專利名稱：新型g蛋白偶聯(lián)受體的制作方法
相關(guān)申請參考本申請要求2000年3月14日遞交的USSN09/524,730的權(quán)益，在此以其全文引作參考。關(guān)于根據(jù)聯(lián)邦政府資助的研發(fā)項目提出的發(fā)明權(quán)的聲明非適用本發(fā)明首次提供了編碼G蛋白偶聯(lián)受體的四種新型核酸，所述G蛋白偶聯(lián)受體在乳腺癌細胞中擴增和/或過度表達。這些核酸和它們編碼的多肽稱為“乳腺癌擴增G蛋白偶聯(lián)受體”或“BCA-GPCR”，即“BCA-GPCR-1”、“BCA-GPCR-2”、“BCA-GPCR-3”和“BCA-GPCR-4”。這些BCA-GPCR是細胞中信號轉(zhuǎn)導途徑成分，可以用于診斷癌癥，特別是乳腺癌，以及用于治療化合物的篩選分析，例如用于治療癌癥。例如，針對BCA-GPCR-3的抗體和拮抗物可以用于癌癥的治療。
在一個方面，本發(fā)明提供了編碼G蛋白偶聯(lián)受體多肽的分離的核酸，由所述核酸編碼的所述多肽含有與氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8有70％以上的氨基酸同一性。
在另一方面，本發(fā)明提供了編碼G蛋白偶聯(lián)受體多肽的分離的核酸，其中該核酸在嚴格雜交條件下與具有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的核酸特異性雜交。
在另一方面，本發(fā)明提供了編碼G蛋白偶聯(lián)受體多肽的分離的核酸，由所述核酸編碼的所述多肽與氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ IDNO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的多肽有約70％以上的氨基酸同一性，其中該核酸在適度嚴格雜交條件下與核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7選擇性雜交。
在另一方面，本發(fā)明提供了含有編碼本發(fā)明G蛋白偶聯(lián)受體的分離的核酸的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。
在一個實施方案中，核酸含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5或SEQ ID NO7的核苷酸序列。在另一實施方案中，該核酸來自人、小鼠或大鼠。在另一個實施方案中，該核酸通過在嚴格雜交條件下與和選自下組的引物對相同的序列特異性雜交的引物擴增ATGTTGGGGAACGTCGCCATC(SEQ ID NO9)和TCATCCACAGAGCCTCCAGAT(SEQ ID NO10)；ATGGGAAAGGACAATCCAGTT(SEQ ID NO11)和CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA(SEQ ID NO12)；ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC(SEQ ID NO13)和TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG(SEQ ID NO14)；和ATGGTGAGACATACCAATGAGAG(SEQ ID NO15)和CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC(SEQ ID NO16)在另一方面，本發(fā)明提供了分離G蛋白偶聯(lián)受體多肽，該多肽含有與氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ IDNO8有約70％以上的氨基酸序列同一性。
在一個實施方案中，該多肽與針對SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8或它們的免疫原部分所產(chǎn)生的多克隆抗體特異性結(jié)合。在另一個實施方案中，多肽是來自人、大鼠或小鼠。在另一個實施方案中，多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8或它們的免疫原部分。
在一個實施方案中，多肽具有G蛋白偶聯(lián)受體的活性。
在另一方面，本發(fā)明提供了與分離G蛋白偶聯(lián)受體多肽結(jié)合的抗體，該多肽包含與氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8有約70％以上的氨基酸序列同一性。
在另一方面，本發(fā)明提供鑒定調(diào)節(jié)BCA-PCR的信號轉(zhuǎn)導的化合物的方法，該方法包括如下步驟(i)將化合物與多肽接觸，所述多肽與氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ IDNO8有70％以上的氨基酸序列同一性；和(ii)在多肽的基礎上確定化合物的功能效應。
在一個實施方案中，多肽與固相連接。在另一個實施方案中，多肽與固相共價連接。
在一個實施方案中，通過檢測胞內(nèi)cAMP、IP3或Ca2+的變化確定功能效應。在另一個實施方案中，功能效應是化學效應或物理效應。在另一個實施方案中，功能效應是通過檢測化合物和多肽的結(jié)合來確定的。
在一個實施方案中，多肽是重組的。在另一個實施方案中，多肽是在細胞或細胞膜例如真核細胞或細胞膜中表達的。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，所述方法包括下列步驟將癌細胞與治療有效量的經(jīng)如上所述的方法鑒定的化合物接觸。
在一個實施方案中，癌是乳腺癌。
在另一個實施方案中，化合物是多肽的拮抗劑，所述多肽具有與氨基酸序列SEQ ID NO6有70％以上的氨基酸同一性。
在另一個方面中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，該方法包括下列步驟將癌細胞與治療有效量的抗體接觸，所述抗體與多肽特異性結(jié)合，所述多肽與氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8有70％以上的氨基酸同一性。
在一個實施方案中，抗體與多肽特異性結(jié)合，所述多肽與氨基酸序列SEQ ID NO6有70％以上的氨基酸同一性。
在另一方面中，本發(fā)明提供了在人組織中檢測BCA-GPCR核酸或多肽存在的方法，該方法包括下列步驟(i)分離生物樣品，(ii)將生物樣品與選擇性結(jié)合BCA-GPCR核酸或多肽的BCA-GPCR特異試劑接觸；和(iii)檢測選擇性結(jié)合樣品的BCA-GPCR特異試劑的水平。
在一個實施方案中，BCA-GPCR特異試劑選自下組BCA-GPCR特異抗體、BCA-GPCR特異寡核苷酸引物和BCA-GPCR特異核酸探針。
在另一個實施方案中，組織是乳腺癌組織。
在另一方面，本發(fā)明提供了制備G蛋白偶聯(lián)受體多肽的方法，該方法包括下列步驟從含有編碼該多肽的核酸的重組表達載體中表達多肽，其中多肽的氨基酸序列與具有氨基酸序列為SEQ ID NO2、SEQID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的多肽有約70％以上的氨基酸同一性。
在另一方面，本發(fā)明提供了制備含有G蛋白偶聯(lián)受體多肽的重組細胞的方法，該方法包括下列步驟用含有編碼多肽核酸的表達載體轉(zhuǎn)導細胞，其中多肽的氨基酸序列與具有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的多肽有約70％以上的氨基酸同一性。
發(fā)明詳述前言本發(fā)明第一次提供了編碼四種新型G蛋白偶聯(lián)受體的核酸。這些核酸和他們編碼的受體分別命名為BCA-GPCR-1、2、3和4。這些BCA-GPCR是信號轉(zhuǎn)導途徑的成分，并且與乳腺癌細胞中擴增的基因組區(qū)域相關(guān)。這些核酸對于鑒定乳腺癌細胞提供了有價值的探針，因為這些核酸在某些乳腺癌細胞中特異性擴增，或是非?？拷?在100kb內(nèi))或是在乳腺癌細胞中特異性擴增和/或過度表達的區(qū)域?？梢杂萌缒孓D(zhuǎn)錄和mRNA擴增、總RNA或poly A+RNA的分離、RNA印跡法、斑點印跡法、原位雜交、核糖核酸酶保護、SI消化、探測DNA微芯片陣列等技術(shù)來鑒定編碼本發(fā)明BCA-GPCR的核酸。
這些基因在染色體上的座位已經(jīng)確定，所有四個基因都定位在染色體1q44上，方向如下從著絲粒端開始，5’到3’鏈BCA-GPCR-1(3’-5’方向)；約40kb；BCA-GPCR-2(5’-3’方向)；約40kb；BCA-GPCR-3，(3’-5’方向)；約60kb；BCA-GPCR-4(5’-3’方向)，在端粒端結(jié)束。這些編碼人BCR-GPCR的基因可以用于鑒定由BCA-GPCR引起并相關(guān)的疾病、突變和特征，如癌癥，例如乳腺癌。本發(fā)明的BCA-GPCR也用于癌癥的診斷，尤其是乳腺癌的診斷。
新型BCA-GPCR的分離提供了測試和鑒定G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)劑的方法，這些調(diào)節(jié)劑例如激活劑、抑制劑、刺激劑、增強子、激動劑和拮抗劑。這些信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)劑可以用于信號途徑的藥物調(diào)節(jié)，例如，在癌細胞如乳腺癌中。用BCA-GPCR鑒定的激活劑和抑制劑也可以用于進一步研究信號轉(zhuǎn)導。所以，本發(fā)明提供了信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)的分析，其中BCA-GPCR在調(diào)節(jié)劑對信號轉(zhuǎn)導的效應中充當直接或間接的報道分子。BCA-GPCR可以用于體外和體內(nèi)的分析，例如用于檢測GPCR轉(zhuǎn)錄激活的變化、配體結(jié)合、磷酸化和脫磷酸化、GPCR與G蛋白的結(jié)合、G蛋白的激活、調(diào)節(jié)分子結(jié)合、電壓，膜位和電導變化、離子流通量、細胞內(nèi)第二信使如cAMP和肌醇三磷酸的變化、細胞內(nèi)鈣水平的變化和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。
分析信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)劑的方法包括體外配體結(jié)合分析，該分析利用了BCA-GPCR、其部分如胞外結(jié)構(gòu)域或含有一種或多種GPCR結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白、天然存在的或重組的卵母細胞GPCR的表達或組織培養(yǎng)細胞GPCR表達、天然存在或重組的GPCR的膜表達、GPCR的組織表達、轉(zhuǎn)基因動物中的GPCR的表達等。
從功能上來說，BCA-GPCR代表了G蛋白偶聯(lián)受體家族的七個跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，他們與G蛋白相互作用以介導信號轉(zhuǎn)導(參見，例如Fong，Cell Signal 8217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.Cell Biol.6180(1994))。編碼BCA-GPCR的基因是在染色體1q44上，并且與在乳腺癌細胞中擴增的區(qū)域相關(guān)。
從結(jié)構(gòu)上來說，人BCA-GPCR-1的核苷酸序列(參見，例如SEQ IDNO1)編碼分子量預測約為31kDa和預測范圍為26-36kDa的多肽(參見，例如SEQ ID NO2)。來自其他種類的相關(guān)GPCR-1基因在至少25個氨基酸長度，或者50-100個氨基酸長度的氨基酸區(qū)域應該享有至少約70％的氨基酸同一性。
本發(fā)明也提供了在SEQ ID NO1中描述的BCA-GPCR-1的多態(tài)變體變體#1，其中在從甲硫氨酸開始的氨基酸位置7，用亮氨酸取代亮氨酸殘基；變體#2，其中在從甲硫氨酸開始的氨基酸位置142，用天冬氨酸殘基取代谷氨酸殘基；和變體#3，其中在從甲硫氨酸開始的氨基酸位置6，用甘氨酸殘基取代丙氨酸殘基。
從結(jié)構(gòu)上來說，人BCA-GPCR-2的核苷酸序列(參見，例如SEQ IDNO3)編碼了分子量預測約37kDa和預測范圍為32-42kDa的多肽(參見，例如SEQ ID NO4)。來自其他種類的相關(guān)BCA-GPCR-2基因在至少約25個氨基酸長度或者50-100個氨基酸長度的氨基酸區(qū)域應該享有至少約70％的氨基酸同一性。BCA-GPCR-2在15％的原發(fā)性乳腺瘤和腫瘤細胞系中擴增了至少約2-3倍。
本發(fā)明也提供了SEQ ID NO4中描述的BCA-GPCR-2的多態(tài)變體變體#1，其中在氨基酸位置9用異亮氨酸殘基取代亮氨酸殘基；變體#2，其中在氨基酸位置19用谷氨酸殘基取代天冬氨酸殘基；和變體#3，其中在氨酸位置6用甘氨酸殘基取代丙氨酸殘基。
從結(jié)構(gòu)上來看，人BCA-GPCR-3的核苷酸序列(參見，例如在胎盤和睪丸中表達的SEQ ID NO5)編碼了分子量預測約為37kDa和預測范圍為32-42kDa的多肽(參見，例如SEQ ID NO6)。來自其他種類的相關(guān)BCA-GPCR-3基因在至少約25個氨基酸長度或者50-100個氨基酸長度的氨基酸區(qū)域應該享有至少約70％的氨基酸同一性。BCA-GPCR-3在約15％的原發(fā)性乳腺瘤和腫瘤細胞系中擴增至少約3-7倍(參見

圖1)。另外，在兩個已擴增和未擴增腫瘤的乳腺癌細胞系中BCA-GPCR-3 mRNA的水平提高了(參見圖2-3)。
本發(fā)明也提供了SEQ ID NO6中描述的BCA-GPCR-3的多態(tài)變體變體#1，其中在氨基酸位置8用異亮氨酸殘基取代亮氨酸殘基；變體#2，其中在氨基酸位置73用谷氨酸殘基取代天冬氨酸殘基；和變體#3，其中在氨基酸位置7用甘氨酸殘基取代丙氨酸殘基。
從結(jié)構(gòu)上來看，人BCA-GPCR-4的核苷酸序列(參見，例如SEQ IDNO7)編碼了分子量預測約37kDa和預測范圍為32-42kDa的多肽(參見，例如SEQ ID NO8)。來自其他種類的相關(guān)BCA-GPCR-4基因在至少約25個氨基酸長度或者50-100個氨基酸長度的氨基酸區(qū)域應該享有至少約70％的氨基酸同一性。BCA-GPGR-4在15％的原發(fā)性乳腺瘤和腫瘤細胞系中擴增了至少約2-3倍。
本發(fā)明也提供了SEQ ID NO8描述的BCA-GPCR-4的多態(tài)變體變體#1，其中在氨基酸位置7用異亮氨酸殘基取代亮氨酸殘基；變體#2，其中在氨基酸位置13用天冬氨酸殘基取代谷氨酸殘基；和變體#3，其中在氨基酸位置10用甘氨酸殘基取代絲氨酸殘基。
可以用BCA-GPCR核苷酸和氨基酸序列的特異區(qū)域鑒定多態(tài)變體、種間同系物和BCA-GPCR的等位基因。鑒定可以在體外進行，例如在嚴格雜交條件下或PCR(利用與SEQ ID NO1、3、5和7雜交的引物，例如SEQ ID NO9-16)和測序，或利用計算機系統(tǒng)將序列信息和其他核苷酸序列進行比較。通常，BCA-GPCR的多態(tài)變體和等位基因的鑒定是通過比較約25個氨基酸或更多，例如50-100個氨基酸的氨基酸序列來進行的。氨基酸的同一性至少約為70％或以上，或者75％、80％、85％或90-95％或以上通?？勺C明蛋白是BCA-GPCR的多態(tài)變體、種間同系物或等位基因。序列比較可以利用如下所述的BLAST和BLAST2.0序列比較算法和缺省參數(shù)來進行。與BCA-GPCR或其保守區(qū)特異性結(jié)合的抗體也可以用于鑒定等位基因，種間同系物和多態(tài)變體。多態(tài)變體、等位基因和種間同系物預料保留七個G蛋白偶聯(lián)受體的跨膜結(jié)構(gòu)。
BCA-GPCR核苷酸和氨基酸序列的信息也可用于計算機系統(tǒng)中構(gòu)建BCA-GPCR模型。這些模型隨后用于鑒定可以激活和抑制BCA-GPCR的化合物。這些調(diào)節(jié)BCA-GPCR活性的化合物可用于研究BCA-GPCR在信號轉(zhuǎn)導中的作用。定義“BCA-GPCR”和“BCA-GPCR-1、2、3或4”指新型G蛋白偶聯(lián)受體，定位于染色體1q44并且與在乳腺癌細胞中擴增的染色體區(qū)域相關(guān)的基因。本發(fā)明的BCA-GPCR具有七個跨膜區(qū)并具有“G蛋白偶聯(lián)受體活性”，例如，它們應答胞外刺激而結(jié)合G蛋白和通過刺激下游效應物如磷脂酶C和腺苷酸環(huán)化酶來促進第二信使如IP3、cAMP和Ca2+的生產(chǎn)(GPCR結(jié)構(gòu)和功能的描述參見，例如Fong，同上和Baldwin，同上)。
從拓撲學上看，BCA-GPCR具有N末端“胞外結(jié)構(gòu)域”、含有7個跨膜區(qū)和對應胞質(zhì)和胞外環(huán)的“跨膜結(jié)構(gòu)域”以及C末端的“胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”(參見，例如Buck和Axel，Cell 65175-187(1991))。這些結(jié)構(gòu)域可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如鑒定疏水和親水區(qū)域的序列分析程序來鑒定(參見，例如Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.157105-132(1982))。這些結(jié)構(gòu)域可以用于制備嵌合蛋白和本發(fā)明的體外分析。
“胞外結(jié)構(gòu)域”是指從細胞膜中突出并且經(jīng)常與細胞外配體結(jié)合的BCA-GPCR結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域經(jīng)常用于可溶和固相的體外配體結(jié)合鑒定。
“跨膜結(jié)構(gòu)域”包括七個跨膜區(qū)，外加對應的胞質(zhì)和胞外環(huán)?？缒そY(jié)構(gòu)域的某些區(qū)域也可能參與配體的結(jié)合。
“胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域”指在第7個跨膜區(qū)后突入細胞質(zhì)并且連續(xù)到多肽C末端BCA-GPCR中的結(jié)構(gòu)域。
“GPCR活性”是指GPCR轉(zhuǎn)導信號的能力。此活性可以例如在異源細胞中通過將GPCR(或嵌合GPCR)與G蛋白和下游效應物如PLC偶聯(lián)，然后檢測胞內(nèi)鈣水平的增加來檢測(參見，例如Offermans和Simon，J.Biol.Chem.27015175-15180(1995))。利用熒光Ca2+指示染料和熒光計成象，通過記錄[Ca2+]中配體誘導的變化可有效檢測受體的活性。
術(shù)語“BCA-GPCR”和“BCA-GPCR-1、2、3或4”是指多態(tài)變體、等位基因、突變體和種間同系物及其BCA-GPCR結(jié)構(gòu)域，它們(1)與SEQ ID NO2、4、6或8，在約25個氨基酸優(yōu)選50-100個氨基酸的窗口上約有70％的氨基酸序列同一性，優(yōu)選約75、80、85、90或95％或更高的氨基酸序列的同一性；(2)與針對免疫原產(chǎn)生的抗體結(jié)構(gòu)，所述免疫原含有SEQ ID NO2、4、6或8的氨基酸序列及其保守修飾變體；或(3)在嚴格雜交條件下與序列SEQ ID NO1、3、5或7及其保守修飾變體特異性雜交(大小至少為100，優(yōu)選至少約500或1000個核苷酸)。該術(shù)語也稱為如上所述的BCA-GPCR結(jié)構(gòu)域，或含有與異源蛋白連接的BCA-GPCR結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
“宿主細胞”是含有表達載體并且支持表達載體復制或表達的天然存在的細胞或轉(zhuǎn)化細胞。宿主細胞可以是培養(yǎng)細胞、外植體、體內(nèi)細胞等。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞如CHO、Hela等。
本發(fā)明所用的“生物樣品”是指含有新型BCA-GPCR核酸或多肽的生物組織或流體的樣品。這些樣品包括但不限于從人、小鼠和大鼠中分離的組織。生物樣品也可包括組織切片如為組織學目的而取出的冷凍切片。生物樣品通常獲自真核生物，如昆蟲、原生動物、鳥類、魚類、爬行動物，和優(yōu)選哺乳動物如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或兔，以及最優(yōu)選靈長類動物如黑猩猩或人。優(yōu)選的組織包括例如正常的前列腺上皮組織、胎盤和睪丸組織。
短語“功能效應”在測試調(diào)節(jié)BCA-GPCR介導的信號轉(zhuǎn)導的化合物實驗中包括確定間接或直接受到BCA-GPCR影響的任何參數(shù)，例如功能性、物理或化學效應。其包括配體結(jié)合、離子流通量的變化、膜電位、電流、轉(zhuǎn)錄、G蛋白結(jié)合、基因擴增、癌細胞中的表達、GPCR的磷酸化或脫磷酸化、信號轉(zhuǎn)導、受體-配體的相互作用、體外、體內(nèi)和離體的第二信使?jié)舛?例如cAMP、cGMP、IP3或胞內(nèi)Ca2+)，也可以包括其他生理效應如神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放的增加或降低。
“確定功能效應”是指分析化合物的效應，所述化合物增加或減少直接或間接受到BCA-GPCR影響的參數(shù)，如功能效應、物理效應和化學效應。這些功能性效應可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定，如利用光譜特征的變化(如熒光、吸光率、折射率)、流體動力學(如形態(tài))、色譜或溶解特性、膜片鉗、電壓敏感染料、全細胞電流、放射性同位素流、可誘導標記、BCA-GPCR轉(zhuǎn)錄激活、配體結(jié)合分析、電壓、膜電位和電導率變化、離子流通量分析、胞內(nèi)第二信使如cAMP和肌醇三磷酸(IP3)的變化、胞內(nèi)鈣水平的變化、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。
BCA-PGCR的“抑制劑”、“激活劑”和“調(diào)節(jié)劑”交互使用，意指經(jīng)過對信號轉(zhuǎn)導采用體外和體內(nèi)測定所鑒定的抑制、激活或調(diào)節(jié)的分子，例如配體、激動劑、拮抗劑和它們的同系物和模擬物。抑制劑是例如結(jié)合、部分或全部阻斷刺激、降低、預防、延遲活化、失活、脫敏或負調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導的化合物，如拮抗劑。激活劑是例如結(jié)合、刺激、增加、打開、激活、促進、增強活化、致敏或上調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導的化合物，如興奮劑。調(diào)節(jié)劑包括例如改變多肽與胞外蛋白相互作用的化合物，所述胞外蛋白結(jié)合激活劑或抑制劑、G蛋白、G蛋白α、β和γ亞基以及激酶。調(diào)節(jié)劑也包括經(jīng)遺傳修飾的BCA-GPCR版本，例如具有活性改變以及天然發(fā)生和合成配體、拮抗劑、激動劑、抗體、化學小分子等的BCA-GPCR。對抑制劑和激活劑的這些分析包括例如，在細胞或細胞膜中體外表達BCA-GPCR，利用公認的調(diào)節(jié)劑化合物，然后如上所述確定對信號轉(zhuǎn)導的功能效應。
含有BCA-GPCR的樣品或分析，經(jīng)潛在激活劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理后，與沒有抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑的對照樣品比較，從而檢測抑制程度。將對照樣品(未用抑制劑處理)的相對BCA-GPCR活性值賦值100％。當BCA-GPCR活性值相對于對照約為80％，優(yōu)選50％，更優(yōu)選25-0％時，實現(xiàn)BCA-GPCR的抑制。當BCA-GPCR活性值相對于對照(未用激活劑處理)為110％，更優(yōu)選150％，更優(yōu)選200-500％(即相對于對照高出2-5倍)或更優(yōu)選1000-3000％以上時，實現(xiàn)BCA-GPCR的活化。
術(shù)語“分離的”、“純化的”或“生物純”是指實質(zhì)上或基本上沒有如天然狀態(tài)所發(fā)現(xiàn)的通常相伴的成分的物質(zhì)。純度和同質(zhì)性的確定通常采用分析化學技術(shù)，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高壓液相色譜。存在于制劑中的優(yōu)勢種類蛋白是基本純的。具體而言，分離的BCA-GPCR核酸從位于BCA-GPCR基因側(cè)翼并編碼除BCA-GPCR以外的蛋白的可讀框中分離。術(shù)語“純化的”表示核酸或蛋白在電泳凝膠中基本產(chǎn)生一條帶。具體地，其表示核酸或蛋白的純度至少85％，優(yōu)選至少95％以及最優(yōu)選至少99％。
“生物活性的”BCA-GPCR指如上所述的具有信號轉(zhuǎn)導活性和G蛋白偶聯(lián)受體活性的BCA-GPCR。
“核酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸及其多聚體。該術(shù)語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其可以是合成、天然存在和非天然存在，與標準核酸具有相似的結(jié)合特性，并且以與標準核苷酸相似的方式代謝。這些類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸酰胺、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸鹽、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另有所指，特定核酸序列也暗含其保守修飾的變體(如簡并密碼子替換)和互補序列，以及明示的序列。具體而言，通過生成序列可實現(xiàn)簡并密碼子替換，在所述序列中，一個或多個選定的(或全部)密碼子的第3個位置用混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基替換(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。術(shù)語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸交互使用。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本發(fā)明中可交互使用，用來指氨基酸殘基的多聚體。這些術(shù)語適用于這樣的氨基酸多聚體，即其中一個或多個氨基酸殘基是對應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物，以及適用于天然存在的氨基酸多聚體和非天然存在的氨基酸多聚體。
術(shù)語“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及后來經(jīng)修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學結(jié)構(gòu)的一些化合物，即與氫結(jié)合的α碳、羧基基團、氨基基團和R基團，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物具有修飾的R基團(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指其結(jié)構(gòu)與氨基酸一般化學結(jié)構(gòu)不同，但其作用方式類似于天然存在的氨基酸的一些化合物。
氨基酸在本發(fā)明中可參照共知的三字母符號或參照用IUPAC-IUB生化命名委員會建議的單字母符號。同樣，核苷酸也可以參照普遍接受的單字母密碼表示。
“保守性修飾變體”適用于氨基酸和核酸序列。關(guān)于特定核酸序列，保守性修飾變體是指那些編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者指基本相同的核酸序列，如果該核酸不編碼氨基酸序列。由于遺傳密碼簡并，很多功能性相同的核酸編碼任何給定的多肽。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在每個由密碼子所規(guī)定的丙氨酸的位置上，可將密碼子改變成任何所述的對應密碼子，而不改變所編碼的多肽。這些核酸變化稱為“沉默替換”或“沉默變異”，其是一類“保守性修飾變異”。本發(fā)明所述的每個編碼多肽的多核苷酸序列也描述每種可能的沉默變異，除了另有標注以外。因此，沉默替換是每個編碼氨基酸的核酸序列暗含的特征。專業(yè)技術(shù)人員將認識到通過標準技術(shù)將核酸中各個密碼子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密碼子AUG和色氨酸的唯一密碼子TGG以外)可經(jīng)修飾產(chǎn)生功能性相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各個沉默變異在各個描述的序列中是暗含的。
至于氨基酸序列，專業(yè)技術(shù)人員將認識到核酸、肽、多肽或蛋白序列中個別替換、缺少或添加，可變更、添加或缺失編碼序列中單一氨基酸或小百分比的氨基酸，是保守性修飾變體，其中變更導致用化學相似的氨基酸替換某種氨基酸。保守替換表提供了功能相似的氨基酸，為本領(lǐng)域所熟知。這些保守修飾變體除上述之外，不排除本發(fā)明的多態(tài)變體、種內(nèi)同系物以及等位基因。
下列8組中每組都含有對另一氨基酸是保守替換的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天門冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天門冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見，如Creighton，Proteins(1984))。
根據(jù)各層次結(jié)構(gòu)，可描述如多肽結(jié)構(gòu)的大分子結(jié)構(gòu)。對此結(jié)構(gòu)的綜述，參見，如Albets等，Molecular Biology ofthe Cell(第3版，1994)以及Cantor和Schimmel，Biophysical Chemistry Part ITheConformation of Biological Macromolecules(1980)?！耙患壗Y(jié)構(gòu)”指特定肽的氨基酸序列?！岸壗Y(jié)構(gòu)”指多肽內(nèi)局部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常被認作結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是形成多肽的緊密單元多肽部分，長度通常有25-約500個氨基酸。典型的結(jié)構(gòu)域由次級結(jié)構(gòu)如β-折疊和α-螺旋部分組成?！叭壗Y(jié)構(gòu)”指多肽單體完整的三維結(jié)構(gòu)?！八募壗Y(jié)構(gòu)”指由獨立的三級單元非共價締合組成的三維結(jié)構(gòu)。各向異性術(shù)語也稱為能量術(shù)語。
“標記”或“可檢測部分”是可通過分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學或化學方法檢測的組合物。例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子密試劑、酶(如在ELISA中通常所用的酶)、生物素、地高辛配基或肝素和可檢測ant或7的蛋白，如將放射性標記摻入所述肽，并用于檢測與所述肽特異性反應的抗體。
“標記核酸探針或寡核苷酸”是一種通過接頭或化學鍵共價結(jié)合，或通過離子、范德華、靜電或氫鍵非共價與標記結(jié)合的核酸或寡核苷酸，這樣通過檢測與探針結(jié)合的標記的存在就可檢測探針的存在。
如本發(fā)明所用的“核酸探針或寡核苷酸”定義為通過一種或多種類型的化學鍵，通?；パa堿基配對或形成氫鍵，能夠與互補序列的靶核酸結(jié)合的核酸。如本發(fā)明所用的探針可包括天然堿基(即A、G、C或T)或修飾堿基(7-脫氮鳥苷、肌苷等)。此外，探針中的堿基可通過除磷酸二酯鍵以外的鍵連接，只要其不干擾雜交。因此，例如，探針可以是肽核酸，其中組成型堿基通過肽鍵連接而非以磷酸二酯鍵連接。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員將會理解，探針可與探針序列缺乏完全互補性的靶序列結(jié)合，取決于雜交條件的嚴格性。探針任選直接標記，如用同位素、生色團、發(fā)光團、色原標記，或間接標記，如采用后來可與鏈親和素復合體結(jié)合的生物素標記。通過對探針存在與否的分析，人們可檢測選擇序列或亞序列的存在與否。
術(shù)語“重組”當用于涉及例如細胞或核酸、蛋白或載體時表示細胞、核酸、蛋白或載體已被異源核酸或蛋白的導入或天然核酸或蛋白的變更所修飾，或表示細胞是經(jīng)過如此修飾的細胞衍生來的。因此，例如重組細胞表達細胞的天然(非重組)形式中未發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達那些異常表達、低水平表達或根本不表達的天然基因。
術(shù)語“異源”當用于有關(guān)核酸部分時表示核酸包含兩種或更多種自然界中相互之間未發(fā)現(xiàn)關(guān)系相同的亞序列。例如，通常核酸經(jīng)重組產(chǎn)生，具有兩種或更多種來自不相關(guān)基因的序列，這些不相關(guān)基因排列成新的功能性核酸，例如來自一種源的啟動子和來自另一種源的編碼區(qū)。同樣，異源蛋白表示蛋白包含自然界中相互之間未發(fā)現(xiàn)關(guān)系相同的兩種或多種亞序列(如融合蛋白)。
“啟動子”定義為指導核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列的排列。如本發(fā)明所用的啟動子包括在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點的必需核酸序列，例如在聚合酶II啟動子情況下的TATA元件。啟動子也任選包括遠端的增強子或阻遏元件，其可位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點多達數(shù)千個堿基對。“組成型”啟動子在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下是活潑的。“可誘導”啟動子在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下是活潑的。術(shù)語“可操作連接”是指介于核酸表達控制序列(如啟動子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的排列)和第二核酸序列之間的功能鍵合，其中表達控制序列指導與第二序列相對應的核酸轉(zhuǎn)錄。
“表達載體”是核酸構(gòu)建體，由重組或合成產(chǎn)生，具有一系列指定核酸元件，這些元件允許特定核酸在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄。表達載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的部分。表達載體通常包括與啟動子可操作連接、有待轉(zhuǎn)錄的核酸。
術(shù)語“相同的”或百分數(shù)的“同一性”在兩種或更多種核酸或多肽序列的情況下，指兩種或更多種序列或亞序列是相同的，或具有規(guī)定百分數(shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸(即當在比較窗口和指定區(qū)域上對最大對應性進行比較和序列對比時，在指定區(qū)域上有約70％同一性，優(yōu)選75％、80％、85％、90％或95％同一性，正如利用BLAST或BLAST2.0序列比較算法和下述的缺省參數(shù)或通過手工對比和肉眼觀察所測定。這些序列可以說是“基本相同的”。該定義也指測試序列的補碼(compliment)。此定義還包括具有缺失和/或添加的序列，以及那些具有替換的序列。如下所述，優(yōu)選算法可說明間隙等。同一性優(yōu)選存在于長度至少約25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域，更優(yōu)選在長度為50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。
對于序列比較，通常把一種序列充當標準序列來比較測試序列。當利用序列比較算法時，將測試和標準序列都輸入計算機，如果需要，設定亞序列座標，然后設定序列算法程序參數(shù)。可采用缺省的程序參數(shù)，或者設定選擇參數(shù)。然后，序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計算測試序列相對于標準序列的序列同一性百分數(shù)。
如本發(fā)明所用，“比較窗口”包括涉及任何一個數(shù)目的鄰接位置的區(qū)段，數(shù)目選自20-600，通常約50-約200，更通常是約100-約150，其中在兩個序列最佳對比后，可將一個序列與相同數(shù)目鄰接位置的標準序列比較。序列對比比較方法是本領(lǐng)域熟知的。通過Smith和Waterman在Adv.Appl.Math.2482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch在J.Mel.Biol.48443(1970)中的同源性序列對比算法、Pearson和Lipman在Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 852444(1988)中的相似性方法的研究、這些算法的計算機化實施(威斯康星遺傳基因軟件包GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或通過手工對比和肉眼觀察(參見，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編，1995年增刊)，可以進行最佳序列對比比較。
適于確定序列同一性和序列相似性百分數(shù)的算法的優(yōu)選例子是BLAST和BLAST2.0算法，其在Altschul等，Nuc.Acids Res.252389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中分別有描述。采用BLAST和BLAST2.0以及本發(fā)明所述的參數(shù)對本發(fā)明的核酸和蛋白的序列同一性百分數(shù)進行確定。BLAST分析的軟件可以公開地從國家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。該算法包括通過鑒定欲查詢序列中的短長度W字碼首先鑒定高得分序列對(HSP)，與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字碼進行對比時，它們可匹配或滿足一些正的閾值分T。T稱為鄰近字碼得分閾值(Altschul等，同上)。這些初始鄰近字碼命中作為起始檢索的種子以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP。字碼命中可沿著各個序列在兩個方向上延伸，直到累積對比得分增加。對于核苷酸序列，累積得分可以利用參數(shù)M(匹配殘基對的獎分；總是大于0)和N(錯配殘基的罰分；總是小于0)來計算。對于氨基酸序列，采用得分矩陣計算累積得分。當累積對比得分以數(shù)量X從其最大獲得值下降時；當由于積累了一個或多個負的得分殘基對比，累積得分趨向零或以下時；或當每個序列達到終點時，各方向的字碼命中就暫時終止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了序列對比的敏感性和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)采用字碼長度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4作為缺省參數(shù)，并比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序采用字碼長度3和期望值(E)10作為缺省參數(shù)，以及BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))采用對比(B)50、期望值(E)、10、M＝5、N＝-4作為參數(shù)，并比較兩條鏈。
BLAST算法也進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析(參見，例如Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一個測量值是最小概率和(P(N))，其提供了兩個核苷酸或氨基酸序列之間匹配偶然出現(xiàn)的概率的指征。例如，如果在測試核酸和標準核酸的比較中，最小概率和小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，那么該核酸就可視為與標準序列相似。
有用算法的另一個例子是PILEUP。PILEUP利用了漸進式成對的序列對比，從一組相關(guān)序列產(chǎn)生多個序列對比以表明相互的關(guān)系和序列同一性百分數(shù)。PILEUP還繪出了世系圖或樹狀圖(dendogram)，表示用于產(chǎn)生序列對比的成簇關(guān)系。PILEUP簡化了Feng和Doolittle在J.Mol.Evol.，35351-360(1987)中所述的漸進式序列對比方法。該方法與Higgins和Sharp在CABIOS 5151-153(1989)中所述的方法相似。該程序可以對比多至300個序列，每個序列最大長度為5000個核苷酸或氨基酸。多重序列對比程序是從兩個最相似的序列成對對比開始的，產(chǎn)生了兩個已對比序列的簇。然后將這簇與下一個最相關(guān)序列或已對比序列的簇進行對比。通過兩個單個序列成對對比的簡單延伸可以對比兩個序列簇。通過一系列漸進式成對序列對比可以完成最后的對比。通過設定序列比較區(qū)域指定的序列和它們的氨基酸或核苷酸座標和設定程序參數(shù)可以運行程序。利用PILEUP，將標準序列和其他測試序列比較，可以確定序列同一性關(guān)系百分數(shù)，其中利用了下面的參數(shù)缺省間距權(quán)值(3.00)、缺省間距長度權(quán)值(0.10)和權(quán)值末端間距。PILEUP可以從GCG序列分析軟件包例如7.0版本得到(Devereaux等，Nuc.Aciols Res.，12387-395(1984))。
兩個核酸序列或多肽基本相同的指征如下文所述是由第一核酸編碼的多肽可以與針對由第二核酸編碼的多肽所產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫交叉反應。所以，這個多肽通常與第二多肽基本相同，例如兩個肽只有靠保守取代來區(qū)別。兩個核酸序列基本相同的另一個指征是兩個分子或它們的互補分子在嚴格條件下相互雜交，如下文所述。兩個核酸序列基本同源的另一個指征是可以利用相同的引物擴增序列。
短語“選擇性(或特異性)雜交”指分子在嚴格雜交條件下只與特定核苷酸序列結(jié)合、轉(zhuǎn)接或雜交，當該序列以復合體混合物(如總細胞或文庫DNA或RNA)存在時。
短語“嚴格雜交條件”通常是指在核酸復合體混合物中，探針與其靶亞序列雜交而不與其他序列雜交的條件。嚴格條件取決于序列，并且在不同環(huán)境下有所區(qū)別。序列越長，特異性雜交的溫度越高。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid assays”(1993)中可以找到核酸雜交的詳盡的指南。一般而言，在規(guī)定的離子強度和pH下，所選擇的嚴格條件比特異序列的熱熔點(Tm)低約5-10℃。Tm是指在探針與靶序列雜交平衡時有50％的探針與靶互補(在規(guī)定離子強度、pH和核酸濃度下)的溫度(靶序列過量存在，在Tm雜交平衡時，有50％的探針被占用)。嚴格條件是在pH7.0-8.3時，鹽濃度小于約1.0M鈉離子，通常約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，以及對于短探針(例如10-50個核苷酸)溫度至少約30℃，對于長探針(例如大于50個核苷酸)至少約60℃。嚴格條件也可加入去穩(wěn)定試劑如甲醛來達到。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號至少兩倍于背景，任選10倍于背景雜交。嚴格雜交條件的例子如下50％甲醛、5×SSC和1％SDS，42℃溫育，或5×SSC、1％SDS，65℃溫育，并用0.2×SSC和0.1％SDS，65℃洗滌。
如果核酸所編碼的多肽基本相同，那么在嚴格條件下該核酸仍然是基本同源的，它們相互不發(fā)生雜交。例如，當采用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性創(chuàng)建核酸拷貝時，就會出現(xiàn)這種情形。在這些情況中，核酸通常在適度嚴格雜交條件下雜交。“適度嚴格雜交條件”的例子包括在40％甲醛、1M NaCl、1％SDS的緩沖液中37℃雜交，以及用1×SSC 45℃洗滌。陽性雜交至少兩倍于背景。普通技術(shù)人員將容易地認識到選擇性雜交和洗滌條件可用于提供相似嚴格性的條件。
“抗體”是指含有來自免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)的多肽，該多肽可特異性結(jié)合和識別抗原。識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和mu恒定區(qū)的基因以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈可分類為κ或λ。重鏈可分類為γ、mu、α、δ或ε，它們依次分別定義免疫球蛋白類別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元的例子包括四聚體。各個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對都具有一個“輕”鏈(約25kDa)和一個“重”鏈(約50-70kDa)。各鏈的N末端限定了一個主要負責抗原識別的約100-110或更多個氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體例如可作為完整的免疫球蛋白存在，或作為用各種肽酶消化產(chǎn)生的特征清晰的許多片段存在。所以，例如胃蛋白酶在絞鏈區(qū)中二硫鍵以下消化抗體以產(chǎn)生F(ab)’2，F(xiàn)(ab)’2是Fab的二聚體，其本身是通過二硫鍵與VH-CH1連接的輕鏈。在溫和條件下可斷裂絞鏈區(qū)中的二硫鍵，還原F(ab)’2，從而將F(ab)’2二聚體轉(zhuǎn)變成Fab’單體。Fab’單體基本上是帶有部分絞鏈區(qū)的Fab(參見Fundamental Immunology(Paul編，第三版，1993年)。當各種抗體片段依據(jù)完整抗體的消化來限定時，技術(shù)人員將懂得這些片段可用化學方法或采用重組DNA方法重新合成。因此，如本文所用的術(shù)語抗體也包括由修飾整個抗體所產(chǎn)生的抗體片段，或采用重組DNA方法重新合成的那些抗體片段(例如單鏈Fv)，或采用噬菌體展示文庫鑒定的那些抗體片段(參見，例如McCafferty等，Nature 348552-554(1990))。
對于單克隆或多克隆抗體的制備，可以利用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)(參見，例如Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cole等，第77-96頁，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy(1985))。生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)可適用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的抗體。同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠或其他生物體如其他哺乳動物可用于表達人源化抗體?；蛘?，噬菌體展示技術(shù)可用于鑒定與選定抗原特異性結(jié)合的抗體和異數(shù)的Fab片段(參見，例如McCafferty等，Nature 348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology 10779-783(1992))。
“嵌合抗體”是抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替代或交換，從而使抗原結(jié)合位點(可變區(qū))連接到不同類別或改變類別的恒定區(qū)、效應物官能團和/或物種上，或連接到給嵌合抗體賦予新特性的完全不同的分子上，如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或其部分被具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、替代或交換。
“抗-BCA-GPCR”抗體是與由BCA-GPCR基因、cDNA或其亞序列編碼的多肽特異性結(jié)合的抗體或抗體片段。
術(shù)語“免疫測定”是利用抗體特異性結(jié)合抗原的分析。免疫測定是利用特定抗體的特異性結(jié)合特性為特征來分離、靶擊和/或定量抗原。
短語“特異性(或選擇性)結(jié)合”抗體或“特異性(或選擇性)免疫反應”當涉及蛋白或肽時，指在異源蛋白群體和其他生物制品中確定蛋白存在的結(jié)合反應。因此，在設定的免疫測定條件下，指定抗體與特定蛋白結(jié)合至少兩倍于背景，并基本上不與樣品中存在的其他蛋白有顯著量的結(jié)合。在這些條件下，與抗體的特異性結(jié)合可要求選擇對特定蛋白有特異性的抗體。例如，對特定BCA-GPCR產(chǎn)生的多克隆抗體可被選擇獲得只與BCA-GPCR而不與其他蛋白發(fā)生特異性免疫反應，除了BCA-GPCR的多態(tài)變體、直向同源物和等位基因之外。減去與BCA-GPCR分子發(fā)生交叉反應的抗體可完成這種選擇。各種免疫測定形式可用于選擇與特定蛋白特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定通常用于選擇與蛋白特異性免疫反應的抗體(參見，例如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual (1988)，描述了可用于確定特異免疫反應性的免疫測定形式和條件)。特異性或選擇性反應通常至少兩倍于背景信號或噪聲，更通常是背景的10倍到100倍以上。如上所述，通過減去與來自另一物種相同的BCA-GPCR結(jié)合的抗體，也可制備只與特定BCA-GPCR直向同源物反應的抗體，所述直向同源物來自特異物種，如大鼠、小鼠或人。
術(shù)語“選擇性相關(guān)”指核酸與如上定義的另一核酸“選擇性雜交”的能力，或指抗體“選擇性(或特異性)結(jié)合”蛋白的能力，如上定義。
編碼BCA-GPCR核酸的分離A.一般重組DNA方法本發(fā)明依賴于重組遺傳學領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)?；A版本公開了本發(fā)明采用的一般方法，包括Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Mannual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transfer andExpressionA Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等編，1994年)。
對于核酸，其大小以千堿基(kb)或堿基對(bp)表示。這些大小的估計來自于瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、測序核酸或公布的DNA序列。對于蛋白，大小是以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)表示。蛋白大小的估計來自凝膠電泳、測序蛋白、衍生的氨基酸序列或公布的蛋白序列。
根據(jù)Beaucage和Caruthers在Tetrahedron Letts.221859-1862(1981)中首先描述的固相亞磷酸胺三酯方法，采用自動合成儀可化學合成市場上不能得到的寡核苷酸，正如Van Devanter等在Nucleic AcidsRes.126159-6168(1984年)中所述。通過純聚丙烯酰胺凝膠電泳或通過如Pearson和Reanier在J.Chrom.255137-149(1983)中所述的離子交換HPLC可進行寡核苷酸的純化。
采用例如Wallace等在Gene 1621-26(1981)中所述的對雙鏈模板測序的鏈終止方法，在克隆后可證實克隆基因和合成寡核苷酸的序列。
B.分離編碼BCA-GPCR的核苷酸序列的克隆方法一般而言，編碼BCA-GPCR的核酸序列和相關(guān)核酸序列同系物可通過與探針雜交從cDNA和基因組DNA文庫中克隆，或采用帶有寡核苷酸引物的擴增技術(shù)分離。例如，BCA-GPCR序列通常通過與核酸探針雜交從哺乳動物核酸(基因組或cDNA)文庫中分離，所述核酸探針的序列可衍生自SEQ ID NO1、3、5或7。BCA-GPCR的RNA和cDNA可從中分離的合適組織包括如乳腺癌細胞、正常前列腺上皮細胞、胎盤或睪丸。
利用引物的擴增技術(shù)也可以用于從DNA或RNA中擴增和分離BCA-GPCR核酸。編碼下面氨基酸序列的簡并引物也可以用于擴增BCA-GPCR序列SEQ ID NO9-16(參見，例如Dieffenfach和Dveksler，PCR PrimerA Laboratory Manual(1995))。這些引物可以用于例如擴增全長序列或一個到數(shù)百個核苷酸探針，然后用于篩選全長BCA-GPCR的哺乳動物文庫。
也可以抗體作為探針從表達文庫中分離編碼BCA-GPCR的核酸。使用序列SEQ ID NO2、4、6或8可產(chǎn)生這些多克隆或單克隆抗體。
使用BCA-GPCR核酸探針和寡核苷酸，在嚴格雜交條件下，通過篩選文庫可分離與BCA-GPCR基因基本相同的多態(tài)變體、等位基因和種間同系物?；蛘撸ㄟ^采用抗BCA-GPCR的抗血清或純化抗體免疫檢測表達的同系物，所述抗血清或純化抗體也識別和選擇性結(jié)合BCA-GPCR同系物，利用表達文庫來克隆BCA-GPCR多態(tài)變體、等位基因和種間同系物。
為了制備cDNA文庫，應選擇富含BCA-GPCR mRNA的源，例如從大腦，或乳腺癌或肺癌細胞中分離的細胞。然后使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA制成cDNA，連接到重組載體上，并轉(zhuǎn)染入重組宿主中用于繁殖、篩選和克隆。制備和篩選cDNA文庫的方法是眾所周知的(參見，例如Gubler和Hoffman，Gene 25263-269(1983)；Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
對于基因組文庫，將DNA從組織或細胞中抽提出來，通過機械剪切或酶消化產(chǎn)生約12-20kb的片段。然后梯度離心，從不需要的大小片段中分離出所需的片段，并且構(gòu)建在λ噬菌體載體中。這些載體和噬菌體在體外包裝。通過如Benton和Davis在Science 196180-182(1977)中所述的噬菌斑雜交可分析重組噬菌體。如Grunstein等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.723961-3965(1975)中通常描述的進行菌落雜交。
分離BCA-GPCR核酸及其同系物的另一種方法是將合成的寡核苷酸引物的利用和RNA或DNA模板的擴增相結(jié)合(參見，美國專利4,683,195和4,683,202；PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications(Innis等編，1990))。聚合酶鏈式反應(PCR)和連接酶鏈式反應(LCR)的方法可用于直接從mRNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫中擴增BCA-GPCR基因的核酸序列。使用本文提供的序列可設計簡并寡核苷酸來擴增BCA-GPCR同系物。引物中能摻入限制性內(nèi)切酶位點。聚合酶鏈式反應或其他體外擴增方法也可用于例如克隆編碼待表達蛋白的核酸序列，制備核酸探針，用于檢測生理樣品中編碼BCA-GPCR mRNA的存在、核酸測序或其他目的。通過PCR反應擴增的基因可從瓊脂糖凝膠中純化并克隆到適當?shù)妮d體中。
BCA-GPCR的基因表達可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)分析，例如mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增、總RNA或poly A+RNA的分離、RNA印跡、斑點印跡、原位雜交、核糖核酸酶保護、探針DNA微芯片陣列等。在一個實施方案中，高密度的寡核苷酸分析技術(shù)(例如GeneChipTM)用于鑒定本發(fā)明GPCR的同系物和多態(tài)變體。在BCA-GPCR與已知疾病例如癌癥相連的情況下，它們可采用GeneChipTM作為診斷工具以檢測生物樣品中的疾病，參見，例如Gunthand等，AIDSRes.Hum.Retroviruses 14869-876(1998)；Kozal等，Nat.Med.2753-759(1996)；Matson等，Anal.Biochem.224110-106(1995)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.141675-1680(1996)；Gingeras等，Genome Res.8435-448(1998)；Hacia等，Nucleic Acids Res.263865-3866(1998)。
可采用合成的寡核苷酸構(gòu)建重組BCA-GPCR基因，用作探針或用于蛋白表達。該方法的操作采用一系列長度通常為40-120bp的表示基因有義和無義鏈的重疊寡核苷酸進行。然后將這些DNA片段退火、連接和克隆?；蛘撸脭U增技術(shù)和精確引物擴增BCA-GPCR核酸的特異亞序列。然后將特異亞序列連接到表達載體中。
通常將編碼BCA-GPCR的核酸在轉(zhuǎn)化到原核或真核細胞用于復制和/或表達之前先克隆到中間載體上。這些中間載體通常是原核載體，例如質(zhì)?；虼┧筝d體。
根據(jù)標準技術(shù)，可任選制備編碼包含BCA-GPCR或其結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的核酸。例如，如配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域(例如包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域和對應的胞外和胞質(zhì)環(huán)的一種結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、活性位點、亞基締合區(qū)域等的結(jié)構(gòu)域可共價于異源蛋白連接。例如，胞外結(jié)構(gòu)域可連接到異源GPCR跨膜結(jié)構(gòu)域，或異源GPCR胞外結(jié)構(gòu)域可連接到跨膜結(jié)構(gòu)域。其他選擇的異源蛋白包括例如，綠色熒光蛋白、熒光酶或β-gal。
C.原核和真核生物中表達為了獲得高水平表達的克隆基因或核酸，如編碼BCA-GPCR的cDNA，通常將BCA-GPCR序列亞克隆到表達載體中，所述表達載體含有指導轉(zhuǎn)錄的強啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子，以及如果核酸編碼蛋白還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點。合適的細菌啟動子是本領(lǐng)域熟知的，并例如在Sambrook等和Ausubel等中有描述。表達BCA-GPCR的細菌表達系統(tǒng)可利用例如大腸桿菌、芽孢桿菌和沙門氏菌(Palva等，Gene 22229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302543-545(1983))。這些表達系統(tǒng)的試劑盒可以從市場上得到。哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，并且也可以從市場上得到。在一個實施方案中，真核表達載體是腺病毒載體、腺病毒相關(guān)載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
用于指導異源核酸表達的啟動子取決于特定應用。啟動子任選定位在距離異源轉(zhuǎn)錄起始位點與其天然座位中距離轉(zhuǎn)錄起始位點大約相同的位置上。然而，正如本領(lǐng)域已知，這種距離可允許有一些變化而無需喪失啟動子的功能。
除啟動子以外，表達載體通常含有轉(zhuǎn)錄單位或表達盒，所述表達盒在宿主細胞中含有編碼BCA-GPCR核酸的表達所需要的所有其他元件。因此，表達盒通常含有與編碼BCA-GPCR的核酸序列可操作連接的啟動子以及含有轉(zhuǎn)錄物有效聚腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止所需的信號。編碼BCA-GPCR的核酸序列能與可切割的信號肽序列連接，以促進轉(zhuǎn)染細胞中編碼蛋白的分泌。這些信號肽還包括來自組織溶酶原激活劑的信號肽、胰島素和神經(jīng)元生長因子以及綠夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶。表達盒的其他元件可包括增強子，以及如果基因組DNA被用作結(jié)構(gòu)基因，還包括帶有功能拼接供體的內(nèi)含子和受體位點。
除啟動子序列以外，表達盒也應含有結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以提供有效的終止。終止區(qū)可從與啟動子序列相同的基因中獲得，或可從不同的基因中獲得。
用于將遺傳信息輸入細胞中的特定表達載體不是特別關(guān)鍵?？梢岳迷谡婧撕驮思毎斜磉_的任何常規(guī)載體。標準的細菌表達載體包括質(zhì)粒如以pBR322為基礎的質(zhì)粒、pSKF、pET23D，還包括融合表達系統(tǒng)如GST和LacZ。在重組蛋白中也可以加入表位標記，以提供分離常規(guī)方法，如c-myc。
通常將含有來自真核生物病毒的調(diào)節(jié)元件的表達載體用于真核表達載體中，如SV40載體、乳頭狀瘤病毒載體和衍生自EB病毒的載體。真核載體的其他例子包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE和任何其他載體，所述其他載體允許在CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或其他在真核細胞中顯示有效表達的啟動子的指導下表達蛋白。
一些表達系統(tǒng)具有提供基因擴增的標記，如新霉素、胸腺嘧啶核苷激酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶和二氫葉酸還原酶?；蛘?，不參與基因擴增的高產(chǎn)表達系統(tǒng)也是合適的，如在昆蟲細胞中使用桿狀病毒載體，其帶有在多角體蛋白啟動子或其他強桿狀病毒啟動子指導下的編碼BCA-GPCR的序列。
通常包括在表達載體中的元件也包括大腸桿菌中發(fā)揮功能的復制子、編碼抗生素抗性的基因以允許選擇含有重組質(zhì)粒的細菌，和質(zhì)粒非必需區(qū)域中獨特的限制位點允許插入真核序列。特定抗生素抗性基因的選擇并非關(guān)鍵，本領(lǐng)域已知的許多抗性基因任何一個都合適。如果需要，可以任選原核序列，這樣它們就不干擾真核細胞中DNA的復制。
可使用標準轉(zhuǎn)染方法生產(chǎn)細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系，所述細胞系可表達大量的BCA-GPCR，然后采用標準技術(shù)純化蛋白(參見，例如Colley等，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；Guide toProtein Purification，in Methods in Enzymology，Vol.182(Deutscher編，1990年))。根據(jù)標準技術(shù)操作真核和原核細胞的轉(zhuǎn)化(參見，例如Morrison，J.Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss和Curtiss，Methodsin Enzymology 101347-362(Wu等編，1983年))。
任何用于在宿主細胞中導入外源核苷酸序列的熟知方法都可被采用。這些方法包括使用的試劑如Superfect(Qiagen)、脂質(zhì)體、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、原生質(zhì)體融合、電穿孔、微注射、質(zhì)粒載體、病毒載體和任何其他熟知的在宿主細胞中導入克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遺傳物質(zhì)的方法(參見，例如Sambrook等，同上)。所用的特定遺傳工程方法只需要能在表達BCA-GPCR的宿主細胞中成功導入至少一種基因。
在表達載體導入細胞后，在有利于BCA-GPCR表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞，再使用下文所鑒定的標準技術(shù)從培養(yǎng)物中回收BCA-GPCR。
BCA-GPCR的純化天然存在或重組的BCA-GPCR純化后可用于功能分析、結(jié)合分析、診斷分析和其他應用中。天然存在的BCA-GPCR例如從哺乳動物組織，如血液和淋巴組織，或從任何其他來源的BCA-GPCR同系物中純化出來。重組BCA-GPCR從任何適當?shù)募毦蛘婧吮磉_系統(tǒng)例如CHO細胞或昆蟲細胞中純化出來。
通過標準技術(shù)可將BCA-GPCR純化至基本純，這些標準技術(shù)包括但不限于用如硫酸銨這樣的物質(zhì)進行選擇性沉淀、柱層析、免疫純化方法和其他方法(參見，例如Scopes，Protein PurificationPrinciplesand Practice(1982)；美國專利4,673,641；Ausubel等，同上；和Sambrook等，同上)。
當重組BCA-GPCR正被純化時，可使用許多方法。例如，可將具有分子粘著特性的蛋白與BCA-GPCR可逆性融合。利用適當?shù)呐潴w，可將BCA-GPCR選擇性地吸附到純化柱上，從柱中再以相對純的形式分離出來。然后用酶除去融合蛋白。最后使用免疫親和柱可純化BCA-GPCR。
A.來自重組細胞的BCA-GPCR的純化通常在啟動子誘導后，重組蛋白被轉(zhuǎn)化的細菌或真核細胞，如CHO細胞或昆蟲細胞，大量表達，但表達可能是組成型的。用IPTG誘導啟動子是可誘導啟動子系統(tǒng)的一個例子。根據(jù)本領(lǐng)域標準方法可使細胞生長。新鮮或冷凍細胞用于蛋白分離。
細菌中表達的蛋白可形成不溶的團聚體(“包含體”)。有若干方案適用于純化BCA-GPCR包含體。例如，包含體的純化通常包括細菌細胞破裂，例如在50mM Tris/HCl pH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ATP和1mM PMSF的緩沖液中溫育，然后抽提、分離和/或純化包含體。細胞懸浮液可通過French Press采用2-3個通道裂解，用Polytron(Brinkman Instruments)勻漿或在冰上超聲處理。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，采用任一個方法裂解細菌都是顯而易見的(參見，例如Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
如果需要，包含體可被溶解，通常將裂解細胞懸浮液離心，以除去不需要的不溶物質(zhì)。用配伍的緩沖液稀釋或透析后可將形成包含體的蛋白復性。適當?shù)娜軇┌ǖ幌抻陔?從約4M到約8M)、甲醛(至少約80％v/v)和鹽酸胍(從約4M到約8M)。由于蛋白可能不可逆變性，并伴隨出現(xiàn)免疫原性和/或活性缺乏，因此，能溶解團聚體形成的蛋白的一些溶劑，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)和70％甲酸在本方法中是不適用的。雖然鹽酸胍和類似試劑是變性劑，但是這種變性也不是不可逆的，在去除(例如通過透析)或稀釋變性劑后可發(fā)生復性，允許重新形成免疫原性和/或生物活性的蛋白。其他合適的緩沖液是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。使用標準分離技術(shù)，例如采用Ni-NTA瓊脂糖樹脂，能將BCA-GPCR從其他細菌蛋白中分離出來。
或者，從細菌周質(zhì)中純化BCA-GPCR是可能的。細菌裂解后，當把BCA-GPCR排出到細菌的周質(zhì)中時，除了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法以外，通過冷滲透休克可分離細菌周質(zhì)部分。為了從周質(zhì)中分離重組蛋白，細菌細胞離心形成沉淀。在含有20％蔗糖的緩沖液中重懸浮沉淀。為了裂解細胞，細菌離心后將沉淀再懸浮于冰冷的5mMMgSO4并在冰浴中保持約10分鐘。離心細胞懸浮液，傾析上清液并保存。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準分離技術(shù)可從宿主蛋白中分離上清液中存在的重組蛋白。
B.純化BCA-GPCR的標準蛋白分離技術(shù)可溶性分級分離通常作為起始步驟，特別是如果蛋白混合物是復合體時，初始鹽分級分離可從目的重組蛋白中分離出許多不需要的宿主細胞蛋白(或來源于細胞培養(yǎng)基的蛋白)。優(yōu)選鹽是硫酸銨。硫酸銨通過有效減少蛋白混合物中的水量沉淀蛋白。然后根據(jù)它們的溶解度，蛋白沉淀。蛋白越疏水，越有可能在較低的硫酸銨濃度下沉淀。方案通常包括在蛋白溶液中加入飽和硫酸銨，以使硫酸銨濃度介于20-30％之間。該濃度將沉淀大多數(shù)疏水蛋白。丟棄沉淀(除非目的蛋白是疏水的)，再在上清液中加入硫酸銨至目的蛋白沉淀已知的濃度。然后以緩沖液溶解沉淀，如果需要，通過透析或滲濾除去過量的鹽。依賴蛋白溶解度的其他方法如冷乙醇沉淀，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，也可用于分級分離復合蛋白混合物。
大小差別過濾使用超濾方法，通過孔徑大小不同的膜(例如Amicon或Millipore膜)，依據(jù)BCA-GPCR的分子量，可將其從更大和更小的蛋白中分離出來。作為第一步，將蛋白混合物通過一定孔徑大小的膜超濾，此膜的截留分子量小于目的蛋白的分子量。將超濾存留液再次對膜超濾，此膜的截留分子量大于目的蛋白的分子量。重組蛋白將通過膜進入濾出液中。然后如下所述層析分離濾出液。
柱層析BCA-GPCR也可根據(jù)大小、表面靜電荷、疏水性和對異源分子的親和性從其他蛋白中分離。另外，針對蛋白所產(chǎn)生的抗體可以與柱基質(zhì)結(jié)合，然后免疫純化蛋白。所有這些方法都是本領(lǐng)域熟知的。對專業(yè)技術(shù)人員來說，層析技術(shù)可在任何規(guī)模并使用來自許多不同制造商的設備來進行是顯而易見的(例如Pharmacia Biotech)。
BCA-GPCR的免疫檢測除了利用核酸雜交技術(shù)檢測BCA-GPCR基因和基因表達外，技術(shù)人員也可以利用免疫測定檢測BCA-GPCR，例如，鑒定細胞，如癌細胞，特別是乳腺癌細胞，和BCA-GPCR的變體。免疫測定可用于定性或定量分析BCA-GPCR。此實用技術(shù)的綜述可在Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)中找到。
A.針對BCA-GPCR的抗體與BCA-GPCR特異性反應的多克隆和單克隆抗體的生產(chǎn)方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的(參見，例如Coligan，Current Protocolsin Immunology(1991)；Harlow和Lane，同上；Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice(第二版，1986)；以及Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))。這些技術(shù)包括通過從噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫中篩選抗體來制備抗體，以及通過免疫兔或小鼠來制備多克隆和單克隆抗體(參見，例如Huse等，Science 2461275-1281(1989)；Ward等，Nature 341544-546(1989))。這些抗體可用于治療和診斷應用，例如用于乳腺癌的治療和/或檢測中。
許多包含BCA-GPCR的免疫原可用于生產(chǎn)與BCA-GPCR特異性反應的抗體。例如，如本發(fā)明所述分離重組BCA-GPCR或其抗原片段。如上文所述，重組蛋白可在真核或原核細胞中表達和純化。重組蛋白是生產(chǎn)單克隆或多克隆抗體的優(yōu)選免疫原?；蛘?，從本發(fā)明公開的序列衍生并與載體蛋白結(jié)合的合成肽可用作免疫原。天然存在的蛋白也可以純的或不純的形式采用。然后將產(chǎn)物注射到能產(chǎn)生抗體的動物體內(nèi)?？缮蓡慰寺』蚨嗫寺】贵w，隨后用于免疫測定以檢測蛋白。
多克隆抗體的生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。使用標準佐劑如弗氏佐劑和標準免疫方案將蛋白免疫純種品系的小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔子。動物對免疫原制劑的免疫應答通過采集測試血并測定BCA-GPCR的反應性效價來監(jiān)控。當所獲得的針對免疫原的抗體效價適當高時，從動物中收集血液，并制備抗血清。如果需要，可進一步進行抗血清的分級分離以富集與蛋白反應的抗體(參見Harlow和Lane，同上)。
通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)可獲得單克隆抗體。簡而言之，從以所需抗原免疫的動物中產(chǎn)生的脾細胞通常與骨髓瘤細胞的融合而永生化(參見Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519(1976))。永生化的其他方法包括用EB病毒、致癌基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化或其他本領(lǐng)域熟知的方法。為了生產(chǎn)對抗原所需的特異性和親和性的抗體，篩選來自單個永生化細胞的菌落，并且由這些細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量可通過各種技術(shù)包括給脊椎動物宿主的腹膜腔注射來提高?；蛘?，根據(jù)Huse等在Science 2461275-1281(1989)中概括的一般方案，通過從人B細胞中篩選DNA文庫可分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。
收集單克隆抗體和多克隆血清，并在免疫測定中滴定免疫原蛋白，例如采用固定在固相支持物上的免疫原進行的固相免疫測定。通常，選擇效價為104或更高的多克隆抗血清，采用競爭性結(jié)合免疫測定方法，測試它們針對非BCA-GPCR或甚至針對來自其他生物體的相關(guān)蛋白的交叉反應性。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體通常以一定的Kd結(jié)合，Kd至少約0.1mM，更常見至少約1μM，或者至少約0.1μM或更少，和任選0.01μM或更少。
一旦得到BCA-GPCR特異抗體，單個BCA-GPCR就可通過各種免疫測定方法進行檢測。對于一般免疫測定的綜述，也參見Methods inBiologyAntibodies in Cell Biology，volume 37(Asai編1993)；Basicand Clinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991年)。另外，本發(fā)明的免疫測定可用于若干結(jié)構(gòu)的任一結(jié)構(gòu)的檢測。這些在EnzymeImmunoassay(Maggio編，1980)；以及Harlow和Lane，同上中有廣泛綜述。
B.免疫結(jié)合測定利用眾多熟知的免疫結(jié)合測定法中的任一種，可檢測和/或定量BCA-GPCR(參見，例如美國專利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。對于一般免疫測定的綜述可以參見Methods in CellBiologyAntibodies in Cell Biology，第37卷(Asai編，1993年)；Basic andClinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991年)。免疫學結(jié)合測定(或免疫測定)通常利用與選擇的蛋白或抗原特異性結(jié)合的抗體(在此情況下是BCA-GPCR或其抗原亞序列)?？贵w(例如抗-BCA-GPCR)可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員許多已知方法的任一種和如上所述方法生產(chǎn)。
免疫測定也經(jīng)常利用標記介質(zhì)來特異性結(jié)合和標記由抗體和抗原形成的復合體。標記介質(zhì)本身可以是含有抗體/抗原復合體的一個部分。因此，標記介質(zhì)可以是標記的BCA-GPCR或標記的抗-BCA-GPCR抗體?；蛘?，標記介質(zhì)可以是第三部分，如與抗體/BCA-GPCR復合體特異性結(jié)合的第二抗體(第二抗體通常是特異于衍生第一抗體的物種的抗體)。能特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的其他蛋白如蛋白A或蛋白G也可用作標記介質(zhì)。這些蛋白與來自各種物種的免疫球蛋白恒定區(qū)表現(xiàn)出強的非免疫原反應性(參見，例如Kronval等，J.Immunol.1111401-1406(1973)；Akerstrom等，J.Immunol.1352589-2542(1985))。標記介質(zhì)可用可檢測部分如生物素進行修飾，生物素可特異性結(jié)合另一分子如鏈親和素。各種可檢測部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
測定全程中，在試劑各個結(jié)合后，都需要溫育和/或洗滌步驟。溫育步驟的時間可從約5秒到幾小時內(nèi)變化，任選從約5分鐘到約24小時。然而，溫育時間將根據(jù)測定形式、抗原、溶液體積、濃度等發(fā)生變化。測定一般在室溫下進行，盡管它們可在如10℃到40℃的溫度范圍進行。
非競爭測定形式檢測樣品中BCA-GPCR的免疫測定可以是競爭性的也可以是非競爭性的。非競爭免疫測定是直接測定抗原量的測定。在一個優(yōu)選“三明治”的測定中，例如抗-BCA-GPCR抗體可直接與固體底物結(jié)合，并固定在其上。這些固定的抗體捕獲測試樣品中存在的BCA-GPCR。因此，固定的BCA-GPCR被如攜有標記的第二BCA-GPCR抗體的標記介質(zhì)結(jié)合?；蛘?，第二抗體可缺少標記，但它可依次被標記的第三抗體結(jié)合，所述第三抗體特異于衍生第二抗體物種的抗體。第二或第三抗體通常用可檢測部分如生物素修飾，而生物素又與另一分子如鏈親和素特異性結(jié)合從而提供可檢測部分。
競爭測定形式在競爭測定中，通過測定已知的加入(外源)BCA-GPCR與抗-BCA-GPCR抗體的結(jié)合被樣品中存在的未知BCA-GPCR所取代(競爭占用)的量，可間接檢測樣品中存在的BCA-GPCR量。在一個競爭測定中，樣品中加入已知量的BCA-GPCR，然后將樣品與和BCA-GPCR特異性結(jié)合的抗體接觸。與抗體結(jié)合的外源BCA-GPCR量與樣品中存在的BCA-GPCR濃度成反比。在特定的優(yōu)選實施方案中，抗體固定于固相底物上。通過測定BCA-GPCR/抗體復合體中存在的BCA-GPCR量，或者通過測定剩余未復合的蛋白量可以確定與抗體結(jié)合的BCA-GPCR量。通過提供標記BCA-GPCR分子可檢測BCA-GPCR量。
半抗原抑制測定是另一優(yōu)選的競爭測定。在此測定中，將已知BCA-GPCR固定在固相基質(zhì)上。樣品中加入已知量的抗-BCA-GPCR抗體，然后將樣品與固定的BCA-GPCR接觸。與已知固定的BCA-GPCR結(jié)合的抗-BCA-GPCR抗體量與樣品中存在的BCA-GPCR量成反比。通過檢測抗體的固定部分或溶液中剩余的抗體部分可再次檢測固定抗體的量。如果抗體是標記的，可直接檢測，或者通過如上文所述的隨后加入與抗體特異性結(jié)合的標記部分進行間接檢測。
交叉反應性的確定以競爭結(jié)合形式的免疫測定也可用于交叉反應性的確定。例如，可將至少部分由SEQ ID NO2、4、6或8編碼的蛋白固定于固相支持物上。將與固定抗原競爭結(jié)合抗血清的蛋白(例如BCA-GPCR和同系物)加入到測定中。把外加蛋白與固定化蛋白競爭結(jié)合抗血清的能力和由SEQ ID NO2、4、6或8編碼的BCA-GPCR與自身競爭的能力比較。利用標準算法計算上面蛋白的交叉反應性的百分數(shù)。選擇與上面列出的各個外加蛋白交叉反應性小于10％的抗血清并合并。通過用外加假定的蛋白例如遠緣相關(guān)的同系物進行免疫吸附可從合并的抗血清中任選除去交叉反應的抗體。
然后將免疫吸附和合并的抗血清用于如上所述競爭結(jié)合的免疫測定中，從而把認為也許是BCA-GPCR的等位基因或多態(tài)變體的第二蛋白與免疫原蛋白(即SEQ ID NO2、4、6或8的BCA-GPCR)進行比較。為了進行此比較，在寬范圍的濃度下分別測定兩個蛋白，并確定抑制50％的抗血清與固定蛋白結(jié)合所需的各個蛋白量。如果抑制50％的結(jié)合所需的第二蛋白量比抑制50％的結(jié)合所需的由SEQ ID NO2、4、6或8編碼的蛋白量小10倍，那么就說第二蛋白與針對BCA-GPCR免疫原所產(chǎn)生的多克隆抗體特異性結(jié)合。
其他測定形式蛋白質(zhì)印跡(免疫印跡)分析可用于檢測和定量樣品中BCA-GPCR的存在。此技術(shù)一般包括通過凝膠電泳根據(jù)分子量分離樣品蛋白，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到適當?shù)墓滔嘀С治锷?如硝酸纖維素濾膜、尼龍濾膜或衍生的尼龍濾膜)，和把樣品和特異性結(jié)合BCA-GPCR的抗體一起溫育?？?BCA-GPCR抗體在固相支持物上與BCA-GPCR特異性結(jié)合。這些抗體可直接標記，或者可隨后采用與抗-BCA-GPCR抗體特異性結(jié)合的標記抗體(例如，標記的羊抗小鼠抗體)進行檢測。
其他測定形式包括脂質(zhì)體免疫測定(LIA)，其采用設計成結(jié)合特異分子(例如抗體)并釋放膠囊化的試劑或標記的脂質(zhì)體。然后根據(jù)標準技術(shù)檢測釋放的化學成分(參見Monroe等，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41(1986))。
非特異性結(jié)合的減少本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得通常理想的是使免疫測定中的非特異結(jié)合最小化。具體而言，當測定包括固定于固相基質(zhì)上的抗原或抗體時，需要使與基質(zhì)非特異結(jié)合的量最小化。減少這種非特異結(jié)合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。該技術(shù)通常包括用蛋白組合物包被基質(zhì)。具體而言，廣泛使用蛋白組合物，如牛血清白蛋白(BSA)、無脂奶粉和明膠，以奶粉最優(yōu)選。
標記只要不顯著干擾測定中所用的抗體的特異性結(jié)合，測定中所用的特定標記或可檢測基團不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。可檢測基團可以是具有可檢測物理或化學特性的任何物質(zhì)。這些可檢測標記已在免疫測定領(lǐng)域發(fā)展成熟，一般而言，這些方法中有用的大多數(shù)標記都可適用于本發(fā)明。因此，標記是通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電、光或化學方法可檢測的任何組合物。本發(fā)明中有用的標記包括磁珠(例如DYNABEADSTM)、熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、Texas紅、羅丹明等)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其他ELISA中常用的酶)，以及比色標記，如膠體金或有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)。
根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，標記可直接或間接與測定所需的成分偶聯(lián)。如上所示，可使用多種標記，標記選擇依據(jù)所要求的靈敏度、與化合物結(jié)合的容易程度、穩(wěn)定性要求、可用儀器和防護條件。
非放射性標記通常用間接方法附著。配體分子(例如生物素)一般與分子共價結(jié)合。然后配體與另一分子(例如鏈親和素)結(jié)合，此分子或是固有可檢測的，或與信號系統(tǒng)如可檢測酶、熒光化合物或化學發(fā)光化合物共價結(jié)合。配體及其靶可與識別BCA-GPCR的抗體或識別抗-BCA-GPCR的第二抗體以任意適當組合方式使用。
這些分子也可以例如通過與酶或熒光團結(jié)合直接與產(chǎn)生信號的化合物結(jié)合。作為標記的目的酶主要是水解酶，具體是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化酶，尤其是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹酰、傘形酮等。化學發(fā)光化合物包括熒光素和2，3-二氫二氮雜萘酮(dihydrophthalazinediones)，例如發(fā)光氨?？衫玫母鞣N標記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述參見美國專利4,391,904。
檢測標記的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，例如當標記是放射性標記時，檢測的方法包括閃爍計數(shù)器或放射白顯影中的光學膠片。當標記是熒光標記時，可通過用適當波長的光激發(fā)熒光染料并檢測產(chǎn)生的熒光。熒光檢測可通過肉眼、照相膠片方法、電子檢測器如電荷偶聯(lián)裝置(CCD)或光電倍增管等進行。通過給酶提供合適的底物并檢測形成的反應產(chǎn)物可相似地檢測酶標記。最后，通過觀察與標記相關(guān)的顏色可容易地檢測簡單的比色標記。因此，在各種量尺的測定中，結(jié)合金經(jīng)常顯示粉紅色，而不同的結(jié)合珠顯示不同的珠的顏色。
有些測定形式不需要使用標記成分。例如凝集測定可用于檢測靶抗體的存在。在此情況下，抗原包被的顆粒為包含靶抗體的樣品所凝集。以此形式，沒有成分需要標記，靶抗體的存在通過簡單的肉眼觀察進行檢測。
對BCA-GPCR調(diào)節(jié)劑的測定A.對BCA-GPCR活性的測定BCA-GPCR和它們的等位基因和多態(tài)變體是參與信號轉(zhuǎn)導并且與乳腺癌細胞中擴增的區(qū)域相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體。BCA-GPCR多肽的活性可以利用各種體外和體內(nèi)試驗來評估，以確定功能性、化學和物理效應，例如測定配體結(jié)合(例如放射性配體結(jié)合)、第二信使(例如cAMP、cGMP、IP3、DAG、或Ca2+)、離子流通量、磷酸化水平、轉(zhuǎn)錄水平、神經(jīng)遞質(zhì)水平等。另外，這些測定可用于測試BCA-GPCR的抑制劑和激活劑。調(diào)節(jié)劑還可以是BCA-GPCR遺傳上改變的版本。本發(fā)明用于鑒定調(diào)節(jié)劑的篩選測定可用作治療化合物，例如針對BCA-GPCR的抗體和BCA-GPCR活性的拮抗劑。
該測定中的BCA-GPCR選自具有序列SEQ ID NO2、4、6或8的多肽或其保守修飾的變體?；蛘?，該測定的BCA-GPCR將從真核生物中衍生并且包括與SEQ ID NO1-2或7具有氨基酸序列同一性的氨基酸亞序列。通常，氨基酸序列同一性至少是70％，任選至少是85％，任選至少是90-95％?；蛘?，該測定的多肽任選包括BCA-GPCR的結(jié)構(gòu)域，如胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、亞基結(jié)合結(jié)構(gòu)域、活性位點等。BCA-GPCR或其結(jié)構(gòu)域可以與異源蛋白共價連接，產(chǎn)生用于如本發(fā)明所述測定中的嵌合蛋白。
采用如上所述的BCA-GPCR多肽測試BCA-GPCR活性的調(diào)節(jié)劑，BCA-GPCR多肽或是重組或是天然存在的。蛋白可被分離并在細胞、從細胞衍生的膜、組織或動物中表達，所述蛋白或是重組或是天然存在的。例如，可以利用乳腺癌細胞、正常前列腺上皮細胞、胎盤、睪丸組織、轉(zhuǎn)化細胞或膜。利用一種如本文所述的體外或體內(nèi)測定可以測試調(diào)節(jié)。利用嵌合分子，如與異源信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域共價連接的受體胞外結(jié)構(gòu)域、或與受體的跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域共價連接的異源胞外結(jié)構(gòu)域，也可在體外用可溶性或固態(tài)反應檢測信號轉(zhuǎn)導。還可以檢測基因擴增。另外，目的蛋白的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以在體外用于可溶或固態(tài)反應中，從而測定配體結(jié)合。
在溶液、雙層膜、附著于固相、脂單層或小泡中可以測試與BCA-GPCR、結(jié)構(gòu)域或嵌合蛋白的配體結(jié)合。利用例如光譜特性(例如熒光、吸光率、折射率)、流體動力學(例如形態(tài))、色譜或可溶性特性中的變化可測試調(diào)節(jié)劑的結(jié)合情況。
也可以檢測受體-G-蛋白的相互用。例如，可以檢測G蛋白和受體的結(jié)合或該蛋白從受體中的釋放。例如，在沒有GTP時，激活劑將導致形成G蛋白(都是3個亞基)與受體的緊密復合體。這個復合體可以用如上所示的各種方法來檢測。這種試驗可以改變成搜尋抑制劑。沒有GTP時，在受體和G蛋白中加入激活劑形成了緊密的復合體，然后通過觀察受體-G蛋白復合體的解離篩選抑制劑。有GTP時，從其他兩個G蛋白亞基中釋放G蛋白的α亞基作為激活標準。
激活或抑制的G蛋白將依次改變下游效應物如蛋白、酶和通道的特性。典型的例子是可見系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導素對cGMP磷酸二酯酶的激活、刺激性G蛋白對腺苷酸環(huán)化酶的激活、Gq和其他同源G蛋白對磷酸酯酶C的激活，以及Gi和其他G蛋白對不同通道的調(diào)節(jié)。也可以檢測下游的結(jié)果，如通過磷酸酯酶C產(chǎn)生二?；视秃虸P3，和依次檢測由IP3引起的鈣轉(zhuǎn)移。
活化的GPCR受體變成激酶的底物，所述激酶使受體的C末端尾(以及可能的其他位點)磷酸化。所以，激活劑將能促進32P從γ標記的GTP轉(zhuǎn)移到受體，這可以用閃爍計數(shù)器測定。C末端尾的磷酸化將能促進類似抑制蛋白的蛋白結(jié)合，并將干擾G蛋白的結(jié)合。激酶/抑制蛋白途徑在許多GPCR受體的脫敏中起關(guān)鍵作用。對GPCR信號的轉(zhuǎn)導和測試信號轉(zhuǎn)導的方法的綜述參見，例如Methods in Enzymology，第237卷和238卷(1994)和第96卷(1983)；Bourne等，Nature 10349117-27(1991)；Bourne等，Nature 348125-32(1990)；Pitcher等，Annu.Rev.Biochem.67653-92(1998)。
把用潛在BCA-GPCR抑制劑或激活劑處理的樣品或測定與沒有測試化合物的對照樣品比較，以便檢驗調(diào)節(jié)程度。對照樣品(未用激活劑或抑制劑處理)的相對BCA-GPCR活性值設定為100。當BCA-GPCR的活性值相對于對照是約90％，任選50％，任選25-0％時，就達到了BCA-GPCR的抑制。當BCA-GPCR的活性值相對于對照是110％，任選150％、200-500％或1000-2000％時，就達到了BCA-GPCR的激活。
通過確定表達BCA-GPCR細胞或膜的極化(即電位)的變化可以評估離子流通量的變化。確定細胞極化變化的一個方法是用電壓鉗和膜片鉗技術(shù)測定電流變化(從而測量極化的變化)，例如“細胞附著”方式，“內(nèi)翻外”方式和“全細胞”方式(參見，例如Ackerman等，NewEngl.J.Med.3361575-1595(1997))。全細胞電流利用標準方法可方便地確定(參見，例如Hamil等，Pflugers.Archiv.39185(1981))。其他已知的測定包括放射性標記的離子流通量測定和用電壓敏感染料的熒光測定(參見，例如Vestergarrd-Bogind等，J.Membrane Biol.8867-75(1988)；Gonazales和Tsien，Chem.Biol.4269-277(1997)；Daniel等，J.Pharmacol.Meth.，25185-193(1991)；Holevinsky等，J.MembraneBiology 13759-70(1 994))。通常，待測化合物存在的范圍從1pM到100mM。
通過檢驗如上所述的任何參數(shù)可測定測試化合物對多肽功能的影響。任何影響B(tài)CA-GPCR活性的適當生理變化都可用于評估測試化合物對本發(fā)明的多肽的影響。當利用完整細胞或動物確定其功能效果時，人們也可測定各種效應，例如遞質(zhì)釋放，激素釋放，已知和未鑒別遺傳標記(如RNA印跡)的轉(zhuǎn)錄變化，細胞代謝的變化如細胞生長或pH變化，以及胞內(nèi)第二信使如Ca2+、IP3或cAMP的變化。
對G蛋白偶聯(lián)受體的優(yōu)選測定方法包括用離子或電壓敏感染料加載細胞，以便報道受體活性。確定這些受體的測定也可以用其他G蛋白偶聯(lián)受體的激動劑和拮抗劑作為陰性或陽性對照，以便評估測試化合物的活性。在鑒定調(diào)節(jié)性化合物(例如激動劑、拮抗劑)的測定中，利用離子敏感性或膜電壓熒光的指示劑分別監(jiān)控細胞質(zhì)中的離子水平或膜電壓的變化?？捎玫碾x子敏感性指示劑和電壓探針在MolecularProbes 1997年目錄中公開。對于G蛋白偶聯(lián)受體，混棲G蛋白如Gα15和Gα16可用于選擇測定中(Wilkie等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 8810049-10053(1991))。這些混棲G蛋白允許將大范圍的受體與信號轉(zhuǎn)導途徑在異源細胞中偶聯(lián)。
受體激活通常啟動隨后的胞內(nèi)事件如第二信使如IP3的增加，其釋放胞內(nèi)儲藏的鈣離子。對一些G蛋白偶聯(lián)受體的激活刺激了通過磷酸酯酶C介導的磷脂酰肌醇水解形成肌醇三磷酸酯(IP3)(Berridge和Irvine，Nature，312315-21(1984))。然后IP3刺激胞內(nèi)儲藏的鈣離子的釋放。所以，細胞質(zhì)鈣離子水平的變化或第二信使如IP3水平的變化可用于評估G蛋白偶聯(lián)受體的功能。表達這些G蛋白偶聯(lián)受體的細胞可表現(xiàn)出細胞質(zhì)鈣水平的提高，這是胞內(nèi)儲藏和通過離子通道激活共同作用的結(jié)果，在這種情況下，雖然無需在任選補充有螯合劑如EGTA的無鈣緩沖液中進行這些測定，但需要區(qū)分從內(nèi)部儲藏釋放鈣而產(chǎn)生的熒光應答信號。
其他測定可包括確定受體的活性，當受體受激時，通過激活或抑制下游效應物如腺苷酸環(huán)化酶，導致細胞內(nèi)環(huán)核苷酸如cAMP或cGMP水平的變化。環(huán)核苷酸門控的離子通道是存在的，例如棒光受體細胞通道和嗅覺神經(jīng)元通道，這些通道通過結(jié)合cAMP或cGMP受激后可滲透陽離子(參見，例如Altenhofen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，889868-9872(1991)和Dhallan等，Nature.347184-187(1990))。在受體激活導致環(huán)核苷酸水平下降的情況下，測定中激活受體的化合物加入細胞之前，將細胞暴露給與提高胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平的試劑例如毛喉素是優(yōu)選的。對這種類型測定的細胞可以用編碼環(huán)核苷酸門控的離子通道、GPCR磷酸酶的DNA和編碼受體的DNA共轉(zhuǎn)染宿主細胞進行制備，所述受體(例如某些谷氨酸受體、毒蠅堿性乙酰膽堿受體、多巴胺受體、羥色胺酸受體等)激活時引起細胞質(zhì)中環(huán)核苷酸水平變化。
在一個實施方案中，利用免疫測定可測定胞內(nèi)cAMP或cGMP的變化。Offermanns和Simon在J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995)中描述的方法可用于確定cAMP的水平。同樣，F(xiàn)elley-Bosco等在Am.J.Resp.Cell和Mol.Biol.11159-164(1994)中描述的方法可用于確定cGMP的水平。另外，引入本文作為參考的美國專利4,115,538描述了檢測cAMP和/或cGMP的測定試劑盒。
在另一個實施方案中，根據(jù)引入本文作為參考的美國專利5,436,128可以分析磷脂酰肌醇(PI)。簡而言之，該測定包括用3H-肌醇標記細胞48小時或更多。用測試化合物處理標記細胞1小時。裂解處理細胞，并在氯仿-甲醇-水中萃取，然后用離子交換層析分離肌醇磷酸，并且用閃爍計數(shù)器定量。通過計算存在激動劑時的cpm和存在緩沖液對照時的cpm的比例來確定刺激倍數(shù)。同樣，通過計算存在拮抗劑時的cpm和存在緩沖液對照(可以含有或不含有激動劑)時的cpm的比例來確定抑制倍數(shù)。
在另一個實施方案中，可以測定轉(zhuǎn)錄水平來評估測試化合物對信號轉(zhuǎn)導的影響。將含有目的蛋白的宿主細胞與測試化合物接觸足夠的時間以便發(fā)生相互作用，然后檢測基因表達的水平。憑經(jīng)驗確定發(fā)生這些相互作用的時間，如經(jīng)過一個時間過程然后測定作為時間函數(shù)的轉(zhuǎn)錄水平。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當方法可以檢測轉(zhuǎn)錄量。例如，利用RNA印跡可以檢測目的蛋白的mRNA表達，或利用免疫測定鑒定它們的多肽產(chǎn)物?；蛘撸脠蟮阑蚩墒褂没谵D(zhuǎn)錄的測定，如美國專利5,436,128所述，文獻引入本文作為參考。報道基因可以是如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢火蟲熒光素酶、細菌熒光素酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。另外，目的蛋白通過附著于第二報道分子如綠熒光蛋白可用作間接的報道分子(參見，例如Mistili和Spector，Nature Biotechnology 15961-964(1997))。
然后，將轉(zhuǎn)錄量與相同細胞中沒有測試化合物的轉(zhuǎn)錄量比較，或者將它與基本相同缺乏目的蛋白的細胞中的轉(zhuǎn)錄量比較。基本相同的細胞可以從相同細胞中衍生，由此制備了沒有經(jīng)過導入異源DNA而修飾的重組細胞。轉(zhuǎn)錄量中的任何差異指示測試化合物以某種方式已經(jīng)改變了目的蛋白的活性。
B.調(diào)節(jié)劑作為BCA-GPCR調(diào)節(jié)劑，測試化合物可以是任何小的有機或無機化學化合物或生物學實體，例如蛋白、糖、核酸或脂。測試化合物通常是小化學分子和肽。盡管可用的大多數(shù)化合物常常溶解在水或有機(特別是基于DMSO)溶液中，但基本上任何化合物都可用作本發(fā)明測定中潛在的調(diào)節(jié)劑或結(jié)合化合物。通過使測定步驟自動化并給測定方法提供任何方便來源的化合物，設計測定方法對大的化學品文庫進行篩選，通常測定平行進行(例如以自動化測定中微量滴定板上的微滴形式)。人們可意識到有許多化學化合物的供應商，包括Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)等。
在一個優(yōu)選的實施方案中，高通量的篩選方法包括提供含有大量潛在治療化合物(潛在調(diào)節(jié)劑或結(jié)合化合物)的組合化學品或肽文庫。然后如本發(fā)明所述，在一個或多個測定中，篩選這些“組合化學品文庫”或“配體文庫”，以便對展示所需特征活性的那些文庫成員(特別是化學物種或亞類)進行鑒定。經(jīng)鑒定的化合物可充當常規(guī)的“引導化合物”或自身可用作潛在或真正的治療劑。
組合化學品文庫是各種各樣的化學化合物的集合，所述化合物由化學合成或生物合成通過組合許多化學“構(gòu)件”如試劑產(chǎn)生。例如，多肽文庫的線性組合化學品文庫是通過對給定化合物長度(即多肽化合物中氨基酸的數(shù)目)以各種可能的方式組合一系列化學構(gòu)件(氨基酸)而形成的。通過化學構(gòu)件的如此組合混合可合成數(shù)百萬的化合物。
組合化學品文庫的制備和篩選是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些組合化學品文庫包括但不限于肽文庫(參見，例如美國專利5,010,175，F(xiàn)urka，Int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)和Houghton等，Nature35484-88(1991))。也可使用產(chǎn)生化學多樣性文庫的其他化學物質(zhì)。這些化學物質(zhì)包括但不限于類肽(例如PCT公開號WO 91/19735)、編碼肽(例如PCT公開號WO 93/20242)、無規(guī)則的生物寡聚體(例如PCT公開號WO 92/00091)、苯二氮平(benzodiazepines)(例如美國專利號5,288,514)、如海因、苯二氮平(benzodiazepines)和二肽的多變聚體(diversomers)(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A 906909-6913(1993))、聯(lián)乙烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))、帶有葡萄糖支架的非肽的肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))、小化合物文庫的類似有機合成物(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))、寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science 2611303(1993))，和/或肽基磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))、核酸文庫(參見Ausubel、Berger和Sambrook，全部同上)、肽核酸文庫(參見，例如美國專利號5,539,083)、抗體文庫(參見，例如Vaughn等，Nature Biotechnology14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文庫(參見，例如Liang等，Science 2741520-1522(1996)和美國專利號5,593,853)、有機小分子文庫(參見，例如苯二氮平(benzodiazepines)，Baum C和EN，1月18日，第33頁(1993)；類異戊二烯，美國專利號5,569,588；噻唑烷酮(thiazolidinones)和間噻唑烷酮(metathiazanones)，美國專利號5,549,974；吡咯烷，美國專利號5,525,735和5,519,134；嗎啉化合物，美國專利號5,506,337；苯二氮平(benzodiazepines)，美國專利號5,288,514等)。
制備組合文庫的設備可從市場上得到(參見，例如357MPS、390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。另外，許多組合文庫本身也可從市場得到(參見，例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD等)。
C.固態(tài)和溶性高通量測定在一個實施方案中，本發(fā)明提供了溶性測定，利用如N末端或C末端結(jié)構(gòu)域的分子，所述分子是單獨的或與異源蛋白共價連接產(chǎn)生的嵌合分子。在另一實施方案中，本發(fā)明提供以高通量形式基于固相的體外測定，其中結(jié)構(gòu)域、嵌合分子、BCA-GPCR，或表達BCA-GPCR的細胞或組織附著到固相基質(zhì)上。
在本發(fā)明的高通量測定中，一天篩選多達數(shù)千個不同的調(diào)節(jié)劑是可能的。具體而言，各個微量滴定板的孔都可用于針對選定的潛在調(diào)節(jié)劑進行單獨測定，或者如果需要觀察濃度或溫育時間的作用，那么每5-10個孔可測試一個調(diào)節(jié)劑。因此，一個標準微量滴定板可分析約100個(即96個)調(diào)節(jié)劑。如果使用1536個孔的平板，那么一個平板可容易地測定約100至約1500個不同的化合物。每天測定若干個不同的平板是可能的，利用本發(fā)明的綜合系統(tǒng)，可對多達6000-20000個不同的化合物進行測定篩選。最近，已開發(fā)出試劑操作的顯微流體方法。
通過共價或非共價鍵例如通過標記，可將目的分子與固態(tài)成分直接或間接結(jié)合。標記可以是各種成分的任一種。一般而言，結(jié)合標記的分子(標記結(jié)合物)固定于固相支持物上，目的標記分子(例如目的信號轉(zhuǎn)導分子)通過標記和標記結(jié)合物的相互作用而附著于固相支持物上。
根據(jù)文獻中清楚描述的已知分子的相互作用，可使用許多標記和標記結(jié)合物。例如，當標記具有天然結(jié)合物時，例如生物素、蛋白A或蛋白G，其可與適當標記結(jié)合物(抗生物素蛋白、鏈親和素、中性抗生物素蛋白、免疫球蛋白的Fc區(qū)域等)結(jié)合使用。針對帶有如生物素的天然結(jié)合物的分子的抗體和適合的標記結(jié)合物也是廣泛得到的(參見SIGMA Immunochemicals 1998目錄，SIGMA，St.Louis MO)。
任意半抗原性或抗原性化合物相似地可與適當抗體結(jié)合使用，以形成標記/標記結(jié)合物對。成千上萬的特異抗體都可從市場上得到，并且其他許多抗體在文獻中都有描述。例如，在一個共同的構(gòu)型中，標記是第一抗體，標記結(jié)合物是識別第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原相互作用，受體-配體相互作用也適于作為標記和標記-結(jié)合物對。例如，細胞膜受體的激動劑和拮抗劑(例如細胞受體-配體的相互作用，如鐵傳遞蛋白、c-試劑盒、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘著蛋白家族、整合蛋白家族、選擇蛋白家族等；參見，例如Pigott和Power，The AdhesionMolecule Facts Book I(1993)。同樣，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如阿片劑、類固醇等)、胞內(nèi)受體(例如介導各種小配體的作用，包括類固醇、甲狀腺激素、視黃素和維生素D；肽)、藥物、凝集素、蔗糖、核酸(線性和環(huán)多聚體構(gòu)型)、寡糖、蛋白、磷脂和抗體都可以與各種細胞受體相互作用。
如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙酰亞胺、聚亞芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亞胺和聚乙酸的合成多聚體也可形成適當?shù)臉擞浕驑擞浗Y(jié)合物。許多其他的標記/標記結(jié)合物對在本發(fā)明所述的測定系統(tǒng)中也是有用的，正如專業(yè)技術(shù)人員在參閱本發(fā)明內(nèi)容后將是清楚的。
如肽、聚醚等的常見接頭也可用作標記，包括如介于約5-200個氨基酸的聚甘氨酸序列的多肽序列。這些活接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，聚乙二醇接頭可從Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama得到。這些接頭任選具有酰胺鍵、硫氫鍵或雜官能團鍵。
利用目前任意可得的各種方法，將標記結(jié)合物固定于固相基質(zhì)上。固相基質(zhì)通常通過將全部或部分基質(zhì)暴露給化學試劑而被衍生或功能化，所述化學試劑是將化學基團固定于與部分標記結(jié)合物反應的表面上。例如，適于附著較長鏈部分的基團包括胺、羥基、硫醇和羧基基團。氨烷基硅烷和羥烷基硅烷可用于使各種表面功能化，如玻璃表面。構(gòu)建這些固相生物多聚體陣列在文獻中已有清楚描述，參見，例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102259-274(1987)(描述了在針狀物上固相成分的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron 4460316040(1988)(描述了在纖維素圓形物上各種肽序列的合成)；Fodor等，Science，251767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)718-719(1993)；和Kozal等，Nature Medicine 2(7)753759(1996)(全部描述了固定于固相基質(zhì)的生物多聚體陣列)。將標記結(jié)合物固定于底物的非化學途徑包括其他常用方法，如熱、紫外輻射交聯(lián)等。
D.基于計算機分析對調(diào)節(jié)BCA-GPCR活性的化合物的另一測定包括計算機輔助藥物設計，其中根據(jù)由氨基酸序列編碼的結(jié)構(gòu)信息，計算機系統(tǒng)用于生成BCA-GPCR的三維結(jié)構(gòu)。輸入的氨基酸序列與計算機程序中預先設立的算法直接和主動地相互作用，產(chǎn)生蛋白的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)模型。然后檢驗蛋白結(jié)構(gòu)的模型以便鑒定具有結(jié)合能力的結(jié)構(gòu)區(qū)。
將這些區(qū)域再用于鑒定與蛋白結(jié)合的配體。
將至少10個氨基酸殘基的蛋白氨基酸序列或編碼BCA-GPCR的對應核酸序列輸入計算機系統(tǒng)，產(chǎn)生蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。編碼多肽的核苷酸序列或其氨基酸序列選自SEQ ID NO1-8及其保守修飾版本。氨基酸序列表示蛋白的一級序列或亞序列，其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)信息。至少10個殘基的氨基酸序列(或編碼10個氨基酸的核苷酸序列)通過計算機鍵盤和計算機可讀介質(zhì)輸入到計算機系統(tǒng)中，所述計算機可讀介質(zhì)包括但不限于電子存儲介質(zhì)(例如磁盤、磁帶、膠卷和芯片)、光介質(zhì)(例如CDROM)、通過互聯(lián)網(wǎng)和RAM傳播的信息。然后通過氨基酸序列和計算機系統(tǒng)的相互作用，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的軟件，生成蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。
氨基酸序列表示編碼信息的一級結(jié)構(gòu)，所述信息對形成目的蛋白的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)是必須的。軟件能閱讀由一級序列編碼的某些參數(shù)以生成結(jié)構(gòu)模型。這些參數(shù)稱為“能量術(shù)語”，其主要包括靜電電位、疏水性電位、溶劑可達的表面和氫鍵。二級能量術(shù)語包括范德華電位。生物分子以累積方式形成使能量術(shù)語最小化的結(jié)構(gòu)。所以計算機程序利用由一級結(jié)構(gòu)或氨基酸序列編碼的這些術(shù)語來產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)模型。
然后，在二級結(jié)構(gòu)能量術(shù)語基礎上形成由二級結(jié)構(gòu)編碼的蛋白的三級結(jié)構(gòu)。此時用戶可以輸入其他變量，如蛋白是否是膜結(jié)合的或可溶性的、其在體內(nèi)和細胞內(nèi)的定位，如細胞質(zhì)、表面或核中。這些變量和二級結(jié)構(gòu)的能量術(shù)語一起用于形成三級結(jié)構(gòu)模型。在制作三級結(jié)構(gòu)模型中，計算機程序匹配同樣的二級結(jié)構(gòu)疏水表面和同樣的二級結(jié)構(gòu)親水表面。
一旦結(jié)構(gòu)已生成，由計算機系統(tǒng)來鑒定潛在的調(diào)節(jié)劑結(jié)合區(qū)。如上所述，通過輸入氨基酸或核苷酸序列或化合物的化學式，可生成潛在調(diào)節(jié)劑的三維結(jié)構(gòu)。再將潛在調(diào)節(jié)劑的三維結(jié)構(gòu)與BCA-GPCR的三維結(jié)構(gòu)比較，以鑒定結(jié)合BCA-GPCR的配體。采用能量術(shù)語確定蛋白和化合物之間的結(jié)合親和性，從而確定哪些化合物具有提高的與蛋白結(jié)合的可能性。
計算機系統(tǒng)也用于篩選BCA-GPCR基因的突變、多肽變體、等位基因和種間同系物。這些突變可與疾狀況態(tài)或遺傳特征相關(guān)。如上所述，GeneChipTM和相關(guān)技術(shù)也可用于篩選突變、多態(tài)變體、等位基因和種間同系物。一旦變體得到鑒定，診斷測定就可用于鑒定具有這些突變基因的患者。鑒定突變的BCA-GPCR基因包括分別接受選自SEQ ID NO1-8及其保守修飾版本、編碼BCA-GPCR的第一核酸或氨基酸序列輸入。如上所述，將序列輸入到計算機系統(tǒng)。再將第一核酸或氨基酸序列同與第一序列基本相同的第二核酸或氨基酸序列比較。以上述方式將第二序列輸入到計算機系統(tǒng)中。一旦將第一和第二序列比較后，就可鑒定序列間核苷酸或氨基酸的差異。這些序列可表示BCA-GPCR基因中等位基因差異以及與疾狀況態(tài)和遺傳特性相關(guān)的突變。
試劑盒BCA-GPCR及其同系物是鑒定細胞如癌細胞、法醫(yī)和親子鑒定，診斷如癌癥的疾病，例如乳腺癌，以及測定信號轉(zhuǎn)導的有用工具。與BCA-GPCR核酸，如BCA-GPCR探針和引物，特異性雜交的BCA-GPCR特異試劑以及與BCA-GPCR蛋白如BCA-GPCR抗體特異性結(jié)合的BCA-GPCR特異試劑可用于測定信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)。
用于檢測樣品中BCA-GPCR DNA和RNA存在的核酸測定方法包括許多本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的技術(shù)，如Southern分析、Northern分析、斑點印跡、核糖核酸酶保護、S1分析、如PCR和LCR的擴增技術(shù)和原位雜交。在原位雜交中，例如將靶核酸從其細胞環(huán)境中釋放出來，以用于細胞內(nèi)雜交，而保存細胞形態(tài)用于隨后的說明和分析。下列文獻提供了原位雜交的技術(shù)綜述Singer等，Biotechniques 4230-250(1986)；Haase等，Methods in Virology，第VII卷，第189-226頁(1984)；和Nucleic Acid HybridizationA Practical Approach(Hames等編，1987)。另外，使用上述的各種免疫測定技術(shù)可檢測BCA-GPCR。通常將測試樣品與陽性對照(例如表達重組BCA-GPCR的樣品)和陰性對照比較。
本發(fā)明還提供了篩選BCA-GPCR或核酸的調(diào)節(jié)劑的試劑盒。這些試劑盒可從容易得到的材料和試劑中制備。例如，這些試劑盒可包含下列任何一個或多個材料BCA-GPCR核酸或蛋白、反應管和測試BCA-GPCR活性的說明書。試劑盒任選含有生物活性的BCA-GPCR。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)試劑盒的目的用途和用戶的特定要求，可制備各種試劑盒和成分。
給藥和藥物組合物BCA-GPCR調(diào)節(jié)劑可直接給哺乳動物受試對象施用，用于調(diào)節(jié)體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，例如用于癌癥如乳腺癌的治療。給藥可通過任意途徑實現(xiàn)，所述途徑正常用于將調(diào)節(jié)劑化合物導入與待治療組織的最終接觸。BCA-GPCR調(diào)節(jié)劑以任何適當方式施用，任選與可藥用載體一起施用。施用這些調(diào)節(jié)劑的合適方法是可用的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，雖然有一個以上途徑可用于施用特定組合物，但特定途徑經(jīng)常能比其他途徑提供更直接和更有效的反應。
由即將施用的特定組合物以及施用組合物所用的特定方法可部分確定可藥用載體。因此有許許多多各種各樣的本發(fā)明藥物組合物的適合的配方(參見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985))。
BCA-GPCR調(diào)節(jié)劑單獨或與其他適當成分組合可制成通過吸入給藥的汽霧劑(即它們可被“汽霧化”)。汽霧劑能放置于可加壓的推進劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷和氮等。
適于給藥的制劑包括水溶液和非水溶液、等滲無菌溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖液、細菌抑制劑和讓制劑等滲的溶質(zhì)，和可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的非水無菌懸浮液。在本發(fā)明的實踐中，例如通過口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)、鞘內(nèi)可施用組合物。組合物任選口服或鼻內(nèi)施用。化合物制劑可以單劑量或多劑量的密封容器呈現(xiàn)，如安瓿和小瓶。溶液和懸浮液可從前述種類的無菌粉末、顆粒和片劑中制備。調(diào)節(jié)劑也可作為部分制備的食物或藥物被施用。
在本發(fā)明情況下，給患者施用的劑量應足以在一段時間中給受試對象產(chǎn)生有益的應答。這些劑量可以預防性地施用或給已患病的個體施用。給患者施用組合物的量應足以在患者中引發(fā)有效的保護或治療應答。足夠?qū)崿F(xiàn)此目的的量定義為“治療有效量”。劑量將由所使用的特定BCA-GPCR調(diào)節(jié)劑(例如GPCR拮抗劑和抗GPCR抗體)的功效和受試對象的狀況以及體重或待治療區(qū)的表面積來確定。劑量的大小也將由伴隨特定受試對象中特定化合物或載體的施用而帶來的狀況、性質(zhì)和任何副作用程度來確定。
在確定待施用調(diào)節(jié)劑的有效量時，醫(yī)生可評估調(diào)節(jié)劑的血漿循環(huán)水平、調(diào)節(jié)劑的毒性和抗調(diào)節(jié)劑抗體的產(chǎn)生。一般而言，調(diào)節(jié)劑劑量對通常的受試對象是約1ng/kg-10mg/kg。
對于給藥，如同適合受試對象的體重和整體健康程度一樣，本發(fā)明調(diào)節(jié)劑的施用可由調(diào)節(jié)劑的LD-50和各種濃度下抑制劑的副作用所確定的速度進行。給藥劑量可以一次或分次完成。
本說明書引用的所有出版物和專利申請都引入本文作為參考，如同各個出版物或?qū)＠暾埵翘禺惡蛦蝹€地引作參考一樣。
盡管為了清楚理解目的，上述發(fā)明通過說明和例子已在一定程度上進行了詳細描述，但對本領(lǐng)域普通專業(yè)技術(shù)人員來說，按照本發(fā)明的教導，在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求書的實質(zhì)和范圍內(nèi)，可以很明顯做出某些變化和修飾。
這些序列可利用下列PCR引物和標準的PCR條件從cDNA或基因組DNA中進行擴增ATGTTGGAACGTCGCCATC(SEQ ID NO9)和TCATCCACAGAGCCTCCAGAT(SEQ ID NO10)(BCA-GPCR-1)ATGGGAAAGGACAATCCAGTF(SEQ ID NO11)和CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA(SEQ ID NO12)；(BCA-GPCR-2)ATGGAAATAGCCAATGTGAGTIC(SEQ ID NO13)和TAAATITGCGCCAGCTTGCCTG(SEQ ID NO14)；(BCA-GPCR-3)和ATGGTGAGACATACCAATGAGAG(SEQ ID NO15)和CATAAAATATITACTCCCAGAGCC(SEQ ID NO16)(BCA-GPCR-4)。實施例II在乳腺癌細胞和腫瘤中BCA-GPCR-3的mRNA表達和基因擴增根據(jù)標準方法學測定乳腺癌細胞系和腫瘤中BCA-GPCR-3的基因擴增(參見圖1)。
根據(jù)標準方法學，利用RT-PCR測定在乳腺癌細胞系中表達的BCA-GPCR-3mRNA。在來自擴增和非擴增腫瘤的癌細胞系中，BCA-GPCR-3的mRNA水平即致癌基因標記提高了。
序列表BCA-GPCR-1核酸序列SEQ ID NO1AGTGCCAGAAAATGCCGCAACATGAAAAGTGACAACCATAGCTCTTAGGGGACTCCCCTAAAGCCTTCATCCTTCTGGGTGTGTCTGACAGGCCGTGGCTGGAACTCCCTCTCTTTGTGGTCCTCCTGCTGTCCTATGTGCTGGCCATGTTGGGGAACGTCGCCATCATCCTGGCATCCCGGGTGGATCCTCAACTCCACAGCCCCATGTACATCTTCCTCAGTCACCTGTCCTTCCTGGACCTCTGCTACACCACCACGACAGTCCCTCAGATGCTGGTCAACATGGGCAGTTCCCAGAAGACCATCAGCTATGGAGGCTGCACTGTGCAATATGCAGTCTTCCACTGGCTGGGATGCACGGAGTGCATCGTCCTGGCCGCCATGGCCCTGGACCGCTACGTGGCCAGCTGCAAGCCCCTGCACTATGCCGTTCTCATGCACCGTGCTCTCTGTCAGCAGCTCGTGGCTCTGGCCTGGCTCAGTGGCTTCGGCAACTCCTTCGTGCAGGTGGTCCTGACGGTGCAATTGCCATTCTGCGGGCGGCAGGTGCTGAACAACTTTTTCTGTGAGGTGCCGGCCGTGATCAAGCTGTCGTGTGCTGACACCGCTATGAATGACACCATACTGGCTGTGCTGGTGGCCTTCTTCGTGTTGGTGCCCCTGGCTCTCATCCTTCTCTCCTATGGCTTTATTGCCCGGGCAGTGCTCAGGATCCAGTCCTCCAAGGGACGACACAAGGCCTTTGGGACGTGTTCCTCCCACCTGATGATCGTCTCCCTCTTCTACCTACCTGCGATTTACATGTATCTGCAGCCCCCTTCCAGCTACTCCCAAGAGCAGGGCAAATTTATTTCTCTCTTCTATTCCATAATCACCCCCACTCTCAATCCCTTCACCTACACCCTGAGAAATAAAGATATGAAGGGGGCTCTGAGGAGACTTCTGGCCAGGATCTGGAGGCTCTGTGGATGATGAGGACATGAGATGTAGCATCTCCATCAATTAAAGAACACAGCACAAGTCTATTGTGCACBCA-GPCR-1氨基酸序列SEQ ID NO2(LLGDSPKAFILLGVSDRPWLELPLFVVLLLSYVLA)MLGNVAIILASRVDPQLHSPMYIFLSHLSFLDLCYTTTTVPQMLVNMGSSQKTISYGGCTVQYAVFHWLGCTECIVLAAMALDRYVASCKPLHYAVLMHRALCQQLVALAWLSGFGNSFVQVVLTVQLPFCGRQVLNNFFCEVPAVIKLSCADTAMNDTILAVLVAFFVLVPLALILLSYGFIARAVLRIQSSKGRHKAFGTCSSHLMIVSLFYLPAIYMYLQPPSSYSQEQGKFISLFYSIITPTLNPFTYTLRNKDMKGALRRLLARIWRLCGBCA-GPCR-2核酸序列SEQ ID NO3GGCAAATGGCTCTCTTAACTTCACAGACCTGTAAATGGAAATTGGAGAGTGCCAGATCATCTGCATGTGCCCCCTTATCTAATTCTTTGGTTGTTTCTCTGTAATAGCTGGTGGATTATGGGAAAGGACAATGCCAGTTACCTACAGGCATTCATCCTGGTGGGCTCTTCTGATCGGCCTGGACTGGAGAAAATTCTCTTTGCTGTTATCTTGATCTTCTGCATCCTGACCCTGGTGGGCAACACTGCCATCATCCTCTTGCTGGTCATGGATGTCAGGCTCCACACACCCATGTACTTCTTTCTTGGGAATCTGTCTTTCTTAGATCTCTGCTTTACAGCAAGCATTGCCCCTCAGCTGCTGTGGAACCTGGGGGGTCCAGAGAAGACCATCACCTACCACGGCTGTGTGGCCCAACTCTACATCTACATGATGCTGGGCTCCACCGAGTGCGTCCTCCTGGTTGTCATGTCCCATGACCGCTATGTGGCCGTCTGCCGGTCCCTGCACTACATGGCAGTCATGCGCCCACATCTCTGCCTGCAGCTGGTGACTGTGGCCTGGTGCTGTGGCTTCCTAAACTCCTTCATCATGTGTCCTCAGACGATGCAGCTCTCCCGGTGTGGACGTCGCAGGGTGGACCACTTCCTGTGTGAGATGCCTGCTCTTATTGCCATGTCTTGTGAGGAAACCATGCTGGTAGAAGCGATTCACCTTTGCCCTGGGGGTGGCTCTCCTCCTGGTGCCGCTCTCCCTCATCCTCATCTCTATGGCGTGATTGCAGCCGCGGTGCTGAGGATGAAGTCAGCAGCAGGGCGAAAGAAAGCCTTCCACACCTGCTCTTCTCACCTCACAGTGGTCTCTCTCTTCTACGGAACCATCATCTACGTGTACCTGAAGCCGGCCAACAGCTACTCCCAAGATCAGGGGAAGTTCCTGACTCTCTTCTACACCATCGTCATTCCCAGCATCAACCCCCTCATCTACACTTTGAGGAACAAGGATGTGAAGGGGACCATGAAGAAACTTCTGGGGTGGGAGAAAGGGGCTGGGGAGCCTCAACGAGGGGAACACTCTAGTAATGTAGACAGTTTGCTGGAGTTACTCTCTTAGATGTGTCTGTGGCCATGTGGAGAACTAATATTCAAGGAGTAGAGTGAACGCGGGTGGGAAAATGCTTTCGAGTTTGACCCCGTCCTCTGCCCTCTGGATGTGAAGTGGTTTCCTTCTGTTTGAAGTTGCCTGCTTCAGGATATCTCTGCTGTATCTTGCACTTTCCTTGTCTTTTTGATTTATCCACAACTGCTGGGGACTTACAAAACTAATTCAATCACCCAAAGGCACTGGGCAGTCTGCAGATTATGTCATGGATGTCAAATAAAAATTGAGACAACATGaaaaaaaaaaaaaaBCA-GPCR-2氨基酸序列SEQ ID NO4MGKDNASYLQAFILVGSSDRPGLEKILFAVILIFCILTLVGNTAIILLLVMDVRLHTPMYFFLGNLSFLDLCFTASIAPQLLWNLGGPEKTITYHGCVAQLYIYMMLGSTECVLLVVMSHDRYVAVCRSLHYMAVMRPHLCLQLVTVAWCCGFLNSFIMCPQTMQLSRCGRRRVDHFLCEMPALIAMSCEETMLVEAIHLCPGGGSPPGAALPHPHLYGVIAAAVLRMKSAAGRKKAFHTCSSHLTVVSLFYGTIIYVYLKPANSYSQDQGKFLTLFYTIVIPSINPLIYTLRNKDVKGTMKKLLGWEKGAGEPQRGEHSSNVDSLLELLSBCA-GPCR-3核酸序列SEQ ID NO5GATTGTGTCTCTAAAAAAGAATAACATAAAATGAACTAAAATACACTTTTAATGTTTGCTAACTGATGTAATTGCTTCATGTCTCATGCCCTGTATGCCCTGTGCTCTTCCCACAGGTGGCCTTTTGCCCCACCCCCAGCATACAATGATGGAAATAGCCAATGTGAGTTCTCCAGAAGTCTTTGTCCTCCTGGGCTTCTCCGCACGACCCTCACTAGAAACTGTCCTCTTCATAGTTGTCTTGAGTTTTTACATGGTATCGATCTTGGGCAATGGCATCATCATTCTGGTCTCCCATACAGATGTGCACCTCCACACACCTATGTACTTCTTTCTTGCCAACCTCTCCTTCCTGGACATGAGCTTCACCACGAGCATTGTCCCACAGCTCCTGGCTAACCTCTGGGGACCACAGAAAACCATAAGCTATGGAGGGTGTGTGGTCCAGTTCTATATCTCCCATTGGCTGGGGGCAACCGAGTGTGTCCTGCTGGCCACCATGTCCTATGACCGCTACGCTGCCATCTGCAGGCCACTCCATTACACTGTCATTATGCATCCACAGCTTTGCCTTGGGCTAGCTTTGGCCTCCTGGCTGGGGGGTCTGACCACCAGCATGGTGGGCTCCACGCTCACCATGCTCCTACCGCTGTGTGGGAACAATTGCATCGACCACTTCTTTTGCGAGATGCCCCTCATTATGCAACTGGCTTGTGTGGATACCAGCCTCAATGAGATGGAGATGTACCTGGCCAGCTTTGTCTTTGTTGTCCTGCCTCTGGGGCTCATCCTGGTCTCTTACGGCCACATTGCCCGGGCCGTGTTGAAGATCAGGTCAGCAGAAGGGCGGAGAAAGGCATTCAACACCTGTTCTTCCCACGTGGCTGTGGTGTCTCTGTTTTACGGGAGCATCATCTTCATGTATCTCCAGCCAGCCAAGAGCACCTCCCATGAGCAGGGCAAGTTCATAGCTCTGTTCTACACCGTAGTCACTCCTGCGTTGAACCCACTTATTTACACCCTGAGGAACACGGAGGTGAAGAGCGCCCTCCGGCACATGGTATTAGAGAACTGCTGTGGCTCTGCAGGCAAGCTGGCGCAAATTTAGAGACTCCAGTGCCTTCTGAGAAGGAAGATCAAGTTTACATCGAGCAAAGTGACCTTGGAAGACAGGGCACTTGGGATGTCGTTTTTCTTCTAATATTGTTTGAGCTCAAGGTAGATGGAAATCTGAAAGGAGTGTGCTCATGCCATTTCCAGACCAAGAAAACACATTTATTATTTGCTAATTATCATAGTTTTGTTCAATTGCGTTGTTGGTTTTTGCTATATATACACATGTTGACTGTCABCA-GPCR-3氨基酸序列SEQ ID NO6MPCMPCALPTGGLLPHPQHTMMEIANVSSPEVFVLLGFSARPSLETVLFIVVLSFYMVSILGNGIIILVSHTDVHLHTPMYFFLANLSFLDMSFTTSIVPQLLANLWGPQKTISYGGCVVQFYISHWLGATECVLLATMSYDRYAAICRPLHYTVIMHPQLCLGLALASWLGGLTTSMVGSTLTMLLPLCGNNCIDHFFCEMPLIMQLACVDTSLNEMEMYLASFVFVVLPLGLILVSYGHIARAVLKIRSAEGRRKAFNTCSSHVAVVSLFYGSIIFMYLQPAKSTSHEQGKFIALFYTVVTPALNPLIYTLRNTEVKSALRHMVLENCCGSAGKLAQIBCA-GPCR-4核酸序列SEQ ID NO7ATTGTCACTCATTTAACCCTATGTGATGTGTTATCTTTCTCAGCTATGCCTCAGCCTTGGGGAACACACTTTACATATGGGGATGGTGAGACATACCAATGAGAGCAACCTAGCAGGTTTCATCCTTTTAGGGTTTTCTGATTATGCTCAGTTACAGAAGGTTCTATTTGTGCTCATATTGATTCTGTATTTACTAACTATTTTGGGGAATACCACCATCATTCTGGTTTCTCGTCTGGAACCCAAGCTTCATATGCCGATGTATTTCTTCCTTTCTCATCTCTCCTTCCTGTACCGCTGCTTCACCAGCAGTGTTATTCCCCAGCTCCTGGTAAACCTGTGGGAACCCATGAAAACTATCGCCTATGGTGGCTGTTTGGTTCACCTTTACAACTCCCATGCCCTGGGATCCACTGAGTGCGTCCTCCCGGCTCTGATGTCCTGTGACCGCTATGTGGCTGTCTGCCGTCCTCTCCATTACACTGTCTTAATGCATATCCATCTCTGCATGGCCTTGGCATCTATGGCATGGCTCAGTGGAATAGCCACCACCCTGGTACAGTCCACCCTCACCCTGCAGCTGCCCTTCTGTGGGCATCGCCAAGTGGATCATTTCATCTGCGAGGTCCCTGTGCTCATCAAGCTGGCTTGTGTGGGCACCACGTTTAACGAGGCTGAGCTTTTTGTGGCTAGTATCCTTTTCCTTATAGTGCCTGTCTCATTCATCCTGGTCTCCTCTGGCTACATTGCCCACGCAGTGTTGAGGATTAAGTCAGCTACCGGGAGACAGAAAGCATTCGGGACCTGCTTCTCCCACCTGACAGTGGTCACCATCTTTTATGGAACCATCATCTTCATGTATCTGCAGCCAGCCAAGTAGTAGATCCAGGGACCAGGGCAAGTTTGTTTCTCTCTTCTACACTGTGGTACCCGCATGCTTAACCCTCTTATTTATACCTTGAGGATCAAGGAGGTGAAAGGGGCATTAAAGAAAGTTCTAGCAAAGGCTCTGGGAGTAAATATTTTATGATTATTAAAAAAAAATTTAAGTGACACTGTGATGAABCA-GPCR-4氨基酸序列SEQ ID NO8MCYLSQLCLSLGEHTLHMGMVRHTNESNLAGFILLGFSDYAQLQKVLFVLILILYLLTILGNTTIILVSRLEPKLHMPMYFFLSHLSFLYRCFTSSVIPQLLVNLWEPMKTIAYGGCLVHLYNSHALGSTECVLPALMSCDRYVAVCRPLHYTVLMHIHLCMALASMAWLSGIATTLVQSTLTLQLPFCGHRQVDHFICEVPVLIKLACVGTTFNEAELFVASILFLIVPVSFILVSSGYIAHAVLRIKsATGRQKAFGTCFSHLTVVTIFYGTIIFMYLQPAKSRSRDQGKFVSLFYTVVTRMNPLIYTLRIKEVKGALKKVLAKALGVNIL
權(quán)利要求
1.編碼G蛋白偶聯(lián)受體多肽的分離的核酸，由所述核酸編碼的所述多肽與氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8有70％以上的氨基酸同一性。
2.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸編碼了與多克隆抗體特異性結(jié)合的多肽，所述多克隆抗體針對氨基酸序列SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8而產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸編碼具有G蛋白偶聯(lián)受體活性的多肽。
4.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸編碼含有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的多肽。
5.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸含有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7。
6.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸是來自人、小鼠或大鼠。
7.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸通過在嚴格雜交條件下與和選自下組引物對相同序列特異性雜交的引物擴增ATGTTGGGGAACGTCGCCATC(SEQ ID NO9)和TCATCCACAGAGCCTCCAGAT(SEQ ID NO10)；ATGGGAAAGGACAATCCAGTT(SEQ ID NO11)和CTAAGAGAGTAACTCCAGCAA(SEQ ID NO12)；ATGGAAATAGCCAATGTGAGTTC(SEQ ID NO13)和TAAATTTGCGCCAGCTTGCCTG(SEQ ID NO14)；和ATGGTGAGACATACCAATGAGAG(SEQ ID NO15)和CATAAAATATTTACTCCCAGAGCC(SEQ ID NO16)。
8.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸編碼約介于25-35kDa或約介于32-42kDa分子量的多肽。
9.編碼G蛋白偶聯(lián)受體多肽的分離的核酸，其中所述核酸在嚴格雜交條件下與具有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5或SEQ ID NO7的核酸特異性雜交。
10.編碼G蛋白偶聯(lián)受體多肽的分離的核酸，由所述核酸編碼的所述多肽與具有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的多肽有約70％以上的氨基酸同一性，其中所述核酸在適度嚴格雜交條件下與核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5或SEQ ID NO7選擇性雜交。
11.分離G蛋白偶聯(lián)受體多肽，所述多肽包含與氨基酸序列SEQID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8有約70％以上的氨基酸序列同一性。
12.權(quán)利要求11所述的分離多肽，其中所述多肽與針對SEQ IDNO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8產(chǎn)生的多克隆抗體特異性結(jié)合。
13.權(quán)利要求11所述的分離多肽，其中所述多肽具有G蛋白偶聯(lián)受體活性。
14.權(quán)利要求11所述的分離多肽，其中所述多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8。
15.權(quán)利要求11所述的分離多肽，其中所述多肽來自人、大鼠或小鼠。
16.與權(quán)利要求11所述的多肽選擇性結(jié)合的抗體。
17.含有權(quán)利要求1所述的核酸的表達載體。
18.用權(quán)利要求17所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
19.鑒定調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導的化合物的方法，所述方法包括下列步驟(i)將化合物與和氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8有70％以上氨基酸序列同一性的多肽接觸，和(ii)確定化合物對多肽的功能效應。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽具有G蛋白偶聯(lián)受體的活性。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽與固相連接。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述多肽與固相共價連接。
23.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述功能效應的確定是測定胞內(nèi)cAMP、IP3或Ca2+的變化。
24.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述功能效應是化學效應。
25.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述功能效應是物理效應。
26.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述功能效應的確定是檢測化合物與多肽的結(jié)合。
27.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽是重組的。
28.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽來自大鼠、小鼠或人。
29.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽含有氨基酸序列SEQID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8。
30.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多肽在細胞或細胞膜中表達。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述細胞是真核細胞。
32.治療癌癥的方法，所述方法包括將癌細胞與治療有效量的抗體接觸的步驟，所述抗體與和氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8有70％以上氨基酸同一性的多肽特異性結(jié)合。
33.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述抗體與和氨基酸序列SEQID NO6有70％以上氨基酸同一性的多肽特異性結(jié)合。
34.治療癌癥的方法，所述方法包括將含有G蛋白偶聯(lián)受體的癌細胞與治療有效量化合物接觸的步驟，所述化合物采用權(quán)利要求19所述的方法鑒定。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述癌是乳腺癌。
36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述化合物是多肽拮抗劑，所述多肽與氨基酸序列SEQ ID NO6有70％以上的氨基酸同一性。
37.檢測人組織中存在BCA-GPCR核酸或多肽的方法，所述方法包括下列步驟(i)分離生物樣品；(ii)將生物樣品與和BCA-GPCR核酸或多肽選擇性相關(guān)的BCA-GPCR特異試劑接觸；和(iii)檢測與樣品選擇性相關(guān)的BCA-GPCR特異試劑的水平。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述BCA-GPCR特異試劑選自BCA-GPCR特異抗體、BCA-GPCR特異寡核苷酸引物和BCA-GPCR特異核酸探針。
39.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述組織是乳腺癌組織。
40.制備G蛋白偶聯(lián)受體多肽的方法，所述方法包括從含有編碼所述多肽的核酸的重組表達載體中表達所述多肽的步驟，其中所述多肽的氨基酸序列包含與具有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的多肽有約70％以上的氨基酸同一性。
41.制備包含G蛋白偶聯(lián)受體多肽的重組細胞的方法，所述方法包括用含有編碼多肽的核酸的表達載體轉(zhuǎn)導細胞的步驟，其中所述多肽的氨基酸序列與具有氨基酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQID NO6或SEQ ID NO8的多肽有約70％以上的氨基酸同一性。
全文摘要
本發(fā)明提供了在乳腺癌細胞中擴增的四種新型G蛋白偶聯(lián)受體的分離的核酸和氨基酸序列、針對這些受體的抗體、檢測這些核酸和受體的方法以及篩選G蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)節(jié)劑的方法。
文檔編號C07K14/705GK1422281SQ01806636
公開日2003年6月4日 申請日期2001年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月14日
發(fā)明者斯科特·鮑爾斯, 楊建新, 吉恩·庫爾特 申請人:圖拉萊克公司