專利名稱：抗iv型膠原酶單鏈抗體與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白scFv-LDP的構(gòu)建產(chǎn)生，它是一種新型兼具細(xì)胞毒和抑制侵襲轉(zhuǎn)移的雙功能小型化單抗導(dǎo)向藥物。
本發(fā)明的目的主要是從小型化、高效化以及選用新型靶點(diǎn)著手研制新型單抗導(dǎo)向藥物。本發(fā)明目前未見類似報(bào)道。
酵母屬于單細(xì)胞低等真核生物，一方面具有原核生物易于培養(yǎng)、生長繁殖快、便于基因工程操作等特性，另一方面又具有真核生物的蛋白翻譯后加工能力。因此，用酵母表達(dá)體系高效表達(dá)真核外源蛋白目前受到廣泛研究和應(yīng)用。本發(fā)明是在甲醇營養(yǎng)型酵母Pichia pastoris中生產(chǎn)重組融合蛋白。
本項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)容和要點(diǎn)包括以下步驟1.抗IV型膠原酶單抗片段scFv基因的克隆構(gòu)建本部分使用Pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統(tǒng)試劑盒產(chǎn)生scFv片段。以抗IV型膠原酶雜交瘤細(xì)胞3D6mRNA為模板，分別擴(kuò)增出抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。然后用一段編碼(GGGGS)3的linker序列，經(jīng)重組PCR將抗體輕、重鏈可變區(qū)基因連接構(gòu)建成scFv片段(

圖1)。將此基因片段克隆進(jìn)質(zhì)粒pCANTAB5E(Pharmacia公司)構(gòu)建重組噬菌體抗體庫。用IV型膠原酶對文庫進(jìn)行兩輪免疫淘選后得到一株對抗原有最高親和力的重組噬菌體抗體43#。ScFv-43基因片段由上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測定，全長744bp，編碼248個(gè)氨基酸。該基因序列與專利99121668.7中的scFv基因序列92.2％同源(圖2)。兩個(gè)scFv片段都是抗IV型膠原酶，但本發(fā)明所涉及的scFv片段的起源雜交瘤細(xì)胞3D6比專利99121668.7中的scFv片段的起源雜交瘤細(xì)胞C2H5對抗原具有更強(qiáng)的親和力，因此具備更高的腫瘤靶向性。
2.ScFv-LDP融合基因的構(gòu)建重組質(zhì)粒pCANscFv、pC由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，分別含有scFv和LDP基因片段。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。PH1(scFv 5’端引物)5’ATCTCGAGAAAAGAGAGGCCCAGGTGAAGCTG 3’XhoIPL2(scFv 3’端引物)5’CGCCATGGTGAACCGCCTCCACCACGTTTGATTTC3’Nco I spacerPLD1(LDP 5’端引物)5’CATGCCATGGGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTC 3’Nco IPLD2(LDP 3’端引物)5’GTGAATTCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCAC 3’EcoR I以質(zhì)粒pCANscFv為模板，PH1、PL2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長約800bp的scFv基因片段(圖3)，分離純化后用Xho I和Nco I雙酶切。同時(shí)以質(zhì)粒pC為模板，PLD1和PLD2為引物PCR擴(kuò)增LDP基因，獲得約340bp的擴(kuò)增片段(圖3)，分離純化后用Nco I和EcoR I雙酶切。將上述兩個(gè)片段與經(jīng)Xho I和EcoRI酶切的質(zhì)粒pPIC9(Invitrogen公司)進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9-Fv1027。由上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測定，融合基因讀碼框插入正確，整個(gè)基因全長1095bp，編碼365個(gè)氨基酸。通過分析計(jì)算機(jī)同源模建的scFv三維結(jié)構(gòu)以及LDP的X-衍射三維結(jié)構(gòu)，在scFv的C-端和LDP的N-端附加一段小肽spacer，以使兩部分的空間構(gòu)象不至于相互影響。為了以后克隆替換的方便，在兩個(gè)基因之間還引入Nco I酶切位點(diǎn)(圖9)。
3.融合蛋白在酵母中的產(chǎn)生本發(fā)明所使用的表達(dá)體系是甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K(Invitrogen公司)。構(gòu)建的融合基因兩端分別是Xho I、EcoR I酶切位點(diǎn)，但質(zhì)粒pPIC9K有兩個(gè)Xho I酶切位點(diǎn)。因此首先是將融合基因經(jīng)Xho I、EcoR I位點(diǎn)亞克隆至質(zhì)粒pPIC9構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9-Fv1027，然后選定Sph I、EcoR I酶切將含融合基因片段亞克隆至表達(dá)載體pPIC9K構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pKFv1027(圖4)。重組質(zhì)粒pKFv1027經(jīng)酶切分析鑒定插入正確(圖5)。重組質(zhì)粒pKFv1027經(jīng)Bgl II酶切線性化并純化后，電轉(zhuǎn)化PichiapastorisGS115，用MD培養(yǎng)基(含YNB1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖1％)及含不同濃度G418的YPD培養(yǎng)基(含酵母浸出物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)平板篩選陽性多拷貝重組轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子G34，提取基因組DNA，以5’AOX1引物(5’GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3’)和3’AOX1引物(5’GCAAATGGCATTCTGACATCC 3’)進(jìn)行PCR鑒定(圖6)，表明外源融合基因通過5’AOX1序列和3’AOX1序列雙交換同源重組整合進(jìn)酵母基因組中，其表型為His+Muts。將G34接種至50ml BMGY培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600約3。離心收集菌體，用5ml BMMY培養(yǎng)基(Invitrogen公司)重懸，30℃振蕩培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度1％，4天后離心收集上清。用抗LDM單抗F9(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)做為一抗進(jìn)行Western blot分析，G34成功地表達(dá)了可溶性重組融合蛋白(圖7)。
4.融合蛋白scFv-LDP的免疫反應(yīng)性將IV型膠原酶按1μg/100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，以100μl 10％脫脂奶粉進(jìn)行封閉。加入酵母表達(dá)上清，孵育后洗去。加入抗LDM單抗F9再次孵育，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，以鄰苯二氨為底物進(jìn)行顯色，酶標(biāo)儀測定490nm處吸光值。結(jié)果表明，融合蛋白仍保留了單抗對抗原IV型膠原酶的免疫反應(yīng)性(圖8)。
5.融合蛋白scFv-LDP抑制血管生成將表達(dá)上清用截留分子量為10kDa的超濾濃縮膜濃縮20倍后，用雞胚尿囊膜法檢測對血管生成抑制作用。結(jié)果表明，在酵母中產(chǎn)生的融合蛋白scFv-LDP能抑制血管生成(表1)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果是運(yùn)用基因工程手段獲得小型化的單抗片段，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建產(chǎn)生融合蛋白scFv-LDP，這為加入LDC生成組裝型單抗導(dǎo)向藥物scFv-LDM奠定了基礎(chǔ)。該策略可以最大限度地確保維持LDM的活性。運(yùn)用酵母表達(dá)體系可以經(jīng)濟(jì)、方便、大量地生產(chǎn)融合蛋白，因而為研制兼具強(qiáng)烈殺傷腫瘤細(xì)胞活性和抑制侵襲轉(zhuǎn)移活性的雙功能小型化單抗導(dǎo)向藥物打下了基礎(chǔ)。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所<120>抗IV型膠原酶單鏈抗體與力達(dá)霉素輔基蛋白的融合蛋白<160>1<170><210>1<212>DNA<213>畢赤酵母(Pichia pastoris)<220><221>misc_feature<222><223><400>1atggcccagg tgaagctgca gcagtctgga actgaagtgg taaagcctgg ggcttcagtg 60aagttgtcct gcaaggcttc tggctacatc ttcacaagtt atgatataaa ctgggtgagg 120cagacgcctg aacagggact tgagtggatt ggatggattt ttcctggaga ggggagtact 180gaatacaatg agaagttcaa gggcagggcc acactgagtg tagacaagtc ctccagcaca 240gcctatatgg agctcactag gctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgctaga 300ggggactact ataggcgcta ctttgacttg tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catcgagctc 420actcagtctc cagcttcttt ggctgtgtct ctagggcaga gggccaccat atcctgcaga 480gccagtgaaa gtgttgatac ttatggcgat acttttatgt actggtacca gcagaaacca 540ggacagccac ccaaactcct catctatctt gcaaccaacc taggatctgg ggtccctgcc 600aggttcagtg gcagtgggtc taggacaaac ttcaccctca ccattgatcc tgtggaggct 660gatgatgctg caacctatta ctgtcagcaa aataatgagg atccgtacac gttcggaggg 720ggcaccaagc tggaaatcaa acgt74權(quán)利要求
1.抗IV型膠原酶單鏈抗體(scFv)與力達(dá)霉素輔基蛋白(LDP)的融合蛋白(scFv-LDP)，其特征是所說方案的實(shí)施包括以下步驟A.抗IV型膠原酶scFv基因的克隆構(gòu)建；B.ScFv-LDP融合基因的構(gòu)建；C.融合蛋白酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；D.融合蛋白在酵母中的可溶性表達(dá)；E.融合蛋白的生物學(xué)活性測定。
2.按照權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征是從抗IV型膠原酶雜交瘤細(xì)胞3D6中反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，然后用一段連接序列連接構(gòu)建scFv基因。
3.按照權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征是運(yùn)用基因工程技術(shù)，用編碼一段柔性小肽的DNA序列將scFv基因與LDP基因連接成scFv-spacer-LDP形式的融合基因，同時(shí)，在spacer區(qū)引入相應(yīng)酶切位點(diǎn)。
4.按照權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征是融合基因克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒，如pPIC9K等構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pKFv1027。
5.按照權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征是Bgl II線性化pKFv1027經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)宿主系統(tǒng)如Pichia pastoris獲得陽性克隆轉(zhuǎn)化子，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)可溶性融合蛋白。
6.按照權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征是ELISA檢測產(chǎn)生的融合蛋白對抗原IV型膠原酶的結(jié)合能力，用雞胚尿囊膜法檢測融合蛋白抑制血管生成能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小型化融合蛋白scFv－LDP的構(gòu)建產(chǎn)生，其實(shí)施方案是運(yùn)用DNA分子重組技術(shù)、基因工程技術(shù)，構(gòu)建了抗IV型膠原酶單鏈抗體(Single－chain Fv fragment，scFv)基因和力達(dá)霉素輔基蛋白(LDP)基因的融合基因，在甲醇營養(yǎng)型酵母Pichia pastoris中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白保留了對抗原IV型膠原酶的結(jié)合能力，同時(shí)對雞胚尿囊膜血管生成有抑制作用，該融合蛋白有望成為兼具強(qiáng)烈殺傷腫瘤細(xì)胞活性和抑制侵襲轉(zhuǎn)移活性的雙功能小型化單抗導(dǎo)向藥物。
文檔編號C07K14/36GK1403577SQ01131299
公開日2003年3月19日 申請日期2001年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者甄永蘇, 唐勇 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所