材料預(yù)處理，有利于生物材料中細(xì)胞內(nèi)含物增溶釋放，降低了提取劑用量，節(jié)約提取時間，減少提取次數(shù)；(3)采用多種溶劑配伍，能找到工藝上最佳熱力學(xué)條件，理論和實踐上都有較好效果。
綜上所述，本發(fā)明的方法，生產(chǎn)工藝簡單，適宜于規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品純度高，能夠滿足食用和藥用的要求。
實施例1將100克豬腦組織用絞肉機絞碎，勻漿，在冷處用丙酮浸漬三次，第一次用3倍量，第二次用2.5倍量，第三次用1.5倍量，每次24小時，用細(xì)布或壓濾機過濾；上述處理過的豬腦組織，加入200ml水，1200ml四氫呋喃，充分?jǐn)嚢?，離心，殘渣用300ml四氫呋喃，重復(fù)提取一次，合并二次提取液，加入450ml石油醚，進行多元分配，分層后得下層極性溶劑相，上層非極性溶劑相用100ml的水重復(fù)提取一次，合并下層極性溶劑相，過濾，45℃減壓濃縮，冷凍干燥得成品，色灰白，能溶于水，溶于氯仿——甲醇溶液(2∶1，體積比)，純度為81％。
實施例2將500克豬腦組織，絞碎勻漿，60℃熱風(fēng)吹干，磨成細(xì)粉(水分小于8％)，取上述腦干粉，用丙酮浸泡5小時，重復(fù)5次，過濾，在濾餅中按1∶5的比例加入80％的乙醇水溶液，充分?jǐn)嚢?.5小時，接著按1∶4加入正己烷，充分?jǐn)嚢?.5小時，靜止分層后，分得下層乙醇溶液，上層非極性相用500ml水重復(fù)抽提，合并醇和水提取液，40℃減壓濃縮，冷凍干燥得成品，白色或灰白色，純度79.0％。
實施例31公斤牛胎盤，絞碎，勻漿，用實施例1方法進行丙酮處理后加入2L蒸餾水，12L四氫呋喃，充分?jǐn)噭?.5小時，離心，殘渣用3L四氫呋喃重復(fù)提取一次。合并提取液，加入4.5L正己烷，進行多元分配1.5小時，分層后得下層極性溶劑相，上層非極性溶劑相用1L蒸餾水提取一次，合并兩次水相，過濾，45℃減壓濃縮，冷凍干燥。成品白色或灰白色，純度80.5％。
實施例4將100克豬腦組織用絞肉機絞碎，勻漿，在冷處用丙酮浸漬24小時，然后加入1400二甲基甲酰胺，充分?jǐn)嚢?，離心，加入450ml石油醚，進行多元分配，分層后得下層極性溶劑相，上層非極性溶劑相用100ml的水重復(fù)提取一次，合并下層極性溶劑相，過濾，45℃減壓濃縮，冷凍干燥得成品，色灰白，能溶于水，溶于氯仿——甲醇溶液(2∶1，體積比)，純度為80.5％。
實施例5～9采用與實施例1相同的提取過程，并分別以庚烷、氯仿、乙醚、甲基戊烷和汽油代替石油醚，產(chǎn)品的純度分別為80.5％、81.5％、80.0％、78.0％和79.0％。
權(quán)利要求
1.一種從動物組織中提取神經(jīng)節(jié)苷脂的方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟(1)生物材料的預(yù)處理將生物材料用丙酮或甲乙酮及其混合物浸漬處理，過濾，收集濾餅，所說的生物材料包括動物腦組織、胎盤或血清；(2)極性溶劑提取在步驟(1)的濾餅中加入極性溶劑進行提取，過濾，收集濾液；提取溫度為10℃～60℃；所說的極性溶劑為偶極矩在1.68Debye～1.84Debye之間的極性溶劑，提取時間為1～4小時；(3)反相萃取在步驟(2)的濾液中加入非極性溶劑，分相后下層極性溶劑相經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥得成品神經(jīng)節(jié)苷脂；非極性溶劑的加入量為濾液混合物重量的0.5～2.5倍，多元分配的溫度為10℃～35℃；減壓濃縮溫度為40℃～60℃，時間為2～8小時；所說的非極性溶劑的溶解度參數(shù)為7.0～9.2或溶劑強度∑°為0.01～0.42。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，生物材料預(yù)處理溫度為5℃～25℃，浸漬時間為4～34小時，酮類物質(zhì)用量為生物材料體積的1.5～4倍，極性溶劑提取的溫度為20℃～35℃，多元分配的溫度為25℃～30℃，減壓濃縮溫度為42℃～50℃，時間為3～5小時。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，極性溶劑為水、甲醇、四氫呋喃或二甲基甲酰胺中的一種或一種以上，非極性溶劑為正己烷、庚烷、氯仿、乙醚、石油醚、甲基戊烷或汽油中的一種或一種以上。
4.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，以水和上述其他極性溶劑的混合物作為提取劑，其比例為水/其他極性溶劑＝0.5～6。
5.如權(quán)利要求1～4所述方法，其特征在于，步驟(2)的極性溶劑提取后所獲得的液固混合物，直接加入非極性溶劑，然后進行過濾，獲得濾液，靜置分層，下層極性溶劑相經(jīng)減壓濃縮，冷凍干燥得成品神經(jīng)節(jié)苷脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從動物組織中提取神經(jīng)節(jié)苷脂的方法。該方法采用一種或多種與神經(jīng)節(jié)苷脂的極性相匹配的極性溶劑，可大大提高神經(jīng)節(jié)苷脂的提取效率，并采用反相萃取的方法去除提取物中的雜質(zhì)，可提高產(chǎn)品品位，降低生產(chǎn)成本。采用本發(fā)明的方法所獲得的神經(jīng)節(jié)苷脂，其純度可達(dá)81％，且膽固醇、中性脂質(zhì)、的含量較低，本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單，適宜于規(guī)模化生產(chǎn)，產(chǎn)品純度高，能夠滿足食用和藥用的要求。
文檔編號C07H15/00GK1400216SQ0112634
公開日2003年3月5日 申請日期2001年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者馮萬祥, 吳同新 申請人:上海綠谷偉業(yè)生態(tài)工程有限公司