專利名稱：抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源單鏈抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域，特別涉及到基因工程抗體領(lǐng)域，是抗體工程的最前沿，即全人源化基因工程抗體方面的研究結(jié)果。
抗體工程是當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)的前沿技術(shù)，運(yùn)用免疫學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，藥理學(xué)，生物物理學(xué)，生物工程及醫(yī)學(xué)等多學(xué)科的理論方法，研究抗體的結(jié)構(gòu)和功能。其宗旨在于設(shè)計(jì)構(gòu)建新型抗體，應(yīng)用與臨床檢驗(yàn)和治療。
乙型肝炎是一種流行廣、難治愈的傳染性疾病。目前，全球有3億乙型肝炎病毒攜帶者，不完全統(tǒng)計(jì)認(rèn)為中國有3000萬慢性乙型肝炎患者。乙型肝炎不僅導(dǎo)致肝硬化，而且是肝癌的原因病毒。病毒性乙型肝炎的臨床治療僅停留在免疫增強(qiáng)劑，沒有確切的療效。近1-2年出現(xiàn)了動物源性單克隆抗體，用于臨床治療乙型肝炎。但是因?yàn)槲锓N差異，其具有很強(qiáng)的免疫原性，不僅療效甚微，更易于引起免疫損傷，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。既往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，針對乙型肝炎病毒的人-鼠嵌合抗體、移植抗體均已獲得，在一定程度上減少了抗體的鼠源性成分。目前這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)集中于全人源化基因工程抗體，以期最大限度去除鼠源性成分，滿足臨床治療要求。作為抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的人源Fab抗體也已經(jīng)獲得。但是，乙型肝炎病毒表面抗原具有多種變異，就一種抗原獲得的抗體難以有效中和所有病毒亞型，也使其未來的臨床應(yīng)用受到很大限制。而乙型肝炎病毒表面抗原的組分之一，preS1抗原，相對保守的多。而且，臨床資料證實(shí)，抗preS1抗體的出現(xiàn)與乙型肝炎的臨床治愈密切相關(guān)。所以，全人源化抗preS1的基因工程抗體的開發(fā)具有非常重要的意義。作為基因工程抗體的一種，單鏈抗體(ScFv)是將抗體重鏈和輕鏈的V區(qū)通過連接肽連接成的重組蛋白。它的優(yōu)點(diǎn)在于它是一種分子量最小的活性抗體片段僅為原抗體分子量的1/6。它可以迅速滲透包括腫瘤的各種組織，體內(nèi)清除速度快，并適于進(jìn)一步分子改造。而且，它不含有Fc段，能夠更特異地結(jié)合靶器官。因此，本發(fā)明以獲得全人源化抗preS1的單鏈抗體(ScFv)為目的。
本發(fā)明的目的是獲得全人源化抗preS1的單鏈抗體(ScFv)，解決動物源性抗體容易引起免疫損傷的問題，同時(shí)實(shí)現(xiàn)一種抗體拮抗多種病毒亞型。為將來臨床治療乙型肝炎提供可行性的抗體藥物。該抗體基因可以與質(zhì)粒DNA一起穩(wěn)定、無限復(fù)制，以其低成本使未來廣泛應(yīng)用成為可能。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是選擇健康供者60人，每人取外周血2ml，以淋巴細(xì)胞分離液提取淋巴細(xì)胞，與乙型肝炎病毒preS1抗原共培養(yǎng)，體外致敏后，提取總RNA，經(jīng)過RT-PCR，以人抗體基因特異引物，PCR擴(kuò)增人抗體的輕鏈，重鏈可變區(qū)。再通過Linker基因連接輕鏈和重鏈基因，組裝成單鏈抗體基因。利用噬菌體展示技術(shù)，將得到的單鏈抗體基因插入噬粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建人源免疫單鏈抗體庫。用乙型肝炎病毒preS1抗原對該抗體庫進(jìn)行固相淘選，獲得抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源化單鏈抗體。
本發(fā)明的效果和益處是本發(fā)明所陳述的抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源化單鏈抗體，對人體沒有物種差異，不會導(dǎo)致免疫損傷。而且特異性更好，與靶器官的結(jié)合率高。在將來的臨床治療中，將發(fā)揮現(xiàn)有的抗乙型肝炎病毒的抗體性藥物所達(dá)不到的效果。
以下是抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源單鏈抗體基因的核苷酸序列。下劃線依次為抗體重鏈的CDR1、CDR2、CDR3區(qū)，和抗體輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3區(qū)。CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCATAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCCCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGACATTCTGGTCAGCTGTGGCCGTGTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGCACTTCTGCCTGTGCTGACTCAGCCCCCGTCTGCATCTGCCTTGCTGGCAGCCTCGATCAAGCTCACCTGCACCCTAAGCAGTGAGCACAGCACCTACACCATCGAATGGTATCAACAGAGACCAGGGAGGTCCCCCCAGTATATAATGAAGGTTAAGAGTGATGGCAGCCACAGCAAGGGGGACGGGATCCCCGATCGCTTCATGGGCTCCAGTTCTGGGGCTGACCGCTACCTCACCTTCTCCAACCTCCAGTCTGACGATGAGGCTGAGTATCACTGTGGAGAGAGCCACACGATTGATGGCCAAGTCGTA以下用最佳實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明實(shí)施例1-5為人源抗前S1單鏈抗體ZG1的篩選方法；實(shí)施例6-7為人源抗前S1單鏈抗體ZG1的功能鑒定；實(shí)施例8為人源抗preS1單鏈抗體ZG1的基因特征。
實(shí)施例1淋巴細(xì)胞的體外致敏選擇健康供者60人，每人取外周血2ml，以淋巴細(xì)胞分離液提取淋巴細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，共得到2.5×108白細(xì)胞。與preS1(100μg/ml)在含10％人AB型血清、1％PHA的RPMI1640中共培養(yǎng)5天，鏡下可見分裂相。離心收集淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)顯示增殖1倍，為5×108細(xì)胞，作為免疫抗體庫的原料。
實(shí)施例2人源單鏈抗體基因片段的擴(kuò)增將致敏的淋巴細(xì)胞以TRIZOL REGENT(Gibico)提取RNA。首先以反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。之后以半套式PCR擴(kuò)增抗體基因可變區(qū)基因片段。首先以一組特異性IgG、κ、λ鏈引物PCR擴(kuò)增重鏈(VH+CH1)、輕鏈(VL+CL)基因片段，約為700bp。PCR條件為94℃1分鐘，(98℃10秒，52℃30秒，72℃30秒)×35循環(huán)。引物如下引物 堿基序列HZ5′IGGGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGHZ5′II GGGGCCCAGCCGGCCCAGGTCACCTTGARGGAGTCTGGHZ5′III GGGGCCCAGCCGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCYGGHZ5′IV GGGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGCAGSAGTCGGGHZ5′VGGGGCCCAGCCGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGHZ3′GACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGLκ5′I GACATCCAGATGACCCAGTCLκ5′II GATATTGTGATGACTCAGTCLκ5′III GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCLκ3′ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCLλ5′I CAGTCTGTSBTGACKCAGCCRCCLλ5′II TCYTMTGWGCTGACTCAGSMMCCLλ5′III MASGYTRTRCTGACTCARSMMCMLλ3′TGAAGATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTHZ5′I～HZ5′IV為重鏈5’端引物。HZ5′I與VH的1、7族同源，HZ5′II與VH的2、6族同源，HZ5′III、HZ5′IV、HZ5′V，分別與VH的3-5亞族同源。HZ3’G為重鏈3’端引物，與μ鏈的鉸鏈區(qū)同源。Lκ3’I、Lκ3’II、Lκ3’III為κ鏈5’端引物，分別與Vκ的1-3亞族同源，Lκ3’為κ鏈3’端引物；Lλ5′I、Lλ5′II、Lλ5′III為λ鏈5’端引物，與Vλ的1-7亞族同源，Lλ3′為λ鏈3’端引物。下劃線為SfiI的酶切位點(diǎn)。
再以可變區(qū)的特異性引物PCR擴(kuò)增VH，Vκ、Vλ。PCR條件為94℃1分鐘，(98℃10秒，55℃30秒，72℃30秒)×35循環(huán)。所獲得的DNA片段(330bp左右)經(jīng)膠純化后回收并電泳定量。引物如下JH TGAGGAGACGGTGACCAKKGTBCCJκ1GGGCGGCCGCACGTTTGATWTCCACYTTGGTCCCJκ2GGGCGGCCGCACGTTTRATCTCCAGYYKKGTCCCJλ GGGCGGCCGCACCTARRACGGTSAGCTKGGTJH為VH3’端引物，Jκ1、Jκ2為Vκ3’端引物，Jλ為Vλ3’端引物。下劃線為NOTI的酶切位點(diǎn)。
實(shí)施例3單鏈抗體基因的組裝首先合成linker模板5’CTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGC TCT GGC GGT AGT GCA CAG3’再以6組引物PCR擴(kuò)增。PCR條件94℃1分鐘，(98℃10秒，55℃30秒，72℃30秒)×35循環(huán)。引物如下。
引物堿基序列LJH CMMYGGWCACCGTCTCYTCATCGAGTGGTGGAGGCGGLVκ1 GACTGGGTCATCTGATGTCGTGCACTACCGCCAGAGCLVκ2 GACTGAGTCATCACAATATCGTGCACTACCGCCAGAGCLVκ3 GACTGCGTCAACACAATTTCGTGCACTACCGCCAGAGCLVλ1 CTGMGTCAVSACAGAGTGCACTACCGCCAGAGCLVλ2 GACTCAGTCGWGTMTGTGCACTACCGCCAGAGCLVλ3 YTGAGTCAGYAYARCGTGCACTACCGCCAGAGCLJH為5’端引物，其余為3’端引物。下劃線部分與Linker模板同源，未劃線部分分別與VH、Vκ、Vλ同源。
重疊延伸法連接重鏈、輕鏈和Linker。取等摩爾重鏈、輕鏈DNA，分別和5條linker DNA互為模板，PCR連接，條件94℃1分鐘，(98℃10秒，60℃1分鐘，72℃1分鐘)×10循環(huán)。再分別以相應(yīng)的重鏈5’端、輕鏈3’端引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件94℃1分鐘，(98℃10秒，55℃1分鐘，72℃30秒)×30循環(huán)。電泳檢測得到重鏈-linker-輕鏈(ScFv)的DNA特異帶，≈700bp。膠純化后回收并定量。
實(shí)施例4噬菌體抗體庫的構(gòu)建將單鏈抗體DNA片段用SfiI和NotI內(nèi)切酶酶切，用DNA Ligation Kit(TaKaRa公司)連接載體pCANTAB5E與ScFv片段。ScFv(500ng)+pCANTAB5E(500ng)+Solution I(10μl)，16℃過夜連接。連接液經(jīng)乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀2次以徹底去除鹽離子。取預(yù)冷的電擊杯，加入100μl感受態(tài)細(xì)胞，2μl去除鹽離子的ScFv-pCANTAB5E片段，置于冰上1min。將電擊儀設(shè)置成25mF，25kV，200ohms。擦干電擊杯外壁，插入電擊倉，電擊1次。重復(fù)50次。然后立即加入1ml 2YT-G培養(yǎng)基，將細(xì)胞洗出。將轉(zhuǎn)化后的E.coli TG1 37℃ 250rpm搖床培養(yǎng)1h，全部涂TYE-AG平板(含100μg/ml的氨芐和1％葡萄糖的TYE)，37℃過夜。第2天刮取全部克隆，用含30％glycerol的2YT-AG，-70℃保存。經(jīng)測定，抗體庫容量為7×108。
實(shí)施例5抗體庫的淘選將抗體庫以1∶10000比例接種于2YT-AG培養(yǎng)基(含氨芐100μg/ml，葡萄糖2％)，培養(yǎng)至OD600約為0.5。取適量用于M13KO7超感染。(Moi＝10)。離心棄上清，以10ml 2YT-AK培養(yǎng)基(含氨芐100μg/ml，卡那霉素25μg/ml)重懸沉淀并37℃搖床過夜培養(yǎng)。取適量離心去除沉淀，向上清加入1/5體積PEG沉淀噬菌體。與4倍體積的2％MPBS(2％體積脫脂奶粉的PBS)共孵育20分鐘后，加入預(yù)先以100μg/ml PreS1包被并以2％MPBS封閉的免疫試管。37℃，2小時(shí)后傾空試管，以0.5％tween20-PBS洗20次(倒入再立即倒出)，PBS洗20次后，加入10ml對數(shù)生長期的E.coli TG1，37℃靜置暗養(yǎng)1小時(shí)。取100μl菌液，用2YT培養(yǎng)基級數(shù)稀釋，鋪SOB-AG平板，30℃培養(yǎng)過夜，測定容量，以監(jiān)測次級庫有無富集。其余-70℃保存于含15％甘油的2YT培養(yǎng)基。
此淘選過程重復(fù)5次。對每一輪淘選后的庫容量測定顯示，第1輪淘選后得到6×104次級庫，第2輪后得到8×105，第3輪后得到5×106，第4輪后得到6×106，第5輪后得到5×106次級庫。該結(jié)果顯示了富集性淘選的過程，初步說明淘選有效。
實(shí)施例6多克隆酶連免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)對每一輪淘選后的抗體庫進(jìn)行多克隆ELISA檢測。10μg/ml PreS1 4℃過夜包被96孔酶標(biāo)板。PBS洗板3次，3％BSA-PBS 37℃封閉2小時(shí)。PBS洗板3次。取每一輪淘選后保存的噬菌體10μl，溶于200μl 3％BSA-PBS，加入酶標(biāo)板，室溫孵育2小時(shí)。以0.05％tween20-PBS洗板5次，加入1∶10000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗M13噬菌體抗體，室溫放置60分鐘，0.05％tween20-PBS洗板5次，加入ABTS顯色底物，室溫放置20-60分鐘。每孔加入50μl1M硫酸終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果顯示，酶標(biāo)儀測定的OD600值從第1輪淘選后的0.23遞增至第5輪后的0.88。進(jìn)一步說明淘選到了抗preS1的單鏈抗體。
實(shí)施例7競爭ELISA檢測抗體片段的親和力于第5輪淘選后取ELISA鑒定的陽性克隆，植入E.coli HB2151，37℃搖床30分鐘后，于SOBAG-N平板化線培養(yǎng)至可見單克隆。取單克隆植入5ml2YT-AG，30℃搖床培養(yǎng)過夜。室溫1500g離心20分鐘，棄上清。以50ml2YT-AI重懸沉淀，30℃搖床6小時(shí)。室溫1500g離心20分鐘，上清即含可溶性單鏈抗體片段。同上包被及封閉96孔酶標(biāo)板。取上述含可溶性抗體片段的上清液與級數(shù)稀釋5次的PreS1過夜共孵育達(dá)到平衡后，加入包被并封閉好的96孔酶標(biāo)板。同上方法進(jìn)行ELISA檢測。競爭ELISA結(jié)果顯示該抗體的親和常數(shù)為10-6M-10-7M，該抗體命名為ZG1。
實(shí)施例8人源抗乙型肝炎病毒preSI抗原的單鏈抗體的基因序列分析對ZG1進(jìn)行序列測定(TAKARA大連公司)，結(jié)果經(jīng)DNAPLOT軟件分析顯示，其重鏈屬于人抗體重鏈第4亞族，輕鏈屬于人抗體λ鏈第4亞族。
權(quán)利要求
1.一種抗乙肝病毒preS1抗原的人源單鏈抗體，其特征在于a)抗體基因的序列為該抗體特有的，決定了該抗體特異性識別乙肝病毒preS1抗原的特征，基因序列如下CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCATAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCCCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGACATTCTGGTCAGCTGTGGCCGTGTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGCACTTCTGCCTGTGCTGACTCAGCCCCCGTCTGCATCTGCCTTGCTGGGAGCCTCGATCAAGCTCACCTGCACCCTAAGCAGTGAGCACAGCACCTACACCATCGAATGGTATCAACAGAGACCAGGGAGGTCCCCCCAGTATATAATGAAGGTTAAGAGTGATGGCAGCCACAGCAAGGGGGACGGGATCCCCGATCGCTTCATGGGCTCCAGTTCTGGGGCTGACCGCTACCTCACCTTCTCCAACCTCCAGTCTGACGATGAGGCTGAGTATCACTGTGGAGAGAGCCACACGATTGATGGCCAAGTCGTAb)通過體外致敏的方法獲得preS1抗原免疫的人淋巴細(xì)胞，以此為原料構(gòu)建了人源preS1抗原免疫的單鏈抗體庫，c)該抗體來自preS1抗原對人源免疫單鏈抗體庫的固相淘選。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域,特別涉及到基因工程抗體領(lǐng)域。本發(fā)明是從免疫人源單鏈抗體庫經(jīng)過固相淘選獲得的抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源單鏈抗體(ScFv),其特征在于此重組抗體是由其基因輕鏈和重鏈的可變區(qū)中的特異序列決定,具有識別乙型肝炎病毒preS1抗原的的功能。可以用于臨床治療乙型肝炎病毒感染引起的疾病。
文檔編號C07K16/18GK1335324SQ0112797
公開日2002年2月13日 申請日期2001年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月24日
發(fā)明者安利佳, 張志超, 胡學(xué)軍 申請人:大連理工大學(xué)