專利名稱：分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
血紅蛋白由四個(gè)亞基(α1α2β1β2)組成，是紅細(xì)胞內(nèi)一種負(fù)責(zé)氧氣傳遞的蛋白。由于其獨(dú)特的氧結(jié)合特性、正常的生理代謝途徑等原因，以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品非常符合人體的生理需要。與紅細(xì)胞不同，用巴斯德消毒、超濾和化學(xué)法等方式可以對(duì)血液代用品滅菌，從而除去了引起愛滋病、乙型肝炎等的病原微生物。因?yàn)闆]有紅細(xì)胞群抗原，無(wú)需進(jìn)行交叉驗(yàn)血，省時(shí)，也減少了對(duì)設(shè)備的要求。這使得輸血可以像輸鹽溶液一樣即刻進(jìn)行。然而，未經(jīng)修飾的血紅蛋白不能作為血液代用品，這主要是因?yàn)?1)未經(jīng)修飾的血紅蛋白失去紅細(xì)胞內(nèi)2，3-二磷酸甘油酸調(diào)節(jié)，使血紅蛋白氧親和力升高，影響氧的釋放，不能向組織有效地供氧；(2)未經(jīng)修飾的血紅蛋白在血漿中膠體滲透壓高；(3)未經(jīng)修飾的血紅蛋白由于無(wú)細(xì)胞膜的包被，四聚體在體內(nèi)的循環(huán)半壽期僅為2～4小時(shí)，迅速分解成二聚體和單體并從腎臟濾過(guò)，形成血紅蛋白尿，造成腎中毒。同時(shí)由于游離的血紅蛋白四聚體分子及其分解產(chǎn)物能滲透血管內(nèi)皮進(jìn)入器官及組織間質(zhì)，引起嚴(yán)重的副作用。
以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品的研究都集中于降低氧親和力、穩(wěn)定四聚體結(jié)構(gòu)和延長(zhǎng)其循環(huán)半壽期。通常采用化學(xué)修飾、交聯(lián)、聚合和脂質(zhì)體包埋等方法來(lái)達(dá)到此目的?；瘜W(xué)修飾的血紅蛋白是血液代用品研究的途徑之一，對(duì)血紅蛋白分子進(jìn)行修飾的目標(biāo)集中于血紅蛋白分子上的血紅蛋白效應(yīng)因子結(jié)合部位?；瘜W(xué)修飾的血紅蛋白包括血紅蛋白分子內(nèi)及分子間交聯(lián)形成的聚血紅蛋白、分子內(nèi)交聯(lián)形成的四聚體血紅蛋白、可溶性聚合物交聯(lián)形成的偶合血紅蛋白等。其中，以戊二醛為交聯(lián)劑，可形成分子內(nèi)及分子間交聯(lián)的聚合血紅蛋白；這種交聯(lián)可穩(wěn)定四聚體結(jié)構(gòu)，防止四聚體解聚，并且能夠降低膠體滲透壓和延長(zhǎng)循環(huán)半壽期。目前，OxyglobinTM(美國(guó)Biopure公司)和PolyHemeTM(美國(guó)Northfield公司)，這兩種用該方法制備的產(chǎn)品已進(jìn)入了三期臨床實(shí)驗(yàn)。
戊二醛，是一種同型雙功能試劑。它的兩個(gè)醛基可以分別與兩個(gè)相同或不同的伯氨基形成希夫氏堿，將兩分子以五碳鏈的橋連接起來(lái)。通常，戊二醛交聯(lián)可生成75-85％的聚合血紅蛋白，主要為二聚到六聚血紅蛋白分子(分子量為128-400千道爾頓)。然而，分子量太大的聚合血紅蛋白容易凝聚甚至沉淀。盡管這種聚合血紅蛋白分子的異源性不會(huì)影響它的生理功能，但是當(dāng)出現(xiàn)負(fù)作用時(shí)就很難確定有害物質(zhì)的性質(zhì)和來(lái)源。這一點(diǎn)對(duì)于制備血液代用品來(lái)說(shuō)是必不可少的。聚合血紅蛋白能降低血紅蛋白的膠體滲透壓，而同時(shí)增加了血紅蛋白的粘度。因此，我們需要制備均一分子量的聚合血紅蛋白來(lái)獲得理想的膠體滲透壓和粘度。當(dāng)我們需要某一特定分子量的聚合產(chǎn)物時(shí)，卻很難從戊二醛交聯(lián)的聚合物中分離出該產(chǎn)物。這是由于從技術(shù)角度上來(lái)講分離該主份很困難，并且花費(fèi)高、耗時(shí)間。這就需要在聚合過(guò)程中就控制聚合物的分子量分布。有人嘗試用新型的交聯(lián)劑，如聚合胺類交聯(lián)劑等來(lái)制備分子量分布較窄的聚合血紅蛋白。但是這些交聯(lián)劑很昂貴，且不易買到，而且聚合物的分子量分布仍然不均一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可獲得理想的膠體滲透壓和粘度的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法。
本發(fā)明的實(shí)施方案如下本發(fā)明提供的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其步驟包括1.用固相吸附法將血紅蛋白吸附在固定相上，并加入同型雙功能試劑進(jìn)行聚合反應(yīng)；反應(yīng)溫度為4-30℃，反應(yīng)時(shí)間1小時(shí)；血紅蛋白在固定相上的密度為0.5--4mg血紅蛋白/ml，血紅蛋白與同型雙功能交聯(lián)劑的摩爾比為500∶1∶50；2.用不含氨基基團(tuán)的高鹽緩沖液將步驟1生成的聚合產(chǎn)物洗脫下來(lái)并收集，再用層析法對(duì)該收集物進(jìn)行分離純化，得到聚合血紅蛋白，回收得到的聚合血紅蛋白；所述的血紅蛋白為牛血紅蛋白、豬血紅蛋白或人血紅蛋白；所述的同型雙功能試劑為戊二醛；所述的不含氨基基團(tuán)的高鹽緩沖液pH值為7-9；所述的固定相為陰離子交換介質(zhì)；所述的血紅蛋白在固定相上的密度為2mg血紅蛋白/ml；所述的血紅蛋白與同型雙功能試劑的摩爾比為1∶200較佳；所述的血紅蛋白與同型雙功能試劑戊二醛的摩爾比為1∶200較佳；所述的高鹽緩沖液為HEPES緩沖液，pH值為8.0較佳；所述的聚合反應(yīng)溫度為4℃較佳；所述的血紅蛋白為T態(tài)血紅蛋白脫氧血紅蛋白；所述的陰離子交換介質(zhì)為Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)(QSepharose Fast Flow)，Q瓊脂糖大顆粒介質(zhì)(Q Sepharose Big Beads)，DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)(DEAE Sepharose Fast Flow)；所述的采用的層析法是DEAE-高效液相法；本發(fā)明還可進(jìn)一步包括步驟3采用硼氫化鈉對(duì)得到的聚合血紅蛋白進(jìn)行還原處理后，通過(guò)葡聚糖G-25柱除去鹽份。
本發(fā)明首先用固相吸附血紅蛋白，然后加入戊二醛進(jìn)行聚合反應(yīng)。血紅蛋白在固相上被不均勻地吸附，在空間上距離較近的血紅蛋白分子在戊二醛作用下發(fā)生聚合，聚合產(chǎn)物主要是二聚體血紅蛋白。而有些血紅蛋白分子在空間上距離較遠(yuǎn)，無(wú)法進(jìn)行自身聚合反應(yīng)，并限制了反應(yīng)產(chǎn)物的進(jìn)一步聚合，從而克服了傳統(tǒng)戊二醛交聯(lián)方法的缺陷。該方法不僅適用于制備聚合血紅蛋白，而且還可適用于制備其它蛋白的聚合體，如制備聚合過(guò)氧化氫酶。
本發(fā)明選用的血紅蛋白可為牛血紅蛋白，是從牛紅細(xì)胞中純化出來(lái)的。牛血紅蛋白屬于低氧親和力的血紅蛋白，對(duì)2，3-二磷酸甘油不敏感。這種低氧親和力是由于其對(duì)陰離子的高敏感，其中氯離子是牛血紅蛋白的主要?jiǎng)e構(gòu)效應(yīng)劑。在生理離子強(qiáng)度下牛血紅蛋白的P50隨氯離子濃度的增大而升高，比同樣條件下人血紅蛋白氧親和力的變化明顯的多，且不受2，3-二磷酸甘油濃度的影響。氯離子對(duì)牛血紅蛋白的這種氧親和力調(diào)節(jié)為血紅蛋白溶液作為血液代用品提供了可能，并且由于注入其它動(dòng)物體內(nèi)沒有引起抗體的快速生成而倍受人們青睞。另外，本發(fā)明也可適用于其它來(lái)源的血紅蛋白，如人血紅蛋白、豬血紅蛋白。本發(fā)明用固相吸附人血紅蛋白和豬血紅蛋白，與戊二醛反應(yīng)后，與牛血紅蛋白的制備結(jié)果相同。
本發(fā)明使用的血紅蛋白是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的已知技術(shù)來(lái)提取和制備的。首先收集并裂解牛紅細(xì)胞，通過(guò)超速離心、過(guò)濾等方法除去細(xì)胞碎片和細(xì)胞基質(zhì)。最后，用DEAE纖維素離子交換選擇吸附的方法除去雜蛋白，獲得純化的牛血紅蛋白。純化的牛血紅蛋白在低溫下保存。血紅蛋白在天然狀態(tài)下可分為脫氧血紅蛋白和氧合血紅蛋白。脫氧血紅蛋白在構(gòu)象上處于緊張態(tài)(T態(tài))，而氧合血紅蛋白在構(gòu)象上處于松弛態(tài)(R態(tài))。由于T態(tài)被視為血紅蛋白在紅細(xì)胞中天然存在的構(gòu)象，因而脫氧血紅蛋白的氧結(jié)合性質(zhì)更能滿足人們的需要，本發(fā)明也利用脫氧血紅蛋白來(lái)制備聚合血紅蛋白。血紅蛋白脫氧形成脫氧血紅蛋白是在與戊二醛反應(yīng)之前進(jìn)行的。本發(fā)明采用充入氮?dú)獾姆椒▉?lái)完成血紅蛋白的脫氧過(guò)程，固相也抽去空氣，聚合反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。
本發(fā)明采用固相吸附法制備聚合血紅蛋白。在制備過(guò)程中，吸附的血紅蛋白在固相上的密度以及與參與反應(yīng)的戊二醛的摩爾比，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，緩沖液的性質(zhì)及其pH值對(duì)于制備的聚合血紅蛋白的純度及其產(chǎn)率有很大的影響?？紤]到低溫下制備聚合血紅蛋白有利于保持血紅蛋白的載氧功能，并且在高溫下(如30℃下)聚合物的產(chǎn)率與在低溫下相比僅略有增加，本發(fā)明采用4℃作為反應(yīng)溫度。由于固相采用的是陰離子交換介質(zhì)，而血紅蛋白的等電點(diǎn)為6.9，為了使血紅蛋白吸附在固相上，所使用緩沖液的pH值在7-9之間。本發(fā)明采用的工作pH為8.0。陰離子交換介質(zhì)能特異性地吸附陰離子，不宜采用磷酸緩沖液。由于戊二醛能與氨基基團(tuán)反應(yīng)，緩沖液不能含有氨基，不宜采用含有氨基的Tris-鹽酸緩沖液。因而，本發(fā)明采用HEPES緩沖液進(jìn)行制備反應(yīng)。由于在固相上反應(yīng)1小時(shí)以上，聚合血紅蛋白的產(chǎn)率不再增加，本發(fā)明采用的反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)。血紅蛋白在固相上的密度以及與戊二醛的摩爾比對(duì)于制備的聚合血紅蛋白分子量的均一性至關(guān)重要。本發(fā)明在0.5-4mg血紅蛋白/ml固相和戊二醛與血紅蛋白摩爾比為50-500∶1的范圍內(nèi)優(yōu)化反應(yīng)物的配比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在2mg血紅蛋白/ml固相和200∶1(戊二醛與血紅蛋白的摩爾比)的配比下，聚合血紅蛋白基本上是兩個(gè)分子聚合的血紅蛋白，而且產(chǎn)率較高。而高于這一配比，雖然聚合血紅蛋白的產(chǎn)率有所增加，但是有多聚血紅蛋白生成。因此，本發(fā)明采用這一配比制備聚合產(chǎn)物。
本發(fā)明所制備的聚合血紅蛋白為分子量均一的兩個(gè)分子聚合的聚合血紅蛋白(分子量約為135千道爾頓)，可克服傳統(tǒng)的戊二醛制備方法中聚合產(chǎn)物不均一的缺陷；該聚合血紅蛋白很容易與未聚合的單體血紅蛋白分離，并且由于減少了蛋白膠體的數(shù)量而使膠體滲透壓降低，粘度卻無(wú)顯著變化。


圖1是在固相上制備的聚合產(chǎn)物在Superdex 200凝膠過(guò)濾柱(1×30cm)上的色譜圖；圖1a、1b和1c分別代表在Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)，Q瓊脂糖大顆粒介質(zhì)和DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)上制備的聚合產(chǎn)物的色譜圖，流速為0.25ml/min；圖2是聚合血紅蛋白的產(chǎn)率(■)隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線；圖3是血紅蛋白在固定相上密度分別為0.5∶1(a)，1∶1(b)，2∶1(c)，and4∶1(d)mg血紅蛋白/ml時(shí)的色譜圖；圖4是血紅蛋白與戊二醛的摩爾比分別為1∶50(A)，1∶100(B)，1∶200(C)，and 1∶500(D)時(shí)的色譜圖；圖5是聚合產(chǎn)物用DEAE一高效液相法純化的色譜圖，流速為0.4ml/min。
實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1用Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)制備分子量均一的聚合牛血紅蛋白將純凈的牛血紅蛋白溶液在4℃充氮?dú)?小時(shí)，使牛血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)；用20mM HEPES緩沖液(pH 8.0)平衡Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)；抽氣除去Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)中的氧氣，隨后充入氮?dú)猓蝗?5ml處理的固相與10ml脫氧血紅蛋白(3mg/ml，pH8.0)均勻混合；混合物裝入6.5×1cm的柱中，加入0.5ml0.4％(v/v)的戊二醛溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于4℃反應(yīng)1小時(shí)；隨后用10個(gè)柱體積的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡；最后，用含有0.4M氯化鈉的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，洗脫物在280nm下檢測(cè)，注意收集洗脫峰；收集物用硼氫化鈉還原后，過(guò)葡聚糖G-25柱除去鹽分；收集物上Superdex 200凝膠過(guò)濾柱，用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.25ml/min，洗脫物在280nm下檢測(cè)光吸收?？捎^測(cè)到兩個(gè)洗脫峰。根據(jù)這兩個(gè)洗脫峰的洗脫時(shí)間，可確定第一個(gè)洗脫峰的分子量是135千道爾頓，為兩個(gè)分子聚體的血紅蛋白。第二個(gè)洗脫峰的分子量為66.5干道爾頓，為未反應(yīng)的血紅蛋白。結(jié)果見附圖1。
實(shí)施例2用Q瓊脂糖大顆粒介質(zhì)制備分子量均一的聚合牛血紅蛋白血紅蛋白溶液在4℃充氮?dú)?小時(shí)，使血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)。用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡Q瓊脂糖大顆粒介質(zhì)。抽氣除去Q瓊脂糖大顆粒介質(zhì)中的氧氣并充入氮?dú)狻Ｈ?5ml處理的固相與5ml的6mg/ml脫氧血紅蛋白(pH8.0)均勻混合。隨后，裝入6.5×1cm的柱中，加入0.5ml0.4％(v/v)的戊二醛溶液，于4℃反應(yīng)1小時(shí)。隨后，用10個(gè)柱體積的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡，流速為1m1/min。最后用含有0.4M氯化鈉的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.6ml/min，收集洗脫峰。收集物用硼氫化鈉還原后，過(guò)葡聚糖G-25柱除去鹽分。收集物上Superdex 200凝膠過(guò)濾柱，用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.25ml/min，洗脫物在280nm下檢測(cè)光吸收?？捎^測(cè)到兩個(gè)洗脫峰。根據(jù)這兩個(gè)洗脫峰的洗脫時(shí)間，可確定第一個(gè)洗脫峰的分子量是135千道爾頓，為兩個(gè)分子聚體的血紅蛋白。第二個(gè)洗脫峰的分子量為66.5千道爾頓，為未反應(yīng)的血紅蛋白。結(jié)果見附圖1。
實(shí)施例3用DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)制備聚合血紅蛋白取10ml的3mg/ml血紅蛋白溶液(pH8.0)，在4℃下充氮?dú)?小時(shí)，使血紅蛋白處于脫氧狀態(tài)。用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)。抽氣除去DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)中的氧氣。取15ml處理的DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)與脫氧血紅蛋白混合。混合物裝入6.5×1cm的柱中，加入0.5ml的0.4％(v/v)的戊二醛溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于4℃反應(yīng)1小時(shí)。隨后用10個(gè)柱體積的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡。最后，用含有0.4M氯化鈉的20mMHEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，注意收集洗脫峰。收集物用硼氫化鈉還原后，過(guò)葡聚糖G-25柱除去鹽分。收集物上Superdex 200凝膠過(guò)濾柱，用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.25ml/min，洗脫物在280nm下檢測(cè)光吸收。可觀測(cè)到兩個(gè)洗脫峰。根據(jù)這兩個(gè)洗脫峰的洗脫時(shí)間，可確定第一個(gè)洗脫峰的分子量是135千道爾頓，為兩個(gè)分子聚體的血紅蛋白。第二個(gè)洗脫峰的分子量為66.5千道爾頓，為未反應(yīng)的血紅蛋白。結(jié)果見附圖1。
實(shí)施例4反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)；取120ml處理的固相與80ml脫氧血紅蛋白(3mg/ml，pH8.0)均勻混合，分成8等份，分別加入0.5ml0.4％(v/v)的戊二醛溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于4℃分別反應(yīng)5、10、20、30、40、60、90和120分鐘。隨后，用10個(gè)柱體積的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡，流速為1ml/min。最后用含有0.4M氯化鈉的20mM HEPES緩沖液(pH 8.0)洗脫，流速為0.6ml/min，收集洗脫峰。收集物上Superdex 200凝膠過(guò)濾柱，以確定聚合物的產(chǎn)率。結(jié)果如附圖2所示，在0.5-2小時(shí)內(nèi)產(chǎn)率較高。本發(fā)明采用的反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)。
實(shí)施例5反應(yīng)溫度的優(yōu)化用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)；取60ml處理的固相與40ml脫氧血紅蛋白(3mg/ml，pH8.0)均勻混合，分成4等份，分別加入0.5ml0.4％(v/v)的戊二醛溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于40℃、10℃、20℃和30℃下反應(yīng)1小時(shí)。隨后，用10個(gè)柱體積的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡，流速為1ml/min。最后用含有0.4M氯化鈉的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.6ml/min，收集洗脫峰。收集物上Superdex 200凝膠過(guò)濾柱，以確定聚合物的產(chǎn)率。在4℃、10℃、20℃和30℃下，聚合物的產(chǎn)率分別為45.2％、46.9％、48.3％和49.1％?？梢姕囟葘?duì)聚合反應(yīng)的影響不明顯，同時(shí)考慮到血紅蛋白的生物活性，本發(fā)明采用的反應(yīng)溫度為4℃。
實(shí)施例6血紅蛋白在固定相上密度的優(yōu)化用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)；取15ml處理的固相分別與l0ml、20ml、40ml和80ml脫氧血紅蛋白(3mg/ml，pH8.0)均勻混合，分別加入0.5ml0.4％(v/v)的戊二醛溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于4℃下反應(yīng)1小時(shí)。隨后，用10個(gè)柱體積的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡，流速為1ml/min。最后用含有0.4M氯化鈉的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.6ml/min，收集洗脫峰。收集物上Superdex 200凝膠過(guò)濾柱，以確定聚合物的產(chǎn)率。結(jié)果見附圖3。血紅蛋白在固定相上的密度為2mg血紅蛋白/ml時(shí)產(chǎn)率最高，密度為4mg血紅蛋白/ml時(shí)有多聚體血紅蛋白生成。本發(fā)明采用的密度為2mg血紅蛋白/ml。
實(shí)施例7血紅蛋白與戊二醛摩爾比的優(yōu)化用20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡Q瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)；取60ml處理的固相與40ml脫氧血紅蛋白(3mg/ml，pH8.0)均勻混合，分成4等份，分別加入0.25ml、0.50ml、1ml和25ml的0.2％(v/v)的戊二醛溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于4℃下反應(yīng)1小時(shí)。隨后，用10個(gè)柱體積的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)平衡，流速為1ml/min。最后用含有0.4M氯化鈉的20mM HEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，流速為0.6ml/min，收集洗脫峰。收集物上Superdex 200凝膠過(guò)濾柱，以確定聚合物的產(chǎn)率。結(jié)果見附圖4。血紅蛋白與戊二醛摩爾比為1∶200(即加入0.25ml的0.2％(v/v)的戊二醛溶液)時(shí)產(chǎn)率最高，為48.3％。摩爾比為1∶500時(shí)有多聚體血紅蛋白生成。本發(fā)明采用的血紅蛋白與戊二醛摩爾比為1∶200。
實(shí)施例8聚合血紅蛋白的分離純化采用Protein-PakTMDEAE 8HR陰離子交換柱(美國(guó)Millipore公司，5×100mm)純化。以HEPES緩沖液(50mM，pH8.0)平衡柱子，平衡約5個(gè)柱體積，流速1ml/min。收集物上柱，隨后改為含有0-0.5M氯化鈉的HEPES緩沖液(50mM，pH8.0)梯度洗脫，流速為0.5ml/min，收集第二個(gè)峰的蛋白組分，即為聚合血紅蛋白。結(jié)果見附圖5。該蛋白溶于Hemox緩沖液(pH7.4)，在37℃下用Hemox分析儀(美國(guó)TCS公司)測(cè)定氧分解曲線。經(jīng)測(cè)定聚合產(chǎn)物的P50為21.7mmHg，氧傳遞效率為16.6％，Hill系數(shù)為2.04。
權(quán)利要求
1.一種分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其步驟包括(1)用固相吸附法將血紅蛋白吸附在固定相上，并加入同型雙功能試劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合產(chǎn)物；反應(yīng)溫度為4-30℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5-2小時(shí)；血紅蛋白在固定相上的密度為0.5--4mg血紅蛋白/ml，血紅蛋白與同型雙功能試劑的摩爾比為1∶50--500；(2)用不含氨基基團(tuán)的高鹽緩沖液將步驟(1)生成的聚合產(chǎn)物洗脫下來(lái)并收集，再用層析法對(duì)該收集物進(jìn)行分離純化，得到聚合血紅蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的血紅蛋白為人血紅蛋白、牛血紅蛋白和豬血紅蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的同型雙功能試劑為戊二醛。
4.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的不含氨基基團(tuán)的高鹽緩沖液pH值為7-9。
5.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的固定相為陰離子交換介質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的反應(yīng)溫度為4℃。
7.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)。
8.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的血紅蛋白在固定相上的密度為2mg血紅蛋白/ml。
9.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的血紅蛋白與同型雙功能試劑摩爾比為1∶200。
10.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為HEPES緩沖液，pH值為8.0。
11.如權(quán)利要求4所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為HEPES緩沖液，pH值為8.0。
12.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的血紅蛋白為脫氧血紅蛋白，即“T”態(tài)血紅蛋白。
13.如權(quán)利要求5所述的分子量均一的聚合血紅蛋白血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的陰離子交換介質(zhì)為Q瓊脂糖、Q瓊脂糖大顆粒介質(zhì)或DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)介質(zhì)。
14.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，所述的采用的層析法是DEAE-高效液相法。
15.如權(quán)利要求1所述的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其特征在于，進(jìn)一步包括步驟(3)采用硼氫化鈉對(duì)得到的聚合血紅蛋白進(jìn)行還原處理后，通過(guò)葡聚糖G-25柱除去鹽份。
全文摘要
本發(fā)明涉及的分子量均一的聚合血紅蛋白的制備方法，其步驟包括(1)用固相吸附法將血紅蛋白吸附在固定相上，并加入同型雙功能試劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到聚合產(chǎn)物；(2)用不含氨基基團(tuán)的高鹽緩沖液將步驟(1)生成的聚合產(chǎn)物洗脫下來(lái)并收集，再用層析法對(duì)該收集物進(jìn)行分離純化，得到聚合血紅蛋白；所用的血紅蛋白為人血紅蛋白、牛血紅蛋白和豬血紅蛋白；該方法制備的聚合血紅蛋白為分子量均一的兩個(gè)分子聚合的聚合血紅蛋白(分子量約為135千道爾頓)，克服傳統(tǒng)的戊二醛制備方法中聚合產(chǎn)物不均一的缺陷；該聚合血紅蛋白很容易與未聚合的單體血紅蛋白分離，并且由于減少了蛋白膠體的數(shù)量而使膠體滲透壓降低，粘度卻無(wú)顯著變化。
文檔編號(hào)C07K14/795GK1420127SQ01136190
公開日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2001年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日
發(fā)明者蘇志國(guó), 胡濤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所