專利名稱：山楂sod的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種SOD酶的提取技術(shù)。
背景技術(shù)：
SOD酶是生物重要保護(hù)酶之一，能增強(qiáng)機(jī)體抗逆能力，防衰老。現(xiàn)有文獻(xiàn)表明在很多生物體中存在SOD酶，提取和利用SOD酶已成為當(dāng)今科技研究的熱點(diǎn)之一。專利申請(qǐng)?zhí)?7108883公開(kāi)了一種從蚯蚓中提取SOD的方法，其步驟為洗蚓，凈化，滲透溶液制取SOD母液，粗濾，離心制取上清液，超濾，反滲透濃縮，冷凍干燥等。專利申請(qǐng)?zhí)?6100551公開(kāi)了一種超氧化歧化酶(SOD)的提純方法，它是將動(dòng)物肝臟勻漿在二價(jià)銅鹽的條件下分步加熱和透析沉淀除去雜質(zhì)，提取SOD；采用硫酸銨分步鹽析，除去雜蛋百，收集含SOD的蛋白質(zhì)，再經(jīng)透析、濃縮、干燥，可獲得比活力為2789單位/毫克的SOD。專利申請(qǐng)?zhí)?1101832公開(kāi)了一種大豆超氧化物歧化酶生產(chǎn)方法，它是以大豆(豆類)為原料生產(chǎn)大豆超氧化物歧化酶(大豆SOD)，其生產(chǎn)方法是將大豆依次經(jīng)過(guò)制作膨脹大豆、制取豆?jié){、調(diào)值處理、離心處理得上清液、加熱過(guò)濾、超濾濃縮、干燥等工序獲得SOD。但上述專利申請(qǐng)均因技術(shù)措施或選取的原料不當(dāng)而未實(shí)施。山楂歸類于薔薇科山楂屬，是多年生落葉果樹。經(jīng)過(guò)測(cè)定，山楂果中含有較高的SOD活性，但至今沒(méi)有對(duì)其提取工藝進(jìn)行深入的研究，經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于從山楂果中提取SOD酶的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)人通過(guò)多年反復(fù)實(shí)驗(yàn)和研究，提出一種提取山楂SOD粗酶的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明的山楂SOD粗酶可以通過(guò)硫酸銨沉淀法或膜分離法獲得。本發(fā)明是這樣實(shí)施的1、原料預(yù)處理新鮮山楂果，通過(guò)組織搗碎機(jī)搗碎成漿，置于4000-6000rpm離心機(jī)離心10-30分鐘，棄沉淀殘?jiān)?，獲得上清液作為粗提液。
2、硫酸銨沉淀法提取山楂SOD將粗提液用30％硫酸銨沉淀，采用膜系統(tǒng)過(guò)濾獲得濾液；獲得的濾液用90％硫酸銨沉淀，將沉淀溶于緩沖液中，然后SephadexG-25脫鹽；將脫鹽后的粗酶提取液加入到Sephadex G-100柱中進(jìn)行柱層析，采用全自動(dòng)分布收集系統(tǒng)收集洗脫液，合并SOD活力高的收集液；進(jìn)一步透析，冷凍干燥，獲得高酶活SOD粗酶制劑。
本發(fā)明的另一方法為膜超濾提取山楂SOD，其提取步驟為1、原料預(yù)處理新鮮山楂果，通過(guò)組織搗碎機(jī)搗碎成漿，置于4000-6000rpm離心機(jī)離心10-30分鐘，棄沉淀殘?jiān)?，獲得上清液作為粗提液。
2、膜超濾提取山楂SOD。將粗提液通過(guò)可截留分子量為6萬(wàn)的膜超濾(中空纖維、平板膜和卷式膜)，粗提液超濾后，獲得含有分子量6萬(wàn)以下物質(zhì)的清液，清液再通過(guò)可截留分子量為1萬(wàn)的膜超濾(中空纖維、平板膜和卷式膜)濃縮，得到分子量1～6萬(wàn)的濃縮液，進(jìn)一步冷凍干燥，可獲得SOD粗酶制劑。
本發(fā)明較已有技術(shù)相比具有如下典型優(yōu)點(diǎn)1、提取率高。本發(fā)明所述的方法其提取率高達(dá)80％。
2、SOD酶的活性高。
3、原料易得，成本低廉。


圖1為本發(fā)明工藝流程圖發(fā)明的實(shí)施方式實(shí)施例1硫酸銨沉淀法提取山楂SOD1、原料預(yù)處理新鮮山楂果，通過(guò)組織搗碎機(jī)搗碎成漿，置于4000-6000rpm離心機(jī)離心10-30分鐘，棄沉淀殘?jiān)?，獲得上清液作為粗提液。
2、30％硫酸銨沉淀將粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達(dá)到30％飽和度。在室溫(23-25℃)下攪拌55分鐘，采用膜系統(tǒng)過(guò)濾獲得濾液。
3、90％硫酸銨沉淀在30％硫酸銨沉淀后的濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到90％，在室溫下攪拌60分鐘，置于10000-15000rpm離心機(jī)離心20-40分鐘，將沉淀溶于最小量的5mM pH7.8磷酸緩沖液中(含2mM EDTA)，然后用上述緩沖液和SephadexG-25脫鹽。
4、Sephadex G-100柱層析Sephadex G-100柱，預(yù)先用pH7.8、5mM的磷酸鉀緩沖液平衡；將脫鹽后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述緩沖液洗脫。采用全自動(dòng)分布收集系統(tǒng)收集洗脫液，合并SOD活力高的收集液。
實(shí)施例2膜超濾提取山楂SOD山楂果100kg經(jīng)過(guò)組織搗碎后，離心去除雜質(zhì)留上清液30L作為粗提液，酶活156U/ml；將清液通過(guò)可截留分子量為6萬(wàn)的膜超濾(中空纖維、平板膜和卷式膜)，清液超濾后，獲得含有分子量6萬(wàn)以下物質(zhì)的清液27L，酶活140U/ml，回收率80％；27L清液再通過(guò)可截留分子量為1萬(wàn)的膜超濾(中空纖維、平板膜和卷式膜)濃縮，得到分子量1～6萬(wàn)的濃縮液2.5L，酶活1200U/ml，回收率79％。進(jìn)一步冷凍干燥，可獲得SOD粗酶制劑。
實(shí)施例3硫酸銨沉淀法提取山楂SOD山楂果100kg經(jīng)過(guò)組織搗碎后，離心去除雜質(zhì)留上清液30L作為粗提液，酶活156U/ml；將粗提液用30％硫酸銨沉淀，采用膜系統(tǒng)過(guò)濾獲得濾液；獲得的濾液用90％硫酸銨沉淀，將沉淀溶于緩沖液中，然后SephadexG-25脫鹽，獲得粗酶提取液24L；將脫鹽后的粗酶提取液加入到Sephadex G-100柱中進(jìn)行柱層析，采用全自動(dòng)分布收集系統(tǒng)收集洗脫液，合并SOD活力高的收集液；進(jìn)一步透析，冷凍干燥，獲得高酶活SOD粗酶制劑120.3g，酶活為30085U/g。通過(guò)該方法提取山楂中的SOD，回收率為77.3％。
實(shí)施例4SOD的測(cè)定SOD的測(cè)定方法采用NBT光化學(xué)法，具體如下(1)設(shè)備752型分光光度計(jì)；臺(tái)式離心機(jī)；光照培養(yǎng)箱；冰箱；10ml小燒杯等。
(2)試劑氯化硝基氮藍(lán)四唑(NBT)——上海前進(jìn)制劑廠生產(chǎn)L-甲硫氨酸(L-Met)——上?？颠_(dá)氨基酸廠生產(chǎn)乙二胺四乙酸(EDTA)——北京化工廠生產(chǎn)核黃素(VB2)——北京西中化工廠生產(chǎn)(3)反應(yīng)液的配制NBT反應(yīng)液的制備配制pH7.8，50mmol/L的磷酸緩沖液1000ml，加入1.933mg的L-Met，待完全溶解后，放入45.8mg NBT，0.47mg核黃素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mgEDTA，溶液終濃度Met為13mmol/L；NBT為6.3×10-3mmol/L；核黃素為1.3×10-3mmol/L；EDTA為0.1mmol/L，置于棕色試劑瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1個(gè)月。
(4)測(cè)定方法吸取30μl樣品，放入10ml透明玻璃小燒杯中，加入3mlNBT反應(yīng)液，混勻，在28℃SOD光化反應(yīng)室中，2×15W日光燈光照20分鐘(光照為4000勒克司)，在560nm處測(cè)定吸光度，以NBT反應(yīng)液作空白對(duì)照，每組設(shè)3次重復(fù)，整個(gè)測(cè)定過(guò)程除光化反應(yīng)外，均在避光或弱光條件下進(jìn)行。同時(shí)測(cè)試過(guò)程中以美國(guó)＂Sigma＂公司、上海寶安公司的標(biāo)準(zhǔn)酶和貴州老來(lái)福藥業(yè)公司生產(chǎn)的SOD口服液作為測(cè)試對(duì)照。
(5)計(jì)算 式中CK——空白對(duì)照透光度n——品稀釋倍數(shù)A——樣品透光度酶活單位U/g(ml)
權(quán)利要求
1.一種硫酸銨沉淀法提取山楂SOD酶，其特征在于提取步驟為(1)原料預(yù)處理新鮮山楂果，通過(guò)組織搗碎機(jī)搗碎成漿，置于4000-6000rpm離心機(jī)離心10-30分鐘，棄沉淀殘?jiān)?，獲得上清液作為粗提液；(2)30％硫酸銨沉淀將粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達(dá)到30％飽和度，在室溫(23-25℃)下攪拌55分鐘，采用膜系統(tǒng)過(guò)濾獲得濾液；(3)90％硫酸銨沉淀在30％硫酸銨沉淀后的濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到90％，在室溫下攪拌60分鐘，置于10000-15000rpm離心機(jī)離心20-40分鐘，將沉淀溶于最小量的5mM pH7.8磷酸緩沖液中(含2mM EDTA)，然后用上述緩沖液和SephadexG-25脫鹽；(4)Sephadex G-100柱層析Sephadex G-100柱，預(yù)先用pH7.8、5mM的磷酸鉀緩沖液平衡；將脫鹽后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述緩沖液洗脫，采用全自動(dòng)分布收集系統(tǒng)收集洗脫液，合并SOD活力高的收集液。
2.一種膜超濾提取山楂SOD酶，其特征在于下述步驟(1)原料預(yù)處理新鮮山楂果，通過(guò)組織搗碎機(jī)搗碎成漿，置于4000-6000rpm離心機(jī)離心10-30分鐘，棄沉淀殘?jiān)?，獲得上清液作為粗提液。(2)膜超濾將粗提液通過(guò)可截留分子量為6萬(wàn)的膜超濾，粗提液超濾后，獲得含有分子量6萬(wàn)以下物質(zhì)的清液，清液再通過(guò)可截留分子量為1萬(wàn)的膜超濾濃縮，得到分子量1～6萬(wàn)的濃縮液，冷凍干燥，可獲得SOD粗酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種SOD酶的提取技術(shù)。本發(fā)明的山楂SOD粗酶可以通過(guò)硫酸銨沉淀法或膜分離法獲得,其主要工藝流程為山楂果經(jīng)組織搗碎后,離心,將粗提液用30%硫酸銨沉淀,采用膜系統(tǒng)過(guò)濾獲得濾液;獲得的濾液用90%硫酸銨沉淀,將沉淀溶于緩沖液中,然后SephadexG－25脫鹽,獲得粗酶提取液;將脫鹽后的粗酶提取液加入到Sephadex G－100柱中進(jìn)行柱層析,采用全自動(dòng)分布收集系統(tǒng)收集洗脫液,合并SOD活力高的收集液;進(jìn)一步透析,冷凍干燥,獲得高酶活SOD粗酶制劑。實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明具有原料廉價(jià)易得、酶活性高、回收率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/36GK1341713SQ0113656
公開(kāi)日2002年3月27日 申請(qǐng)日期2001年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月18日
發(fā)明者王 琦, 梅汝鴻, 梁華榮, 付學(xué)池, 劉艷芳 申請(qǐng)人:北京利農(nóng)生物技術(shù)研究中心