專利名稱：重組人甲狀旁腺素1－34肽的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)。更具體地，本發(fā)明涉及人甲狀旁腺素1-34肽的生產(chǎn)工藝以及相應(yīng)的編碼序列、載體和宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
人甲狀旁腺素是由甲狀旁腺分泌的一種直鏈多肽激素，由84個(gè)氨基酸組成，N-端1-34肽段具有其完整的生物學(xué)功能(Potts，J.T.，Jr.，Kronenberg，H.M.，and Rosenblatt，M.Parathyroid hormonechemistry，biosynthesis and mode ofaction(1982)Adv.Protein Chem.35，323-396.)。
目前，已經(jīng)克隆得到了兩種與PTH有關(guān)的受體，從骨細(xì)胞和腎臟細(xì)胞分離得到的I型受體能夠介導(dǎo)多種與PTH相關(guān)的信號(hào)反應(yīng)(Hisashi Takasu，Thomas J.Gardella，Michael D.Luck，et al.Amino-Terminal Modification of HumanParathyroid Hormone(PTH)Selectively Alter Phospholipase C Signaling via the Type1 PTH ReceptorImplication for Design of Signal-Specific PTH LigandsBiochemistry 1999，38，13453-13460)。通過受體的介導(dǎo)，PTH能夠激活腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等產(chǎn)生cAMP、IP3、Ca+2和二酰基甘油等胞內(nèi)二級(jí)信使。
由于人PTH(1-34)肽能夠通過化學(xué)合成大量得到，因而人們采用合成的人PTH(1-34)肽進(jìn)行過大量的結(jié)構(gòu)功能研究。結(jié)果表明hPTH His14-Phe34為受體活性結(jié)合區(qū)域(Caulfield MP.，McKee R.E.，Goldman M.E.，et al.The bovinerenal parathyroid hormone(PTH)receptor has equal affinity for two different aminoacid sequencesthe receptor binding domains of PTH and PTH-related protein arelocated within the 14-34 region(1990)Endocrinology 127，83-87；Lopez-HilkerS.，Martin K.J.，Sugimoto T.，et al.Biologic activities of parathyroidhormone(1-34)and parathyroid hormone-related peptide(1-34)in isolated perfused ratfemur(1992)J.Lab.Clin.Med.119，738-743)，而N-端部分對(duì)于依賴cAMP的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是必須的(Coleman，D.T.，F(xiàn)itzpatrick，A.，and Bilezikian，J.P.(1994)in the Parathyroids，pp.239-258，Raven Press，New York；Luck M.D.，CarterP.H.，and Gardella T.J.The(1-14)fragment of parathyroid hormone(PTH)activites intact and amino-terminal truncated PTH-1 Receptors(1999)Mol.Endocrinol.13，670-680)。
由于人PTH在治療骨質(zhì)疏松癥方面可能具有很好的應(yīng)用前景。關(guān)于PTH制備方法的研究逐漸引起了人們的重視。除了用固相肽方法合成較短的PTH1-34肽及其類似物外，F(xiàn)orsberg G和Brobjer M等還將人PTH 84肽基因和IgG結(jié)合蛋白融合后，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，利用Thrombin&H64A兩種酶切加工手段，分別得到了5mg/L和8mg/L的最終得率(Forsberg G，Brobjer M，HolmgrenE，et al.Thrombin and H64A subtilisin cleavage of fusion proteins for preparationof human recombinant parathyroid hormone(1991)J Protein Chem Oct；10(5)517-26)。
Olstad OK、Reppe S等人則利用人PTH 84肽與酵母菌成熟因子-α融合的方式在酵母菌中表達(dá)了人PTH(Olstad OK，Reppe S，Gabrielsen OS，etc.Isolation and characterization of two biologically active O-glycosylated forms ofhuman parathyroid hormone produced in Saccharomyces cerevisiae.Identification of anew motif for O-glycosylation(1992)Eur J Biochem Apr 1；205(1)311-9)。
Yuji Suzuki，Masayuki Yabuta and Kazuhiro Ohsuye則利用β-galactosidasederivative與PTH(1-34)融合后在大腸桿菌中形成包含體，利用Kex2-660和V8蛋白酶對(duì)其進(jìn)行修飾以得到正確加工的人PTH(1-34)肽。然后，通過以下工藝流程是菌體發(fā)酵-洗滌純化融合蛋白(包含體)-酶解-加乙酸初步去處雜質(zhì)蛋白-POROS HS50柱純化-POROS R2 50純化-去除乙腈-TSK凝膠-120T純化的純品。最終，得到了0.5g/l的產(chǎn)量(Yuji Suzuki，Masayuki Yabuta and KazuhiroOhsuye High-level production of recombinant human parathyroid hormone 1-34(1998)Applied and Environmental Microbiology，64(2)，526-529)。
Sung WL，Chan BS，Luk CK，Zahab DM等則利用人PTH(1-34)-Asp-Pro-與胰島素前體基因融合表達(dá)的方式在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，采用酸解的方式來獲取人PTH(1-34)-Asp-，得到了約300mg/l的產(chǎn)量(Sung WL，Chan BS，LukCK，et al.High-yield expression of fully bioactive N-terminal parathyroid hormoneanalog in Escherichia coli.(2000)IUBMB Life Feb；49(2)131-5)。
除了PTH(1-34)和PTH(1-84)以外，用基因工程方法表達(dá)的其他PTH衍生物還有PTH(1-37)、PTH(1-38)、PTH(3-84)等。一般來說，完整的84肽可采用單獨(dú)表達(dá)的方式進(jìn)行表達(dá)(包括分泌型表達(dá))，而PTH34肽則采用與宿主蛋白融合表達(dá)的方式。
然而，到目前為止，PTH(1-34)肽的生產(chǎn)工藝還不能十分令人滿意。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的生產(chǎn)PTH(1-34)肽的工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供新的人甲狀旁腺素1-34肽生產(chǎn)工藝，該工藝可高效、簡(jiǎn)便地生產(chǎn)高純度、高活力的人甲狀旁腺素1-34肽。
本發(fā)明的另一目的是提供相應(yīng)的編碼序列、載體和宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種甲狀旁腺素前體肽，它包含人甲狀旁腺素1-34肽，以及在人甲狀旁腺素1-34肽前的脯氨酸內(nèi)肽酶酶切位點(diǎn)。在一種優(yōu)選例中，該甲狀旁腺素前體肽具有SEQ ID NO2氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，本發(fā)明的人甲狀旁腺素前體肽。在優(yōu)選例中，該核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明上述的多核苷酸。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明上述的載體。在一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌pGEX-PT，保藏號(hào)為CGMCC No.0631。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種人甲狀旁腺素1-34肽的制備方法，該方法包含步驟(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的人甲狀旁腺素前體肽，即Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽；(c)用脯氨酸內(nèi)肽酶酶切Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，形成PTH 1-34肽；(d)分離純化出PTH 1-34肽。
在一優(yōu)選例中，在本發(fā)明的方法中，所述的步驟(b)包括通過GST柱分離出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽與GST的融合蛋白；用凝血酶從所述融合蛋白中切下GST，形成Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽
通過靡蛋白酶親和柱分離出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。
在另一優(yōu)選例中，在所述的步驟(d)中，通過靡蛋白酶親和柱分離出PTH 1-34肽。在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(d)還包括C18柱脫鹽和凍干。


圖1顯示了PTH融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX-PT的鑒定與分析。其中圖1APTH(1-34)肽前體基因的PCR檢測(cè)泳道1為PCR產(chǎn)物123bp；泳道2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(從上到下依次為657/458/434/328/289/267/174/142/102/80/40)。圖1B為融合基因的表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物可溶性的分析泳道1為.BL21宿主菌陰性對(duì)照；泳道2為BL21/pGEX-PT工程菌株全菌液；泳道3為表達(dá)產(chǎn)物上清；泳道4為pGEX空載體表達(dá)；泳道5為空載體表達(dá)菌株破菌上清；泳道6為中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。
圖2顯示了脯氨酸內(nèi)肽酶(PEP酶)對(duì)pH條件的依賴性及最適pH條件下的酶作用曲線。其中圖2A對(duì)37肽酶切生成34肽的pH依賴關(guān)系；圖2B在pH8.5時(shí)PEP酶對(duì)底物加工的時(shí)間作用曲線，34肽產(chǎn)物均采用HPLC檢驗(yàn)。
圖3顯示了凝血酶對(duì)Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽的作用。其中圖3A凝血酶對(duì)37肽作用的時(shí)間曲線；圖3B凝血酶對(duì)37肽酶解產(chǎn)物的HPLC質(zhì)譜聯(lián)用分析中的液相圖譜。
圖4顯示了GST-Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)融合蛋白的表達(dá)電泳圖。其中各泳道分別是1.中分子量標(biāo)準(zhǔn)(96000；64000；41000；30000；17000)2.宿主菌條帶對(duì)照3.種子在搖瓶中的表達(dá)量4-6.連續(xù)三批發(fā)酵的表達(dá)量7.親和純化后的融合蛋白。
圖5顯示了凝血酶加工檢測(cè)及親和柱純化數(shù)據(jù)。
其中圖5A融合蛋白加工圖譜，各泳道如下1.酶切后的融合蛋白2.酶切前的融合蛋白3.Promega低分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖5B親和純化的洗脫圖譜，其中峰a為流穿峰，峰b，c，d為洗脫峰。
圖5C親和純化的蛋白電泳檢測(cè)。各泳道如下1.流穿峰(即峰a)2洗脫前峰(即峰b)3.親和前樣品4.親和洗脫的PTH前體肽(即峰d)5.Promega低分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖6顯示了Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽用PEP酶切加工過程中的HPLC數(shù)據(jù)及最終產(chǎn)物的純度鑒定結(jié)果。
其中，圖6APEP酶切加工21小時(shí)HPLC圖譜，其中兩個(gè)保留時(shí)間分別為10.2分鐘為產(chǎn)物峰，10.8分鐘為樣品峰。
圖6B顯示了產(chǎn)物PTH(1-34)肽的HPLC純度鑒定；圖6C顯示了產(chǎn)物PTH(1-34)肽的毛細(xì)管電泳純度鑒定。
具體實(shí)施例方式
為了改進(jìn)人PTH34肽制備的基因工程方法，本文充分利用了已有的能夠?qū)Ｒ恍悦盖懈彼犭逆I的脯氨酸內(nèi)肽酶(PEP)研究結(jié)果，并結(jié)合修飾靡蛋白酶親和層析方法，成功的實(shí)現(xiàn)了重組人PTH34肽的高效表達(dá)，經(jīng)高密度發(fā)酵和酶切加工親和純化，每升發(fā)酵液至少可達(dá)0.5g(最高可達(dá)1g)的產(chǎn)物。
具體而言，本發(fā)明采用基因工程的方法，將PTH(1-34)肽與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合并采用凝血酶和PEP酶雙酶切后加工的方法進(jìn)行表達(dá)，不僅獲得了較高的表達(dá)量，提供了一種快速純化PTH(1-34)肽的方法，大大簡(jiǎn)化了純化過程，而且避免了化學(xué)合成中對(duì)人體造成較高毒性的弊端和小肽單獨(dú)表達(dá)后不利于檢測(cè)、純化的缺點(diǎn)。sjur Reppe，Odd S.Gabrielsen，Ole Kristoffer Olstad等人[SjurReppe，Odd S.Gabrielsen，Ole Kristoffer Olstad，etc.Characterization of a K26Qsite-directed mutant of human parathyroid hormone expressed in yeast.J Biol Chem.1991 Aug 5；266(22)14198-201]及Goran Forsberg，Michael Brobjer，Erik Holmgren等人[Forsberg G，Brobjer M，Holmgren E，et al.Thrombin and H64A subtilisincleavage of fusion proteins for preparation of human recombinant parathyroidhormone(1991)J Protein Chem Oct；10(5)517-26]在表達(dá)獲取PTH(1-84)肽時(shí)曾報(bào)道過，PTH84肽內(nèi)部的某些位點(diǎn)在表達(dá)和純化過程中，易于被蛋白酶降解而造成損失，回收率降低。
為了檢驗(yàn)雙酶切工藝的效果及PTH(1-34)肽內(nèi)部是否存在潛在的作用位點(diǎn)，本發(fā)明特意設(shè)計(jì)了利用化學(xué)合成的Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)前體肽與Thrombin酶及PEP酶共同作用的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可以看出，這種內(nèi)部酶切反應(yīng)在最初的幾小時(shí)內(nèi)并不明顯，而且在采用了相應(yīng)正確的酶反應(yīng)條件之后，這種現(xiàn)象在本發(fā)明中得到了有效的控制，一方面可能是由于融合蛋白造成的空間效應(yīng)阻礙了酶的識(shí)別；另一方面可能是由于內(nèi)部位點(diǎn)并非凝血酶的最適位點(diǎn)，因此在采用了正確的酶切策略后，這種效應(yīng)降到最低。這也從另一個(gè)角度驗(yàn)證了雙酶切工藝的必要性，因?yàn)槿绻赑TH(1-34)與融合蛋白之間加入一個(gè)Gly-Lys-X的非最適位點(diǎn)，酶切時(shí)間就必須相應(yīng)的延長(zhǎng)，從而加劇凝血酶對(duì)PTH內(nèi)部位點(diǎn)的降解，降低產(chǎn)率。另外，通過對(duì)化學(xué)合成底物及基因表達(dá)底物的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PEP酶對(duì)兩種來源的肽段的加工動(dòng)力學(xué)基本一致。
另外，本發(fā)明由于采用了大腸桿菌自身的宿主蛋白，不僅使mRNA的翻譯效率提高，而且也有效的避免了宿主菌蛋白酶的攻擊。由于PTH(1-34)肽內(nèi)部即存在Met位點(diǎn)又存在Asp位點(diǎn)，因此相應(yīng)的化學(xué)降解手段并不可行。根據(jù)PTH(1-34)肽中不存在Pro-位點(diǎn)的獨(dú)特的序列特征，充分利用了本發(fā)明室克隆的PEP酶已知的性質(zhì)特征和酶反應(yīng)條件，在PTH(1-34)肽N-端加入了一個(gè)脯氨酸位點(diǎn)，從而較好的解決了由于融合表達(dá)而導(dǎo)致的后加工問題。但PEP酶本身并不能直接加工大的蛋白分子，當(dāng)PEP酶與融合蛋白直接作用時(shí)，PEP酶對(duì)于蛋白內(nèi)部的Pro位點(diǎn)基本上沒有修飾加工作用。這也從一個(gè)側(cè)面證明了，利用凝血酶和PEP雙酶切加工工藝的必要性。對(duì)于PEP酶的其他加工特性將在以后的實(shí)驗(yàn)中作進(jìn)一步的闡述。
另外，本發(fā)明還利用靡蛋白酶在脫水后，其底物降解活性基本消失，而底物結(jié)合活性并不丟失的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了利用脫水靡蛋白酶-Sepharose 4B親和介質(zhì)，快速、高效純化PTH(1-34)肽及其前體肽的方案。這種親和介質(zhì)最早被用作一種肽譜分析手段，它可以專一的從靡蛋白酶處理液中結(jié)合被降解肽段[12]，用作規(guī)?；a(chǎn)尚未見報(bào)道。靡蛋白酶經(jīng)處理后，其活性中心的Ser位點(diǎn)會(huì)由于脫水轉(zhuǎn)變?yōu)槊撍彼?dehydroalanine)，而破壞了底物降解活性所必需的電子傳遞鏈，導(dǎo)致靡蛋白酶的降解活性丟失，但并不影響靡蛋白酶對(duì)于相應(yīng)底物的結(jié)合。這使得脫水靡蛋白酶有利于作為一種親和配體而被采用。對(duì)于那些反應(yīng)性底物而言，由于其芳香簇氨基酸C-端存在其他種類的氨基酸或氨基酸組成的肽鏈，空間位阻的作用同樣使得它們?cè)谂c產(chǎn)物性底物的競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，因此有條件將這兩種底物分開。由于酶的空間構(gòu)象隨pH的變化會(huì)發(fā)生較大的變動(dòng)，而這些變動(dòng)使得結(jié)合的底物與酶分離，利用這一原理，可以采用pH梯度洗脫的方法進(jìn)行洗脫。由于這種親和樹脂具有很高的專一性，因此它還具有將產(chǎn)物與后加工酶分離的作用，給純化帶來方便。
本發(fā)明解決了PTH研究中的大量樣品來源問題，為今后研究和利用PTH及其衍生物打下了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)由于本發(fā)明是一個(gè)較普遍的多肽表達(dá)體系，因此本發(fā)明同樣適用于其他符合凝血酶和PEP雙酶切加工條件的多肽。
本發(fā)明提供了一種甲狀旁腺素前體肽，其中引入了在PTH 1-34肽前引入了PEP酶切位點(diǎn)。一種優(yōu)選的前體肽包含SEQ ID NO2氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了相應(yīng)的編碼該前體肽的核苷酸序列，一種優(yōu)選的多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了含有上述多核苷酸的載體。適用于本發(fā)明的載體包括本領(lǐng)域中熟知的各種表達(dá)載體，一種優(yōu)選的載體是pGEX載體。
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，含有上述的載體，從而可以表達(dá)甲狀旁腺素前體肽，或者表達(dá)甲狀旁腺素前體肽與其他蛋白的融合蛋白，例如甲狀旁腺素前體肽-GST融合蛋白。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)PTH 1-34肽的方法。通常，該方法包括以下步驟(a)表達(dá)甲狀旁腺素前體肽該步驟就是在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明上述轉(zhuǎn)化的、攜帶表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，而所述表達(dá)載體中含有編碼甲狀旁腺素前體肽或其融合蛋白的DNA序列。
一種優(yōu)選的發(fā)酵條件是NBS Bioflo3000型5升自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行，選取表達(dá)量達(dá)25％以上的種子液，按照1％的接種量接種到含有120ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液的500ml搖瓶中，37℃過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入5L的發(fā)酵罐中于37℃進(jìn)行恒溶氧分批補(bǔ)料培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到60左右時(shí)，加入終濃度為0.4mmol的IPTG，誘導(dǎo)3小時(shí)后終止發(fā)酵。
(b)從培養(yǎng)物中分離Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽一種方法是直接分離Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，如果表達(dá)產(chǎn)物就是Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽的話。
另一種方法是表達(dá)Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽的融合蛋白，例如Gly-Ser-Pro-PTH1-34肽-GST融合蛋白，然后通過GST柱分離出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽與GST的融合蛋白；再用凝血酶從所述融合蛋白中切下GST；最后通過靡蛋白酶親和柱分離出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。
一種優(yōu)選的分離純化融合蛋白的條件是純化將發(fā)酵結(jié)束后，離心收集的菌體重新懸浮于1×PBS緩沖液中，超聲破碎。15000rpm離心15分鐘收集上清。將收集到的上清液通過用1×PBS平衡好的GST親和柱，用10倍柱體積的1×PBS重新平衡親和柱至沒有蛋白洗脫為止，用洗脫液(10mmol谷胱甘肽，50mmol Tris(pH 8.5))洗脫融合蛋白并收集。親和柱用溶液A(pH 8.5 50mmolTris-HCl，0.5N NaCl)和溶液B(pH4.5 50mmol HAc-NaAc 0.5N NaCl)交替淋洗再生。
一種優(yōu)選的凝血酶酶切條件是按每2mg GST-PTH(1-34)融合蛋白加入1U的凝血酶(Thrombin)于50mM Tris-HCl(pH8.4)22℃進(jìn)行酶切。
靡蛋白酶(chymotrypsin)親和層析方法是一種較為常用的純化方法，在例如下列文獻(xiàn)中有描述Weiner H，White W.N.，Hoare D.G.，etc.The formation ofanhydrochymotrypsin by removing the elements of water from the serine at the activesite(1966)J.Am.Chem.Soc.88，3851-3859；Takashi Kumazaki，Asamichi Fujitani，Kumiko Terasawa，etc.(1988)J.Biochem.103，297-301；Rolf Axen and SverkerErnback Chemical fixation of enzymes to cyanogen halide activated polysaccharidecarriers(1971)Eur J Biochem.18，351-360。
一種親和純化人PTH(1-34)前體肽的優(yōu)選條件是將凝血酶切后產(chǎn)物對(duì)L緩沖液(20mM NaH2PO4，20mM硼酸，20mM乙酸，0.1M NaCl pH5.0)透析過夜，與親和樹脂(即脫水靡蛋白酶親和柱)室溫下結(jié)合；用L緩沖液平衡柱子；將L緩沖液對(duì)Vs H緩沖液(20mM Na3PO3，20mM四硼酸鈉，0.2M NaCl，pH 10)進(jìn)行pH梯度洗脫。收集樣品峰。
(c)用脯氨酸內(nèi)肽酶酶切Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，形成PTH 1-34肽；一種優(yōu)選的反應(yīng)條件是將PEP酶與樣品按照150(w/w)的比例混合后，于20mM Tris-HCl(pH8.5)34℃條件酶切30小時(shí)，同時(shí)酶切過程用HPLC監(jiān)測(cè)。
(d)分離純化出PTH 1-34肽。
一種優(yōu)選方法是通過靡蛋白酶親和柱分離出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。此外，所述的步驟(d)還包括C18柱脫鹽和凍干。
一種親和純化人PTH(1-34)肽的優(yōu)選條件是將酶切后產(chǎn)物對(duì)L緩沖液(20mMNaH2PO4，20mM硼酸，20mM乙酸，0.1M NaCl pH5.0)透析過夜，與親和樹脂室溫下結(jié)合；用L緩沖液平衡柱子；將L緩沖液對(duì)Vs H緩沖液(20mM Na3PO3，20mM四硼酸鈉，0.2M NaCl，pH 10)進(jìn)行pH梯度洗脫。收集樣品峰。
由于本發(fā)明改進(jìn)了人甲狀旁腺素的編碼序列，并采用凝血酶和PEP酶雙酶切和靡蛋白酶親和層析法的工藝，因此本發(fā)明工藝可高效、簡(jiǎn)便地生產(chǎn)高純度、高活力的人甲狀旁腺素1-34肽。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一.材料菌種與質(zhì)粒大腸桿菌BL-21(supE hsdΔ5 thiΔ(lac-proAB)F′[traD36proAB′lacZ9lacZ ΔM15]。pGEX-4T-3質(zhì)粒購自Pharmacia公司。
酶類T4DNA激酶，T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶，購自寶靈曼公司，靡蛋白酶為上海第一生化藥業(yè)公司產(chǎn)品粗品進(jìn)一步純化。
主要試劑PTH(1-34)肽和Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)前體肽由采用Fmoc/tBu固相肽合成方法合成。谷胱甘肽Sepharose 4B和和Sepharose fast flow 4B樹脂購自Pharmacia公司，低分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Promega公司，中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購自麗珠東風(fēng)公司，Prosphere 300A C18反相多肽柱購自Alltech公司。
實(shí)施例1基因的合成根據(jù)Gly-Ser-Pro-hPTH34肽的氨基酸序列，選用大腸桿菌優(yōu)選密碼子，設(shè)計(jì)并在ABI 391核酸合成儀上合成了如下6個(gè)片段(P1-P6)P1.5′-cc gga tcc ccg tct gtt tct gaa atc-3′(26bp)(SEQ ID NO5)P2.5′-cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa cac ctg aac tct atg gaa cgt gtt gaa tgg-3′(54bp)(SEQ ID NO6)P3.5′-ctg cgt aaa aaa ctg cag gac gtt cac aac ttc taa tag c-3′(40bp)(SEQ ID NO7)P4.5′-cag ctg gat ttc ag-3′(14bp)(SEQ ID NO8)P5.5′-t acg cag cca ttc a-3′(14bp)(SEQ ID NO9)P6.5′-cg ctc gag cta tta gaa gtt gtg aac-3′(26bp)(SEQ ID NO10)
P1、P2、P3組成基因的上鏈部分。P4和P1的3′末端及P2的5′末端各有7個(gè)堿基互補(bǔ)。P5和P2的3′末端及P3的5′末端各有7個(gè)堿基互補(bǔ)。P6則與P3在3′末端由19個(gè)堿基互補(bǔ)。
將合成的P2、P3片段5′磷酸化后，通過以P4、P5為補(bǔ)丁的連接方式得到P1、P2和P3連接成的基因上鏈，再以P1和P6為引物，PCR擴(kuò)增得到目的基因。DNA序列分析由上海基康公司代為測(cè)定。測(cè)序結(jié)果證實(shí)了人工合成的基因的序列如下gga tcc ccg tct gtt tct gaa atc cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa48cac ctg aac tct atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag96gac gtt cac aac ttc111(SEQ ID NO1)編碼的具有SEQ ID NO2所示的蛋白質(zhì)Gly Ser Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys1 5 10 15His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln20 25 30Asp Val His Asn Phe35實(shí)施例2工程菌的構(gòu)建然后將實(shí)施例1中構(gòu)建的目的基因用BamHI/XholI雙酶切后，與經(jīng)同樣處理的pGEX-4T-3質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)染宿主菌BL21。抗性平板篩選陽性克隆，挑選單菌落進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)菌體密度達(dá)到0.6OD600時(shí)，加入終濃度為0.4mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)篩選，從表達(dá)目的產(chǎn)物的陽性菌株中挑選出一株，抽提其質(zhì)粒，以基因片段P1、P6為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，可見到預(yù)期長(zhǎng)度的PCR擴(kuò)增片段。DNA序列分析也與預(yù)期的相符(PCR結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果見圖1A)。該菌株命名為大腸桿菌pGEX-PT，其表達(dá)結(jié)果見圖1B，在分子量為30000道爾頓處，可見到明顯的融合蛋白表達(dá)條帶，表達(dá)量與空載體的GST蛋白表達(dá)量相近，并為完全可溶性蛋白。
該工程菌pGEX-PT于2001年9月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0631。
實(shí)施例3凝血酶酶切預(yù)實(shí)驗(yàn)和PEP酶切條件條件的摸索(1)PEP酶切條件條件的摸索為了確定所設(shè)計(jì)的融合蛋白中的Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽是否能夠被脯氨酸內(nèi)切酶順利的進(jìn)行加工，首先采用了化學(xué)合成的前體37肽進(jìn)行了條件實(shí)驗(yàn)。將PTH(1-34)肽前體37肽，分別溶于20mM的pH值為5.8、6.8、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10的適當(dāng)緩沖液中(其中pH5.8為磷酸鹽緩沖液，其余pH值均為Tris-HCl緩沖液)，配成1mg/ml的底物反應(yīng)液。按照1∶50(w/w)比例加入PEP酶。在34攝氏度條件下對(duì)底物作用7小時(shí)后，HPLC分別檢測(cè)34肽產(chǎn)物的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEP對(duì)37肽作用的最適pH為8.5(圖2A)。但酶切反應(yīng)的速度較慢，在pH8.5條件下，初始的7小時(shí)內(nèi)，酶切反應(yīng)的產(chǎn)物量基本上呈線性關(guān)系(圖2B)。
(2)凝血酶作用實(shí)驗(yàn)在PTH(1-34)肽序列中，存在這一個(gè)潛在的可能的凝血酶作用位點(diǎn)(Leu-Gly-Lys-His-Leu(11-15))。為了確定是否可以用凝血酶進(jìn)行融合蛋白的酶切后加工，采用了化學(xué)合成的PTH(1-34)肽前體進(jìn)行凝血酶切加工預(yù)實(shí)驗(yàn)。酶切反應(yīng)條件為pH8.0的20mM Tris-HCl反應(yīng)液，底物濃度為1mg/ml。按每毫克底物加入1單位的凝血酶于22攝氏度進(jìn)行反應(yīng)，每2小時(shí)取樣一次。
結(jié)果見圖3A。從圖中可以看出，雖然前體肽中存在著可能的凝血酶加工位點(diǎn)，但這種加工在最初的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)并不明顯，只是在作用時(shí)間延長(zhǎng)后，才逐漸的表現(xiàn)出加工產(chǎn)物的積累(見圖3A)。在初始的4小時(shí)內(nèi)，降解的量不超過5％，選用最佳酶切位點(diǎn)、加大合適酶量和減少作用時(shí)間的反應(yīng)條件有可能是可行的。
用HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用分析凝血酶對(duì)37肽作用14小時(shí)后的結(jié)果見圖3B，峰a和峰b的分子量分別為1660和2697，推測(cè)可能是PTH(1-34)肽前體的Gly-Ser-Pro-PTH(1-13)和PTH(14-34)肽，峰c分子量為4358，為未降解的37肽前體。因此PTH(-34)肽分子內(nèi)部確實(shí)存在一個(gè)凝血酶作用位點(diǎn)。這在采用以凝血酶加工融合表達(dá)的PTH(1-34)肽時(shí)，應(yīng)該加以注意。
實(shí)施例4
GST-PTH(1-34)融合蛋白工程菌的高密度發(fā)酵(1)工程菌發(fā)酵的菌體量和表達(dá)量為了檢驗(yàn)在高密度發(fā)酵時(shí)，菌體密度的高低對(duì)最終產(chǎn)物表達(dá)的影響，分別在NBS Bioflo3000 5升自動(dòng)發(fā)酵罐上進(jìn)行了不同密度的連續(xù)三批發(fā)酵，分別在菌體密度達(dá)到15、30及60 OD600左右時(shí)，加入終濃度為0.4mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，三批發(fā)酵的最終密度分別為21.5、46.5和98 OD600。濕菌體回收量分別約61.49、133和280g/L濕重，種子及三批發(fā)酵液表達(dá)量如圖4。電泳結(jié)果顯示，在pH、溫度、溶氧及補(bǔ)料速度等條件相同的情況下，發(fā)酵密度對(duì)增加產(chǎn)物的表達(dá)量無明顯影響。
(2)高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵是在NBS Bioflo3000型5升自動(dòng)發(fā)酵罐中進(jìn)行，選取表達(dá)量達(dá)25％以上的種子液(工程菌是大腸桿菌pGEX-PT)，按照1％的接種量接種到含有120ml基礎(chǔ)培養(yǎng)液的500ml搖瓶中，37℃過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入5L的發(fā)酵罐中于37℃進(jìn)行恒溶氧分批補(bǔ)料培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到60左右時(shí)，加入終濃度為0.4mmol的IPTG，誘導(dǎo)3小時(shí)后終止發(fā)酵。
實(shí)施例5融合蛋白的純化發(fā)酵結(jié)束后，離心收集的菌體重新懸浮于1×PBS緩沖液中，超聲破碎。15000rpm離心15分鐘收集上清。將收集到的上清液通過用1×PBS平衡好的GST親和柱，用10倍柱體積的1×PBS重新平衡親和柱至沒有蛋白洗脫為止，用洗脫液(10mmol谷胱甘肽，50mmol Tris(pH 8.5))洗脫融合蛋白并收集。親和柱用溶液A(pH 8.5 50mmolTris-HCl，0.5N NaCl)和溶液B(pH4.5 50mmol HAc-NaAc0.5N NaCl)交替淋洗再生。
取40g濕菌超聲破碎后，15000rpm離心15分鐘收集上清，與20ml谷胱甘肽GST親和樹脂進(jìn)行親和純化，得到50ml樣品，經(jīng)Bradford法測(cè)蛋白含量，約為33.3mg/ml，總計(jì)約1600mg蛋白，合11.2克融合蛋白/升發(fā)酵液。
實(shí)施例6GST融合蛋白的凝血酶酶切分離
A.無水靡蛋白酶-Sepharose 4B親和柱的制備(1)無水靡蛋白酶的制備取1g靡蛋白酶溶于30ml pH 7.0的50mM磷酸緩沖液中，加入100ul 1M PMSF的二氧六環(huán)溶液，充分混勻，室溫下靜置15′(重復(fù)3次)；用0.1N NaOH將酶稀釋至8mg/ml于0度靜置4h依脫去Ser位點(diǎn)上的修飾基團(tuán)；用鹽酸將溶液pH調(diào)至7.0，分子篩回收后即為脫水靡蛋白酶。
(2)Sepharose 4B的CNBr活化稱8克(濕重)Sepharose 4B，依次用1M NaCl溶液、雙蒸水洗，慮干后轉(zhuǎn)移至100ml小燒杯內(nèi)。在通風(fēng)櫥內(nèi)加入10ml 0.2NNa2CO3溶液，放置冰浴中，電磁攪拌，反應(yīng)器內(nèi)的溫度保持在5攝氏度左右。小心稱取2克CNBr置于另一燒杯內(nèi)，加入5ml乙腈使之完全溶解。用滴管將CNBr溶液滴加到裝有樹脂的燒杯內(nèi)，并同時(shí)滴加5N NaOH溶液，使反應(yīng)液的pH值保持在pH10.5(用酸度計(jì)測(cè)量)，直到CNBr加完后繼續(xù)反應(yīng)5分鐘，停止反應(yīng)(加入一定量的固體FeSO4以破壞未反應(yīng)的CNBr)。慮干樹脂，200ml預(yù)冷的雙蒸水淋洗，再用適量0.2N Na2CO3-Na2HCO3(PH9.5)緩沖液洗。抽干后立即偶聯(lián)。CNBr活化使用過的器具都要經(jīng)過硫酸亞鐵溶液處理。
(3)靡蛋白酶的偶聯(lián)將靡蛋白酶溶于0.1N NaHCO3(pH8.0)，加入活化的樹脂，于4攝氏度偶聯(lián)過夜；分別用10倍體積0.1M NaHCO3、1mM HCl、0.5MNaCl、H2O依次各浸泡3次，每次1小時(shí)；最后保存于50％乙醇中。
B.靡蛋白酶親和層析將凝血酶切后產(chǎn)物對(duì)L緩沖液(20mM NaH2PO4，20mM硼酸，20mM乙酸，0.1M NaCl pH5.0)透析過夜，與親和樹脂室溫下結(jié)合；用L緩沖液平衡柱子；將L緩沖液對(duì)VsH緩沖液(20mM Na3PO3，20mM四硼酸鈉，0.2M NaCl，pH 10)進(jìn)行pH梯度洗脫。收集樣品峰。
將500mg融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切3小時(shí)后，多肽電泳檢測(cè)證實(shí)酶切基本完全，并看到了約4500道爾頓的目的產(chǎn)物條帶(如圖5A.)。將酶切后的樣品，用脫水靡蛋白酶親和柱(實(shí)施例6中制備的親和柱)純化回收前體肽段，經(jīng)電泳檢測(cè)，其純度達(dá)到了90％以上(如圖5B和C.)。前體肽回收量50mg，回收率為75％。親和純化后的前體肽用C18反相柱脫鹽后，冷凍干燥獲得干品即Gly-Ser-Pro-PTH1-34肽，備用。
實(shí)施例7
前體肽的PEP酶切和產(chǎn)物的純化稱取PTH前體肽約14mg溶于20mM Tris-HCl(pH8.5)緩沖液中，配成1mg/ml底物反應(yīng)液，按照1∶50(w/w)的比例將PEP酶與前體肽進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程用HPLC數(shù)據(jù)跟蹤檢測(cè)。Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽和產(chǎn)物PTH(1-34)肽在HPLC圖譜上的定位通過質(zhì)譜檢測(cè)分子量來確定(見圖6A)。
結(jié)果表明在酶底物作用35小時(shí)后反應(yīng)基本進(jìn)行完全。產(chǎn)物和底物峰的保留時(shí)間分別為10.2(分子量4117)和10.8(分子量4358)分鐘。這一結(jié)果與PEP酶對(duì)化學(xué)合成的37肽前體的加工行為基本一致。酶切所得產(chǎn)物再HPLC柱上的洗脫位置也與化學(xué)合成的PTH(1-34)肽相同。
PEP酶切產(chǎn)物經(jīng)脫水靡蛋白酶親和柱一次純化親和純化、C18柱脫鹽和凍干后，即可得到PTH(1-34)肽純品，約10毫克(0.694克PTH(1-34)/升發(fā)酵液)，酶切回收率約71.6％左右。
在另一次采用相同程序的制備例中，產(chǎn)率為0.923克PTH(1-34)肽純品/升發(fā)酵液。
實(shí)施例8 PTH 1-34肽的鑒定(1)PTH 1-34肽的HPLC純度鑒定將樣品上HPLC反向柱(Prosphere 300 C18)采用溶液A對(duì)溶液B(B由0-100％)35分鐘線性梯度洗脫。溶液A液為20％CH3CN；80％H2O；0.1％TFA；溶液B液為95％CH3CN；5％H2O；0.1％TFA。
HPLC鑒定純度為98％(圖6B)，毛細(xì)管電泳鑒定純度為97％(圖6C)。
(2)N-端氨基酸序列分析委托中科院上海生科院生化細(xì)胞所進(jìn)行。N端10個(gè)氨基酸的序列分析結(jié)果為SVSEIQLMH(SEQ ID NO11)，與預(yù)期的天然肽段序列相符。
(3)HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用分析由上海市計(jì)量所承擔(dān)，HPLC操作條件參考方法9。毛細(xì)管電泳純度分析由中科院上海生科院生化細(xì)胞所完成，條件為50mM PBS(pH2.5)/20KV電壓/40cm管程。
測(cè)得重組制備的PTH1-34肽分子量為4117道爾頓，前體肽的分子量為4358道爾頓。
微生物保藏實(shí)施例1中獲得的工程菌大腸埃希氏菌(即大腸桿菌)pGEX-PT于2001年9月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0631。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生物工程研究中心<120>重組人甲狀旁腺素1-34肽的生產(chǎn)工藝<130>016840<160>11<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>111<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>人工合成的Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽編碼序列<220><221>CDS<222>(1)..(111)<400>1gga tcc ccg tct gtt tct gaa arc cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa 48Gly Ser Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys1 5 10 15cac ctg aac tct atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag96His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln20 25 30gac gtt cac aac ttc111Asp Val His Asn Phe35<210>2<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>Gly-Ser-Pro-PTH(1-34)肽<400>2Gly Ser Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys1 5 10 15His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln20 25 30Asp Val His Asn Phe35<210>3<211>102<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(102)<220><221>misc_feature<222>(1)..(102)<223>人工合成的PTH(1-34)肽編碼序列<400>3tct gtt tct gaa atc cag ctg atg cac aac ctg ggt aaa cac ctg aac48Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15tct atg gaa cgt gtt gaa tgg ctg cgt aaa aaa ctg cag gac gtt cac96Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30aac ttc102Asn Phe<210>4<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(102)<223>PTH(1-34)肽<400>4Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Ash Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的片段<400>5ccggatcccc gtctgtttct gaaatc26<210>6<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的片段<400>6cagctgatgc acaacctggg taaacacctg aactctatgg aacgtgttga atgg 54<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的片段<400>7ctgcgtaaaa aactgcagga cgttcacaac ttctaatagc 40<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的片段<400>8cagctggatt tcag14<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的片段<400>9tacgcagcca ttca 14<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID N01的片段<400>10cgctcgagct at tagaagtt gtgaac 26<210>11<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>11Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His1 權(quán)利要求
1.一種甲狀旁腺素前體肽，其特征在于，它包含SEQ ID NO2氨基酸序列。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌pGEX-PT，保藏號(hào)為CGMCC No.0631。
7.一種人甲狀旁腺素1-34肽的制備方法，其特征在于，該方法包含步驟(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的人甲狀旁腺素前體肽，即Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽；(c)用脯氨酸內(nèi)肽酶酶切Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽，形成PTH 1-34肽；(d)分離純化出PTH 1-34肽。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步驟(b)包括通過GST柱分離出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽與GST的融合蛋白；用凝血酶從所述融合蛋白中切下GST，形成Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽；通過靡蛋白酶親和柱分離出Gly-Ser-Pro-PTH 1-34肽。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在所述的步驟(d)中，通過靡蛋白酶親和柱分離出PTH 1-34肽。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步驟(d)還包括C18柱脫鹽和凍干。
全文摘要
本發(fā)明提供了發(fā)明涉及人甲狀旁腺素1－34肽的生產(chǎn)工藝，包含以下步驟(a)在適合表達(dá)人甲狀旁腺素1－34肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有Gly－Ser－Pro－PTH1－34肽；(c)用脯氨酸內(nèi)肽酶酶切Gly－Ser－Pro－PTH1－34肽，形成PTH1－34肽；(d)分離純化出PTH1－34肽。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的編碼序列、載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明可高效、簡(jiǎn)便地生產(chǎn)高純度、高活力的人甲狀旁腺素1－34肽。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1424325SQ0114262
公開日2003年6月18日 申請(qǐng)日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者陳常慶, 修朝陽, 李民 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心