專利名稱：用作抗增殖劑和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑的化合物的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及下面定義的式I化合物，它能抑制甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶(GARFT)。本發(fā)明還涉及含有式I化合物的藥物組合物，以及將它們用于抑制GARFT和用于抑制高級生物體或微生物如細菌，酵母菌和真菌的生長和增殖。本發(fā)明還涉及這些化合物的制備以及用于制備它們的中間體。
GARFT是在從頭生物合成嘌呤途徑中的葉酸酯依賴酶。該途徑對細胞分裂和增殖是決定性的。已知，封閉這條途徑對抗增殖，特別是對抗腫瘤是有效的。因此，人們合成了大量葉酸酯類似物并研究它們對GARFT的抑制能力。已有報道，一種GARFT特定原型緊密結(jié)合抑制劑5，10-二脫氮四氫葉酸(dideazatetrahydrofolic acid)(DDATHF)表現(xiàn)了抗腫瘤活性。參見F.M.Muggia的“抑制從頭合成嘌呤的葉酸酯抗代謝抑制劑”[刊登在New Drugs，Concepts and results in Cancer Chemo therapy，由Kluwer academic Publisher出版，Boston(1992)，65-87]這些大量的抗增殖劑包括抗代謝化合物。已知作為抗葉酸酯或抗葉酸的抗代謝化合物的一個具體小類是維他命葉酸的拮抗劑。典型地，抗葉酸酯與葉酸的結(jié)構(gòu)非常相似，而且包括葉酸的特征性谷氨酸對苯甲酸酯部分。葉酸的谷氨酸酯部分在生理pH處有一個雙負電荷，而且，這個化合物及其類似物具有一種驅(qū)使傳輸系統(tǒng)通過細胞膜并發(fā)揮代謝能力的活動能量。對大量被調(diào)查者的研究表明，葉酸有其還原和氧化兩種形式，而且，其類似物被至少兩種不同的傳輸機理能動地傳入細胞。這些傳輸?shù)鞍踪|(zhì)稱作還原葉酸酯傳輸?shù)鞍?，它們偏愛還原葉酸酯，但會傳輸大量葉酸衍生物。氨甲蝶呤(MTX)就是通過還原葉酸酯傳輸系統(tǒng)傳輸?shù)?。其它的葉酸酯傳輸?shù)鞍妆环Q作膜葉酸酯結(jié)合蛋白或mFBP，它偏愛葉酸。參見A.C.Antony的“葉酸酯受體的生物化學(xué)研究”[刊登在Blood，The Journal of theAmerican Society of Hematology，Vol.79(1992)，2807-2820]今天，含抗癌谷氨酸的抗葉酸酯已被用于臨床，其中包括MTX，除了一個明顯例外之外，MTX通過還原葉酸酯傳輸系統(tǒng)進入細胞。5，10-二脫氮四氫葉酸(DDATHF)是目前正在進行臨床研究的抗腫瘤GARFT抑制劑。已經(jīng)表明，DDATHF經(jīng)還原葉酸酯傳輸系統(tǒng)和mFBP送入細胞。參見G.Pizzorno等人的“5，10-Dideazatetrahydrofolic Acid(DDATHF)Transport in CCRF-CEM and MA104 Cell Lines”[刊登在The Journal ofBiological Chemistry，Vol，268(1993)，1017-1023]。
人們認為，不必要的毒性，特別是對缺葉酸酯的哺乳動物，與DDATHF(現(xiàn)有技術(shù)中的GARFT抑制劑)對mFBP具有強親和力有關(guān)，DDATHF在葉酸酯匱乏期間是未調(diào)整的。人們還認為，葉酸和其它阻斷mFBP傳輸其它GARFT抑制劑的分子能夠減少這些抑制劑的毒性。參見，例如，T.Alati等人的“Evaluation of the Mechanism(s)of Inhibition of the toxicity，But not the Antitumor Activity of Lometrexol(DDATHF)by Folic Acid”[刊登在proceedings of the American Association for Cancer Research，Vol.33(1992)，Abstract 2432，407]；L.L.Habeck等人的“A Novel class ofMonoglutamated Antifolates Exhibits Tight-Binding Inhibition of HumanGlycinamide Ribonucleotide Formyltransferase and Potent Activityagainst solid tumors”[刊登在Cancer Research，Vol.54(1994)，1021-1026]；以及Grindey等人的美國專利5,217,974號。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是制備具有低毒性的高效GARFT抑制劑的化合物。該目的已經(jīng)通過式I抗增殖劑實現(xiàn)，它是高效GARFT抑制劑，但并不與mFBP緊密結(jié)合。這些化合物優(yōu)選具有對mFBP的結(jié)合常數(shù)至少比對DDATHF小1000倍，而且還能保持所需要的GARFT抑制性和與抗腫瘤活性有關(guān)的還原葉酸酯的傳輸。
如上所述，本發(fā)明化合物具有抗增殖活性，該性質(zhì)可以抗腫瘤活性的形式表示。本發(fā)明化合物可以本身是活性的，或作為前體在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成活性化合物。本發(fā)明優(yōu)選化合物是在抑制GARFT酶方面具有特別活性。特別優(yōu)選的化合物是具有抑制L1210細胞線(一種可以在組織培養(yǎng)中生長的鼠白血病細胞)生長的活性。本發(fā)明化合物還具有抑制細菌如可在培養(yǎng)基中生長的大腸埃希氏革蘭氏陰性菌生長的活性。
本發(fā)明化合物及其藥物上可接受的鹽可以被制成方便的劑型，如囊劑，片劑和可注射用制劑。其中可以使用藥物上可接受的固體或液體載體，稀釋劑或賦形劑。
固體載體包括淀粉，乳糖，硫酸鈣二水合物，石膏粉，蔗糖，滑石，明膠，瓊脂，果膠，金合歡，硬脂酸鎂和硬脂酸。液體載體包括糖漿，花生油，橄欖油鹽水溶液和水。
載體或稀釋劑可包括任何緩釋材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，單獨使用或與蠟一起使用。當(dāng)使用液體載體時，制劑可以是糖漿，酏劑，溶劑，軟明膠膠囊，消毒注射液(比如溶液)或非水或水懸浮液。
本發(fā)明藥物制劑是依照藥物化學(xué)中常規(guī)技術(shù)制備的，包括混合，制?；驂浩?如果是制成片劑的話)，或混合，填充及將各種成份溶解成適當(dāng)形式，以制成所需的口服，腸外，局部，陰道內(nèi)，鼻內(nèi)，支氣管內(nèi)，眼內(nèi)，耳內(nèi)或直腸內(nèi)給藥的制劑形式。
本發(fā)明組合物還可以進一步包含一或多種其它藥物活性化合物。例如，下列抗腫瘤藥之一可以包含在本發(fā)明組合物中絲分裂抑制劑(如長春堿)；烷基化劑；二氫葉酸酯還原酶抑制劑或TS抑制劑；抗代謝藥(如5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷)；插入抗菌素(如阿霉素，爭光霉素)；酶(如天冬酰胺酶)；局部異構(gòu)酶抑制劑(如鬼白乙叉甙)；及生物反應(yīng)修飾因子(如干擾素)。本發(fā)明化合物還可以與一或多種抗增殖劑或GARFT抑制劑結(jié)合使用，如在普通轉(zhuǎn)讓的國際公開WO 94/13295(公布于1994年6月23日)或國際公開WO 92/05153(公布于1992年4月2日)中所述的化合物，這些公開物在這里被引作參考。本發(fā)明組合物還可以含有一或多種抗菌藥，殺真菌藥，抗寄生蟲藥，抗病毒藥，治牛皮癬藥或殺球蟲藥(anticoccidial)?？咕幍膶嵗ɑ前奉愃?，如磺胺甲基異口惡唑(新諾明)，磺胺嘧啶，磺胺對甲氧嘧啶和磺胺鄰二甲氧嘧啶；二氫葉酸酯還原酶抑制劑如甲氧芐氨嘧啶，bromodiaprim和曲麥克特(trimetrexate)；青霉素；先鋒霉素；及喹啉酮羧酸和它們稠合的異噻唑類似物。
本發(fā)明另一方面涉及抑制高級生物體或微生物體細胞增殖或生長的治療方法，包括給宿主服用有效量或一定量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明化合物特別適用于治療哺乳動物宿主如人類宿主，和治療鳥類宿主。特別優(yōu)選的治療方法是給宿主服用有效抑制GARFT量的本發(fā)明化合物。
這里所述多種抗增殖化合物及其藥物上可接受的鹽可以用于本發(fā)明的治療方法。這些化合物可以含有上述稀釋劑或載體的藥物上可接受的組合物形式給藥。
組合物的劑量應(yīng)至少含有有效量的活性化合物，并且優(yōu)選制成一或多個藥物劑量單位?！坝行Я俊敝缸阋砸种迫~酸酯的代謝途徑的量，并且，例如，經(jīng)過一個或多個藥劑單位便可得到有利效果。
對脊椎動物宿主日服劑量的實例為每公斤宿主體重最多1克活性化合物，優(yōu)選每公斤宿主體重1/2克，更優(yōu)選100毫克，最優(yōu)選約50毫克或更少。所選劑量可以給暖血動物或哺乳動物，如需要進行抑制葉酸酯代謝途徑的病人，通過適當(dāng)?shù)慕o藥方法給藥，包括局部給藥，例如用油膏或乳膏；口服給藥；直腸給藥，例如用栓劑；通過注射進行腸外給藥；或通過陰道內(nèi)，鼻內(nèi)，支氣管內(nèi)，耳內(nèi)或眼內(nèi)輸液給藥。
本發(fā)明化合物具有任何一種或多種如下所述的作用，如抗增殖作用，抗菌作用，抗寄生物作用，抗病毒作用，抗牛皮癬作用，抗原生動物作用，抗球蟲作用，消炎作用，自身免疫抑制作用和殺真菌作用。本發(fā)明化合物尤其適用于在患有腫瘤的脊椎動物宿主身上產(chǎn)生抗腫瘤作用。
本發(fā)明詳述和優(yōu)選實例特別地，本發(fā)明涉及式I化合物， 其中A是硫，CH2或硒；Z是取代的或未取代的C1-C3烷基，取代的或未取代的C2-C3鏈烯基，取代的或未取代的C2-C3炔基，取代的或未取代的氨基，硫或氧；X是取代的或未取代的C1-C6烷基；取代的或未取代的C2-C6鏈烯基；取代的或未取代的C2-C6炔基；-C(O)E，其中E是氫，取代的或未取代的C1-C3烷基，取代的或未取代的C2-C3鏈烯基，取代的或未取代的C2-C3炔基，取代的或未取代的OC1-C3烷氧基，或NR10R11，其中R10和R11分別為氫，取代的或未取代的C1-C3烷基，取代的或未取代的C2-C3鏈烯基，取代的或未取代的C2-C3炔基；NR10R11，其中R10和R11分別定義如上；羥基；硝基；SR12，其中R12是氫，取代的或未取代的C1-C6烷基，取代的或未取代的C2-C6鏈烯基，或取代的或未取代的C2-C6炔基；氰基；或取代的或未取代的O(C1-C3)基；及R1和R2分別為氫，或者是與相連的CO2形成易水解酯基的部分。
本發(fā)明還涉及式I化合物的藥物上可接受的鹽。
雖然式I化合物被表示為4-氧形式，而且在整個說明書中都如此表示，該氧基以與相應(yīng)的4-羥基互變異構(gòu)平衡的形式存在。因此，式I化合物被認為包括結(jié)構(gòu)式所示4-氧及其互變異構(gòu)4-羥基形式。因此，本發(fā)明還涉及式I所示化合物的4-羥基互變異構(gòu)體的藥物上可接受的鹽。
式I化合物是非對映的混合物形式。應(yīng)該理解，除非另有說明，有手性中心的化合物為非對映體混合物形式。
優(yōu)選A是硫或CH2。
如果Z是被取代的，取代基優(yōu)選C1-C6烷氧基，C1-C6烷基和C2-C6鏈烯基如乙鏈烯基，C2-C6炔基，?；缂柞；鸵阴；?，鹵素，氨基，羥基，硝基，巰基，單環(huán)碳環(huán)，單環(huán)雜環(huán)，非稠合多環(huán)碳環(huán)，非稠合多環(huán)雜環(huán)，羥基C1-C6烷基如羥甲基，及C1-C6烷氧基C1-C6烷基。優(yōu)選地，Z是CH2，CH2CH2，NH，氧，硫，CH(CH2OH)或NCH3。更優(yōu)選地，Z是CH2。
如果X是被取代的，取代基優(yōu)選OH，NH2，O-甲基，O-乙基，SH，SCH3和NH-甲基。優(yōu)選地，X是取代的或未取代的C1-C6烷基。還有，X優(yōu)選未取代的。X更優(yōu)選是甲基或乙基。
優(yōu)選地，R1和R2分別是氫，C1-C6烷基，羥基烷基，烷基芳基或芳烷基。更優(yōu)選地，R1和R2分別是氫或C1-C2烷基。
在特別優(yōu)選的實例中，A是硫或CH2，Z是CH2，X是甲基。
式I化合物的優(yōu)選實例包括N-(5-[2-(2-氨基-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]-嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-L-谷氨酸；N-(5-[2-(2-氨基-4-氧-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]-噻嗪-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-L-谷氨酸二乙酯；及N-(5-[2-(2-氨基-4-氧-4，6，7，8-四氫-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]-噻嗪-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-L-谷氨酸。
式I化合物被用作GARFT抑制劑。其中R1和R2分別是氫的式I化合物尤其被用作活性抗腫瘤或抗增殖劑。其中R1和R2分別與相連的羧基，優(yōu)選乙基，形成易水解酯基部分的式I化合物被用作形成游離谷氨酸形式的化合物的中間體，并且可以在體內(nèi)水解，因此被用作藥物前體。
本發(fā)明藥物上可接受的鹽包括，例如，本發(fā)明谷氨酸化合物的堿金屬鹽，堿土金屬鹽，其它無毒金屬鹽，銨鹽和取代的銨鹽。所說鹽的實例包括游離酸化合物的鈉，鉀，鋰，鈣，鎂，吡啶金翁和取代的吡啶金翁鹽。
本發(fā)明式I化合物可如下制備。
為了制備其中Z是CH2的式I化合物，用式II化合物作起始原料， 其中R是鹵素，優(yōu)選溴；X如上定義；B是OH或氨基酸，優(yōu)選谷氨酸二乙酯，通過與氨基部分連接形成酰胺，或通過與C1-C6醇，優(yōu)選甲醇和乙醇等醇部分連接形成酯。
式II化合物與式III化合物反應(yīng)， 其中Y是CH2OH或被保護的式IV吡啶并嘧啶， 然后，根據(jù)Y是被保護的吡啶并嘧啶還是CH2OH，選擇兩種方法之一進行合成。
當(dāng)式IV中的Y是被保護的吡啶并嘧啶或CH2OH時，式II和III化合物的偶合反應(yīng)優(yōu)選在過渡金屬催化劑，優(yōu)選鈀或鎳，和堿，優(yōu)選非親核輔助堿存在下，在溶劑中進行，在該溶劑中至少有一種反應(yīng)物至少部分可溶。式II和III化合物的偶合反應(yīng)中的優(yōu)選溶劑是二乙胺，乙腈，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺和三乙胺。偶合反應(yīng)中的堿性介質(zhì)優(yōu)選由非親核輔助堿提供，它們能夠中和由偶合反應(yīng)產(chǎn)生的氫鹵酸。該堿優(yōu)選二-或三-烷基胺，如二乙胺，三乙胺或二異丙基乙胺。如果需要，堿性溶劑可用來代替單獨溶劑和堿。
如果Y是吡啶并嘧啶，式II和III化合物的偶合反應(yīng)生成式V化合物， 其中X，R1和R2定義如上。
式V化合物與氫氣反應(yīng)，優(yōu)選在45-1000psi壓力下，在適當(dāng)過渡金屬催化劑，優(yōu)選在炭或其它適當(dāng)載體上的鉑，鈀或銠金屬存在下，在適當(dāng)溶劑，優(yōu)選乙酸或三氟乙酸中進行，得到式VI化合物， 其中X，R1和R2定義如上。
最后，式VI化合物被水解形成一個游離谷氨酸(R1和R2分別為氫)的式I化合物。
如果Y是CH2OH，式II和III化合物反應(yīng)生成式VII化合物， 其中X和B定義如上。
式VII化合物與氫氣在適當(dāng)金屬催化劑，優(yōu)選鈀或鉑，存在下反應(yīng)，得到式VIII化合物， 其中X和B定義如上。
式VIII化合物與一種氧化劑，優(yōu)選四丙基高釕酸銨反應(yīng)，得到式IX化合物， 其中X和B定義如上。
式IX化合物與亞甲基轉(zhuǎn)移試劑，優(yōu)選亞甲基三苯基正膦，在適當(dāng)溶劑，優(yōu)選四氫呋喃中反應(yīng)，得到式X化合物， 其中X和B定義如上。
式X化合物與二羥基化試劑，優(yōu)選四氧化餓，在適當(dāng)氧化劑，優(yōu)選N甲基嗎啉-N-氧化物存在下反應(yīng)，得到式XI化合物， 其中X和B定義如上。
用下述四種方法中的任何一種將式XI化合物轉(zhuǎn)變成式I化合物。
在第一種轉(zhuǎn)變方法中，式XI化合物與磺?；噭瑑?yōu)選對甲苯磺酰氯或甲烷磺酰氨，在非親核堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺存在下反應(yīng)，得到中間體單磺?；衔铩Ｈ缓?，該中間體與強堿，優(yōu)選氫化鈉反應(yīng)，得到式XII化合物， 其中X和B定義如上。
式XII環(huán)氧化物與含氮親核物，優(yōu)選疊氮化鈉，在中等強度路易斯酸催化劑，優(yōu)選高氯酸鋰或高氯酸鎂存在下反應(yīng)，得到中間體醇疊氮化物(alcohol azide)。醇疊氮化物的還原反應(yīng)優(yōu)選與氫氣，在金屬催化劑存在下反應(yīng)，接著與適當(dāng)?shù)Ｗo基，優(yōu)選叔丁氧羰基，芐氧羰基或芐基進行保護反應(yīng)，生成式XIII化合物， 其中X和B定義如上，R4和R5分別為氫或適當(dāng)?shù)Ｗo基。優(yōu)選的保護基是叔丁氧羰基，芐氧羰基或芐基。
式XIII化合物與?；瘎┗蚧酋；噭?，優(yōu)選甲磺酰氯或?qū)妆交酋Ｂ龋诜怯H核堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺存在下，在適當(dāng)?shù)闹辽倌苁挂环N反應(yīng)物至少部分溶解的溶劑中反應(yīng)，得到活化羥基。該活化羥基被適當(dāng)親核物，優(yōu)選硫代酸鹽，更優(yōu)選被硫代乙酸鉀替代，得到式XIV化合物， 其中A，X，B，R4和R5定義如上，Ac是?；瑑?yōu)選乙?；?。
或者，可以用三苯膦，疊氮二羧酸二乙酯或二甲酯，和酸性親核物，優(yōu)選硫代乙酸，在適當(dāng)溶劑中進行化學(xué)反應(yīng)，將式XIII化合物轉(zhuǎn)化成式XIV化合物。
將式XIV化合物在醇溶劑，優(yōu)選甲醇，乙醇或異丙醇中，在烷基化劑，優(yōu)選氯代丙二酸二甲酯或二乙酯存在下，用親核堿，優(yōu)選碳酸鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉或氫氧化鉀處理，得到式XV化合物， 其中A，X，B，R4和R5定義如上，每個R6分別是氫或與相連的CO2形成易水解酯基的部分。優(yōu)選地，R6是C1-C6烷基，羥基烷基，烷基芳基或芳烷基。更優(yōu)選地，R6是C1-C2烷基。
將式XV化合物在適當(dāng)條件下處理，除去R4或R5或?qū)⑦@兩個保護基都除去，得到式XVI化合物， 其中A，X，B和R6定義如上。如果用叔丁氧羰基作保護基，適當(dāng)?shù)臈l件是指用三氟乙酸處理，接著進行中和反應(yīng)。
式XVI化合物與烷基化劑，優(yōu)選三甲基或三乙基四氟硼酸氧金翁，在適當(dāng)溶劑，優(yōu)選二氯甲烷中反應(yīng)，形成中間體內(nèi)酰亞胺醚。中間體內(nèi)酰亞胺醚在醇溶劑，優(yōu)選甲醇，乙醇或異丙醇中與胍反應(yīng)，形成式XVII化合物， 其中A，X和B定義如上。
或者，通過式XVI化合物與硫化試劑，優(yōu)選P2S5或2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二正膦-2，4-二硫化物反應(yīng)，將式XVI化合物轉(zhuǎn)化成式XVII化合物，形成硫代內(nèi)酰胺中間體。然后，該中間體用烷基化劑，優(yōu)選碘甲烷或三甲基或三乙基四氟硼酸氧鎓進行烷基化，然后在醇溶劑，優(yōu)選甲醇，乙醇或異丙醇中，與胍反應(yīng)，得到式XVII化合物。
如果B是醇功能團，即如果與B相連形成酯基，則式XVII化合物在堿性條件下被水解，形成式XVIII化合物， 其中A和X定義如上。
用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法將式XVIII化合物與谷氨酸二酯鹽酸鹽進行肽偶合，生成式XIX的二酯化合物， 其中，除了R1和R2不能是氫以外，A，X，R1和R2定義如上。
最后，如果需要谷氨酸形式，則將式XIX化合物水解成式I化合物形式。
在第二個轉(zhuǎn)化方法中，式XIV化合物如上所述制備。該化合物用酸處理，優(yōu)選三氟乙酸，鹽酸或?qū)妆交撬?，除去所有保護基(R4，R5和Ac)， 其中，A，X和B定義如上。
式XX化合物在弱堿性緩沖劑條件下，優(yōu)選用pH7磷酸鹽緩沖劑，在適當(dāng)溶劑，優(yōu)選乙醇或甲醇中，與式XXI化合物反應(yīng)， 得到式XVII化合物。第二方法的其余部分是用類似于上面所述的方法，從式XVII化合物得到式I化合物。
在第三個轉(zhuǎn)化方法中，式XI化合物與適當(dāng)?shù)牧u基保護基，優(yōu)選三烷基甲硅烷基，更優(yōu)選叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物，在中等非親核堿，優(yōu)選三乙胺的存在下反應(yīng)得到式XXII化合物， 其中X和B如上定義，R7為適當(dāng)?shù)牧u基保護基，優(yōu)選三烷基甲硅烷基。
然后將式XXII化合物與?；噭┗蚧酋；噭?，優(yōu)選甲烷磺酰氯或?qū)妆交酋Ｂ龋诜怯H核堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺的存在下，在適當(dāng)?shù)娜軇?至少一種反應(yīng)物之一部分溶解在該溶劑中)中反應(yīng)得到活化的羥基。用適當(dāng)?shù)挠H核試劑，優(yōu)選硫代酸鹽，更優(yōu)選硫代乙酸鉀置換活化羥基得到式XXIII化合物， 其中A，X，B，R7和Ac如上定義。
或者，將式XXII化合物在一種化學(xué)操作中用三苯膦或疊氮二羧酸二乙酯或二甲酯和適當(dāng)酸性親核試劑，優(yōu)選硫代乙酸，在適當(dāng)?shù)娜軇┲修D(zhuǎn)化為式XXIII化合物。
式XXIII化合物與親核堿或中等酸反應(yīng)選擇性除去在A部分上的?；⒌玫降闹虚g體與式XXIV， 在非親核堿，優(yōu)選三乙胺，二異丙基乙胺或碳酸鉀存在下反應(yīng)得到式XXV化合物， 其中A，X，B和R7如上定義。
用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚沓ナ絏XV化合物上的保護基R7得到式XXVI化合物， 其中A，X和B如上定義。當(dāng)R7為三烷基甲硅烷基時，上述試劑優(yōu)選為氟鹽，更優(yōu)選氟化鉀，四丁基氟化銨或氟化銫。
通過用活化試劑活化羥基，優(yōu)選與甲磺酰氯反應(yīng)，隨后用堿處理，將式XXVI環(huán)合得到式XVII化合物?；蛘?，將嘧啶酮的氮用適當(dāng)保護基，優(yōu)選叔丁氧羰基保護，然后環(huán)合并在酸性條件下除去保護基。本方法的其余部分是用類似于上面所述從式XVII化合物得到式I化合物的方法進行。
在第四個優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法中，式XXVI的醇化合物的制備如上所述。該醇與適當(dāng)?shù)难趸瘎┓磻?yīng)產(chǎn)生醛功能基，該醛功能基可以環(huán)合為式XXVII化合物， 其中A，X和B如上定義。
式XXVII化合物與還原劑，優(yōu)選氰基硼氫化鈉，在路易斯酸，優(yōu)選三氟化硼醚合物存在下反應(yīng)，得到上面定義的式XVII化合物。本方法的其余部分是用類似于上面所述方法從式XVII化合物得到式I化合物。
其中Z不是CH2的式I化合物可以用類似于其中Z是CH2的制備方法制備。特別是，其中Z不是CH2的式I化合物可以用式XXXIV鏈烯制備， 其中X和R6定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。
如果Z是硫，氧或取代的或未取代氨基，式XXXV化合物被烷基化， 其中X和R6定義如上，Z是硫，氧或取代的或未取代氨基。烷基化反應(yīng)可以用烯丙基鹵化物，優(yōu)選烯丙基溴化物，在非親核堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺存在下完成，得到式XXXIV化合物。
如果Z是取代的或未取代C1-C2烷基而不是CH2，取代的或未取代C2-C3鏈烯基，或取代的或未取代C2-C3炔基，式XXXIV化合物可通過將式XXXVI醛鏈烯化來制備， 其中X和R6定義如上，Z是取代的或未取代C1-C2烷基而不是CH2，取代的或未取代C2-C3鏈烯基，或取代的或未取代C2-C3炔基。式XXXVI醛可用類似下列文獻所述方法制備Chuan Shih et al.，Journal ofMedicinal Chemistry，vol.35(1992)，1109-1116。醛的鏈烯化反應(yīng)可用亞甲基轉(zhuǎn)移劑，優(yōu)選亞甲基三苯膦完成。
式XXXIV化合物與二羥基化劑，優(yōu)選四氧化鋨，在適當(dāng)氧化劑，優(yōu)選N-甲基嗎啉-N-氧化物存在下反應(yīng)，得到式XXXVII化合物， 其中X和R6定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。
式XXXVII化合物與磺?；噭瑑?yōu)選對甲苯磺酰氯或甲烷磺酰氯，在非親核堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺的存在下，產(chǎn)生中間產(chǎn)物單磺?；衔铩Ｔ撝虚g產(chǎn)物與強堿，優(yōu)選氫化鈉反應(yīng)，生成式XXXVIII化合物， 其中X、R6如上定義，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。
式XXXVIII環(huán)氧化物與含氮親核物，優(yōu)選疊氮化鈉，在弱路易斯酸催化劑，優(yōu)選高氯酸鋰或鎂存在下反應(yīng)，得到中間體醇疊氮化物。將該中間體還原，優(yōu)選用氫氣，在金屬催化劑存在下進行，接著用適當(dāng)?shù)Ｗo基，優(yōu)選叔丁氧羰基，芐氧羰基或芐基進行保護，生成式XVII’化合物， 其中X，R6，R4和R5定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。
然后，式XVII’化合物與酰化劑或磺?；瘎瑑?yōu)選甲烷磺酰氯或?qū)妆交酋Ｂ?，在非親核堿，優(yōu)選三乙胺或二異丙基乙胺存在下，在適當(dāng)?shù)哪苁怪辽僖环N反應(yīng)物至少部分溶解的溶劑中反應(yīng)，得到活化羥基。該活化羥基被適當(dāng)親核物，優(yōu)選硫代酸鹽，更優(yōu)選硫代乙酸鉀置換，得到式XVIII’化合物， 其中A，X，R6，R4，R5和Ac定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。
或者，用三苯膦，氮雜二羧酸二乙酯或二甲酯和酸性親核物，優(yōu)選硫代乙酸，在適當(dāng)溶劑中，通過某種化學(xué)操作將式XVII’化合物轉(zhuǎn)變成式XVIII’化合物。
式XVIII’化合物用親核堿，優(yōu)選碳酸鉀，碳酸鈉，氫氧化鈉或氫氧化鉀，在醇溶劑，優(yōu)選甲醇，乙醇或異丙醇中，在烷基化劑，優(yōu)選氯代丙二酸二甲酯或二乙酯存在下處理，得到式XIX’化合物， 其中A，X，R6，R4和R5定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。在適當(dāng)條件下處理式XIX’化合物，除去保護基R4和R5，生成式XX’化合物， 其中A，X和R6定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。
如果保護基是叔丁氧羰基，則除去該保護基的適當(dāng)條件優(yōu)選用三氟乙酸處理，然后進行中和，生成式XX’化合物。
式XX’化合物與烷基化劑，優(yōu)選三甲基或三乙基四氟硼酸氧金翁，在適當(dāng)溶劑，優(yōu)選二氯甲烷中反應(yīng)，形成中間體內(nèi)酰亞胺醚。該中間體內(nèi)酰亞胺醚與胍在醇溶劑，優(yōu)選甲醇，乙醇或異丙醇中反應(yīng)，形成式XXI’化合物， 其中A，X和R6定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。
或者，通過式X’化合物與硫化劑，優(yōu)選P2S5或2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二膦-2，4-二硫化物反應(yīng)，形成中間體硫代內(nèi)酰胺，將式XXI’化合物轉(zhuǎn)化成式X’化合物。然后，用烷基化劑將其烷基化，優(yōu)選的烷基化劑是甲基碘或三甲基或三乙基四氟硼酸氧金翁。然后，在醇溶劑，優(yōu)選甲醇，乙醇或異丙醇中與胍反應(yīng)，得到式XXI’化合物。
在堿性條件下將式XXI’化合物水解，形成式XXII’化合物， 其中A和X定義如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定義。如果式XXI’化合物中的R6是氫，則不需要水解反應(yīng)，式XXI’化合物如下所述被肽偶合。
可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法，將游離羧酸形式的式XXII’化合物(如果R6是氫，則為式XXI’化合物)與谷氨酸二酯鹽酸鹽進行肽偶合，形成式XXIII’二酯， 其中A和X同式XXII’中定義，R1和R2分別為與相連的CO2形成易水解酯基的部分，如C1-C6烷基，羥基烷基，烷基芳基或芳烷基。
最后，如果需要游離酸形式，可將式XXIII’水解成其中R1和R2分別為H的式I化合物。
制備式I化合物的詳細實例提供如下。
(C29H33N5O7S.0.75H2O)C，H，N，S.e.N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯 將N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯(959mg，1.6mmol)和10％鈀炭(1.5g，150％wt.eq.)的三氟乙酸(30ml)懸浮液在50psi H2中振蕩22小時。粗反應(yīng)混合物用CH2Cl2稀釋，用Celite(硅藻土)濾墊過濾并真空濃縮。將所得剩余物溶解于CH2Cl2(120ml)，用飽和NaHCO3(2×100ml)洗滌，Na2SO4干燥并真空濃縮，得到一種棕色膠。經(jīng)快速色譜純化，用CH2Cl2∶CH3OH(49∶1)洗脫，生成一種橙色固體(772mg，產(chǎn)率80％)。分析結(jié)果表明，該產(chǎn)物為N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯。
NMR(CDCl3)δ8.60(1H，d，J＝2.2Hz)，8.49(1H，寬峰)，8.32(1H，d，J＝2.2Hz)，7.22(1H，s)，6.78(1H，d，J＝7.5Hz)，4.72(1H，ddd，J＝4.8，7.5，9.5Hz)，4.23(2H，q，J＝7.1Hz)，4.11(2H，q，J＝7.1Hz)，3.12-3.00(4H，m)，2.52-2.41(2H，m)，2.37-2.22(1H，m)，2.16-2.04(1H，m)，2.02(3H，s)，1.33(9H，s)，1.29(3H，t，J＝7.1Hz)，1.23(3H，t，J＝7.1Hz).分析.(C29H37N5O7S.0.5H2O)C，H，N，S.f.N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯
將N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯(2.98g，5mmol)和10％鈀炭(1.5g，50％wt.eq.)和PtO2(1.5g，50％wt.eq.)的三氟乙酸(170ml)懸浮液在800psi H2中搖動40小時。粗反應(yīng)混合物用CH2Cl2稀釋，用硅藻土濾墊過濾并真空濃縮。將所得剩余物溶解于CH2Cl2(150ml)，用飽和NaHCO3(2×150ml)洗滌，Na2SO4干燥并真空濃縮，得到一種棕色樹脂。經(jīng)快速色譜純化，用CH2Cl2∶CH3OH(24∶1)洗脫，開始得到一種未反應(yīng)的作用物(1.42g，產(chǎn)率48％)，然后生成黃色固體(293mg，產(chǎn)率10％)。分析結(jié)果表明，該產(chǎn)物為N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯。NMR(CDCl3)δ7.24(1H，s)，6.75(1H，d，J＝7.6Hz)，5.57(1H，broad)，4.72(1H，ddd，J＝4.8，7.6，12.6Hz)，4.22(2H，q，J＝7.1Hz)，4.11(2H，q，J＝7.1Hz)，3.43-3.36(1H，m)，3.06-2.98(1H，m)，2.89-2.68(3H，m)，2.52-2.40(3H，m)，2.37-2.23(1H，m)，2.15(3H，s)，2.14-2.03(1H，m)，1.94-1.83(1H，m)，1.73-1.63(2H，m)，1.32 (9H，s)，1.29(3H，t，J＝7.1Hz)，1.23(3H，t，J＝7.1Hz).分析(C29H41N5O7S.0.5H2O)C，H，N，S.g.N-(5-[2-(2-氨基-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸(化合物1)將N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯(293mg，0.5mmol)的1N NaOH(25ml)溶液在室溫攪拌90小時，然后用6NHCl中和。過濾收集沉淀，用水(4×100ml)洗滌，得到黃色固體(63mg，產(chǎn)率28％)。分析結(jié)果表明，該產(chǎn)物為N-(5-[2-(2-氨基-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸。
NMR(DMSO-d6)δ12.44(2H，寬峰)，9.89(1H，寬峰)，8.42(1H，d，J＝7.8Hz)，7.57(1H，s)，6.39(1H，brs)，6.12(2H，br s)，4.30(1H，ddd，J＝4.8，7.8，9.6Hz)，3.26-3.18(2H，m)，2.83-2.74(3H，m)，2.31(2H，t，J＝7.4Hz)，2.12(3H，s)，2.09-2.01(1H，m)，1.94-1.80(2H，m)，1.68-1.47(3H，m).分析(C20H25N5O6S.1.1H2O)C，H，N，S.生物和生化評價GAR甲酰轉(zhuǎn)移酶抑制常數(shù)的測定修改并采用的Young等人(Biochemistry 23(1984)，3979-3986)的GAR-甲酰轉(zhuǎn)移酶(GARFT)測定方法如下所述。
反應(yīng)混合物中含有人體GARFT催化域，0-250nM試驗化合物，20μM甘氨酰胺核苷酸(GAR)，10或20μM N10-甲?；?5，8-二脫氮葉酸酯(FDDF)，50mM HEPES-KOH(pH7.5)和50mM KCl。該反應(yīng)從添加酶開始，到最后濃縮為11nM，然后在20℃監(jiān)測294nm處吸收度的增加情況(e294＝18.9mM-1cm-1)。
GARFT抑制常數(shù)(Ki)是由穩(wěn)定狀態(tài)催化率對抑制劑的依賴性和底物濃度來測定的。所觀察到的抑制類型取決于與FDDF的競爭，通過表觀Ki(Ki，app)對FDDF濃度的依賴性來確定抑制賴類型，它們之間的這種關(guān)系可以用下式表示Ki，app＝Ki+(Ki/Km)[FDDF]FDDF的Michaelis常數(shù)Km獨立地由催化率對FDDF濃度的依賴性測定。通過對Michaelis方程或近似競爭抑制情況下的Michaelis方程進行非線性擬合，得到Km和Ki數(shù)據(jù)。對緊密結(jié)合抑制作用所得數(shù)據(jù)進行分析，并用非線性方法對該數(shù)據(jù)進行Morrison緊密結(jié)合方程的擬合(BiochemBiophys Acta 185(1969)，269-286)，得到Ki。人體葉酸酯結(jié)合蛋白離解常數(shù)的測定人體葉酸酯結(jié)合蛋白(FBP)的離解常數(shù)(Kd)的測定是以競爭結(jié)合測定方式，用由培養(yǎng)的KB細胞制備的FBP締合膜測定的。KB細胞膜(部分)的制備將粘連的KB細胞從燒瓶上刮下，用冰冷的PBS沖洗一次，然后在4℃以5000×g離心5分鐘。將細胞顆粒(2×108個細胞)重新懸浮于懸浮緩沖液(KH2PO4-KOH pH7.410mM EDTA10mM 2-巰基乙醇)，用聲波短暫地振動一下以完成細胞團的裂解，并在4℃以12000×g離心10分鐘。通過重新懸浮于20ml酸性緩沖液(KH2PO4-KOH pH3.510mM EDTA10mM 2-巰基乙醇)將內(nèi)生結(jié)合葉酸酯從顆粒中剝離，然后離心同前。將細胞顆粒重新懸浮于20ml pH7.4的懸浮緩沖液中，并離心同前。再將顆粒重新懸浮于5ml無EDTA的pH為7.4的懸浮緩沖液中，用Bradford法以BSA為標準定量測定蛋白質(zhì)含量。這種方法典型的產(chǎn)率是每2×108個細胞生成總共4-5mg膜蛋白。最后的懸浮液作為人體FBP締合膜的來源。FBP競爭性結(jié)合的測定允許抑制劑與3H-葉酸競爭與FBP的結(jié)合能力。
將含有50-100mg含有3-6pmol(10-12摩爾)(3-6nM)FBP的細胞膜蛋白，17.25pmol3H-葉酸(17.25nM，0.5μCi)，各種濃度的競爭物和1ml50mM KH2PO4-KOH pH7.410mM 2-巰基乙醇的反應(yīng)混合物在25℃進行反應(yīng)。因為結(jié)合的3H-葉酸釋放非常緩慢，所以在沒有3H-葉酸時競爭物就已經(jīng)預(yù)先結(jié)合了30分鐘。然后加入3H-葉酸，并允許混合物平衡2.5小時。通過硝基纖維素過濾器真空抽濾全部反應(yīng)混合物以收集帶有結(jié)合的3H-葉酸的細胞膜，然后將收集的細胞膜用1ml反應(yīng)緩沖劑洗滌4次。通過測量該硝基纖維素膜的閃爍計數(shù)測定結(jié)合的3H-葉酸的數(shù)量。所得數(shù)據(jù)用上述方法進行非線性擬合。3H-葉酸的FBP Kd——用于計算競爭物的Kd——是通過3H-葉酸對FBP的直接滴定，接著用所得數(shù)據(jù)對緊密結(jié)合Kd方程進行非線性擬合得到的。細胞線所用細胞線及其來源被列于表1。每個細胞線和生長條件和需要的培養(yǎng)基匯總于表2。所有培養(yǎng)保持在37℃，5％空氣-CO2的潮濕培養(yǎng)皿中進行。體外生長抑制作用抑制物的Stock溶液在10mM碳酸氫鈉水溶液中制成，然后以1ml等份存儲于-20℃，進行細胞培養(yǎng)實驗。用改進的Mosmann方法(J.Immunol.Methods65(1983)，55-63)測量細胞生長抑制性。
在由滲析的胎牛血清(Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)提供的新鮮RPMI生長基(Mediatech，Washington，DC)中，每個細胞線的對數(shù)中期細胞被稀釋成18500個細胞/ml，然后等分到2列12個96孔微滴定盤中。第1列充滿相同體積的135ml無細胞新鮮培養(yǎng)基，用作空白本底。然后將這些盤子放在37℃充有5％空氣-CO2的培養(yǎng)器中。1-4小時后將盤子移出培養(yǎng)器，并加入10倍最終濃度的試驗化合物，從第12列到第4列為兩倍稀釋度15ml/孔。對于相反的實驗，所有藥物溶液(最終濃度為175mM)中包含次黃嘌呤(1.75mM)或AICA(1.75mM)。對于各孔的試驗化合物的濃度各盤之間依次為4倍關(guān)系。15毫升不含試驗化合物的培養(yǎng)基被加到各盤的第1列。然后將細胞送回到培養(yǎng)器中，不間斷地經(jīng)過整個培養(yǎng)期。在第3天將L1210和L1210/CI920細胞，或在第5天將CCRF-CEM細胞，以及溶于組織培養(yǎng)基的50ml 0.8mg/ml MTT(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑全翁(Sigma分類號M2128)加到所有盤的每個孔中，之后將細胞放回培養(yǎng)器。4小時后從培養(yǎng)器中移出各盤，并以1200rpm離心7分鐘。虹吸除掉培養(yǎng)基，并將150ml DMSO加到所有盤的每個孔中。將各盤于黑暗中和室溫下在旋渦混合器上慢速混合1小時。用Molecular Devices VmaxTM動力微片計數(shù)器和分光光度分析法在540nm處測量代謝MTT的程度。抑制細胞生長50％(通過測量MTT代謝而得)所需的藥物濃度由上述O.D.(扣除空白本底)與下面對照組O.D.(扣除空白本底)的50％之間的內(nèi)推來確定。
表1用于體外研究的源組織和細胞線源細胞線 源 源組織L1210 ATCC# 鼠，淋巴白血病CCRF-CEM ATCC# 人，急性原始淋巴細胞白血病#ATCC＝美國典型物培養(yǎng)中心(American Type Culture Collection)表2用于微滴定測定的培養(yǎng)條件，盤密度和培養(yǎng)時間細胞線培養(yǎng)基 DFCS 盤密度 培養(yǎng)時間濃度*(％)(細胞/孔)(天)L1210RPMI-1640 52500 3CCRF-CEM RPMI-1640 10 2500 5*DFCS濃度＝滲析的胎牛血清濃度表3試驗化合物和6R-DDATHF對生長抑制(連續(xù)暴露72小時)的比較數(shù)據(jù)L1210 CCRF-CEM人體葉酸酯化合物GARFT 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng) 結(jié)合蛋白Ki(nM) IC50(nM)aIC50(nM)aKd(nM)11.4 13.5 6.1 28DDATHFb25 17.5 1.5 0.020a平均IC50±標準偏差；b6R-DDATHF，5，10-二脫氮四氫葉酸(Lomeyrexol)(見F.M.Muggia，“Folate antimetabolites inhibitor to de novo purine synthesis”，New Drugs，Concepts and Results in Cancer Chemotherapy，KluwerAcademic Publishers，Boston(1992)，65 87)。
如上面比較數(shù)據(jù)所示，化合物1的葉酸酯結(jié)合蛋白Kd相對于6RDDATHF約小1400倍。
向攪拌的5-(3-羥基丙基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯(3.74g，17mmol)，N-甲基嗎啉-N-氧化物(3.00g，26mmol)和粉末4(埃)分子篩(4.5g)的CH2Cl2(50ml)懸浮液中加入四丙基過釕酸銨(300mg，0.85mmol)。將所得懸浮液在室溫攪拌40分鐘，真空濃縮除去溶劑。剩余物經(jīng)快速色譜純化，用己烷∶EtOAc(4∶1)洗脫，得到的產(chǎn)物為黃色油(1.82g，產(chǎn)率49％)。分析結(jié)果表明，該產(chǎn)物為4-甲基-5-(3-氧丙基)噻吩-2-羧酸甲酯。NMR(CDCl3)δ9.83(1H，t，J＝0.8Hz)，7.50(1H，s)，3.84(3H，s)，3.07(2H，t，J＝7.4Hz)，2.83(2H，dt，J＝0.8，7.4Hz)，2.17(3H，s).分析.(C10H12O3S)C，H，Se.5-(3-丁鏈烯基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯 在0℃和氬氣下向攪拌的甲基三苯基溴化磷金翁(3.14g，8.8mmol)的THF(50ml)懸浮液中加入2.5M正丁基鋰的己烷溶液(3.4ml，8.5mmol)。將所得漿液在0℃攪拌10分鐘，在室溫攪拌75分鐘，再冷卻到-65℃，然后滴加4-甲基-5-(3-氧丙基)噻吩-2-羧酸甲酯(1.71g，8.1mmol)的THF(30ml)溶液。移去冷卻浴，逐漸升至室溫的同時攪拌反應(yīng)物90分鐘。將粗反應(yīng)混合物真空濃縮至20ml，然后用乙醚(200ml)稀釋，經(jīng)硅藻土濾墊過濾。真空濃縮濾液，得到橙色油。經(jīng)快速色譜純化，用己烷∶EtOAc(95∶5)洗脫，得到的產(chǎn)物為黃色油(772mg，產(chǎn)率46％)。分析結(jié)果表明，該產(chǎn)物為5-(3-丁鏈烯基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯。
NMR(CDCl3)δ7.50(1H，s)，5.84(1H，ddt，J＝10.2，17.0，6.6Hz)，5.07(1H，dd，J＝1.6，17.0Hz)，5.02(1H，dd，J＝1.6，10.2Hz)，3.84(3H，s).分析(C11H14O2S)C，H，S.f.5-(3，4-二羥基丁基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯 向攪拌的N-甲基嗎啉-N-氧化物(735mg，6.3mmol)和四氧化鋨(5mg，0.02mmol)的丙酮(30ml)溶液中加入5-(3-丁鏈烯基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯(701mg，3.3mmol)的丙酮(20ml)溶液。將所得溶液在室溫和氬氣下攪拌48小時，然后經(jīng)硅藻土濾墊過濾。加入0.5M H2SO4(10ml)使濾液酸化，真空濃縮除去丙酮。水性殘余物用水(20ml)稀釋，用EtOAc(3×25ml)萃取。合并的有機萃取液用水(3×25ml)洗滌，用Na2SO4干燥，真空濃縮得到棕色膠。經(jīng)快速色譜純化，用CH2Cl2∶EtOAc(2∶3)洗脫，得到的產(chǎn)物為乳白色固體(577mg，產(chǎn)率71％)。分析結(jié)果表明，該產(chǎn)物為5-(3，4-二羥基丁基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯。
NMR(CDCl3)δ7.50(1H，s)，3.84(3H，s)，3.79-3.72(1H，m)，3.86(1H，dd，J＝3.2，10.9Hz)，3.48(1H，dd，J＝7.4，10.9Hz)，3.00-2.80(2H，m).分析.(C11H16O4S)C，H，S.
上面實施例用以說明本發(fā)明各個方面。應(yīng)該理解，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的適當(dāng)修改也屬于本發(fā)明范圍。
如果可能有化學(xué)問題，這里所列舉的化學(xué)基團可以被替代。在某些情況下，例如取代或未取代C1-C3烷基會使這種可能性變得更明顯。
如果一個以上的R6基團在任何通式中被列舉，每一個R6可以從所給的可能性中獨立地選擇。
權(quán)利要求
1.式II化合物， 其中R是鹵素；X是取代的或未取代的C1-C6烷基；及B是氨基酸或其衍生物，連到氨基部分形成酰胺。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R是溴。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中X是被取代的，取代基選自O(shè)H，NH2，O-甲基，O-乙基，SH，SCH3和NH-甲基。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中X是未被取代的。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中X是甲基或乙基。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中B是谷氨酸二乙酯。
7.式VII化合物， 其中X是取代的或未取代的C1-C6烷基；及B是氨基酸，連到氨基部分形成酰胺，或C1-C6醇，連到醇部分形成酯。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中X是被取代的，取代基選自O(shè)H，NH2，O-甲基，O-乙基，SH，SCH3和NH-甲基。
9.權(quán)利要求7的化合物，其中X是未被取代的。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中X是甲基或乙基。
11.權(quán)利要求7的化合物，其中B是谷氨酸二乙酯，或甲醇或乙醇。
全文摘要
式(I)化合物—它們以4－羥基互變異構(gòu)體的平衡物形式和非對映體的混合物形式存在—及其藥物上可接受的鹽是極好的甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶(GARFT)抑制劑。
文檔編號C07D471/04GK1394857SQ0114273
公開日2003年2月5日 申請日期2001年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月28日
發(fā)明者M·D·瓦爾尼, W·H·羅米尼斯 申請人:阿格羅尼制藥公司