專利名稱：非促有絲分裂重組酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)突變體的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人aFGF基因克隆、改造、基因工程菌的構(gòu)建和使用該菌制備重組人aFGF的方法。
一.成纖維細(xì)胞生長因子研究現(xiàn)狀成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GFs)主要包括酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)兩種，是一類對來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的多種類型的細(xì)胞具有廣泛的生物學(xué)活性的細(xì)胞生長因子。aFGF在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于創(chuàng)傷修復(fù)、心腦血管疾病治療(如心肌缺血、腦中風(fēng)等)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如帕金森氏癥、阿爾茨海默病等)治療等。自1974年首先分離bFGF以來，國內(nèi)外對FGFs結(jié)構(gòu)與功能，作用機(jī)理等進(jìn)行了深入研究，我國也投入巨資對FGFs的臨床應(yīng)用進(jìn)行了研究，取得了大量研究成果。但迄今為止，除我國批準(zhǔn)用于創(chuàng)傷治療的外用bFGF進(jìn)入臨床外，對用于其他治療適應(yīng)癥的FGFs新藥的研究進(jìn)展困難。阻礙FGFs進(jìn)入臨床應(yīng)用的瓶頸問題是其臨床安全性問題。由于FGFs具有促有絲分裂活性，在對正常細(xì)胞具有促分裂效應(yīng)的同時(shí)，對腫瘤細(xì)胞也具有同樣作用，因此，長期以來，對其臨床安全性的認(rèn)識一直存在分歧。
對aFGF結(jié)構(gòu)與功能研究結(jié)果表明，aFGF序列中存在多個功能性結(jié)構(gòu)域，其主要功能區(qū)包括肝素區(qū)、受體結(jié)合區(qū)和核轉(zhuǎn)位區(qū)。Imamura等人研究證實(shí)，對154氨基酸殘基的aFGF，其核轉(zhuǎn)位區(qū)位于N端第20至27位氨基酸殘基之間，切除aFGF的N端27個氨基酸殘基后，可顯著降低aFGF的促分裂活性。Rosa M.Lozano等對全長127個氨基酸殘基的aFGF28-154的研究表明，此改構(gòu)體不致使細(xì)胞發(fā)生分裂，但保持了野生型aFGF所有的神經(jīng)調(diào)節(jié)、血管活性、心臟和神經(jīng)保護(hù)的特性。
研究表明，aFGF的非促有絲分裂效應(yīng)包括(1)aFGF參與血管張力與血壓調(diào)節(jié)給動物注射天然純化FGF或給予人工修飾后的FGF(在N末端缺乏核轉(zhuǎn)位序列)，均可顯示出擴(kuò)張血管和降壓效應(yīng)，但劑量有所不同。FGF的降壓效應(yīng)有3個特點(diǎn)(1)有或無肝素作為載體均表現(xiàn)出降壓作用，但血中一定濃度的肝素鹽能增加其降壓效果；(2)FGF誘導(dǎo)的降壓反應(yīng)包括快相與慢相兩個階段，ATP敏感的K+通道可能在早期(快相)血壓下降中起一定作用；(3)從中樞(腦室內(nèi))給予FGF無降壓作用，亦不影響從外周靜脈血給予FGF的降壓效應(yīng)。FGF誘導(dǎo)的降壓效應(yīng)可能是它能誘導(dǎo)升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放松馳因子(EDRF)，進(jìn)而產(chǎn)生血管擴(kuò)張效應(yīng)有關(guān)。因此有人認(rèn)為FGF的這一藥理作用有可能給高血壓的治療帶來突破。(2)aFGF治療缺血性損傷FGF能顯著減少腦缺血導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元死亡率；可防止再灌注損傷中心肌細(xì)胞外和線粒體內(nèi)鈣的沉積，減輕組織水腫，降低毛細(xì)血管損傷率以及肌酸磷酸激酶(CK)的釋放；對急性肢體缺血性損傷，F(xiàn)GF除能顯著減輕組織水腫外，還能部分恢復(fù)組織活力，減少細(xì)胞內(nèi)鈣依賴性ATP酶以及脫氫酶類的損失。其抗缺血損傷效應(yīng)機(jī)制可能包括A.FGF降低血管阻力，有助于開放小動脈與毛細(xì)血管而減少組織缺血后的“無再灌流(no reflow)”現(xiàn)象；B.FGF有助于開放K+-ATP通道，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌釋放血漿纖維蛋白溶酶原激活物(PA)，進(jìn)而有助于清除心血管系統(tǒng)的栓塞；C.FGF能調(diào)節(jié)細(xì)胞Ca2+濃度，有助于維持Ca2+依賴性ATP酶的活性，減少自由基的產(chǎn)生。(3)對神經(jīng)系統(tǒng)的作用實(shí)驗(yàn)表明，許多神經(jīng)元受慢性神經(jīng)退化變性疾病的影響，如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)，影響運(yùn)動神經(jīng)元；帕金森疾病，影響黑質(zhì)中的神經(jīng)元；早老性癡呆，影響基底前腦副交感神經(jīng)元。這些神經(jīng)元中都有大量的aFGF分布，aFGF可作為自分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，感受細(xì)胞質(zhì)膜哪怕是瞬間的滲漏，并立即啟動修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的遷移和纖溶酶活劑的釋放，增加髓磷脂相關(guān)蛋白和類脂的含量，改變神經(jīng)細(xì)胞的典型的細(xì)胞進(jìn)程和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使神經(jīng)元免受神經(jīng)退化變性疾病的影響。
aFGF能延長培養(yǎng)液中多種中樞和外周神經(jīng)元的存活，使神經(jīng)元成活時(shí)間增加和其軸突延長。Koshinaga等研究了脊髓損傷后aFGF的表達(dá)情況后，發(fā)現(xiàn)前角運(yùn)動神經(jīng)元的aFGF含量增加，表明機(jī)體自身產(chǎn)生大量aFGF，在脊髓損傷的自我修復(fù)和再生中起作用，這是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制。
此外，F(xiàn)GF還具有調(diào)節(jié)攝食過程，調(diào)節(jié)激素分泌、誘導(dǎo)促甲狀腺激素的釋放，同時(shí)也增加靶細(xì)胞對這種激素的敏感性等非促分裂效應(yīng)。
二.本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)將非促有絲分裂酸性成纖維細(xì)胞生長因子基因克隆到大腸桿菌高效表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌。從轉(zhuǎn)化子中篩選出含有非促有絲分裂酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)基因的菌株。進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，制備方法及工藝優(yōu)化后非促有絲分裂酸性成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)量為20-120mg/L。
實(shí)施例一 在胞內(nèi)高效表達(dá)非促有絲分裂重組aFGF突變體的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建1.目的基因的獲得設(shè)計(jì)合成兩條含不同限制性酶酶切位點(diǎn)的PCR引物(PI，PII)，用PCR方法，從人胎腦的Quick Clone cDNA中擴(kuò)增haFGF的全編碼序列，所得的PCR產(chǎn)物長485 bp，在5’端有一EcoR I酶切位點(diǎn)，3’端有一HindIII切點(diǎn)。將擴(kuò)增所得的haFGF的全長cDNA用EcoRI和HindIII酶切，將酶切片段與經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切的克隆載體pUC18連接，經(jīng)DNA序列分析，得到含正確haFGF全長cDNA序列的重組子pUC-haFGF。
以所得的重組質(zhì)粒pUC-haFGF為模板，設(shè)計(jì)合成兩條含不同限制性酶酶切位點(diǎn)的PCR引物(PIII，PIV)，使擴(kuò)增所得的haFGF cDNA片段的5’端有一NdeI酶切位點(diǎn)，3’端有一BglII切點(diǎn)。所得的haFGF cDNA片段較全長cDNA在5’端少57-150個個堿基。2.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將擴(kuò)增所得haFGF的cDNA片段用NdeI和BglII酶切，表達(dá)空載體pET3c用NdeI和BamI酶切，其中BglII與BamI酶切后的粘性末端一致，兩種酶切片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，選擇含重組子的陽性克隆，并進(jìn)行DNA序列分析，以確保所得haFGF的cDNA序列是正確的。將所得的重組質(zhì)粒命名為pET3c-haFGF(m)。將重組質(zhì)粒pET3c-haFGF(m)轉(zhuǎn)化DE3噬菌體溶源的宿主菌BL21(DE3)。在抗性(100ug/ml的氨芐青霉素)平板上篩選轉(zhuǎn)化子。
對重組子pUC-haFGF中haFGF cDNA的核苷酸序列測定結(jié)果，和文獻(xiàn)報(bào)道的序列一致；重組子pET3c-haFGF(m)中haFGF cDNA的核苷酸序列測定結(jié)果，與預(yù)計(jì)的序列完全一致。
實(shí)施例二 非促有絲分裂重組aFGF突變體的制備方法及工藝1.發(fā)酵培養(yǎng)1.1培養(yǎng)基由胰蛋白胨、酵母提取物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、糖蜜組成，流加用葡萄糖。1.2培養(yǎng)程序?qū)l(fā)酵培養(yǎng)基適量置發(fā)酵罐中(發(fā)酵罐預(yù)先進(jìn)行空消)，然后進(jìn)行消毒，再將適量上述培養(yǎng)種子液接種于該培養(yǎng)基中，采用連續(xù)流加葡萄糖的高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，通過控制葡萄糖的流加速率將培養(yǎng)液pH值控制在7.0-7.5，當(dāng)菌體OD600達(dá)到25-35左右，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。1.3收菌發(fā)酵結(jié)束后，立即用離心機(jī)將培養(yǎng)液進(jìn)行連續(xù)離心分離，控制溫度4℃，轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分，流速為10升/小時(shí)，離心結(jié)束后收取菌體，稱量濕重。2.菌體的裂解與粗制haFGF的制備將收獲的菌體懸浮于含0.05-0.2M氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液中，用超聲粉碎機(jī)冰浴下超聲破碎細(xì)胞，將所得的細(xì)胞裂解液以20000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心分離，取上清即得粗制haFGF。3.純化3.1純化基本程序?qū)⑸鲜鏊蒙锨逡菏紫冗^CM-Sepharose FF離子交換柱，以含0.01-1M氯化鈉的10-50mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰蛋白質(zhì)溶液，過親和層析柱，用含0.06-3.0氯化鈉的10-50mM的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰蛋白質(zhì)溶液，即獲得haFGF純品。3.2純化各步技術(shù)指標(biāo)1)離子交換填料CM-Sepharose FF流動相A液為含0.01-0.6M氯化鈉的10-50mM磷酸鹽緩沖液B液為含0.6-1M氯化鈉的10-50mM磷酸鹽緩沖液洗脫等度洗脫，B液收峰流速20-50ml/min收集峰活性最高峰(第二洗脫峰)2)親和層析填料Heparin-Sepharose流動相A液為含0.06-1.0M氯化鈉的10-50mM磷酸鹽緩沖液B液為含1.0-1.5M氯化鈉的10-50mM磷酸鹽緩沖液C液為含1.5-3.0M氯化鈉的10-50mM磷酸鹽緩沖液洗脫等度洗脫，C液收峰流速20-50ml/min收集峰活性最高峰(第三洗脫峰)所收蛋白峰即為haFGF原液，加入穩(wěn)定劑人血白蛋白稱為“加白蛋白haFGF原液”，過濾除菌后保存。4.半成品配制4.1稀釋液配制10mMPB pH7.0 121℃高壓滅菌30分鐘4.2半成品配制與除菌白蛋白注射用人血白蛋白除菌濾膜0.22μm濾膜配制白蛋白終濃度1％-2％(g/ml)將加白蛋白haFGF原液和人血白蛋白用4.1項(xiàng)稀釋液稀釋至所需濃度，用0.22μm濾膜過濾除菌，即為半成品，保存于2～8℃。5.分裝及凍干容器2ml西林瓶分裝量1.0ml
預(yù)凍溫度和時(shí)間-45℃ 3小時(shí)真空度2.7Pa 1小時(shí)6.保存條件4～8℃
權(quán)利要求
1.本發(fā)明所說的aFGF突變體為包括N端缺失19到50個氨基酸殘基的重組aFGF；
2.能在胞內(nèi)表達(dá)N端缺失19-50個氨基酸殘基的重組aFGF突變體的基因工程菌；
3.權(quán)利要求2中所說的基因工程宿主菌為大腸桿菌；
4.權(quán)利要求2中所說的基因工程菌表達(dá)N端缺失19到50個氨基酸殘基的重組aFGF突變體的制備方法及工藝。
5.權(quán)利要求1中所說的重組aFGF突變體用于防治心腦血管疾??；
6.權(quán)利要求1中所說的重組aFGF突變體用于防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
全文摘要
本發(fā)明從人胎腦的Quick Clone cDNA中擴(kuò)增haFGF的全編碼序列，并對其cDNA全序列進(jìn)行改造，去掉5’端57－150個堿基，克隆到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，經(jīng)分離純化后，獲得的重組蛋白除不具有促有絲分裂功能外，保留了aFGF的其他生物學(xué)活性，可用于心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療。
文檔編號C07K14/435GK1408726SQ0112789
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日
發(fā)明者李校堃, 鄭青, 吳曉萍, 黃亞東, 許華, 趙文, 姚成燦 申請人:廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心