專利名稱：一種增強(qiáng)多肽在體內(nèi)穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用有機(jī)化學(xué)原理將多肽與人血白蛋白在體內(nèi)或在體外相連的方法，從而增強(qiáng)多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性。
本發(fā)明所涉及的多肽可以是從天然或合成多肽中得到的活性部分，具有潛在的治療作用，有重要的藥物開發(fā)價值。這些治療作用可以是直接的，也可以是間接的，包括用于預(yù)防、涉及疫苗、藥物設(shè)計等。這些具有生物學(xué)活性的多肽可以是人機(jī)體中自然產(chǎn)生的、或者重組合成的、或者是這些多肽的分子異構(gòu)體。例如多肽酶、酶抑制劑、抗原、抗體、多肽激素、細(xì)胞因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、白細(xì)胞介素、等等；他們可以是整個分子，也可以只是一部分；還可以是能與這些多肽的細(xì)胞受體結(jié)合的其他多肽分子，如從隨機(jī)多肽文庫中篩選出的具有特異生物活性的多肽分子。
本發(fā)明所涉及具有生物學(xué)活性的多肽也可以不是人源的，可以是從動物中、細(xì)菌中、真菌中、或者植物中提取的，或者完全人工合成的蛋白多肽的全部或部分。
背景技術(shù)：
許多肽類尤其是小分子多肽具有治療活性但不能開發(fā)成藥物。原因有多種，包括在體內(nèi)不穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、難以大批量制備等。許多多肽在體內(nèi)未產(chǎn)生預(yù)期的效果是由于給藥劑量、方式和藥代等問題造成的。本專利可以解決這些問題。多肽與人血白蛋白相連而不破壞多肽的結(jié)構(gòu)和生理功能，但在體內(nèi)的穩(wěn)定性可以得到增強(qiáng)，從而達(dá)到延長多肽在體內(nèi)的半衰期，提高生物利用度。
本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，人血白蛋白在血清中具有高半衰期，它能提高多肽在血清中的半衰期，使活性維持更長，能更有效地使多肽到達(dá)作用位置，從而可以降低多肽的使用劑量，提高藥效，減少副作用。另外，小分子多肽沒有或只有較弱的抗原性，比大分子蛋白有更大優(yōu)勢。已有提到用基因工程的方法制備多肽與人血白蛋白的融合蛋白，從而增強(qiáng)多肽在體內(nèi)的半衰期的報道(美國專利5,876,969)。
延長藥物在體內(nèi)的半衰期，提高生物利用度、方便臨床用藥一直是制藥公司和許多藥物研究單位進(jìn)行藥物開發(fā)的主要方向之一。大分子藥物，如蛋白類、DNA及RNA類生物技術(shù)產(chǎn)品藥物難于經(jīng)口服途徑給藥，因?yàn)檫@類大分子很容易經(jīng)胃腸道降解，因而這些藥物多數(shù)情況須經(jīng)皮下、肌肉、靜脈或局部注射給藥。但由于任何藥物在血液中僅停留一定時間，所以大分子藥物必須反復(fù)注射以保持一定的血漿濃度，從而給臨床應(yīng)用造成很多不變，尤其是許多生物藥物均須終生用藥。目前研究最多的延長藥物體內(nèi)半衰期的方法有兩種。一種是改變制劑組成，通常使用多聚體(Polymer)包埋藥物或與藥物交聯(lián)，用得最多的多聚體就是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)；另一種方法就是生產(chǎn)一種體內(nèi)可以進(jìn)行控制藥物釋放的醫(yī)療裝置。已有PEG交聯(lián)的生物藥物在美國上市，如PEG干擾素，還有許多用PEG包埋的藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，如InfiMed Therapeutic公司(Cambridge，MA)的InfitropinCR，即長效生長激素(Growth Hormone)。另外，也有許多能控制釋放的醫(yī)療裝置的臨床試驗(yàn)接近完成，如GenetronicBiomedical公司(San Diego，CA)的MedPulser電穿孔系統(tǒng)。然而，鑒于上述兩種方法的不完善及復(fù)雜性，尋找更好的延長多肽藥物體內(nèi)半衰期的方法將具有極高的開發(fā)價值和市場前景。本發(fā)明利用化學(xué)方法使多肽特異性地與人血白蛋白相連，工藝簡單，可以根據(jù)需要選擇在體內(nèi)或體外實(shí)現(xiàn)多肽與人血白蛋白的結(jié)合，并且結(jié)合過程中沒有修飾多肽以外的其它反應(yīng)產(chǎn)物生成。
如前所述，本發(fā)明所涉及的多肽特指由5-100個氨基酸所構(gòu)成的短多肽。多數(shù)酶，或酶的抑制劑，或抗原、或抗體、或激素、或干擾素、或細(xì)胞因子、或生長因子、或分化因子等的活性中心均由少于100個氨基酸的多肽構(gòu)成。另外，由于所有蛋白質(zhì)均由20種不同的氨基酸組成，所以，不同的氨基酸組合可以構(gòu)成任何空間結(jié)構(gòu)已實(shí)現(xiàn)功能的多樣性。由隨機(jī)的氨基酸組合所得到的多肽隨機(jī)文庫的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超出了目前已知的化學(xué)物質(zhì)文庫的多樣性，而且多肽本身的可朔性也較小分子化合物為好，所以，用小分子多肽文庫在一些情況下替代小分子化合物文庫也為藥物篩選開辟了一條新的路線。
與蛋白質(zhì)藥物和小分子藥物一樣，小分子多肽藥物也可以通過多種方法來增強(qiáng)其體內(nèi)的穩(wěn)定性、提高血漿半衰期，如脂質(zhì)體包埋、緩釋裝置、以及利用重組DNA技術(shù)與其他生物穩(wěn)定性蛋白(如抗體Fc段，或人血自蛋白)相連。這些方法可以解決多數(shù)藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性問題，但存在操作復(fù)雜或者有潛在的免疫反應(yīng)的危險。
本發(fā)明所涉及的多肽可以是利用重組DNA技術(shù)于大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)生的；也可以是利用化學(xué)方法人工合成的。在大腸桿菌中表達(dá)時，將編導(dǎo)靶多肽的重組DNA克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，該重組DNA可以利用經(jīng)典方法人工合成，也可以利用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)方法獲得。將含有靶多肽重組DNA的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗鞔竽c桿菌中，經(jīng)表達(dá)、純化獲得靶多肽。應(yīng)用化學(xué)方法人工合成多肽時，可以應(yīng)用自動的固相多肽合成儀或應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的手工合成方法進(jìn)行。已知的自動固相多肽合成儀可以是由Applied Biosystems公司生產(chǎn)；也可以由其他相當(dāng)?shù)膹S家生產(chǎn)。標(biāo)準(zhǔn)的手工多肽合成方法利用了t-butyloxycarbonyl(t-BOC)或9-fluorenylmethyloxycarbonyl(FMOC)對氨基酸α-氨基的保護(hù)作用，將單個氨基酸從C-段開始一步一步加上，然后再經(jīng)脫保護(hù)，并將合成好的多肽從與其連接的固相上切下，經(jīng)系列脫鹽、萃取、純化等步驟獲得多肽。
小分子多肽在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用一直十分廣泛。例如可以用于T細(xì)胞和B細(xì)胞的表型分析，以及與其他免疫增強(qiáng)劑或蛋白結(jié)合后用于免疫動物易產(chǎn)生抗體。近幾年由于人類基因組計劃的進(jìn)展，人們對多肽的認(rèn)識與日俱增，小分子多肽的應(yīng)用也更加廣泛，小分子多肽藥物的開發(fā)于治療性單克隆抗體的開發(fā)一樣，成為許多制藥公司的重要研究方向之一。例如SCIOS公司(Sunnyvale，CA)的Natrecor，即B型利尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)，目前已完成III期臨床試驗(yàn)，等待藥審機(jī)構(gòu)最后的批文。該藥為特效的治療急性充血性心衰的小分子多肽藥物。下表(表一)列出了幾種具有代表性的治療多肽的大小、功能及序列表一.幾種具有代表性的治療多肽

小分子多肽具有很好的治療活性但又有其明顯的缺陷，即在體內(nèi)不穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，因而極易被降解產(chǎn)生給藥劑量、方式和藥代等問題。本發(fā)明通過多肽與人血白蛋白在體內(nèi)或體外自然條件下相連來實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)多肽在體內(nèi)穩(wěn)定性，并達(dá)到提高治療作用的目的。這種連接均在溫和條件下或體內(nèi)進(jìn)行，連接后的多肽保持其原有功能，人血白蛋白也按正常途徑進(jìn)行代謝。
本

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)方案要點(diǎn)包括以下步驟將多肽溶解在10-200mmol/Lol/L的磷酸鹽緩沖液中，緩沖液的pH值為6-9，緩沖液可以是HEPES，也可以是碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，還可以是硼酸鹽緩沖液。對一些疏水性較強(qiáng)而造成溶解度較差的多肽，還可以加入一些諸如非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或變性劑的助溶劑，如吐溫20、吐溫60、吐溫80、Triton、十二烷基硫酸鈉、尿素或鹽酸胍等。這些緩沖液實(shí)例并不以任何方式限制在本發(fā)明中應(yīng)用其他緩沖液。
將修飾用化學(xué)分子溶解在10-200mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，緩沖液的pH值為6-9，緩沖液可以是HEPES，也可以是碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，還可以是硼酸鹽緩沖液，還可以是注射用水，還可以是DMSO，還可以是DMF。這些緩沖液實(shí)例并不以任何方式限制在本發(fā)明中應(yīng)用其他緩沖液。
本發(fā)明所涉及的修飾用化學(xué)分子可以是NHS馬來酰亞氨酯類，也可以是SMCC，還可以是Sulfo-SMCC，還可以是SIAB，還可以是Sulfo-SIAB，還可以是BMPA，還可以是Sulfo-KMUS，還可以是EMCA，還可以是EDC，還可以是DMP，還可以是DMA，還可以是DMS，還可以是DSG，還可以是DSS，還可以是BS3。這些化學(xué)分子實(shí)例并不以任何方式限制在本發(fā)明中應(yīng)用其他適當(dāng)?shù)男揎椨没瘜W(xué)分子，來同樣達(dá)到將靶多肽與人血白蛋白連接，從而增加靶多肽體內(nèi)穩(wěn)定性的目的。上述化學(xué)分子實(shí)例的分子代號與其相應(yīng)的名稱及化學(xué)組成可參見后面附表(表二)。
將溶解后的化學(xué)分子加入多肽溶液中，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘或在4℃下反應(yīng)2-20小時，也可以在37℃反應(yīng)20-40分鐘。
將反應(yīng)混合液過D-Dextran脫鹽柱，用10-200mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液可以是HEPES，也可以是碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，還可以是硼酸鹽緩沖液；緩沖液的pH值為6-9；脫鹽柱還可以是KwikSep Dextran，還可以是Excellulose GF-5，或者是PD-10柱(Pharmacia#17-0851-01)，收集洗脫的多肽峰通過直冷式或復(fù)疊式冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。這些脫鹽柱實(shí)例并不以任何方式限制在本發(fā)明中應(yīng)用其他合適的脫鹽柱。
冷凍干燥后的多肽給藥前用注射用水溶解，以靜脈注射的方式體內(nèi)應(yīng)用。也可以根據(jù)多肽的特異功能進(jìn)行局部注射給藥，例如腫瘤部位的局部注射用藥。
與修飾用化學(xué)分子反應(yīng)后收集的多肽峰也可以不通過冷凍干燥而直接加入含有5-20mmol/L EDTA的人血白蛋白的溶液中，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘或在4℃下反應(yīng)2-20小時，也可以在37℃反應(yīng)20-40分鐘，使修飾后化學(xué)分子與人血白蛋白以二硫鍵或亞氨酯鍵的形式結(jié)合，反應(yīng)終止時加入終濃度30-200mmol/L的半胱氨酸、巰基乙醇、二硫蘇糖醇等含有自由巰基的化合物，或者加入20-200mmol/L的Tris、甘氨酸、賴氨酸、乙醇氨等含有自由氨基的化合物。本發(fā)明所用體外連接的人血白蛋白可以是從市場上獲得的從人血中分離出來的不均一的白蛋白制劑；也可以是利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的均一白蛋白亞型。
反應(yīng)混合液上樣D-Dextran脫鹽柱，用10-200mmol/L的緩沖液洗脫，緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液，還可以是HEPES，還可以是碳酸鹽緩沖液，還可以是硼酸鹽緩沖液，還可以是檸檬酸鹽緩沖液；緩沖液的pH值為6-8；脫鹽柱還可以是KwikSep Dextran，還可以是Excellulose GF-5。收集洗脫的蛋白峰。這些脫鹽柱實(shí)例并不以任何方式限制在本發(fā)明中應(yīng)用其他合適的脫鹽柱。


下面將通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明圖1是本發(fā)明的鈣調(diào)節(jié)素肽的Sulfo-MBS修飾圖2是本發(fā)明鈣調(diào)節(jié)素肽的Sulfo-SMCC修飾圖3是本發(fā)明鈣調(diào)節(jié)素肽的SIAB修飾圖4是本發(fā)明鈣調(diào)節(jié)素肽的EDC修飾圖5A是本發(fā)明EPO類多肽1的DMA修飾圖5B是本發(fā)明EPO類多肽1(EMP1)結(jié)構(gòu)圖6是本發(fā)明EPO類多肽1的DSG修飾圖7是本發(fā)明低壓氧紅細(xì)胞增多小鼠模型生物活性法測定促紅細(xì)胞素活性8是本發(fā)明外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)法具體實(shí)施方式
下面借助實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明。如前所述，本發(fā)明所涉及的多肽均是應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的重組表達(dá)或化學(xué)合成方法經(jīng)純化獲得。
實(shí)施例一付甲狀腺類多肽(PTHrp)的NHS馬來酰亞氨酯修飾應(yīng)用化學(xué)方法合成由34個氨基酸構(gòu)成的付甲狀腺類多肽(PTHrp)?；瘜W(xué)合成時，最后一步受t-BOC保護(hù)的氨基不經(jīng)三氟乙酸(TFA)脫保護(hù)，直接經(jīng)脫鹽、有機(jī)溶劑萃取、反相-HPLC純化獲得高純度付甲狀腺類多肽，溶解于100mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，緩沖液的pH值為7.0，付甲狀腺類多肽的終濃度為100μM。
將NHS馬來酰亞氨酯Sulfo-MBS溶解在10mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，緩沖液的pH值為7.0，NHS馬來酰亞氨酯的終濃度為2mmol/L。。按廠家指導(dǎo)于使用前1小時內(nèi)配制。
溶解后的Sulfo-MBS加入付甲狀腺類多肽溶液中，在室溫下反應(yīng)30分鐘或在4℃下反應(yīng)2小時，并輕輕地攪拌混勻(見圖1)。MBS為應(yīng)用最為廣泛的雙功能交聯(lián)劑。在中性pH，MBS可與多肽上的巰基或氨基交聯(lián)。本發(fā)明中的連接工藝是通過兩個分開的反應(yīng)達(dá)到的，從而避免了相同分子的連接。該游離巰基(SH)是由付甲狀腺類多肽N-端的半胱氨酸殘基所提供，在第一個反應(yīng)中，MBS與付甲狀腺類多肽連接；而在第二個反應(yīng)中(見后面實(shí)例)，MBS可將付甲狀腺類多肽與人血白蛋白上的賴氨酸殘基的氨基交聯(lián)。
Sulfo-MBS交聯(lián)后的付甲狀腺類多肽混合液進(jìn)行TFA脫保護(hù)，然后按‘實(shí)例七’中方法進(jìn)行脫鹽及純化以去除游離化學(xué)分子和未交聯(lián)的付甲狀腺類多肽，計算交聯(lián)效率。分裝成品以進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、藥效和藥代動力學(xué)試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室開發(fā)研究。
實(shí)施例二付甲狀腺類多肽的Sulfo-SMCC修飾同實(shí)例一的方法準(zhǔn)備高純度的付甲狀腺類多肽，溶解在20mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，緩沖液的pH值為7.0，付甲狀腺類多肽的終濃度為50μM。
在上述溶液中加入1mg Sulfo-SMCC，在室溫下反應(yīng)60分鐘或在37℃下反應(yīng)30分鐘，并輕輕地攪拌混勻(見圖2)。SMCC為應(yīng)用非常廣泛的雙功能交聯(lián)劑，Sulfo-SMCC保留了SMCC的反應(yīng)特性，同時具有良好的水溶性。在中性pH，Sulfo-SMCC可使蛋白或多肽之間交聯(lián)。本發(fā)明中的連接工藝是通過兩個分開的反應(yīng)達(dá)到的，從而避免了相同分子的連接。首先Sulfo-SMCC與付甲狀腺類多肽上的半胱氨酸的巰基反應(yīng)，在第一個反應(yīng)中，Sulfo-SMCC與付甲狀腺類多肽連接；而在第二個反應(yīng)中(見實(shí)例八和九)，Sulfo-SMCC可將付甲狀腺類多肽與人血白蛋白上的賴氨酸殘基的氨基交聯(lián)。
Sulfo-SMCC交聯(lián)后的付甲狀腺類多肽混合液脫去保護(hù)基團(tuán)，按‘實(shí)例七’中方法進(jìn)行脫鹽及純化以去除游離化學(xué)分子和未交聯(lián)的付甲狀腺類多肽，計算交聯(lián)效率。分裝成品以進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、藥效和藥代動力學(xué)試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室開發(fā)研究。
實(shí)施例三付甲狀腺類多肽的SIAB修飾同實(shí)例一的方法準(zhǔn)備高純度的付甲狀腺類多肽，并溶解在20mmol/L的硼酸鹽緩沖液中，緩沖液的pH值為7.0，付甲狀腺類多肽的濃度為0.1mg/ml。
將1.4mg SIAB溶解在1ml DMSO中，按廠家指導(dǎo)于使用前1小時內(nèi)配制。
取10μlSIAB溶液加入到1ml付甲狀腺類多肽溶液中，室溫下反應(yīng)30-60分鐘，并輕輕地攪拌混勻(見圖3)。SIAB為應(yīng)用非常廣泛的雙功能交聯(lián)制劑。在中性pH，SIAB可使蛋白或多肽之間交聯(lián)。本發(fā)明中的連接工藝是通過兩個分開的反應(yīng)達(dá)到的，從而避免了相同分子的連接。首先SIAB與付甲狀腺類多肽的半胱氨酸的巰基發(fā)生反應(yīng)，在第一個反應(yīng)中，SIAB與付甲狀腺類多肽連接；而在第二個反應(yīng)中(見實(shí)例八和九)，SIAB可將付甲狀腺類多肽與人血白蛋白上的賴氨酸殘基的氨基交聯(lián)。
SIAB交聯(lián)后的付甲狀腺類多肽混合液脫去保護(hù)基團(tuán)，按‘實(shí)例七’中方法進(jìn)行脫鹽及純化以去除游離化學(xué)分子和未交聯(lián)的付甲狀腺類多肽，計算交聯(lián)效率。分裝成品以進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、藥效和藥代動力學(xué)試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室開發(fā)研究。
實(shí)施例四鈣調(diào)節(jié)素肽的EDC修飾利用化學(xué)方法制備鈣調(diào)節(jié)素肽，制備完成后，暫時不脫去氨基端和賴氨酸殘基上的保護(hù)基團(tuán)。將其溶解在0.5ml、100mmol/L的MES溶液中，pH值為4.5。肽的濃度為1.0mg/ml。
在進(jìn)行反應(yīng)前1小時內(nèi)，將10mg EDC溶解在1ml去離子水中，取100μl加入鈣調(diào)節(jié)素肽溶液中，室溫下反應(yīng)120分鐘，并輕輕地攪拌混勻(見圖4)。EDC為應(yīng)用非常廣泛的雙功能交聯(lián)制劑。在酸性條件下，EDC可使蛋白或多肽之間交聯(lián)。本發(fā)明中的連接工藝是通過兩個分開的反應(yīng)達(dá)到的，從而避免了相同分子的連接。在第一個反應(yīng)中，EDC與鈣調(diào)節(jié)素肽的羧基端殘基反應(yīng)與其連接；而在第二個反應(yīng)中(見實(shí)例八和九)，EDC可將鈣調(diào)節(jié)素肽與人血白蛋白上的賴氨酸殘基的氨基交聯(lián)。
EDC交聯(lián)后的鈣調(diào)節(jié)素肽混合液脫去保護(hù)基團(tuán)，按‘實(shí)例七’中方法進(jìn)行脫鹽及純化以去除游離化學(xué)分子和未交聯(lián)的鈣調(diào)節(jié)素肽，計算交聯(lián)效率。分裝成品以進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、藥效和藥代動力學(xué)試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室開發(fā)研究。
實(shí)施例五EPO類多肽1(EMP1)的DMA修飾應(yīng)用化學(xué)方法合成由20個氨基酸構(gòu)成的EPO類多肽1(EPOmimetic peptide1，EMP1)。經(jīng)脫鹽、有機(jī)溶劑萃取、反相-HPLC純化獲得高純度EMP1，經(jīng)HPLC分析證實(shí)純度達(dá)＞95％，質(zhì)譜分析證實(shí)結(jié)構(gòu)正確。EMP1的兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵使EMP1呈半環(huán)形(見圖5B)。DMA與EMP1的N端游離氨基反應(yīng)連接(見圖5A)。簡要反應(yīng)如下將5mgEMP1以0.5ml含1％DMSO的0.1M磷酸鹽緩沖液溶解，緩沖液的pH值為7.4，然后上樣到10ml已平衡好的Sephadex G-10柱(Pharmacia#17-0010-02)，緩沖液系統(tǒng)仍為0.1M磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4，收集多肽峰，并調(diào)節(jié)EMP1濃度至2mg/ml。
按供應(yīng)廠家指導(dǎo)配制DMA，使其終濃度為100mmol/L，將EMP1溶液緩慢地滴加到DMA溶液中，滴加的同時充分混合均勻，在室溫下反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)結(jié)束時，加入相當(dāng)于四分之一樣品體積的冰乙酸終止反應(yīng)，并按‘實(shí)例七’中方法進(jìn)行脫鹽及純化以去除游離DMA分子、反應(yīng)副產(chǎn)物和未交聯(lián)的EMP1。然后計算交聯(lián)效率，分裝成品以進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)和體內(nèi)活性的驗(yàn)證。
實(shí)施例六EMP1多肽的DSG修飾同上述實(shí)例五準(zhǔn)備EMP1多肽。然后按供應(yīng)廠家指導(dǎo)配制DSG，將EMP1多肽溶液緩慢地滴加入DSG溶液中，滴的同時充分混合均勻，使EMP1多肽的摩爾濃度為DSG摩爾濃度的50-100分之一，室溫下反應(yīng)30分鐘或在冰浴中反應(yīng)120分鐘(見圖6)。
向混合反應(yīng)液中加入20mmol/L的Tris，或甘氨酸，或賴氨酸，或含有自由氨基的溶液終止反應(yīng)。同上述實(shí)例五，按‘實(shí)例七’中方法進(jìn)行脫鹽及純化以去除游離DSG分子、反應(yīng)副產(chǎn)物和未交聯(lián)的EMP1。然后計算交聯(lián)效率，分裝成品以進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)和體內(nèi)活性的驗(yàn)證。
實(shí)施例七修飾后多肽的脫鹽和保存將實(shí)例一、二、三、四、五、以及實(shí)例六中的交聯(lián)反應(yīng)混合液上樣5mlD-Dextran脫鹽柱，用100mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液的pH值為7.0。紫外檢測器檢測洗脫液在280nm的吸收值，收集多肽峰并用洗脫液做適當(dāng)稀釋，分裝西林瓶，每支裝入1ml，進(jìn)行冷凍干燥保存。上述6個實(shí)例中的最終修飾后多肽的濃度均為1.0mg/ml。
實(shí)施例八修飾后多肽在體內(nèi)與血白蛋白結(jié)合凍干后的多肽給藥前用1ml注射用水溶解，以靜脈注射的方式給藥。
實(shí)施例九修飾后多肽在體外與人血白蛋白結(jié)合測定按實(shí)例七中收集的修飾多肽峰的摩爾含量，加入等摩爾含量的含有10mmol/L EDTA的人血白蛋白的溶液中，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘，使修飾后化學(xué)分子與人血白蛋白以二硫鍵或亞氨酯鍵的形式結(jié)合，反應(yīng)終止時加入終濃度50mmol/L的、含有半胱氨酸的Tris或甘氨酸緩沖液，并將反應(yīng)混合液上樣10ml的D-Dextran脫鹽柱，用10mmol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫，緩沖液的pH值為7.0。紫外檢測器檢測洗脫液在280nm的吸收值，收集蛋白峰。脫鹽后的多肽-白蛋白峰可用于穩(wěn)定性試驗(yàn)和體內(nèi)活性的驗(yàn)證研究；同時也可進(jìn)行進(jìn)一步的層析分離，以將未結(jié)合的修飾多肽和白蛋白與多肽-白蛋白交聯(lián)產(chǎn)物徹底分離，從而進(jìn)一步提高多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性。高分辨率的Q離子交換層析和Superose凝膠過濾(Pharmacia#17-0510-01，17-0536-01)可做為這一步層析分離的首要選擇。
實(shí)施例十EMP1-白蛋白交聯(lián)產(chǎn)物仍保留原促紅細(xì)胞生成活性應(yīng)用小鼠模型是檢測促紅細(xì)胞素體內(nèi)活性的重要方法，為增加這一方法的敏感度，可以選擇低壓氧紅細(xì)胞增多小鼠模型生物活性法(Hypoxic-Polycythemic Mouse Bioassay)，通過對同位素標(biāo)記的氯化鐵(59-FeCl3)整合入血紅蛋白的百分比來評估試驗(yàn)樣本促紅細(xì)胞生成的體內(nèi)活性。具體試驗(yàn)如下實(shí)驗(yàn)雌性小鼠(16-18g)首先飼養(yǎng)在0.6大氣壓的低壓氧倉中3天，然后進(jìn)一步降低低壓樣倉中的氣壓至0.4-0.5大氣壓，繼續(xù)飼養(yǎng)11天后轉(zhuǎn)移至正常氣壓下飼養(yǎng)，并于3天后進(jìn)行試驗(yàn)。同時準(zhǔn)備同位素標(biāo)記的氯化鐵(59-FeCl3)，即將由市場上獲得的同位素標(biāo)記的氯化鐵以磷酸鹽緩沖液稀釋至3.7×10exp4Bq/ml。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)小鼠分3大組，每組12只小鼠，每個劑量組3只小鼠，按標(biāo)準(zhǔn)EPO給藥方法分別注射0.25-1.0IU/mouse促紅細(xì)胞生成素(本申請人生產(chǎn)的)，0.01-0.2mg/mouse未經(jīng)修飾EMP1，以及0.01-1μg/mouse的EMP1-白蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，每組均有對照劑量組用同體積的生理鹽水(0.2ml)替代樣品。注射2天后，再給每只動物腹腔內(nèi)注射0.2ml的同位素標(biāo)記的氯化鐵溶液，注射順序與給藥相同。再48小時后，以Avertin麻醉動物，稱體重，從每只小鼠體內(nèi)主動脈弓收集0.65ml血液標(biāo)本，并測出沉降細(xì)胞體積和同位素量。應(yīng)用下列公式計算出每只小鼠對藥物的反應(yīng)(即總循環(huán)血中的59-Fe整合百分比)cpm(s)×0.075bw(g)×1/cpm(t)×1/v(s)其中 cpm(s)＝樣品中同位素量cpm(t)＝注射的同位素總量bw(g)＝體重(克)，小鼠循環(huán)血總體積按體重的7.5％計算v(s)＝樣品體積(ml)以標(biāo)準(zhǔn)常用的統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。當(dāng)沉降細(xì)胞體積小于54％，或者小鼠體重超過24克時，放棄該單項(xiàng)數(shù)據(jù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EPO給藥最高劑量組(1.0IU/mouse)可見59-Fe整合入血紅蛋白的百分比有20倍以上的增高(P＜0.0001)；未經(jīng)修飾EMP1給藥組在用藥劑量達(dá)0.2mg/mouse時，也可見同059-Fe血紅蛋白的百分比有顯著的增高(20倍左右，P＜0.0001)；同樣，在EMP1-白蛋白交聯(lián)產(chǎn)物用藥組，各劑量組均可見不同程度的59-Fe血紅蛋白的百分比增高，最高劑量組(1.0μg/mouse)59-Fe血紅蛋白的百分比增高可達(dá)40倍以上(圖7)。
實(shí)施例十一DMA修飾的EMP1的體內(nèi)穩(wěn)定性有兩種相對簡單的方法可以測定EMP1的體內(nèi)穩(wěn)定性。一種仍然是外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)法，正常小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)是檢測促紅細(xì)胞素體內(nèi)活性的最重要指標(biāo)，通過體內(nèi)活性的測定來間接評估多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性。另一種方法是直接標(biāo)記EMP1，測定其在血漿中的半衰期，從而直接比較其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。選擇正常小鼠外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)法測定EMP1體內(nèi)穩(wěn)定性時，實(shí)驗(yàn)純種正常小鼠(16-18g)隨機(jī)分成3大組，每組7個鼠籠，每個鼠籠6只小鼠，并分別稀釋試驗(yàn)樣品使其達(dá)下列濃度200IU/ml促紅細(xì)胞生成素(沈陽三生生產(chǎn))，10mg/ml未經(jīng)修飾EMP1，以及1.0mg/ml的修飾后EMP1-DMA。實(shí)驗(yàn)時，每只小鼠分別注射0.2ml上述樣品，每大組有一個鼠籠為對照，僅注射0.2ml生理鹽水。注射當(dāng)日取對照鼠籠進(jìn)行外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)，之后第2、4、6、8、10、12天分別于各大組取一鼠籠進(jìn)行外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)。結(jié)果表明，EPO給藥組(40IU/mouse)可見外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)有20％左右的增高(P＜0.0001)，計數(shù)于第2-4天達(dá)最高，一周后恢復(fù)正常水平；未經(jīng)修飾EMP1給藥組也可見到外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)有顯著的增高(約5％，P＜0.001)，于第2天即達(dá)最高，3-4天后即恢復(fù)正常水平；同樣，在修飾EMP1-DMA用藥組也可見外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)增高可達(dá)110％，也于第2-4天達(dá)最高，10天后才逐漸恢復(fù)正常水平(圖8)。由此可推斷，經(jīng)DMA修飾的EMP1具有較高的體內(nèi)穩(wěn)定性。未經(jīng)修飾EMP1雖然在體內(nèi)還具有一定的意想不到的活性，但畢竟十分短暫，可能是由已確知的經(jīng)肝、腎、和組織的排泄機(jī)制對多肽的迅速清除造成的。
如前所述，修飾EMP1-DMA也可應(yīng)用直接標(biāo)記EMP1法測定其在血漿中的半衰期，從而評估其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。初步實(shí)驗(yàn)已證實(shí)修飾EMP1-DMA的體內(nèi)半衰期遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未經(jīng)修飾的EMP1(半衰期約為8小時)，確切的EMP1-DMA的體內(nèi)半衰期有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)獲得。
表二化學(xué)分子結(jié)構(gòu)檢索表(1)
表二化學(xué)分子結(jié)構(gòu)檢索表(2)
表二化學(xué)分子結(jié)構(gòu)檢索表(3)
表二化學(xué)分子結(jié)構(gòu)檢索表(4)
表二化學(xué)分子結(jié)構(gòu)檢索表(5)
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)多肽在體內(nèi)穩(wěn)定性的方法，該方法是指先在體外將多肽用化學(xué)分子修飾即將多肽溶解在10-200mmol/L的鹽類緩沖液中，再將修飾用化學(xué)分子溶解在10-200mmol/L的溶液中，將溶解后的化學(xué)分子加入多肽溶液中，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘或在4℃下反應(yīng)2-20小時，也可以在37℃反應(yīng)20-40分鐘；將上述反應(yīng)混合液通過脫鹽柱，用鹽類緩沖液洗脫，收集洗脫的多肽進(jìn)行冷凍干燥或不冷凍干燥；并且在體外使修飾后的多肽直接加入含有5-20mmol/L EDTA的人血白蛋白的溶液中，在室溫下反應(yīng)30-60分鐘或在4℃下反應(yīng)2-20小時，也可以在37℃反應(yīng)20-40分鐘，反應(yīng)終止時加入終濃度30-200mmol/L含有自由巰基的化合物或者含有自由氨基的化合物，與人血白蛋白以共價鍵的方式相連；在體內(nèi)以靜脈注射或局部注射的方式使修飾后的多肽與人血白蛋白以共價鍵的方式相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的多肽由5-100個氨基酸組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的多肽含有酶，或酶的抑制劑，或抗原、或抗體、或激素、或干擾素、或細(xì)胞因子、或生長因子、或分化因子等的全部或部分結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和3的方法，所指的多肽是天然蛋白中部分結(jié)構(gòu)的變異體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的鹽類緩沖液是磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的溶液是磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液或注射用水，還可以是DMSO或DMF。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、5和6的方法，所指的鹽類緩沖液或溶液中的pH值為6-9。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的脫鹽柱是D-Dextran脫鹽柱、KwikSep Dextran脫鹽柱、Excellulose GF-5脫鹽柱、或者是PD-10脫鹽柱(Pharmacia#17-0851-01)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指修飾多肽的化學(xué)分子可以是NHS馬來酰亞氨酯類(MBS、Sulfo-MBS、SMPB、Sulfo-SMPB、GMBS、Sulfo-GMBS、EMCS、Sulfo-EMCS)、SMCC、Sulfo-SMCC、SIAB、Sulfo-SIAB、BMPA、Sulfo-KMUS、或者是EMCA；還可以是EDC、DMP、DMA、DMS、DSG、DSS、或者是BS3。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的修飾方式可以是酰氨鍵、亞氨酰氨鍵，或者是酯鍵。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，對于溶解度較差的多肽，可加入非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或變性劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的用化學(xué)分子修飾后的多肽在體內(nèi)與人血白蛋白的特異氨基酸通過共價鍵結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的用化學(xué)分子修飾后的多肽在體外與人血白蛋白的特異氨基酸通過共價鍵結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、12和13的方法，所指的特異氨基酸是半胱氨酸，也可以是賴氨酸，還可以是其它含有自由氨基的氨基酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、12和13的方法，所指的共價鍵是二硫鍵、或者是亞氨酯鍵。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所指的含有自由巰基的化合物或者含有自由氨基的化合物是半胱氨酸、巰基乙醇、二硫蘇糖醇、Tris、甘氨酸、賴氨酸或乙醇氨。
全文摘要
一種增強(qiáng)多肽在體內(nèi)穩(wěn)定性的方法及其應(yīng)用,本發(fā)明是利用有機(jī)化學(xué)原理將多肽與人血白蛋白在體內(nèi)或在體外相連的方法,從而增強(qiáng)多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性。該方法包括在體外將由5～100個氨基酸組成的多肽用特殊的化學(xué)分子修飾。修飾后的多肽保持原多肽的生物學(xué)活性,并能在體內(nèi)或體外與人血白蛋白以共價的方式連接,以達(dá)到延長多肽在體內(nèi)的半衰期,提高生物利用度。本發(fā)明具有工藝簡單,可以根據(jù)需要選擇在體內(nèi)或體外實(shí)現(xiàn)多肽與人血白蛋白的結(jié)合,并且結(jié)合過程中沒有修飾多肽以外的其它反應(yīng)產(chǎn)物生成。
文檔編號C07K14/435GK1338463SQ0112801
公開日2002年3月6日 申請日期2001年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月7日
發(fā)明者婁競, 蘇冬梅 申請人:沈陽三生制藥股份有限公司