專利名稱：質(zhì)量標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于標(biāo)記分析物(具體是生物分子如核酸和蛋白質(zhì))的有用的化合物。具體而言，本發(fā)明涉及采用質(zhì)譜法使用特殊的質(zhì)量標(biāo)記物進(jìn)行分析的方法。
標(biāo)記感興趣的分子的各種方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括放射性原子、熒光染料、發(fā)光試劑、電子俘獲劑和光吸收染料。這些標(biāo)記系統(tǒng)的每一種都具有使其適合于某些應(yīng)用而非其它應(yīng)用的特征。由于安全原因，對(duì)非放射性標(biāo)記系統(tǒng)的興趣已導(dǎo)致熒光標(biāo)記方案的廣泛的商業(yè)發(fā)展，尤其是用于遺傳分析的熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記方案使得相對(duì)少量的分子能同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，通?？赏瑫r(shí)使用4種標(biāo)記物，也可能達(dá)到8種。但是，檢測(cè)裝置的成本和分析所產(chǎn)生的信號(hào)的難度限制了可在熒光檢測(cè)方案中同時(shí)使用的標(biāo)記物的數(shù)量。
最近，在質(zhì)譜法領(lǐng)域中已開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)可斷裂地連接于它們相關(guān)的感興趣分子的標(biāo)記物的方法。在許多分子生物學(xué)應(yīng)用中，人們需要能在分析之前分離出感興趣的分子。通常進(jìn)行液相分離。近年來(lái)，質(zhì)譜法已發(fā)展了許多用于液相分離的界面，這使得質(zhì)譜法可特別有效地用作這些應(yīng)用的檢測(cè)系統(tǒng)。直到最近才采用液相色譜質(zhì)譜法直接檢測(cè)分析物離子或它們的片段離子。但是，對(duì)于許多應(yīng)用，如核酸分析，分析物的結(jié)構(gòu)可從間接的標(biāo)記而得以確定。這尤其對(duì)于采用質(zhì)譜法是有利的，因?yàn)閺?fù)雜的生物分子(如DNA)具有復(fù)雜的質(zhì)譜，并且其檢測(cè)具有相對(duì)差的敏感性。間接檢測(cè)指可使用相關(guān)的標(biāo)記物分子來(lái)鑒別原始的分析物，該標(biāo)記物被設(shè)計(jì)用于敏感性檢測(cè)，并具有簡(jiǎn)單的質(zhì)譜。簡(jiǎn)單的質(zhì)譜使得可同時(shí)使用多種標(biāo)記物分析大量的分析物。
PCT/GB98/00127描述了共價(jià)連接于可斷裂的標(biāo)記物的核酸探針的陣列，所述標(biāo)記物可采用質(zhì)譜法檢測(cè)到，該方法可鑒別共價(jià)連接的核酸探針的序列。此申請(qǐng)中的標(biāo)記的探針具有Nu-L-M的結(jié)構(gòu)，其中Nu是共價(jià)連接于L的核酸，L是可斷裂的連接物，它共價(jià)連接于M，M是質(zhì)量標(biāo)記物。在此應(yīng)用中，較佳的可斷裂的連接物在質(zhì)譜儀的離子源中斷裂。此申請(qǐng)公開(kāi)了多種離子化方法和使用四極質(zhì)量分析儀、飛行時(shí)間(Time of flight，TOF)分析儀和磁性扇形場(chǎng)儀器進(jìn)行的分析，將它們作為采用質(zhì)譜法分析質(zhì)量標(biāo)記物的特殊方法。
PCT/GB94/01675公開(kāi)了可斷裂地連接于質(zhì)量標(biāo)記分子的配體和特殊的核酸。較佳的可斷裂連接物是光可斷裂的。此申請(qǐng)公開(kāi)了基質(zhì)輔助的激光解吸電離(MALDI)TOF質(zhì)譜法作為采用質(zhì)譜法分析質(zhì)量標(biāo)記物的特殊方法。
PCT/US97/22639公開(kāi)了可釋放的非揮發(fā)性質(zhì)量標(biāo)記物分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些標(biāo)記物含有聚合物，通常是生物聚合物，這些聚合物可斷裂地連接于反應(yīng)性基團(tuán)或配體(即探針)。優(yōu)選的可斷裂的連接物似乎在化學(xué)上和酶學(xué)上是可斷裂的。此申請(qǐng)公開(kāi)了MALDI TOF質(zhì)譜法作為采用質(zhì)譜法分析質(zhì)量標(biāo)記物的特殊方法。
PCT/US97/01070、PCT/US97/01046和PCT/US97/01304公開(kāi)了可斷裂地連接于質(zhì)量標(biāo)記分子的配體和特殊的核酸。較佳的可斷裂的連接物似乎是化學(xué)可斷裂的或光可斷裂的。這些申請(qǐng)公開(kāi)了許多離子化方法和使用四極質(zhì)量分析儀、TOF分析儀和扇形磁場(chǎng)儀器進(jìn)行的分析，將它們作為采用質(zhì)譜法分析質(zhì)量標(biāo)記物的特殊方法。
分析物材料所產(chǎn)生的質(zhì)譜對(duì)污染物非常敏感。基本上，可電離的導(dǎo)入質(zhì)譜儀中的任何材料都將出現(xiàn)在質(zhì)譜中。這意味著對(duì)于許多分析，需要在將分析物導(dǎo)入質(zhì)譜儀前進(jìn)行小心地純化。對(duì)于高通量系統(tǒng)，為了通過(guò)使用質(zhì)量標(biāo)記物對(duì)分析物進(jìn)行間接分析的目的，需要避免任何不需的樣品制備步驟。即，需要能檢測(cè)污染材料背景中的標(biāo)記物，并能確定所檢測(cè)到的峰事實(shí)上與標(biāo)記物相符。現(xiàn)有的技術(shù)沒(méi)有公開(kāi)在以檢測(cè)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的質(zhì)譜法中改進(jìn)信噪比的方法或組合物，或者可提供證明譜中由質(zhì)量標(biāo)記物的存在引起的質(zhì)量峰的方法或組合物。
為了在液相層析或電泳分離后檢測(cè)分析物，需要使所使用的標(biāo)記物對(duì)分離過(guò)程產(chǎn)生的干擾最小。如果使用這類分析物的陣列，則需要陣列中的各個(gè)成員對(duì)與它們連相關(guān)的分析物的影響與其它標(biāo)記物相同。這在某種程度上與質(zhì)量標(biāo)記的意圖有抵觸，這種意圖產(chǎn)生基于其質(zhì)量在質(zhì)譜儀中可分解的標(biāo)記物陣列。質(zhì)量標(biāo)記物較佳應(yīng)可被分解成4道爾頓，以防止一種標(biāo)記物的同位素峰受到其它標(biāo)記物的同位素峰的干擾。這意味著為了產(chǎn)生250個(gè)不同的質(zhì)量標(biāo)記物，可能需要標(biāo)記物的范圍擴(kuò)展到約1000道爾頓，可能還更多，因?yàn)橹匾氖钱a(chǎn)生被4道爾頓精確分離的大陣列的標(biāo)記物。這個(gè)質(zhì)量范圍質(zhì)量將幾乎肯定會(huì)產(chǎn)生對(duì)采用質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)的任何分離過(guò)程產(chǎn)生不同影響的質(zhì)量標(biāo)記物。這對(duì)儀器設(shè)計(jì)也有關(guān)系，因?yàn)殡S著質(zhì)量范圍的增加超過(guò)了質(zhì)譜儀可檢測(cè)離子的范圍，儀器的成本也增加。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是解決與上述現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問(wèn)題，并提供在污染背景中可檢測(cè)到的質(zhì)量標(biāo)記物，以及作為質(zhì)量標(biāo)記物的身份可被證實(shí)的標(biāo)記物。此外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在壓縮的質(zhì)量范圍內(nèi)可被分解的標(biāo)記物的陣列，這樣這些標(biāo)記物不會(huì)對(duì)分離過(guò)程有太多干擾，以及提供在質(zhì)荷比的有限范圍內(nèi)檢測(cè)離子的質(zhì)譜儀中可容易地被檢測(cè)到的標(biāo)記物的陣列。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供分析生物分子的方法，該方法利用本發(fā)明的標(biāo)記物使通量、信噪比和這些檢測(cè)的敏感性最大化，具體是在遺傳分析中，更具體是用在分析蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳中。
此外，下面公開(kāi)的質(zhì)量標(biāo)記物的設(shè)計(jì)使得為檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物的目的而設(shè)計(jì)出一種簡(jiǎn)易的串聯(lián)質(zhì)譜儀。第一質(zhì)量分析儀僅僅需要選擇有限量的其質(zhì)量相對(duì)低的離子。第二質(zhì)量分析儀僅僅需要檢測(cè)少量的斷裂產(chǎn)物。
因此，本發(fā)明提供一組兩個(gè)或多個(gè)質(zhì)量標(biāo)記物，組中的各個(gè)標(biāo)記物含有通過(guò)可斷裂的連接物連接于質(zhì)量歸一化部分的質(zhì)量指示部分，此部分具有抗碎裂性，其中，組中各標(biāo)記物的聚集質(zhì)量(aggregate mass)可相同或不同，并且，組中各標(biāo)記物的質(zhì)量指示部分的質(zhì)量可相同或不同，其中，在組中具有共同質(zhì)量的質(zhì)量指示部分的任何類的標(biāo)記物中，各標(biāo)記物具有不同于該類中所有其它標(biāo)記物的聚集質(zhì)量，并且，在組中具有共同聚集質(zhì)量的任何類的標(biāo)記物中，各標(biāo)記物具有其質(zhì)量不同于該類中所有其它質(zhì)量指示部分的質(zhì)量的質(zhì)量指示部分，這樣，采用質(zhì)譜法分析時(shí)組中所有的質(zhì)量標(biāo)記物都可互相區(qū)分。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)量指示部分”在本文中指采用質(zhì)譜法檢測(cè)到的部分，而術(shù)語(yǔ)“質(zhì)量歸一化部分”在本文中指采用質(zhì)譜法不一定能檢測(cè)到的部分，但是它的存在確保了質(zhì)量標(biāo)記物具有所需的聚集質(zhì)量。組中標(biāo)記物的數(shù)量并沒(méi)有特殊的限制，但條件是該組含有許多的標(biāo)記物。但是，組中含有兩種以上、三種以上、四種以上或五種以上的標(biāo)記物較佳。
本發(fā)明還提供質(zhì)量標(biāo)記物的陣列，該陣列含有兩組以上上述陣列標(biāo)記物，其中，任一組中各質(zhì)量標(biāo)記物的聚集質(zhì)量與陣列中其它組中的每個(gè)質(zhì)量標(biāo)記物的聚集質(zhì)量不同。
本發(fā)明還提供一種分析方法，該方法包括采用質(zhì)譜法鑒別不同于分析物的質(zhì)量標(biāo)記物或其組合，從而檢測(cè)分析物，其中，質(zhì)量標(biāo)記物是上述的標(biāo)記物組或其陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物。
現(xiàn)在，本發(fā)明將結(jié)合附圖僅采用舉例方式作更詳細(xì)的描述，其中

圖1顯示三重四極質(zhì)譜儀的示意性布局圖；圖2顯示形成本發(fā)明的標(biāo)記物組的10個(gè)片段，包括5個(gè)質(zhì)量歸一化部分(M0-M4)和5個(gè)質(zhì)量指示部分(X0-X4)，其中，將氟原子取代基用作質(zhì)量調(diào)節(jié)部分；圖3顯示本發(fā)明一組5個(gè)標(biāo)記物，由圖2的質(zhì)量歸一化部分和質(zhì)量指示部分形成；圖4顯示本發(fā)明一組5個(gè)質(zhì)量標(biāo)記物，其中，所有的標(biāo)記物的質(zhì)量不同，但該組中所有的質(zhì)量指示物具有相同的質(zhì)量；圖5顯示標(biāo)記分析物(如寡核苷酸與質(zhì)量標(biāo)記物結(jié)合)的例子，這樣，質(zhì)量標(biāo)記物的結(jié)合具有唯一的可鑒別分析物的質(zhì)譜；圖6顯示成組的質(zhì)量標(biāo)記物的陣列，各組具有相同質(zhì)量系列的修飾基團(tuán)(S)，并且，由于其基底苯基上的氟取代基的數(shù)量的緣故，各組互不相同；圖7顯示成組的質(zhì)量標(biāo)記物的陣列，各組具有相同質(zhì)量系列的修飾基團(tuán)(S)，并且，由于質(zhì)量系列修飾基團(tuán)中苯基醚的數(shù)量的緣故，各組互不相同；圖8闡述了本發(fā)明的“混合模式”實(shí)施方式，該圖顯示了當(dāng)存在0或1的相對(duì)量時(shí)，三種標(biāo)記物P、Q和R的所有組合的8種可能的唯一質(zhì)譜中的4種；圖9闡述本發(fā)明的“混合模式”實(shí)施方式，該圖顯示了當(dāng)存在0、1或2的相對(duì)量時(shí)，三種標(biāo)記物P、Q、R、S和T的所有組合的243種可能的唯一質(zhì)譜中的8種(如果T維持恒定，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，則有81種可能的質(zhì)譜)；圖10顯示通過(guò)擴(kuò)大質(zhì)量歸一化部分和質(zhì)量指示部分，以允許進(jìn)行更大范圍的取代而可形成的標(biāo)記物組有多大——這組標(biāo)記物有9個(gè)成員，以及用氟原子取代基作為質(zhì)量調(diào)節(jié)部分而形成的標(biāo)記物組有多大——這組標(biāo)記物至少有8個(gè)成員，這便于采用本發(fā)明的混合模式對(duì)寡核苷酸陣列中的256個(gè)四聚體進(jìn)行標(biāo)記；圖11顯示質(zhì)譜1，這是個(gè)含有從所有的離子A+、B+、C+和D+的峰的完整的質(zhì)譜；圖12顯示質(zhì)譜2，這個(gè)質(zhì)譜僅僅是A+的質(zhì)譜，通過(guò)在質(zhì)譜儀的第一四極(Q1)中選擇A+離子而產(chǎn)生的質(zhì)譜；圖13顯示質(zhì)譜3，這是第一離子A1+(與A+具有相同的質(zhì)荷比)和A1+、P+和Q+的斷裂產(chǎn)物的質(zhì)譜；
圖14顯示質(zhì)譜4，這是第二離子A2+(與A+具有相同的質(zhì)荷比)和A2+、X+和Y+的斷裂產(chǎn)物的質(zhì)譜；圖15顯示質(zhì)譜5，當(dāng)兩類這樣的離子(A1+和A2+)存在時(shí)，選擇A+離子而形成的質(zhì)譜；圖16顯示質(zhì)譜6，這是個(gè)在質(zhì)譜儀的三極矩中形成的譜，當(dāng)兩類在Q2中通過(guò)碰撞誘導(dǎo)了所選擇離子的解離的這樣的離子(A1+和A2+)存在時(shí)，在Q1中選擇A+離子，在Q3中選擇已知的撞擊產(chǎn)物A1+(P+)——這種方法可使A1+和A2+分解；圖17顯示質(zhì)譜7，這是本發(fā)明一組5種質(zhì)量標(biāo)記物的二維譜，其中，在Q1(第一維)中選擇質(zhì)量MX，在Q3(第二維)中選擇5種不同的質(zhì)量X0、X1、X2、X3和X4；圖18顯示質(zhì)譜8，這是本發(fā)明一組4種質(zhì)量標(biāo)記物的二維譜，其中，在Q1(第一維)中選擇4種不同的質(zhì)量M0X0、M1X0、M2X0和M3X0，在Q3(第二維)中選擇單一質(zhì)量M0；圖19顯示質(zhì)譜9，這是含有由M0-M3和X0-X3的所有組合形成的標(biāo)記物的一組質(zhì)量標(biāo)記物的二維譜，其中，在Q1(第一維)中選擇7種不同的質(zhì)量，在Q3(第二維)中選擇4種不同的質(zhì)量X0-X3；圖20顯示使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物進(jìn)行典型的斷裂過(guò)程的示意圖，本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物與它們的分析物發(fā)生熱斷裂，或者使用電噴射離子化使它們斷裂；圖21顯示使用本發(fā)明的一組5個(gè)質(zhì)量標(biāo)記物在二維質(zhì)譜中進(jìn)行選擇的示意圖。
圖22顯示本發(fā)明的氘化的質(zhì)量標(biāo)記物；圖23顯示本發(fā)明的進(jìn)一步氘化的質(zhì)量標(biāo)記物；圖24顯示具有H2N-gly-1eu-ala-ser-glu-COOH序列的兩條肽樣品的理論譜，各樣品與圖23中的式子所述的一種標(biāo)記物連接。
在一個(gè)較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明提供上述一組質(zhì)量標(biāo)記物，其中，組中各標(biāo)記物具有有共同質(zhì)量的質(zhì)量指示部分，并且組中各標(biāo)記物具有唯一的聚集質(zhì)量。這種第一類型的標(biāo)記物組的例子在圖4中給出。
在另一可選擇的更佳的實(shí)施方式中，組中各標(biāo)記物具有共同的聚集質(zhì)量，并且組中各標(biāo)記物具有有唯一質(zhì)量的質(zhì)量指示部分。這種第二類型的標(biāo)記物組的例子在圖3中給出。
該組標(biāo)記物并不受到上述兩個(gè)較佳實(shí)施方式的限制，可包括如兩種類型的標(biāo)記物，但條件是，如上所述，所有的標(biāo)記物通過(guò)質(zhì)譜法分析都是可區(qū)分的。
較佳的是，在第二類型的標(biāo)記物組中，組中各質(zhì)量指示部分具有共同的基本結(jié)構(gòu)，組中各質(zhì)量歸一化部分具有共同的基本結(jié)構(gòu)，并且組中各質(zhì)量標(biāo)記物含有一個(gè)或多個(gè)質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，該質(zhì)量調(diào)節(jié)部分被連接于質(zhì)量指示部分和/或質(zhì)量歸一化部分的基本結(jié)構(gòu)上或者位于這些結(jié)構(gòu)之中。在這個(gè)實(shí)施方式中，組中每一個(gè)質(zhì)量指示部分含有不同數(shù)量的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，組中每一質(zhì)量標(biāo)記物具有相同數(shù)量的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分。
在整篇說(shuō)明書中，所述的“共同的基本結(jié)構(gòu)”是指兩個(gè)或多個(gè)部分共享有一個(gè)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有基本上相同的結(jié)構(gòu)構(gòu)架、骨架或核心。這種構(gòu)架或骨架可以是如苯基醚部分。該構(gòu)架或骨架可含有與其側(cè)接的取代基，或者用其中沒(méi)有改變共同的基本結(jié)構(gòu)的原子或同位素取代。
通常，上述第二類型的標(biāo)記物組含有具有下式的質(zhì)量標(biāo)記物M(A)y-L-X(A)z式中，M是質(zhì)量歸一化部分，X是質(zhì)量指示部分，A是質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，L是可斷裂的連接物，y和z是0或0以上的整數(shù)，y+z是1或1以上的整數(shù)。較佳的是，M是抗碎裂性基團(tuán)，L是在與其它分子或原子碰撞時(shí)易斷裂的連接物，X較佳是預(yù)先電離的具有抗碎裂性的基團(tuán)。M和X的質(zhì)量總和與該組的所有成員相同。較佳的是，M和X具有相同的基本結(jié)構(gòu)或核心結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被質(zhì)量調(diào)節(jié)部分修飾。該質(zhì)量調(diào)節(jié)部分確保M和X的質(zhì)量總和與組中所有的質(zhì)量標(biāo)記物相同，但保證了每個(gè)X具有不同的(唯一的)質(zhì)量。
具有上述結(jié)構(gòu)的優(yōu)選質(zhì)量標(biāo)記物組是其組中每種標(biāo)記物具有下述結(jié)構(gòu)的組 式中，R是氫或者是取代的或未取代的脂族、芳族、環(huán)狀的或雜環(huán)狀的基團(tuán)，L是可斷裂的連接物，A是質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，每個(gè)p是相同的，并且是0或0以上的整數(shù)，每個(gè)y′可以相同或不同，為0-4的整數(shù)，所有的y′的總和等于y，每個(gè)z′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，所有的z′的總和等于z。較佳的是，R是H，L是酰胺鍵，p＝0，A是氟原子。
在本文中，R基團(tuán)上的取代模式根本不受到限制。取代基可包括任何有機(jī)基團(tuán)和/或一種或多種選自元素周期表中的IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA族的原子，如B、Si、N、P、O或S原子或者鹵原子(如F、Cl、Br或I)。
當(dāng)取代基包括有機(jī)基團(tuán)時(shí)，該有機(jī)基團(tuán)可包括烴基。烴基可包括直鏈基團(tuán)、支鏈基團(tuán)或者環(huán)狀基團(tuán)。獨(dú)立地，所述烴基可包括脂族基團(tuán)或芳族基團(tuán)。同樣獨(dú)立地，該烴基可包括飽和的或不飽和的基團(tuán)。
當(dāng)烴含有不飽和基團(tuán)時(shí)，它可含有一個(gè)或多個(gè)烯烴官能度和/或一個(gè)或多個(gè)炔烴官能度。當(dāng)烴含有直鏈或支鏈基團(tuán)時(shí)，它可含有一個(gè)或多個(gè)伯、仲和/或叔烷基。當(dāng)烴含有環(huán)狀基團(tuán)時(shí)，它可含有芳環(huán)、脂族環(huán)、雜環(huán)基團(tuán)和/或這些基團(tuán)的融合環(huán)衍生物。因而所述環(huán)狀基團(tuán)可含有苯、萘、蒽、茚、芴、吡啶、喹啉、噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吡咯、吲哚、咪唑、噻唑和或噁唑基團(tuán)，以及上述基團(tuán)的區(qū)域異構(gòu)體(regioisomer)。
對(duì)烴基中的碳原子數(shù)并沒(méi)有特殊的限制，但通常，烴基含有1-40個(gè)碳原子。因而，烴基可以是低級(jí)烴(1-6個(gè)碳原子)或高級(jí)烴(7個(gè)或7個(gè)以上碳原子，如7-40個(gè)碳原子)。環(huán)狀基團(tuán)的環(huán)中的原子數(shù)也沒(méi)有特殊的限制，但環(huán)狀基團(tuán)的環(huán)可含有3-10個(gè)原子，如3、4、5、6或7個(gè)原子。
上述定義的含有雜原子的基團(tuán)以及上面定義的其它基團(tuán)可含有一個(gè)或多個(gè)雜原子，這些雜原子選自元素周期表中的IIIA、IVA、VA、VIA或VIIA族中的任何原子，如B、Si、N、P、O或S原子或者鹵原子(如F、Cl、Br或I)。因而，取代基可含有有機(jī)化學(xué)中一個(gè)或多個(gè)任何一種普通官能團(tuán)，如羥基、羧基、酯基、醚基、醛基、酮基、胺基、酰胺基、亞胺基、巰基、硫醚基、硫酸根、磺酸根和磷酸根。取代基還可含有這些基團(tuán)的衍生物，如羧酸酐和羧酸鹵化物。
此外，任何取代基可含有兩種以上上述定義的取代基和/或官能團(tuán)的組合。
對(duì)本發(fā)明質(zhì)量標(biāo)記物的陣列并沒(méi)有特殊的限制，只要它們含有大量的本發(fā)明的陣列標(biāo)記物組。較佳的是，所述陣列含有兩組以上、三組以上、四組以上或五組或五組以上質(zhì)量標(biāo)記物。較佳的是，陣列中各質(zhì)量標(biāo)記物具有下述任一結(jié)構(gòu)(S)x-M(A)y-L-X(A)zM(A)y-(S)x-L-X(A)z其中，S是質(zhì)量系列修飾基團(tuán)，M是質(zhì)量歸一化部分，X是質(zhì)量指示部分，A是質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，L是可斷裂的連接物，x是0或0以上整數(shù)，y和z是0或0以上整數(shù)，y+z是1或1以上整數(shù)。
上述類型的質(zhì)量標(biāo)記物的優(yōu)選陣列是其質(zhì)量標(biāo)記物具有下述任一結(jié)構(gòu)的陣列 式中，R是氫或者是取代的或未取代的脂族、芳族、環(huán)狀的或雜環(huán)狀的基團(tuán)，每個(gè)p是相同的，并且是0或0以上的整數(shù)，x是0或0以上的整數(shù)，任一組中的每個(gè)x與該陣列中其它每組中的x不同，每個(gè)y′可以相同或不同，為0-4的整數(shù)，所有的y′的總和等于y，每個(gè)z′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，所有的z′的總和等于z。圖7描述了這種類型的陣列。
在另一較佳的方面，質(zhì)量標(biāo)記物的陣列可含有具有下述任一結(jié)構(gòu)的陣列標(biāo)記物S(A*)r-M(A)y-L-X(A)zM(A)y-S(A*)r-L-X(A)z式中，S是質(zhì)量系列修飾基團(tuán)，M是質(zhì)量歸一化部分，X是質(zhì)量指示部分，A是所述質(zhì)量指示部分和質(zhì)量歸一化部分的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，A*可以與A相同或不同，且是所述質(zhì)量系列修飾基團(tuán)的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，L是可斷裂的連接物，r是0或0以上的整數(shù)，陣列中有一組或多組質(zhì)量標(biāo)記物的r至少為1，y和z是0或0以上的整數(shù)，x+y是1或1以上整數(shù)。較佳的是，M是抗斷裂基團(tuán)，L是在與別的分子或原子碰撞時(shí)易斷裂的連接物，X較佳是預(yù)先電離的、具有抗碎裂性的基團(tuán)。S一般是基團(tuán)，這樣標(biāo)記物組的陣列的各成員含有其質(zhì)量較佳以4道爾頓與該陣列中的其它每個(gè)成員中的其它每個(gè)S相分離的S。從而，各不同組的質(zhì)量標(biāo)記物具有不同(唯一)的質(zhì)量。
上述后一種類型的質(zhì)量標(biāo)記物的較佳陣列是其陣列標(biāo)記物具有下述任一結(jié)構(gòu)的陣列 式中，R是氫或者是取代的或未取代的脂族、芳族、環(huán)狀的或雜環(huán)狀的基團(tuán)，每個(gè)p是相同的，并且是0或0以上的整數(shù)，x是0或0以上的整數(shù)，陣列中所有的質(zhì)量標(biāo)記物的x都相同，每個(gè)y′可以相同或不同，為0-4的整數(shù)，所有的y′的總和等于y，每個(gè)z′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，所有的z′的總和等于z，每個(gè)r′可以相同或不同，所有r′的總和等于r。圖6描述了這種類型的陣列。
在本發(fā)明的上述組和陣列中，對(duì)M、X和S基團(tuán)的共同的基本結(jié)構(gòu)并沒(méi)有特殊的限制，它們可包括環(huán)狀的和/或非環(huán)狀的基團(tuán)。對(duì)M、X和S的性質(zhì)也沒(méi)有特殊的限制。但是，較佳的是，M和/或X，和/或S含有基本(核心)結(jié)構(gòu)——環(huán)狀基團(tuán)，如芳基、環(huán)烷基或雜環(huán)基。這些基團(tuán)可以是未取代的，但較佳是取代的基團(tuán)。M、X和/或S可分別含有由上述環(huán)狀單體形成的寡聚物或聚合物，其中環(huán)狀單體通過(guò)抗斷裂的鍵或基團(tuán)連接。
對(duì)于M、X和S，芳基醚，如苯基醚基團(tuán)及其寡聚物和聚合物，尤其是取代的芳基醚是優(yōu)選的共同的基本結(jié)構(gòu)。
對(duì)可斷裂的連接基團(tuán)L并沒(méi)有什么特殊的限制。但是，較佳的是，L含有可通過(guò)碰撞而斷裂的基團(tuán)，和/或L在質(zhì)譜儀中可斷裂。較佳的是，基團(tuán)L含有酰胺鍵。
在另一較佳的方面中，本發(fā)明提供可與分析物分子反應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)記物組和陣列，所述質(zhì)量標(biāo)記物具有下述形式Re-L′-標(biāo)記物 或者 Re-L′-S-標(biāo)記物式中，Re是使質(zhì)量標(biāo)記物與分析物分子中的適當(dāng)?shù)墓倌芑鶊F(tuán)共價(jià)地反應(yīng)的反應(yīng)性的官能度或基團(tuán)，如(但不限于)核苷酸寡核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽或多肽。L′是可斷裂或不可斷裂的連接物，標(biāo)記物是上述定義的組或陣列中任一種質(zhì)量標(biāo)記物。S的定義與上面的相同。L′可以是可斷裂的連接物，如果需要，它可以是如上所定義的可斷裂的連接物L(fēng)。
在本發(fā)明上述方面的較佳實(shí)施方式中，L和/或L′在質(zhì)譜儀中可斷裂，并且較佳在質(zhì)譜儀的離子源中可斷裂。連接基團(tuán)在上下文的討論中提到用于將感興趣的分子連接到本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記化合物上的連接基團(tuán)。各種各樣的連接物在本領(lǐng)域中是已知的，這類連接物可被引入本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物及其共價(jià)連接的分析物之間。這類連接物中的一些是可斷裂的。寡乙二醇或聚乙二醇或它們的衍生物可用作連接物，如在Maskos，U.和Southern，E.M.，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，201679-1684，1992中所公開(kāi)的那些連接物。雖然基于琥珀酸的連接物通常是堿不穩(wěn)定性，并因而與許多寡核苷酸合成儀中進(jìn)行的堿介導(dǎo)的去保護(hù)步驟不相容，從而使它們?cè)跇?biāo)記寡核苷酸的應(yīng)用中較少優(yōu)選使用，但是它們還是被廣泛應(yīng)用。
丙炔醇是雙功能連接物，它提供的連接在寡核苷酸合成的條件下穩(wěn)定，并且是用于本發(fā)明涉及寡核苷酸應(yīng)用的優(yōu)選連接物。類似地，6-氨基己醇是連接適當(dāng)官能化的分子的有用的雙功能試劑，它也是優(yōu)選的連接物。
各種已知的可斷裂的連接基團(tuán)可與本發(fā)明的化合物一起使用，如光可斷裂的連接物。鄰位-硝基芐基是已知的光斷裂的連接物，尤其是2-硝基芐酯和在芐胺鍵斷裂的2-硝基芐胺。關(guān)于可斷裂的連接物的綜述，可參見(jiàn)Lloyd-Williams等人，Tetrahedron49，11065-11133，1993，該文中包括了許多光可斷裂的連接物和化學(xué)可斷裂的連接物。
WO 00/02895公開(kāi)了乙烯基砜化合物作為可斷裂的連接物，這類化合物也可用于本發(fā)明，尤其是用于標(biāo)記多肽、肽和氨基酸。本文將該申請(qǐng)的內(nèi)容納入作為參考。
WO 00/02895公開(kāi)了硅化合物用作連接物，這類連接物在氣相中通被堿斷裂。這些連接物也可用于本發(fā)明，尤其是涉及標(biāo)記寡核苷酸的應(yīng)用。本文將申請(qǐng)的內(nèi)容納入作為參考。
在下面的討論中將提到使本發(fā)明的化合物連接于其它化合物(不論是報(bào)道基團(tuán)或者是分析物分子)的反應(yīng)性官能度Re?？蓪⒍喾N反應(yīng)性官能度引入本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物中。
下面的表1列出可與生物分子中發(fā)現(xiàn)的親核官能度反應(yīng)，產(chǎn)生兩個(gè)實(shí)體間的共價(jià)鍵的一些反應(yīng)性官能度。對(duì)于寡核苷酸合成，常常在分子的末端引入伯胺或硫醇，使該分子被標(biāo)記。可將下面列出的任何一個(gè)官能度引入本發(fā)明的化合物中，使質(zhì)量標(biāo)記物被連接到感興趣的分子上。如果需要，可使用反應(yīng)性官能度來(lái)引入另一具有另一反應(yīng)性官能度的連接基團(tuán)。表1中的內(nèi)容并不詳盡，本發(fā)明并不局限于僅使用這些列出的官能度。
表1 應(yīng)注意的是，在使用本發(fā)明的質(zhì)量指示物標(biāo)記寡核苷酸的應(yīng)用中。上述一些反應(yīng)性官能度或它們的所產(chǎn)生的連接基團(tuán)在引入寡核苷酸合成儀前可能要進(jìn)行保護(hù)。較佳的是，未保護(hù)的酯、硫醚和硫酯、胺以及酰胺鍵最好被取消，因?yàn)樗鼈冊(cè)诠押塑账岷铣蓛x中通常是不穩(wěn)定的。各種各樣的保護(hù)基團(tuán)在本領(lǐng)域中是已知的，可使用這些保護(hù)基團(tuán)來(lái)保護(hù)化學(xué)鍵不發(fā)生不需要的副反應(yīng)。
下面的討論將提到“帶電官能度”和增溶基團(tuán)?？蓪⑦@些基團(tuán)引入質(zhì)量標(biāo)記物(如本發(fā)明的質(zhì)量指示物)中，以促進(jìn)電離和溶解。指示物的選擇取決于使用陽(yáng)離子檢測(cè)還是陰離子檢測(cè)。表2列出了一些官能度，這些官能度可被引入質(zhì)量指示物中，以促進(jìn)陽(yáng)電離或陰電離。表中的內(nèi)容并不詳盡，本發(fā)明并不局限于僅使用這些所列出的官能度。
表2 WO 00/02893公開(kāi)了為了改進(jìn)質(zhì)量指示物的電離而使用金屬離子結(jié)合部分，如冠醚或卟啉。這些部分也可用于本發(fā)明的質(zhì)量指示物。
本發(fā)明的質(zhì)量指示物的成分較佳具有抗碎裂性，這樣該指示物的斷裂位點(diǎn)可由易于被碰撞引起的解離所破壞的鍵的引入所控制。芳基醚是這類具有抗碎裂性的化合物的例子，它們可用于本發(fā)明。這些化合物也是化學(xué)惰性的或者是熱穩(wěn)定的。WO 99/32501更詳細(xì)地討論了聚醚在質(zhì)譜法中的應(yīng)用，本文將此申請(qǐng)的內(nèi)容納入作為參考。
過(guò)去，芳基醚合成的一般方法是以芳基溴與苯酚在銅粉末的存在下，在約200℃時(shí)的Ullmann偶聯(lián)為基礎(chǔ)〔代表性文獻(xiàn)H.Stetter、G.Duve，Chemische Berichte，87(1954)，1699〕。已使用不同的金屬催化劑發(fā)展了芳基醚合成的較溫和的方法，但反應(yīng)的溫度仍為100-120℃〔M.Iyoda、M.Sakaitani、H.Otsuka、M.Oda，Tetrahedron Letters，26(1985)，477〕。這是生產(chǎn)聚醚質(zhì)量標(biāo)記物的優(yōu)選途徑。參見(jiàn)下面的實(shí)施例中給予的FT77的合成。最近發(fā)表的方法提供一種生產(chǎn)聚醚質(zhì)量標(biāo)記物的最佳途徑，因?yàn)樵撏緩绞窃诒容^早方法更溫和的條件下進(jìn)行的(D.E.Evans、J.L Katz、T.R.West，Tetrahedron Lett.，39(1998)，2937〕。
本發(fā)明還提供一組兩個(gè)或多個(gè)探針，組中各探針不同，它們與唯一的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的唯一組合連接，這些質(zhì)量標(biāo)記物選自上述定義的質(zhì)量標(biāo)記物的組或陣列。
還提供的是探針的陣列，該陣列含有兩組或多組探針，其中，任一組中的各探針連接于唯一的質(zhì)量標(biāo)記物或者質(zhì)量標(biāo)記物的唯一的組合，這些質(zhì)量標(biāo)記物選自上述定義的質(zhì)量標(biāo)記物組，并且，其中任一組中的探針連接于相同的質(zhì)量標(biāo)記物組中的質(zhì)量標(biāo)記物，并且各組探針連接于上述定義的質(zhì)量標(biāo)記物陣列中唯一的質(zhì)量標(biāo)記物組的質(zhì)量標(biāo)記物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，各探針較佳連接于質(zhì)量標(biāo)記物的唯一組合，各組合可通過(guò)質(zhì)量標(biāo)記物組中的各質(zhì)量標(biāo)記物的存在或缺乏而得以區(qū)分，和/或通過(guò)連接于探針的各質(zhì)量標(biāo)記物的數(shù)量而得以區(qū)分。這就是本發(fā)明的“混合模式”，因?yàn)樘结樋杀贿B接于質(zhì)量標(biāo)記物的混合物。
在上述方面，對(duì)探針的性質(zhì)并沒(méi)有特殊的限制。但較佳的是，各探針包含生物分子?？墒褂萌魏紊锓肿?，但該生物分子較佳選自DNA、RNA、寡核苷酸、核酸堿基、肽、多肽、蛋白質(zhì)和氨基酸。
在一個(gè)較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有下述形式的質(zhì)量標(biāo)記的分析物組和陣列，如核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸分析物-L′-標(biāo)記物 或者 分析物-L′-S-標(biāo)記物式中，L′和S的定義如上，標(biāo)記物是選自上述任何組和陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物。
在上述方面，對(duì)分析物的性質(zhì)并沒(méi)有特殊的限制。但較佳的是，各分析物包含生物分子?？墒褂萌魏紊锓肿?，但該生物分子較佳選自DNA、RNA、寡核苷酸、核酸堿基、肽、多肽、蛋白質(zhì)和氨基酸。
在一個(gè)實(shí)施方式中，各分析物較佳連接于獨(dú)特的質(zhì)量標(biāo)記物的組合，各組合通過(guò)質(zhì)量標(biāo)記物組中各質(zhì)量標(biāo)記物的存在或缺乏而得以區(qū)分，和/或通過(guò)連接于探針的各質(zhì)量標(biāo)記物的數(shù)量而得以區(qū)別。如上所述，這就是本發(fā)明的“混合模式”，因?yàn)樘结樋蛇B接于質(zhì)量標(biāo)記物的混合物。
如上所述，本發(fā)明提供一種分析的方法，該方法包括通過(guò)采用質(zhì)譜法鑒別對(duì)分析物獨(dú)特的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合，從而檢測(cè)該分析物，其中，質(zhì)量標(biāo)記物是上述質(zhì)量標(biāo)記物的組和陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物。這類方法并沒(méi)有特殊的限制，只要它有利于使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物鑒別分析物。例如，該方法可以是核酸測(cè)序的方法，或者是通過(guò)檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的數(shù)量來(lái)描述一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的方法。該方法特別有利，因?yàn)樗捎糜谌菀椎赝瑫r(shí)分析大量的分析物。但該方法還具有單獨(dú)分析單種分析物的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槭褂帽景l(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物，可獲得比常規(guī)質(zhì)譜更清楚的質(zhì)譜，從而使得該方法準(zhǔn)確和敏感。
在另一較佳實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種方法，該方法包括(a)使一種或多種分析物與探針組或探針陣列接觸，組或陣列中的各探針對(duì)至少一種分析物特異，其中，各探針如上所述；(b)通過(guò)檢測(cè)對(duì)分析物特異的探針鑒別分析物。
在這個(gè)實(shí)施方式中，較佳的是，在采用質(zhì)譜法檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物之前，先從探針上解離下標(biāo)記物。
這個(gè)
具體實(shí)施例方式
的方法的性質(zhì)并沒(méi)有特殊的限制。但較佳的是，該方法包括使一種或多種核酸與一組雜交探針接觸。該組雜交探針通常包括達(dá)到256個(gè)四聚體的組，組中各探針具有不同組合的核酸堿基。這個(gè)方法可適合用于鑒別靶核酸的存在，或者可用于一種或多種核酸模板的引物延伸測(cè)序的逐步式的方法。
本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物特別適合用于二維分析的方法，這主要是由于大量的標(biāo)記物可同時(shí)得以區(qū)分。因而，這些標(biāo)記物可用于雙向凝膠電泳的方法，或者用于二維質(zhì)譜法。
因而，在一方面，本發(fā)明提供一種二維質(zhì)譜法分析的方法，它包括(a)提供一種或多種分析物，各分析物用對(duì)該分析物唯一的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合標(biāo)記，其中，這些質(zhì)量標(biāo)記物選自上述質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列；(b)將質(zhì)量標(biāo)記物從分析物中解離；(c)檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物；(d)在質(zhì)譜儀中解離質(zhì)量標(biāo)記物，以從質(zhì)量歸一化部分中釋放出質(zhì)量指示部分；(e)檢測(cè)質(zhì)量指示部分；(f)在第一方向上，在質(zhì)量標(biāo)記物的質(zhì)譜的基礎(chǔ)上鑒別分析物，在第二方向上鑒別質(zhì)量指不部分的質(zhì)譜。
在此方法中，較佳的是，在步驟(c)中，選擇質(zhì)量的質(zhì)量標(biāo)記物或者質(zhì)量的選擇范圍是選擇為檢測(cè)而選擇的。還較佳的是，在步驟(e)中，具有特殊的質(zhì)量或質(zhì)量的特殊范圍的質(zhì)量指示部分是為檢測(cè)而選擇的。
在另一方面，本發(fā)明提供一種分析的方法，該方法包括(a)在分析物的第一特性的基礎(chǔ)上，對(duì)標(biāo)記的分析物的混合物進(jìn)行第一分離處理；(b)在分析物的第二特性的基礎(chǔ)上，對(duì)分離的分析物進(jìn)行第二分離處理；(c)通過(guò)檢測(cè)分析物的標(biāo)記物，從而檢測(cè)該分析物；其中，分析物用選自上述質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物標(biāo)記。
分析物的特性沒(méi)有特殊的限制。但是，在這個(gè)實(shí)施方式的步驟(a)和/或(b)中，較佳是根據(jù)分析物的長(zhǎng)度或質(zhì)量將它們分離。還較佳的是，在步驟(a)和/或(b)中，分析物是根據(jù)它們的等電點(diǎn)而被分離。通常，這些分析物含有一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸或核酸，或者它們的片段。特別優(yōu)選的是，在各個(gè)分離步驟中使用凝膠電泳。在這個(gè)實(shí)施方式中，該方法是雙向凝膠電泳法。
在另一方面，本發(fā)明提供一種表征核酸的方法，該方法包括；(a)提供一組核酸片段，各片段具有可斷裂地連接于其上、用于鑒別該片段特征的質(zhì)量標(biāo)記物，這些質(zhì)量標(biāo)記物選自上述質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列；(b)在它們的長(zhǎng)度的基礎(chǔ)上分離這些片段；(c)解離各片段，以釋放出其質(zhì)量標(biāo)記物；(d)采用質(zhì)譜法測(cè)定各質(zhì)量標(biāo)記物，以描述片段的長(zhǎng)度與各片段特征的關(guān)系。
通常，本發(fā)明這方面的方法用于表征cDNA。較佳的是，此方法包括(a)使含有一組含一種或多種cDNA或其片段的樣品暴露于斷裂劑中，該斷裂劑識(shí)別預(yù)定的序列，并在距離預(yù)定序列已知偏移位置的基準(zhǔn)位點(diǎn)上進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生一組末端片段，所述預(yù)定序列接近各cDNA或其片段的一端；(b)將銜接子寡核苷酸連接于各基準(zhǔn)位點(diǎn)上，該寡核苷酸含有樣品斷裂劑的識(shí)別位點(diǎn)；(c)將這組末端片段暴露于樣品斷裂劑中，該斷裂劑與上述識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，并從該識(shí)別位點(diǎn)開(kāi)始，在已知偏移位置的樣品位點(diǎn)上進(jìn)行切割，從而在各個(gè)末端片段中產(chǎn)生來(lái)自未知序列和預(yù)定長(zhǎng)度達(dá)到6個(gè)堿基的的粘性末端序列；
(d)根據(jù)序列的長(zhǎng)度將該組末端片段分成亞組；(e)如下測(cè)定各粘性末端序列(i)用標(biāo)記的雜交探針陣列探測(cè)，該陣列含有所有可能的預(yù)定長(zhǎng)度的堿基序列；(ii)連接這些雜交到粘性末端序列上的探針；(iii)通過(guò)鑒別標(biāo)記物，較佳是通過(guò)定量標(biāo)記物，測(cè)定哪些探針被連接。其中，這些標(biāo)記物是來(lái)自上述組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物。
在這個(gè)方法中，較佳采用毛細(xì)管電泳、HPLC或凝膠電泳分離末端片段組。
在本發(fā)明的又一方面中，本發(fā)明提供一種表征核酸的方法，該方法包括，在至少一種標(biāo)記的末端堿基的存在下，從一個(gè)或多個(gè)核酸模板產(chǎn)生Sanger梯核酸片段，然后鑒別該片段的長(zhǎng)度及其末端堿基，其中，該標(biāo)記物對(duì)該末端堿基特異，并且是來(lái)自上面定義的組或陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物。
在本發(fā)明的這個(gè)方面，較佳的是，所有四種末端堿基都在相同反應(yīng)區(qū)中存在。該方法通常包括，從存在于相同反應(yīng)區(qū)中的大量核酸模板產(chǎn)生Sanger梯核酸片段，然后鑒別所產(chǎn)生的各核酸片段的長(zhǎng)度、產(chǎn)生該片段的模板的身份以及該片段的末端堿基，其中，在產(chǎn)生這些片段之前，先使標(biāo)記的引物核苷酸或寡核苷酸雜交到各模板上，而各引物上的標(biāo)記物對(duì)該引物所雜交的模板特異，從而鑒別該模板。對(duì)鑒別模板的這類標(biāo)記物沒(méi)有特殊的限制。但較佳的是，該鑒別模板用的標(biāo)記物是選自上面定義的組和陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物。
本發(fā)明方法的另一方面提供一種核酸測(cè)序的方法，該方法包括(a)獲得靶核酸組，該組中包含一條或多條將要測(cè)序的單鏈DNA，每條DNA以唯一的量存在，并具有一個(gè)引物，為該核酸提供雙鏈部分用于連接；(b)使核酸組與雜交探針的陣列接觸，各探針包含可斷裂地連接于預(yù)定長(zhǎng)度的已知堿基序列上的標(biāo)記物，該陣列包含該預(yù)定長(zhǎng)度的所有可能的堿基序列，這些堿基序列不能相互連接，其中，在連接酶的存在下，在使具有與位于各核酸的雙鏈部分附近的單鏈核酸互補(bǔ)的堿基序列的探針與該雙鏈部分連接的條件下，進(jìn)行接觸，從而形成延伸的雙鏈部分，該部分不能與更多的探針連接；(c)除去所有未連接的探針；接著進(jìn)行如下步驟(d)將連接的探針解離，釋放出各標(biāo)記物；(e)記錄各標(biāo)記物的數(shù)量；
(f)激活延伸的雙鏈部分，使能夠在其上進(jìn)行連接；其中(g)步驟(b)和(f)作為一輪循環(huán)，重復(fù)進(jìn)行足夠多次，以通過(guò)測(cè)定釋放的各標(biāo)記物的序列來(lái)測(cè)定單鏈核酸或各單鏈核酸的序列；其中，雜交探針的標(biāo)記物是來(lái)自上面定義的組和陣列中的各標(biāo)記物。
在本發(fā)明的這個(gè)方面，較佳的是，雜交探針是一組256個(gè)四聚體，組中各探針具有不同組合的核酸堿基。
如已經(jīng)提到的，較佳的是，在本方法所有的上述方面中，通過(guò)采用質(zhì)譜法同時(shí)分析物的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合，從而檢測(cè)兩種或多種分析物。
本發(fā)明的混合模式可用于上述所有的方法。在這個(gè)實(shí)施方式中，由選自質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物的獨(dú)特組合鑒別各分析物，各組合由該組或陣列中的各質(zhì)量標(biāo)記物的存在與否加以區(qū)別，和/或由各質(zhì)量標(biāo)記物的數(shù)量加以區(qū)分。
如果本方法用于兩種或多種分析物的同時(shí)分析，則在一些方面，較佳的是，在采用質(zhì)譜法檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物之前，先根據(jù)這些分析物的質(zhì)量將它們分離。較佳的是，分離步驟是色譜步驟(如液相色譜法)或凝膠電泳。類型2的標(biāo)記物在這些實(shí)施方式中是特別有利的，因?yàn)樵摻M中所有標(biāo)記物的聚集質(zhì)量相同，因此，在進(jìn)行色譜分離步驟中，所有分析物的移動(dòng)性同樣受到這些標(biāo)記物的影響。
通常，在本發(fā)明的方法中，用來(lái)檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物的質(zhì)譜儀包含一個(gè)或多個(gè)質(zhì)量分析儀，這些質(zhì)量分析儀能使特定的質(zhì)量或質(zhì)量范圍的離子通過(guò)，以進(jìn)行檢測(cè)，和/或它們能使離子解離。較佳的是，使用這種質(zhì)量分析儀選擇對(duì)一種或多種已知的質(zhì)量標(biāo)記物特異的特定質(zhì)量或質(zhì)量范圍的離子，使所選擇的離子解離，然后檢測(cè)解離產(chǎn)物，鑒別出能指示所選擇的質(zhì)量標(biāo)記物的離子模型。在特別優(yōu)選的方法中，質(zhì)譜儀包含三個(gè)四極質(zhì)量分析儀。在這個(gè)實(shí)施方式中，第一質(zhì)量分析儀通常用于選擇具有特定質(zhì)量或質(zhì)量范圍的離子，第二質(zhì)量分析儀用于解離所選擇的離子，而第三分析儀用于檢測(cè)可得到的離子。
上述方法的一個(gè)較佳實(shí)施方式提供了一種分析質(zhì)量標(biāo)記的分析物分子的方法，該方法包括1.從質(zhì)量標(biāo)記物所結(jié)合的感興趣的分子上將該質(zhì)量標(biāo)記物解離；2.使解離的質(zhì)量標(biāo)記物電離；3.選擇預(yù)定質(zhì)荷比的離子，該質(zhì)荷比對(duì)應(yīng)于質(zhì)量分析儀中已知質(zhì)量標(biāo)記物的優(yōu)選離子的質(zhì)荷比；4.通過(guò)碰撞誘導(dǎo)這些選擇的離子解離；5.檢測(cè)碰撞產(chǎn)物以鑒別指示所選擇的質(zhì)量標(biāo)記物的碰撞產(chǎn)物。
較佳的是，從質(zhì)量標(biāo)記物結(jié)合的核酸中解離質(zhì)量標(biāo)記物的過(guò)程是在質(zhì)譜儀中進(jìn)行的，較佳在離子源中進(jìn)行。還較佳的是，質(zhì)量標(biāo)記物是預(yù)先電離的。在這個(gè)實(shí)施方式中，這些標(biāo)記物僅需從液相或固相轉(zhuǎn)變成氣相(如果這些質(zhì)量標(biāo)記物是在液相或固相中的話)。通常，由質(zhì)譜儀的離子源中的質(zhì)量標(biāo)記物的解離引起質(zhì)量標(biāo)記物的電離步驟。
較佳的是，在串聯(lián)儀器的第一質(zhì)量分析儀中進(jìn)行選擇預(yù)定質(zhì)荷比的離子的第3步。然后，根據(jù)上述第4步，將所選擇的離子導(dǎo)入分離的碰撞孔中，它們?cè)谶@些孔中與氣體或固體表面碰撞。然后，根據(jù)上述第5步，將碰撞產(chǎn)物導(dǎo)入串聯(lián)儀器的另一質(zhì)量分析儀中，以檢測(cè)碰撞產(chǎn)物。用于本發(fā)明的典型的串聯(lián)儀器包括三重四極質(zhì)譜儀、串聯(lián)式扇形場(chǎng)儀器和四極飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。
還優(yōu)選的是，上述選擇預(yù)定質(zhì)荷比的離子的第三步、使所選擇的離子與氣體碰撞的第四步和檢測(cè)碰撞產(chǎn)物的第五步是在質(zhì)譜儀的相同區(qū)域內(nèi)進(jìn)行的。這可以在如離子俘獲質(zhì)量分析儀和傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀中進(jìn)行。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種分析質(zhì)量標(biāo)記的分析物分子的方法，該方法包括1.從質(zhì)量標(biāo)記物所結(jié)合的感興趣的分子上將該質(zhì)量標(biāo)記物解離；2.使解離的質(zhì)量標(biāo)記物電離；3.選擇預(yù)定質(zhì)荷比的離子，該質(zhì)荷比對(duì)應(yīng)于質(zhì)量分析儀中已知質(zhì)量標(biāo)記物的優(yōu)選離子的質(zhì)荷比；4.通過(guò)碰撞誘導(dǎo)這些選擇的離子解離；5.檢測(cè)一種以上的碰撞產(chǎn)物，以鑒別指示所選擇的質(zhì)量標(biāo)記物的碰撞產(chǎn)物離子模型，又可鑒別標(biāo)記的核酸。
在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方式的優(yōu)選方面，從質(zhì)量標(biāo)記物結(jié)合的核酸上解離質(zhì)量標(biāo)記物的過(guò)程是在質(zhì)譜儀中進(jìn)行的，較佳是在離子源中進(jìn)行。
在這個(gè)實(shí)施方式的某些優(yōu)選方面，質(zhì)量標(biāo)記物是預(yù)先電離的，僅需將它們由液相或固相轉(zhuǎn)變成氣相(如果質(zhì)量標(biāo)記物是在液相或固相中的話)。
在其它優(yōu)選的方面，由質(zhì)譜儀離子源中的質(zhì)量標(biāo)記物的解離引起質(zhì)量標(biāo)記物的電離步驟。
在某些方面，在串聯(lián)儀器的第一質(zhì)量分析儀中進(jìn)行選擇具有預(yù)定質(zhì)荷比的離子的第3步。然后，根據(jù)上述第4步，將所選擇的離子導(dǎo)入分離的碰撞孔中，在該孔中，這些離子與氣體或固體表面碰撞。然后，根據(jù)上述第5步，將碰撞產(chǎn)物導(dǎo)入串聯(lián)儀器的另一質(zhì)量分析儀中，檢測(cè)碰撞產(chǎn)物。典型的串聯(lián)儀器包括三重四極質(zhì)譜儀、串聯(lián)式扇形場(chǎng)儀器和四極飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。
在另一較佳實(shí)施方式中，所述選擇具有預(yù)定質(zhì)荷比的離子的第3步、使所選擇的離子與氣體碰撞的第4步和檢測(cè)碰撞產(chǎn)物的第5步是在質(zhì)譜儀的相同區(qū)域內(nèi)進(jìn)行的。這可以在離子俘獲質(zhì)量分析儀和傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀中進(jìn)行。串聯(lián)質(zhì)譜法以損失一些敏感性為代價(jià)，采用串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)檢測(cè)本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物在選擇性方面可獲得極大的增益。為了闡述本發(fā)明，現(xiàn)在對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行一些討論，在此參照三重四極質(zhì)譜儀進(jìn)行描述。三重四極可容易地闡述MS/MS的原理。
四極質(zhì)量分析儀主要是一個(gè)質(zhì)量過(guò)濾器，它可在任何時(shí)候設(shè)置為僅使具有特定質(zhì)荷比的離子通過(guò)。四極包含4個(gè)平行的棒狀電極，這些電極形成一個(gè)通道。將由正弦射頻電勢(shì)疊加的直流電勢(shì)施加到棒狀電極上。進(jìn)入由平行的棒狀電極形成的通道的離子跟蹤復(fù)雜的軌道，對(duì)于特定的直流電勢(shì)和射頻電勢(shì)，只有具有預(yù)定質(zhì)荷比的離子具有穩(wěn)定的軌道，這將使它們通過(guò)該通道。通過(guò)改變所施加的電勢(shì)，可將該四極制成超越整個(gè)質(zhì)荷比范圍的掃描，該質(zhì)荷比可達(dá)到約4000。
圖1顯示三重四極(Q)的排列。三個(gè)分離的四極質(zhì)譜分析儀串聯(lián)連接。第一個(gè)四極下文稱為Q1，類似地，第二個(gè)四極稱為Q2，第三個(gè)稱為Q3。四極Q1和Q3通常以掃描模式使用。掃描的速率非常高。或者，可將Q1和Q3用作“門”，這些門僅使經(jīng)選擇的離子通過(guò)。四極Q2以非掃描的模式使用，其中，它起到離子聚焦設(shè)備的作用。當(dāng)Q2是高真空時(shí)，所有的離子都通過(guò)Q2。當(dāng)將氣體注入Q2中時(shí)，進(jìn)入的離子與氣體碰撞，許多離子獲得足夠的能量來(lái)斷裂。這就是“碰撞誘導(dǎo)解離”(CID)。
研究了三重四極的一個(gè)特殊用途。假設(shè)離子是在離子源(A+、B+、C+、D+等)中產(chǎn)生的。如果使所有的這些離子通過(guò)Q1，而Q2和Q3以掃描模式運(yùn)行，則會(huì)產(chǎn)生完全的質(zhì)譜(圖11的質(zhì)譜1)。質(zhì)譜1顯示包含分子的離子A+到D+以及各種各樣的碎片離子的質(zhì)譜。
現(xiàn)在，假設(shè)Q1設(shè)置為僅僅可通過(guò)A+離子，Q2處于低壓狀態(tài)。A+離子通過(guò)Q2和Q3，并被檢測(cè)到(圖12中的質(zhì)譜2)。新的質(zhì)譜現(xiàn)在已“清除”了被Q1拒絕的其它離子(B+、C+等)。通過(guò)將Q1設(shè)置為在對(duì)應(yīng)于感興趣的分析物的特定離子種類的有限質(zhì)量系列內(nèi)掃描，可從注入質(zhì)譜儀中的同一樣品中檢測(cè)到多種分析物。這稱為“選擇性離子監(jiān)測(cè)”。
然而，三重四極可用于獲得進(jìn)一步的選擇性。A+可從幾種來(lái)源獲得(如，幾種離子可具有相同的質(zhì)荷比，都為100，但有不同的組成，如C7H16、C6H12O、C5H8O等)。假設(shè)兩有種組成的A+離子(A1+和A2+)，它們都具有相同的標(biāo)稱質(zhì)量(圖13和14中的質(zhì)譜3和4)。如果在Q1中選擇A+離子，并在Q2中進(jìn)行CID，則Q3的掃描將產(chǎn)生圖15所示的質(zhì)譜5。這就是“混合”質(zhì)譜。
假設(shè)已知離子P+、Q+(或僅僅是P+)可清楚地揭示A1+的存在。即，已知發(fā)生A1+→P++Q+的斷裂(反應(yīng))。不在Q3中掃描所有的離子，取而代之的是將Q3設(shè)置為僅檢測(cè)P+離子。從而，在離開(kāi)離子源后，離子A+、B+……被還原成正確的A+(＝A1+、A2+)離子，這些離子進(jìn)入Q2中。
經(jīng)CID后，僅有碎片離子P+被選擇，這些離子僅僅是A1+的特征。這被稱為“單一或選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)”，這種監(jiān)測(cè)是高度選擇的。更一般地說(shuō)，進(jìn)入Q1的離子的完全質(zhì)譜(圖11的質(zhì)譜1)在Q3中被還原成P+(圖16中的質(zhì)譜6)，而已知這些離子僅僅涉及A1+。
在隨后的一些討論中，實(shí)施例涉及使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物鑒別核苷酸或寡核苷酸。同樣可能的是，本發(fā)明的標(biāo)記物可與蛋白質(zhì)或肽或其它分析物一起使用，并且為了實(shí)施例的目的提及了寡核苷酸。為了分析寡核苷酸，假定質(zhì)量標(biāo)記物通過(guò)可斷裂的連接物共價(jià)連接于寡核苷酸?？刹捎酶鞣N機(jī)制將連接物斷裂，這些機(jī)制包括熱斷裂、化學(xué)斷裂、錐形電壓(cone voltage)斷裂或光致斷裂。在下述關(guān)于質(zhì)量標(biāo)記物的性能的討論中，假設(shè)這些標(biāo)記物已在電離期間或之前從它們所結(jié)合的核酸中解離下來(lái)。英國(guó)專利申請(qǐng)GB 9815163.2和GB 9815164.0公開(kāi)了優(yōu)選的可斷裂的連接物及其使用方法。圖20用示意圖列出了優(yōu)選的斷裂方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，可將選擇性離子監(jiān)測(cè)(SIM)與選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)結(jié)合的原理用于質(zhì)量標(biāo)記技術(shù)，從而產(chǎn)生二維檢測(cè)方法。如果A1+是從質(zhì)量標(biāo)記物獲得的離子，并因此是已知的組成和端裂模式的離子，那么在電離步驟中，不論產(chǎn)生多少離子，都可在沒(méi)有其它離子的任何干擾的情況下，通過(guò)在三重四極的第一四極中使A+離子通過(guò)，然后檢測(cè)A1+斷裂產(chǎn)物，即在三重四極的第三極中僅通過(guò)P+離子，從而鑒別該質(zhì)量標(biāo)記物。要檢測(cè)哪一個(gè)M/Z范圍是無(wú)關(guān)緊要的，并且也不再需要在質(zhì)譜中尋找“清晰”的窗口。
如上所述，本發(fā)明的一個(gè)方面提供可以式M-L-X表示的質(zhì)量標(biāo)記物。作為一個(gè)例子，A1+可以是下式所示的標(biāo)記物的分子離子 因此，M是芐基，L是酰胺鍵，X是吡啶基。將芐基環(huán)連接到吡啶基環(huán)的酰胺鍵特別易于通過(guò)碰撞而斷裂。因此，在碰撞時(shí)，A1+產(chǎn)生以下碎片離子 這表示P+。因此，P+的檢測(cè)意味著存在A1+，也即存在標(biāo)記物中的一種。該標(biāo)記物已被從所有其它離子中選擇性地鑒別出來(lái)，這有效地消除了“背景”污染。這意味著標(biāo)記的分析物不需要完全純化，并且這些標(biāo)記物不需要在質(zhì)譜儀外從分析物中解離和分離出來(lái)。采用這一原理，通?？商峁┮活愑米髻|(zhì)量標(biāo)記物的有用的化合物，所有這些標(biāo)記物具有通式M-L-X，其中，M通過(guò)易斷裂的鍵L(如酰胺鍵)連接于X，而X是用SRM檢測(cè)的離子。因此，X與以上所示的斷裂產(chǎn)物類似，稱為P+。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，以上闡述的質(zhì)量標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)通?？商峁┮唤M有用的質(zhì)量標(biāo)記物，所有的標(biāo)記物都具有相同的質(zhì)量，但是它們?nèi)砸子诒籗RM分解。使M0、M1……M4和X0、X1……X4成為M-L-X一半的同位形，其中L是連接M和X的酰胺鍵?？稍俅问褂蒙鲜鰳悠?。如果這種結(jié)構(gòu)被氟取代，則可產(chǎn)生圖2所示的成分。這些標(biāo)記物成分可組合形成如下的質(zhì)量標(biāo)記物MX(暫時(shí)忽略可斷裂的鍵L)M0X4、M1X3、M2X2、M3X1、M4X0這五種物質(zhì)具有完全相同的質(zhì)量(圖3)。因此，如果在三重四極的Q1中選擇一種質(zhì)量標(biāo)記物，則僅有其質(zhì)量等于MmXn(m＝0-4，n＝4-0)的離子會(huì)被選擇。Q1被設(shè)置為僅尋找MX離子。如圖21所示，如果在Q2中進(jìn)行CID，則可將Q3設(shè)置為儀讓離子X(jué)0、X1、X2、X3和X4通過(guò)。
因此，在所有具有相同質(zhì)量的標(biāo)記物中，在Q1中會(huì)有5種質(zhì)量標(biāo)記物被選擇，然后可在Q3中鑒別下面所示的斷裂反應(yīng)。如果在Q3中檢測(cè)到139的質(zhì)量，則它必須由M3X1產(chǎn)生，依此類推M0X4+→X4+(m/z 193)M1X3+→X3+(m/z 175)M2X2+→X2+(m/z 157)M3X1+→X1+(m/z 139)M0X4+→X0+(m/z 121)本方法的選擇過(guò)程可用圖17中的二維質(zhì)譜——質(zhì)譜7形象化表示。
在另一方法中，可合成不同組的質(zhì)量標(biāo)記物。在這種分析模式中，SRM與“選擇性離子監(jiān)測(cè)”(SIM)組合。在SIM模式的分析中，第一四極(Q1)選擇性掃描了預(yù)定的質(zhì)量，僅讓具有預(yù)定質(zhì)量的離子通過(guò)。
再次考慮到圖2和3中的M0、M1、M2、M3、M4和X0，可組合這些標(biāo)記物成分可組合產(chǎn)生5種具有不同質(zhì)量的標(biāo)記物，分別是M0X0、M1X0、M2X0、M3X0和M4X0?，F(xiàn)在，假設(shè)三重四極的Q1設(shè)置為選擇這5種質(zhì)量，那么Q3僅需設(shè)置為檢測(cè)1個(gè)質(zhì)量(X0)，如圖4所示。
因此，質(zhì)譜儀僅檢測(cè)1種固定的離子(X0)。由于X0必須僅僅來(lái)自M0X0、M1X0、M2X0、M3X0和M4X0，并且已知這些物質(zhì)已在Q1中被選擇，所以這提供了質(zhì)量標(biāo)記的另一種模式。現(xiàn)在，可由5個(gè)特殊的“單一反應(yīng)”中的一個(gè)來(lái)鑒別5種不同的分析物M0X0→X0M1X0→X0M2X0→X0M3X0→X0M4X0→X0這產(chǎn)生了不同的二維質(zhì)譜，如圖18的質(zhì)譜8所示。
可將上述兩種方法組合。假設(shè)選擇M0、M1、M2、M3表示二核苷酸的第一個(gè)堿基。第二個(gè)堿基的特點(diǎn)以X0、X1、X2和X3表示，產(chǎn)生16種不同的質(zhì)量標(biāo)記物，如表3所示
表3

各質(zhì)量標(biāo)記物將具有7種不同質(zhì)量中的一種，它們可在串聯(lián)儀器的第一質(zhì)量分析儀中選擇。使用第二質(zhì)量分析儀中鑒別的碰撞產(chǎn)物鑒別二聚體。因此，用8種標(biāo)記物成分可能產(chǎn)生16種質(zhì)量標(biāo)記物。所有這些標(biāo)記物的完全質(zhì)量二維質(zhì)譜在圖19的質(zhì)譜9中顯示。類似地，如果需要256種質(zhì)量標(biāo)記物，則兩組16種成分，即M0到M15和X0到X15，會(huì)產(chǎn)生足夠的標(biāo)記物，其中，各標(biāo)記物會(huì)具有31種不同的質(zhì)量中的一種。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，使用質(zhì)量系列修飾基團(tuán)還可能產(chǎn)生質(zhì)量標(biāo)記物組的陣列。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，組中各標(biāo)記物具有相同的質(zhì)量，但是可被SRM分解的一組標(biāo)記物，可通過(guò)將組中的各成員連接到質(zhì)量系列修飾基團(tuán)上而擴(kuò)展成附加組標(biāo)記物，所述質(zhì)量系列修飾基團(tuán)將該組中各成員的質(zhì)量按預(yù)定量轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生總質(zhì)量與第一組不同的第二組標(biāo)記物。因此，在質(zhì)量分析儀的第一四極中采用SIM，使兩組不同的質(zhì)量標(biāo)記物離子通過(guò)，然后通過(guò)監(jiān)測(cè)兩組標(biāo)記物的相同的碎片種類，在第三四極中分析碰撞產(chǎn)物。使用不同的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)，可產(chǎn)生與在質(zhì)譜儀中輕松地分析那樣清楚的許多不同組的標(biāo)記物。
較佳的是，質(zhì)量系列修飾基團(tuán)(S)是抗碎裂性基團(tuán)，這樣當(dāng)各個(gè)S基團(tuán)連接到標(biāo)記物組中的各成員上時(shí)，產(chǎn)生新的標(biāo)記物組，這些基團(tuán)明顯地從標(biāo)記物的陣列中的其它每一個(gè)標(biāo)記物中分解。在本文中，“可分解”指陣列中的各組標(biāo)記物較佳以至少約4道爾頓與其它每一組分離。這將確保質(zhì)譜中一種標(biāo)記物的同位素峰不會(huì)與另一種標(biāo)記物的峰重疊。在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，S基團(tuán)是取代的或未取代的環(huán)狀基團(tuán)，如芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)基，優(yōu)選通過(guò)醚鍵連接于SRM可分解的質(zhì)量標(biāo)記基團(tuán)組的成員。陣列中的各組可具有相同的S基團(tuán)，但具有不同水平的取代，以確保各組互不相同。這類標(biāo)記物的陣列的例子在圖6中顯示。在此陣列中，F(xiàn)原子用作取代基(調(diào)節(jié)部分)，但可使用其它的取代基，如甲基。應(yīng)弄清楚的是，這類標(biāo)記物的陣列對(duì)任何結(jié)合的分析物分子的移動(dòng)性將具有非常類似的影響。
可使用甲基取代的苯基將附加組的標(biāo)記物加到這種陣列中，也可用甲基和氟基取代的苯基。甲基與氟基的質(zhì)量的不同之處在于甲基比氟基少4道爾頓，這樣可產(chǎn)生如此明顯的陣列的標(biāo)記物，這些標(biāo)記物對(duì)所結(jié)合的分析物的移動(dòng)性的影響或許是最小的。
在本發(fā)明這方面的其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，S基團(tuán)是環(huán)狀基團(tuán)如芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)基的寡聚物或聚合物，這些基團(tuán)也可以是取代的基團(tuán)。尤其是，優(yōu)選的S基團(tuán)是聚芳基醚。這種陣列的一個(gè)例子在圖7中顯示。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，通過(guò)用本發(fā)明質(zhì)量標(biāo)記物的不同組合標(biāo)記分析物，可進(jìn)一步利用上述原理。如上所述，這個(gè)實(shí)施方式是混合模式標(biāo)記。當(dāng)必須鑒別大量分析物中的任何一個(gè)單獨(dú)的分析物時(shí)，例如，在組合化學(xué)中，可選擇標(biāo)記物如M0X3、M1X2、M2X1、M3X0的混合物。該混合物與分析物連接，這樣將存在特定數(shù)量的各標(biāo)記物。例如，aM0X3+bM1X2+cM2X1+dM3X0，其中a＝b＝b＝d＝1(圖5)。如果等量的四種標(biāo)記物(a＝b＝c＝d＝0.25)在相同的反應(yīng)中結(jié)合于一種分析物，則它們之間的化學(xué)連接反應(yīng)不可能區(qū)分。當(dāng)寡核苷酸被標(biāo)記時(shí)，該寡聚物將以每個(gè)核苷酸或寡核苷酸1個(gè)以上標(biāo)記物被質(zhì)量標(biāo)記。表4顯示三種質(zhì)量標(biāo)記物的形式表4 <p>本文中提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)，如同各個(gè)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和個(gè)別地指出全文引用作為參考一樣，在同一范圍被全文引用作為參考。
表1

可以看出該原理可延伸。在本發(fā)明的一些方面中，最好是要采用上述策略標(biāo)記256種可能的四聚體。需要產(chǎn)生7種不同的標(biāo)記物，這些標(biāo)記物以上面顯示的所有可能的組合比例混合。或者，如果這些標(biāo)記物是圖6或7中顯示的形式，則如圖6所示，通過(guò)使用4種不同的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)，以產(chǎn)生不同組的5種標(biāo)記物，從而可產(chǎn)生上述實(shí)施例所示的4組81種編碼類型。這會(huì)產(chǎn)生足夠的標(biāo)記物，以編碼所有可能的256種四聚體。
本發(fā)明這方面的原理還可進(jìn)一步延伸?？紤]含有所有256種可能的天然核苷酸的組合的DNA四聚體庫(kù)。該系列中的每個(gè)四聚體可以1到256的數(shù)字表示，即AAAA表示為1，AAAC表示為2，到TTTT表示為256。
數(shù)值1到256以二進(jìn)制表示，例如，可表示為計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)寄存器中表示的數(shù)目的形式。在寄存器中有一系列的開(kāi)關(guān)，這些開(kāi)關(guān)可表示數(shù)值28、27、26、25、24、23、22、21和20。為了表示1-256中的任何一個(gè)數(shù)值，這些開(kāi)關(guān)處于開(kāi)和關(guān)的狀態(tài)，以便這些二進(jìn)制數(shù)的冪的總和表示原始的十進(jìn)制數(shù)，如下面的表6所示表6

使用質(zhì)量標(biāo)記物分子可獲得與這些數(shù)值類似的表示方法，其中，儲(chǔ)存器中的各開(kāi)關(guān)由特定分子的存在或缺乏表示。因而，為了鑒別四聚體，可使用標(biāo)記物的混合物標(biāo)記該四聚體，該混合物表示鑒別該四聚體的數(shù)量，例如，如果AACG由數(shù)字7表示，則可用表示22的分子與表示21和20的分子的混合物標(biāo)記該四聚體，從而將其鑒別。
事實(shí)上，在用不同數(shù)量的特定取代基或同位素(如不同數(shù)量的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，如氟原子或不同的氘同位素)取代核心分子的基礎(chǔ)上，這些分子可表示為一系列的分子。因此，20可由無(wú)氟取代基的核心分子表示，21可由具有1個(gè)氟取代基的核心分子表示，類似地，28可由具有8個(gè)氟取代基的核心分子表示。當(dāng)采用質(zhì)譜法分析這些分子時(shí)，它們可與互補(bǔ)的成分組合，以產(chǎn)生9種同量異位的標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可在串聯(lián)儀器中分析。
因此，在四聚體為AACG的例子中，可用上面顯示的標(biāo)記物0、1和2標(biāo)記此寡聚物。很明顯，如圖10所示，其它所有可能的四聚體可以這種二進(jìn)制的方式表示，并且僅僅需要8種基本的標(biāo)記物來(lái)鑒別它們。采用SRM進(jìn)行DNA測(cè)序使用上述形式的質(zhì)量標(biāo)記物可有效地進(jìn)行Sanger測(cè)序梯分析。Sanger方法學(xué)的常規(guī)DNA測(cè)序使用DNA聚合酶將大量的二脫氧/脫氧核苷酸加到寡核苷酸引物中，然后以模板特異性的方式退火，產(chǎn)生單鏈DNA模板。當(dāng)將終止核苷酸，即二脫氧核苷酸加到模板補(bǔ)充物中時(shí)，可隨機(jī)終止此過(guò)程。當(dāng)在變性聚丙烯酰胺凝膠上或毛細(xì)管中分離隨機(jī)終止的鏈時(shí)，產(chǎn)生了“DNA梯”。通常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)長(zhǎng)度分離終止片段，接著檢測(cè)該“DNA梯”，可收集到序列信息。在常規(guī)的半自動(dòng)和自動(dòng)DNA測(cè)序儀中(如Perkin Elmer的ABI377或MolecularDynamics的MegaBACE)，使用熒光標(biāo)記物F1、F2、F3和F4，通過(guò)將熒光標(biāo)記物加到一種終止核苷酸中或者反應(yīng)中使用的引物中，從而鑒別出四種終止堿基A、C、G和T。然后尋找通過(guò)掃描凝膠或毛細(xì)管的檢測(cè)器的四種染料，讀取此序列梯。其它熒光檢測(cè)形式也是可能的。給單一模板測(cè)序在質(zhì)譜法中，用熒光標(biāo)記物替換質(zhì)量標(biāo)記物(如圖3所示的M0X4、M1X3、M2X2、M3X1、M4X0)?，F(xiàn)在，用M1X3標(biāo)記腺苷的二脫氧終止子。類似地，用M2X2標(biāo)記胞苷的二脫氧終止子，用M3X1標(biāo)記鳥苷的終止子，用M4X0標(biāo)記胸苷的終止子。以在線的方式，在條帶從毛細(xì)管中洗脫出來(lái)時(shí)，將它們噴射入適當(dāng)?shù)拇?lián)質(zhì)量分析儀的離子源中，如根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面用于分析質(zhì)量標(biāo)記的核酸的三重四極。通常，在離子源中，這些標(biāo)記物從序列梯各片段的終止堿基中解離下來(lái)，進(jìn)入三重四極的第一質(zhì)量分析儀Q1中。Q1設(shè)置為僅僅讓MX的分子離子通過(guò)，而Q3設(shè)置為尋找標(biāo)記物X0到X4?？赡苄枰氖?，質(zhì)量中的一種，比如X4應(yīng)用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，即該質(zhì)量總是存在，而X0、X1、X2和X3是相對(duì)于X4進(jìn)行測(cè)量的。
在另一種方法中，可用圖4所示的4種標(biāo)記物標(biāo)記這四種終止核苷酸，這樣現(xiàn)在用M1X0標(biāo)記腺苷的二脫氧終止子。類似地，用M2X0標(biāo)記胞苷的二脫氧終止子，用M3X0標(biāo)記鳥苷的終止子，而用M4X0標(biāo)記胸苷的終止子。如果需要，可將標(biāo)記物M0X0用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。在這個(gè)實(shí)施方式中，三重四極的Q1設(shè)置為讓標(biāo)記物M4X0到M0X0的分子離子通過(guò)，而Q3設(shè)置為尋找標(biāo)記物X0。
除了核苷酸終止子標(biāo)記的測(cè)序外，也可進(jìn)行引物標(biāo)記的測(cè)序。PCT/GB98/02048提供了引物標(biāo)記的測(cè)序的詳細(xì)描述，該測(cè)序可使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物。具有質(zhì)量標(biāo)記物的模板的多重測(cè)序使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物可同時(shí)分析一種以上的模板，這是因?yàn)榭砷_(kāi)發(fā)4種以上的標(biāo)記物。這意味著可產(chǎn)生多組4種標(biāo)記物，以根據(jù)上述基于最初由Sanger設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行多模板的分析。關(guān)于核酸模板的多重測(cè)序的詳細(xì)描述由PCT/GB98/02048提供，該測(cè)序可使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物。
可將圖6或7所示形式的質(zhì)量標(biāo)記物用于多重分析多DNA序列。在質(zhì)譜儀中可通過(guò)不同的質(zhì)量系列修飾物從其它每一組中分解的各組5個(gè)標(biāo)記物，可用于鑒別單一模板，如果需要，可將一個(gè)多余的標(biāo)記物用作大小/數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)。但是，4個(gè)一組的標(biāo)記物已足以進(jìn)行測(cè)序，大小標(biāo)準(zhǔn)不是必需的。因而，使用圖6所示的20個(gè)標(biāo)記物的陣列來(lái)同時(shí)分析5個(gè)模板的Sanger反應(yīng)產(chǎn)物是可能的。基因表達(dá)的描述(Profiling)已發(fā)展了各種分析從聚腺苷酸化信使RNA衍生的互補(bǔ)DNA群的方法。大量的這種方法是以通過(guò)電泳分離擴(kuò)增的cDNA庫(kù)，檢測(cè)不同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物或限制產(chǎn)物為基礎(chǔ)。通常，這些技術(shù)的基礎(chǔ)是由衍生自聚腺苷酸化信使RNA的互補(bǔ)DNA(cDNA)庫(kù)中的成員產(chǎn)生特征性的限制片段或擴(kuò)增產(chǎn)物。
示差顯示〔Laing和Pardee，《科學(xué)》(Science)，257，967-971，1992〕是基于電泳的基因表達(dá)描述的經(jīng)典方法。已發(fā)展了這種技術(shù)的概念，導(dǎo)致這種技術(shù)得以改進(jìn)地繼承?；凇胺肿又笜?biāo)”的表達(dá)描述方法使用了IIS型或IP型的限制性內(nèi)切核酸酶如Sibson(PCT/GB93/0145)或Kato(EP0 735 144 A1)，這是一類繼承的例子。尤其是WO 98/48047公開(kāi)了基于毛細(xì)管電泳質(zhì)譜法(CEMS)的分子指標(biāo)法。
在此方法中，使用錨定的和生物素化的多腺苷引物合成cDNA，這可確保所有的cDNA以固定的長(zhǎng)度的短多A尾終止。在“錨定引物”cDNA制備中，使用具有大約18個(gè)脫氧胸苷殘基的寡核苷酸俘獲和注入攜帶mRNA的多A，該寡核苷酸的3′端具有三種剩余的堿基中的一種，它將引物錨定在多A鏈的末端上。引物的生物素化使cDNA被固定在抗生物素蛋白化的固相載體上?？捎闷胀ǖ腎I類限制性內(nèi)切核酸酶切割這些被俘獲的cDNA。這使3′末端的限制性片段留在固相載體上，而其它片段則被洗掉。將一個(gè)銜接子連接到所得的已知的粘性末端上。將該銜接子設(shè)計(jì)成攜帶II類限制性內(nèi)切核酸酶結(jié)合位點(diǎn)。這些酶結(jié)合它們的靶序列，但在遠(yuǎn)離結(jié)合位點(diǎn)確定數(shù)量的堿基處將潛伏DNA(underlying DNA)切割。這些酶中的某些產(chǎn)生交錯(cuò)切口；例如，fok1產(chǎn)生不明確的4bp粘性末端。如果用這種酶處理cDNA群，則粘性末端將暴露在群中各cDNA的銜接末端中。使用一類銜接子分子來(lái)探測(cè)那4種暴露的堿基。有了4bp的不明確的粘性末端，將存在256種可能的候選物。為了鑒別這些探針，使用可斷裂的連接物使這些探針標(biāo)記上質(zhì)量標(biāo)記物，以致一種獨(dú)特的質(zhì)量標(biāo)記物鑒別256種可能的4bp銜接子中的每一種。這產(chǎn)生了一組根據(jù)普通的II類限制性內(nèi)切核酸酶的切割而具有不同長(zhǎng)度的片段，和該cDNA的5′末端上256種可能的質(zhì)量標(biāo)記的銜接子的一種。
然后在長(zhǎng)度的基礎(chǔ)上，采用毛細(xì)管電泳，接著分析連接于cDNA片段末端的質(zhì)量標(biāo)記物，從而分離這些質(zhì)量標(biāo)記的3′限制性片段。直接將CE柱填充到電噴射質(zhì)譜儀或相等的質(zhì)譜儀中。在電離時(shí)，這些標(biāo)記物在質(zhì)譜儀中從它們所結(jié)合的限制性片段中解離下來(lái)。測(cè)定各條帶中存在的對(duì)應(yīng)于不同的限制性片段長(zhǎng)度的從毛細(xì)管電泳柱上洗脫下來(lái)的各質(zhì)量標(biāo)記物的數(shù)量。這個(gè)過(guò)程獲得各cDNA的信號(hào)，可用這種信號(hào)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)。
這種技術(shù)較佳是使用256種質(zhì)量標(biāo)記物。采用常規(guī)的方法進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)記可產(chǎn)生質(zhì)量標(biāo)記物陣列，這些質(zhì)量標(biāo)記物以約4道爾頓分離，該陣列跨越了1000道爾頓以上的質(zhì)量范圍。不可能的是，在所有的標(biāo)記物都對(duì)所結(jié)合的cDNA限制性片段的遷移產(chǎn)生相同的影響時(shí)可產(chǎn)生這些標(biāo)記物的陣列。這意味著必須使用復(fù)雜的校正算法來(lái)計(jì)算移動(dòng)中的差異，并精確測(cè)定片段長(zhǎng)度。但是，本發(fā)明的這些質(zhì)量指示物和相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)記物非常適合用于上述方法，以產(chǎn)生其對(duì)相關(guān)的分析物分子的遷移的影響相同的質(zhì)量指示物陣列，以及直接測(cè)定具有高敏感性和優(yōu)異的信噪比的片段長(zhǎng)度。
第二類電泳技術(shù)是以采用普通的II類限制性內(nèi)切核酸酶為基礎(chǔ)，該酶用于將引物序列導(dǎo)入cDNA限制性片段中。使用標(biāo)記的引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增可產(chǎn)生不同的限制性片段，這可用于鑒別它們所結(jié)合的mRNA。這類方法包括US5,712,126中所述的方法，該文公開(kāi)了一種將銜接子導(dǎo)入限制性內(nèi)切核酸酶消化的cDNA片段中的方法，該銜接子使選擇性擴(kuò)增以及3′末端cDNA片段的標(biāo)記得以進(jìn)行。類似地，WO 99/02727公開(kāi)了一種擴(kuò)增3′末端限制性片段的方法，該方法使用固相載體和探測(cè)鄰近已知限制性位點(diǎn)的未知序列的PCR引物。在這種技術(shù)中，使用生物素錨定的引物制備cDNA，這確保了所有的cDNA都以具有固定長(zhǎng)度的短多A尾終止，并且所有的cDNA都可固定在固相基質(zhì)上。多T引物可在其5′端額外攜帶一引物序列。然后用普通的II類限制性內(nèi)切核酸酶切割俘獲的cDNA。將銜接子連接到所得的已知的粘性末端上。該銜接子設(shè)計(jì)為攜帶一個(gè)引物序列。然后使所得的雙鏈構(gòu)建物變性。如果需要，可將沒(méi)有固定的鏈洗掉。將一類與銜接子引物互補(bǔ)的引物加到上述經(jīng)變性的混合物中，該引物在鄰近該銜接子引物的未知序列上有4個(gè)堿基的重疊。這4個(gè)堿基的重疊產(chǎn)生256種可能的引物。為了鑒別這些探針，使用可斷裂的連接物將它們標(biāo)記上質(zhì)量標(biāo)記物，這樣，在質(zhì)譜儀中，256種可能的4bp重疊中的每一種都可用唯一的可鑒別的標(biāo)記物鑒別。這產(chǎn)生了一組根據(jù)普通的II類限制性內(nèi)切核酸酶的切割而具有不同長(zhǎng)度的片段，和在cDNA的5′末端的256種可能的質(zhì)量標(biāo)記的引物的一種。視需要，可進(jìn)行變性和引物延伸循環(huán)多次。如果僅僅用銜接子引物位點(diǎn)，則可進(jìn)行線性擴(kuò)增。這使cDNA定量的失真比指數(shù)擴(kuò)增小。如果需要進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，那么用于俘獲mRNA的多T寡聚物還必須攜帶一個(gè)引物位點(diǎn)。如果必須分析少的組織樣品，那么盡管存在潛在的cDNA頻率失真，但可能仍需要進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。
再一，在限制性片段的長(zhǎng)度的基礎(chǔ)上，采用毛細(xì)管電泳，接著分析cDNA片段末端上的質(zhì)量標(biāo)記物，從而分離出質(zhì)量標(biāo)記物的3′限制性片段。這種技術(shù)與WO98/48047中公開(kāi)的一樣，較佳是使用256種質(zhì)量標(biāo)記物進(jìn)行，因而同樣地受益于本發(fā)明質(zhì)量標(biāo)記物的有利特征。
因此，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供一種分析的方法，該方法包括下述步驟1.提供一組具有不同長(zhǎng)度的質(zhì)量標(biāo)記的核酸片段，其中這些質(zhì)量標(biāo)記物表現(xiàn)出標(biāo)記的核酸的特征；2.在標(biāo)記的片段的大小的基礎(chǔ)上將它們分離；3.從標(biāo)記的片段分離質(zhì)量標(biāo)記物；4.在質(zhì)譜儀中檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物。
在本發(fā)明這方面的某些實(shí)施方式中，該試驗(yàn)測(cè)定核酸或一系列核酸的序列。在以Sanger梯的產(chǎn)生為基礎(chǔ)的測(cè)序?qū)嵤┓绞街?，質(zhì)量標(biāo)記物鑒別各片段的終止核苷酸，并且，各片段由一組4種標(biāo)記物鑒別。在Sanger測(cè)序?qū)嵤┓绞街?，?biāo)記物是以質(zhì)量標(biāo)記的引物或標(biāo)記的終止核苷酸導(dǎo)入的。
在本發(fā)明這方面的其它實(shí)施方式中，該試驗(yàn)用于測(cè)定表達(dá)的RNA分子的身份和數(shù)量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采用WO 98/48047或WO 99/02727中公開(kāi)的方法制備質(zhì)量標(biāo)記的核酸。在采用這些方法的實(shí)施方式中，分別通過(guò)質(zhì)量標(biāo)記的銜接子的連接作用或質(zhì)量標(biāo)記的引物的延伸作用，將質(zhì)量標(biāo)記物導(dǎo)入核酸片段中。對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，應(yīng)清楚的是，基于核酸片段大小的基因表達(dá)描述的其它方法，如PCT/GB93/0145、EP-A-0 735 144或US5,712,126中公開(kāi)的方法，都適于使用本發(fā)明的標(biāo)記物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在尺寸的基礎(chǔ)上分離分析物的步驟是采用毛細(xì)管電泳或高效液相層析法進(jìn)行，使用如Transgenomic Inc.(San Jose，加利福尼亞州，美國(guó))提供的和US5,585,236、US5,772,889以及其它申請(qǐng)中公開(kāi)的系統(tǒng)。較佳的是，這種分離是使用質(zhì)譜儀以在線的方式進(jìn)行。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將質(zhì)量標(biāo)記物從它們所結(jié)合的分析物中分離出來(lái)的步驟在質(zhì)譜儀的離子源中進(jìn)行。在PCT/GB98/00127中公開(kāi)了使質(zhì)量標(biāo)記物在質(zhì)譜儀的離子源中易于從它所結(jié)合的分析物上解離的連接物。在PCT/GB98/00127中公開(kāi)了增加采用質(zhì)譜法檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物的敏感性的化合物。
對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，應(yīng)清楚的是，其它定尺寸的試驗(yàn)也適于使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物，包括如Grossman P.D.等人在《核酸研究》〔“Nucleic AcidsResearch”，1994年10月25日，22(21)4527-34)中公開(kāi)的復(fù)合的基因型試驗(yàn)。這種試驗(yàn)將極大地受益于復(fù)合到較高數(shù)量級(jí)并仍容易地分解片段大小的能力。蛋白質(zhì)表達(dá)描述和雙向凝膠電泳描述蛋白質(zhì)的技術(shù)，即編錄組織中表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的身份和數(shù)量的技術(shù)，在自動(dòng)化或處理量方面還沒(méi)有得到很好的發(fā)展。描述一組蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法是雙向電泳〔R.A.Van Bogelen.，E.R.Olson，《雙向蛋白質(zhì)凝膠在生物技術(shù)中的應(yīng)用》(“Application of two-dimensional protein gels in biotechnology”)，Biotechnol.Ann.Rev.，169-103，1995〕。在這個(gè)方法中，在窄的凝膠帶上分離從生物樣品中抽提得到的蛋白質(zhì)樣品。第一次分離通常在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)基礎(chǔ)上將它們分離。然后將整條凝膠帶靠一長(zhǎng)方形的凝膠(如聚丙烯酰胺凝膠)的一個(gè)邊緣放置。之后，凝膠帶中被分離的蛋白質(zhì)在第二條凝膠帶中根據(jù)它們的大小被電泳分離，如采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。這種方法的速度慢，而且很難自動(dòng)化。它在其最簡(jiǎn)單的顯現(xiàn)方面也相對(duì)不敏感。一旦分離結(jié)束，蛋白質(zhì)必須是可見(jiàn)的。這通常涉及到使用可在視覺(jué)上檢測(cè)的試劑或熒光染色凝膠。也采用放射性標(biāo)記和放射自顯影術(shù)。在另外一些方法中，在分離前，可先使熒光染料可共價(jià)連接于樣品中的蛋白質(zhì)。染料的共價(jià)添加可改變蛋白質(zhì)的移動(dòng)性，因而，這有時(shí)不太可取，尤其是如果是與雙向凝膠影像的公眾數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的情況。使蛋白質(zhì)在凝膠上可視化后，通常需要在凝膠的特定點(diǎn)上鑒別蛋白質(zhì)。通常將該點(diǎn)從凝膠中切下，從凝膠基質(zhì)中抽提蛋白質(zhì)。然后采用各種技術(shù)鑒別抽提得到的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的技術(shù)包括蛋白質(zhì)的消化，接著進(jìn)行微測(cè)序。已作了許多改進(jìn)，以增加雙向凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)的分辨率，并增進(jìn)該系統(tǒng)的敏感性。增進(jìn)雙向凝膠電泳的敏感性及其分辨率的一種方法是采用質(zhì)譜法分析凝膠的特定位點(diǎn)中的蛋白質(zhì)〔Jungblut P.，Thiede B.，《采用MALDI質(zhì)譜法從雙向凝膠中鑒別蛋白質(zhì)》(“Proteinidentification from 2-D gels be MALDI mass spectrometry”)，Mass Spectrom.Rev.，16，145-162，1997〕。這樣的一種方法是在凝膠中進(jìn)行胰蛋白酶消化，接著采用質(zhì)譜法分析胰蛋白酶消化片段，產(chǎn)生肽質(zhì)量指紋。如果需要序列信息，可進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜法分析。
目前，雙向分析是相對(duì)慢的“批量”方法。它的再現(xiàn)性也不是非常好，而且分析凝膠也很昂貴。由于基于凝膠的分析的大多數(shù)成本都在對(duì)各凝膠的處理上，所以，需要的是能在雙向凝膠上同時(shí)復(fù)合許多樣品。如果用不同的、獨(dú)立的可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記不同樣品中的蛋白質(zhì)是可能的話，那么可在同一凝膠上同時(shí)分析各樣品中的蛋白質(zhì)。這對(duì)于需要隨著特定生物體中的相同蛋白質(zhì)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的性質(zhì)進(jìn)行的研究特別有價(jià)值，例如，在監(jiān)測(cè)細(xì)菌如何在一預(yù)定的時(shí)間過(guò)程中對(duì)藥物應(yīng)答的研究中。類似地，將從多位患有相同疾病的患者獲得的活檢材料與相應(yīng)的對(duì)照進(jìn)行比較，需要確保從不同的樣品獲得的相同蛋白質(zhì)在凝膠上的相同位點(diǎn)停止。使所有的樣品在相同的凝膠上移動(dòng)，可對(duì)不同的樣品進(jìn)行比較，而勿需考慮到凝膠分離的再現(xiàn)性。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，需要對(duì)不同樣品中的蛋白質(zhì)的移動(dòng)性的影響相同的一系列標(biāo)記物，這樣各樣品中被不同的標(biāo)記物標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)仍將停留在凝膠的相同位置上，而與其標(biāo)記物無(wú)關(guān)。
最近，在采用質(zhì)譜法分析由液相色譜或毛細(xì)管電泳分級(jí)分離的全蛋白質(zhì)方面已作出嘗試〔Dolnik V，《蛋白質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳》(“Capillary zone electrophoreisof proteins”)，Electrophoresis，18，2353-2361，1997〕。已測(cè)試了利用毛細(xì)管電泳質(zhì)譜法的在線系統(tǒng)。但是，采用質(zhì)譜法分析全蛋白質(zhì)受到許多困難的困擾。第一個(gè)困難是，對(duì)復(fù)雜的質(zhì)譜進(jìn)行分析需要使單種蛋白質(zhì)達(dá)到多種電離狀態(tài)。第二個(gè)主要缺點(diǎn)是，目前對(duì)于高分子量的種類，即其質(zhì)量大于約4千道爾頓的離子，質(zhì)譜儀的質(zhì)量分辨率還非常差，因此要分辨質(zhì)量接近的蛋白質(zhì)是困難的。第三個(gè)缺點(diǎn)是，采用串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)全蛋白質(zhì)作進(jìn)一步分析也是困難的，因?yàn)槿鞍踪|(zhì)的斷裂模型非常復(fù)雜，且難以解釋。
PCT/GB98/00201和PCT/GB99/03258描述了通過(guò)分離從混合物中的蛋白質(zhì)得到的C末端肽，并采用質(zhì)譜法對(duì)它們進(jìn)行分析，從而表征蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物的方法。所述的方法可用于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)存在與否，但不會(huì)得出這些樣品之間的比較數(shù)據(jù)。這些方法沒(méi)有描述同時(shí)分析多個(gè)樣品的技術(shù)，而這類技術(shù)對(duì)于多樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的定量比較或許是必需的。
EP-A-0 594 164描述了在使用N末端測(cè)序試劑在C末端肽測(cè)序的方法中分離從蛋白質(zhì)得到的C末端肽的方法。在此方法中，用在C末端一側(cè)的賴氨酸殘基解離的內(nèi)肽酶消化感興趣的蛋白質(zhì)。所得的肽與DITC聚苯乙烯反應(yīng)，該DITC聚苯乙烯與所有游離的氨基基團(tuán)反應(yīng)?？捎萌宜?TFA)解離與DITC聚苯乙烯反應(yīng)的N末端氨基，從而釋放出所有肽的N末端。但是，賴氨酸的ε-氨基沒(méi)有被解離，因此，所有的非末端肽被保留在載體上，僅有C末端肽釋放。根據(jù)該文獻(xiàn)，回收這些C末端肽用于微測(cè)序。
《自然生物技術(shù)》〔Nature Biotechnology，17994-999(1999)〕公開(kāi)了采用“同位素編碼的親和標(biāo)記物”俘獲從蛋白質(zhì)得到的肽，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)分析。在這篇文章中，作者描述了生物素連接物的使用，該連接物與巰基反應(yīng)，以俘獲帶有半胱氨酸的肽。從一個(gè)來(lái)源得到的蛋白質(zhì)樣品與生物素連接物反應(yīng)，然后用內(nèi)肽酶解離。然后，在抗生物素蛋白化的珠上可分離含有肽的生物素化的半胱氨酸，用于接下來(lái)的質(zhì)譜分析。通過(guò)用生物素連接物標(biāo)記一個(gè)樣品，和用生物素連接物的變性形式標(biāo)記第二個(gè)樣品，可對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行定量比較。然后使樣品中的各肽表示為質(zhì)譜中的一對(duì)峰，其中，相對(duì)峰高度表示它們的相對(duì)表達(dá)水平。
這篇文獻(xiàn)中的方法有許多局限。在這種“同位素編碼”方法的各種局限中，第一個(gè)是，蛋白質(zhì)中巰基的存在的可靠性——許多蛋白質(zhì)沒(méi)有巰基，而其它有一些。在這種方法的一個(gè)變化中，可將連接物設(shè)計(jì)成與其它側(cè)鏈反應(yīng)(如胺)，但是，由于許多蛋白質(zhì)含有一種以上賴氨酸殘基，這這種方法中，每個(gè)蛋白質(zhì)將分離出多條肽。這可能不會(huì)減少足以進(jìn)行質(zhì)譜法分析的樣品的復(fù)雜性。含有太多種類的樣品可能會(huì)受到“離子抑制”的困擾，即某些種類比其它種類優(yōu)先電離，這種情況通常出現(xiàn)在較不復(fù)雜的樣品中的質(zhì)譜中。通過(guò)蛋白質(zhì)的側(cè)鏈將其俘獲通常要么使每種蛋白質(zhì)產(chǎn)生太多的肽，要么使某些蛋白質(zhì)一起遺漏。
這種方法的第二個(gè)局限是用來(lái)在比較從不同樣品得到的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的方法中。使用親和標(biāo)記物的不同的同位素變體標(biāo)記各樣品，每種樣品中的每條肽在質(zhì)譜中會(huì)產(chǎn)生額外的峰，這意味著如果一起分析兩份樣品，則在質(zhì)譜中將會(huì)有兩倍多的峰。類似地，如果一起分析三份樣品，質(zhì)譜將比單獨(dú)分析一份樣品要復(fù)雜三倍。試圖采用這種方法比較兩份或三份樣品是可行的，但是，這很可能是一種局限，因?yàn)榉鍞?shù)增加會(huì)增加兩種不同的肽在質(zhì)譜中具有重疊峰的可能性。
該文獻(xiàn)的作者報(bào)道的另一局限是由標(biāo)記物引起的移動(dòng)性的改變。這些作者報(bào)道，在用未變性的標(biāo)記物標(biāo)記的相同的肽之后，標(biāo)記了變性的生物素標(biāo)記物的肽有一點(diǎn)洗脫。
綜上所述，本發(fā)明的又一目的是，提供同時(shí)測(cè)定復(fù)雜的多肽混合物的許多樣品中多肽的身份和相對(duì)數(shù)量的改進(jìn)方法。本發(fā)明這方面的另一目的是，確保所有的蛋白質(zhì)在分析中表現(xiàn)。本發(fā)明的這方面還有一個(gè)目的是，提供可對(duì)多份樣品同時(shí)進(jìn)行定量分析，在與從單一樣品得到的質(zhì)譜進(jìn)行比較時(shí)，沒(méi)有顯著地增加質(zhì)譜的復(fù)雜性的質(zhì)量標(biāo)記物和技術(shù)。本發(fā)明這方面的最后一個(gè)目的是，提供對(duì)標(biāo)記的肽的移動(dòng)性具有相同的影響的標(biāo)記物，這樣在色譜法分離后具有不同標(biāo)記物的相同肽的樣品將一同洗脫。
因此，本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方式提供一種分析含有一種以上蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)樣品的方法，該方法包括1.用至少一種分離的可分解的質(zhì)量標(biāo)記物標(biāo)記樣品中的肽、多肽和/或蛋白質(zhì)，該質(zhì)量標(biāo)記物從本發(fā)明的組和陣列中獲得，這樣，各肽、多肽和/或蛋白質(zhì)都被標(biāo)記上對(duì)該蛋白質(zhì)唯一的標(biāo)記物或其組合；2.采用質(zhì)譜法分析這些標(biāo)記的肽、多肽和/或蛋白質(zhì)，較佳是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面如串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，以檢測(cè)連接于蛋白質(zhì)的標(biāo)記物。然后可鑒別該樣品中的標(biāo)記的肽，并測(cè)定它們的相對(duì)表達(dá)水平。
較佳的是，對(duì)多份樣品采用上述方法。還較佳的是，對(duì)于許多樣品中的每一份樣品，在進(jìn)行上述標(biāo)記步驟(1)之前，先使用斷裂劑(尤其是序列特異性斷裂劑)將肽從混合物中的多肽中分離出來(lái)。在標(biāo)記步驟(1)后，如果需要可將樣品集中。任選地，在標(biāo)記步驟(1)和/或集中樣品后，采用凝膠電泳、等電聚焦電泳、液相色譜法或其它適當(dāng)?shù)姆椒?，將肽、多肽?或蛋白質(zhì)從樣品中分離出來(lái)，較佳是產(chǎn)生分離的部分。這些部分可以是凝膠上的條帶或點(diǎn)，或者是從色譜法分離得到的液體部分?？墒褂玫诙N分離步驟進(jìn)一步分離從一個(gè)分離步驟中獲得的部分。類似地，進(jìn)一步分離得到的部分可再次分級(jí)分離，直到蛋白質(zhì)足以分解，以用于接下去的分析步驟中。
因此，本發(fā)明的這個(gè)方面提供本發(fā)明上述標(biāo)記物和方法的進(jìn)一步應(yīng)用。本發(fā)明標(biāo)記物組或陣列可用于增加生物體中蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳分析的處理量。每一種質(zhì)量標(biāo)記物都會(huì)以相同的方式改變它所結(jié)合的蛋白質(zhì)的移動(dòng)性，但它仍可獨(dú)立地被檢測(cè)到。在將質(zhì)譜法用于分析從雙向凝膠電泳獲得的蛋白質(zhì)的已知用途中，如肽質(zhì)量指紋法，需要從凝膠中抽提出蛋白質(zhì)，并將其純化，以除去去污劑(如SDS)和來(lái)自凝膠的其它污染。本發(fā)明的標(biāo)記物可使從凝膠得到的蛋白質(zhì)的相對(duì)未純化的抽提物直接導(dǎo)入質(zhì)譜儀中，然后可采用本發(fā)明的方法，在污染材料的背景中鑒別結(jié)合的標(biāo)記物。
在本發(fā)明這方面的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)多份樣品采用下述方法1.對(duì)于許多樣品中的每一份，使用序列特異性斷裂劑從混合物中的多肽中分離肽；2.用本發(fā)明的標(biāo)記物標(biāo)記各樣品中分離的肽，這樣每份樣品由獨(dú)特的標(biāo)記物鑒別
3.集中標(biāo)記的樣品；4.任選地，采用色譜法或電泳法分離該集中的和標(biāo)記的肽；5.采用串聯(lián)質(zhì)譜法分析標(biāo)記的樣品，以鑒別樣品中標(biāo)記的肽和測(cè)定它們的相對(duì)表達(dá)水平。
本發(fā)明這方面的另一優(yōu)選實(shí)施方式提供了一種分析一系列蛋白質(zhì)樣品的方法，各樣品含有一種以上蛋白質(zhì)，該方法包括1.使各份樣品的蛋白質(zhì)與至少一種分離的可分解的質(zhì)量標(biāo)記物發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，該質(zhì)量標(biāo)記物從本發(fā)明的組和陣列中獲得，這樣，各樣品的蛋白質(zhì)被標(biāo)記上一種或多種質(zhì)量標(biāo)記物，該標(biāo)記物不同于和其它每一份樣品的蛋白質(zhì)反應(yīng)的標(biāo)記物；2.集中質(zhì)量標(biāo)記的樣品；3.采用凝膠電泳、等電聚焦電泳、液相色譜法或其它適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x該集中的樣品，以產(chǎn)生分離的部分。這些部分可以是凝膠上的條帶或點(diǎn)，或者是從色譜法分離得到的液體部分?？墒褂玫诙N分離技術(shù)進(jìn)一步分離從一個(gè)分離步驟中獲得的部分。類似地，進(jìn)一步分離得到的部分可再次分級(jí)分離，直到所述蛋白質(zhì)足以分解，以用于接下去的分析步驟中；4.采用質(zhì)譜法分析這些部分，較佳的是，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面檢測(cè)連接于蛋白質(zhì)的標(biāo)記物。
本發(fā)明這方面的又一優(yōu)選實(shí)施方式提供一種鑒別樣品中的蛋白質(zhì)的方法，該樣品含有一種以上蛋白質(zhì)，該方法包括1.使樣品中的蛋白質(zhì)與至少一種分離的可分解的質(zhì)量標(biāo)記物發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，該質(zhì)量標(biāo)記物從本發(fā)明的組和陣列中獲得；2.采用凝膠電泳、等電聚焦電泳、液相色譜法或其它適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生分離的部分。這些部分可以是凝膠上的條帶或點(diǎn)，或者是從色譜法分離得到的液體部分。可使用第二種分離技術(shù)進(jìn)一步分離從一個(gè)分離步驟中獲得的部分。類似地，進(jìn)一步分離得到的部分可再次分級(jí)分離，直到所述蛋白質(zhì)足以分解，以用于接下去的分析步驟中；3.用序列特異性斷裂劑消化該部分中的蛋白質(zhì)；4.任選地使樣品中的蛋白質(zhì)與附加的質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)；5.采用液相色譜質(zhì)譜法分析消化的部分，其中，通過(guò)檢測(cè)連接于這些肽的質(zhì)量標(biāo)記物，測(cè)定質(zhì)量標(biāo)記的肽從液相色譜柱步驟中洗脫出來(lái)的時(shí)間。較佳是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)譜分析，以檢測(cè)連接于蛋白質(zhì)的標(biāo)記物；6.比較步驟5的液相色譜質(zhì)譜法分析得到的標(biāo)記的肽的洗脫特征與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征，也確定該蛋白質(zhì)以前是否已被鑒別。
本發(fā)明這方面的又一優(yōu)選實(shí)施方式提供從一系列蛋白質(zhì)樣品中鑒別一種蛋白質(zhì)的方法，所述各樣品含有一種以上的蛋白質(zhì)，該方法包括；1.使各份樣品的蛋白質(zhì)與至少一種分離的可分解的質(zhì)量標(biāo)記物發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，該質(zhì)量標(biāo)記物從本發(fā)明的組和陣列中獲得，這樣，各樣品的蛋白質(zhì)被標(biāo)記上一種或多種質(zhì)量標(biāo)記物，該標(biāo)記物不同于和其它每一份樣品的蛋白質(zhì)反應(yīng)的標(biāo)記物；2.集中質(zhì)量標(biāo)記的樣品；3.采用凝膠電泳、等電聚焦電泳、液相色譜法或其它適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x該集中的樣品，以產(chǎn)生分離的部分。這些部分可以是凝膠上的條帶或點(diǎn)，或者是從色譜法分離得到的液體部分。可使用第二種分離技術(shù)進(jìn)一步分離從一個(gè)分離步驟中獲得的部分。類似地，進(jìn)一步分離得到的部分可再次分級(jí)分離，直到蛋白質(zhì)足以分解，以用于接下去的分析步驟中；4.用序列特異性斷裂劑消化所述部分中的蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生針對(duì)樣品中的各蛋白質(zhì)的特征肽；5.任選地使樣品中的蛋白質(zhì)與附加的質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)；6.采用液相色譜質(zhì)譜法分析消化的部分，其中，通過(guò)檢測(cè)連接于這些肽的質(zhì)量標(biāo)記物，測(cè)定質(zhì)量標(biāo)記的肽從液相色譜柱步驟中洗脫出來(lái)的時(shí)間。較佳是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)譜分析，以檢測(cè)連接于所述蛋白質(zhì)的標(biāo)記物；7.比較步驟6的液相色譜質(zhì)譜法分析得到的標(biāo)記的肽的洗脫特征與數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征，也確定該蛋白質(zhì)以前是否已經(jīng)被鑒別。
本發(fā)明上述優(yōu)選實(shí)施方式的步驟1涉及本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物與一組蛋白質(zhì)的反應(yīng)性側(cè)鏈的共價(jià)反應(yīng)。本領(lǐng)域已知該反應(yīng)性側(cè)鏈官能度可以選擇性地反應(yīng)。反應(yīng)性側(cè)鏈包括賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸常自身交聯(lián)，形成二硫鍵。為了本發(fā)明的目的，不需要將這些二硫鍵破壞，但半胱氨酸側(cè)鏈可以是高度反應(yīng)性的，并且易于與各種試劑反應(yīng)。如果該二硫鍵存在，可使用巰基乙醇將它們還原成一對(duì)巰基。巰基在弱堿性的條件下可被碘乙酸(Aldrich)選擇性加帽，這促進(jìn)了硫醇鹽離子的形成(Mol.Microbiol.，52293，1991)。適當(dāng)?shù)娜鯄A是碳酸鹽。為了本發(fā)明的目的，其反應(yīng)性官能度是碘乙酰基的本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物可與分析物蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)。在其它實(shí)施方式中，可用其反應(yīng)性官能度是異氰酸鹽基的質(zhì)量標(biāo)記物處理該組蛋白質(zhì)。異氰酸鹽幾乎專門地與蛋白質(zhì)N末端的α-氨基反應(yīng)，并且與任何賴氨酸ε-氨基反應(yīng)，即在溫和條件下(即，室溫，中性溶劑)與伯胺反應(yīng)，產(chǎn)生脲衍生物。也可將這些試劑制成在較高溫度下，在適當(dāng)?shù)拇呋瘎?如吡啶)或錫化合物(如甲錫烷基月桂酸二丁酯)的存在下，與任何攜帶羥基的側(cè)鏈(如絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側(cè)鏈)反應(yīng)，以產(chǎn)生尿烷衍生物。在另一實(shí)施方式中，可用其反應(yīng)性官能度是甲硅烷基(如氯硅烷)的質(zhì)量標(biāo)記物處理該組蛋白質(zhì)。這些化合物易與大多數(shù)反應(yīng)性官能基團(tuán)反應(yīng)。胺衍生物在水性條件下不穩(wěn)定，因此如果需要，可將它們水解成游離的胺。還可將磺酰氯用作質(zhì)量標(biāo)記物上的反應(yīng)性基團(tuán)，用于選擇性地與具有游離胺(如賴氨酸)的質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)。羧酸側(cè)鏈處理也可與本發(fā)明的標(biāo)記物反應(yīng)，雖然通常需要激活這些側(cè)鏈，以確保它們會(huì)反應(yīng)。通常將乙酸酐用于此目的。這會(huì)形成游離羧酸的混合酐，然后可使這種混合酐與親核官能度(如胺)反應(yīng)。
上述特殊的實(shí)施方式僅僅是闡述使側(cè)鏈官能度選擇性地與質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)的優(yōu)選方法的例子。各種各樣的反應(yīng)性基團(tuán)在本領(lǐng)域中是已知的，它們當(dāng)中的許多種都可用于完成本發(fā)明這些方面的第一步。還需要的是，使樣品中蛋白質(zhì)的一種類型以上的側(cè)鏈與不同的質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)。如果要同時(shí)分析多份樣品，則可使用兩種或多種標(biāo)記物標(biāo)記每一份樣品。這會(huì)從各蛋白質(zhì)中獲得更多的信息，從而有助于該蛋白質(zhì)的鑒別。
在本發(fā)明這個(gè)方面的后兩個(gè)實(shí)施方式的步驟3和4中，C末端被修飾的蛋白質(zhì)與序列特異性斷裂劑反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，可使用序列特異性內(nèi)切蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶或其它酶。斷裂劑也可以是化學(xué)劑。這些試劑較佳是可揮發(fā)的，以便使未反應(yīng)的試劑易于去除。適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)斷裂劑包括溴化氰和BNPS-甲基吲哚，前者在甲硫氨酸殘基處解離，后者在色氨酸殘基處解離(D.LCrimmins等人，Anal.Biochem.，18727-38，1990)。
在本發(fā)明這個(gè)方面的上述優(yōu)選實(shí)施方式中，分級(jí)分離蛋白質(zhì)的步驟較佳是采用雙向凝膠電泳進(jìn)行，在第一向中進(jìn)行等電聚焦電泳，在第二向中進(jìn)行SDS-PAGE。然后使凝膠可視化，以鑒別蛋白質(zhì)已遷移到凝膠上的哪個(gè)位置上。然后將這些點(diǎn)從凝膠上切下，之后從切下的凝膠點(diǎn)中抽提出蛋白質(zhì)。然后，采用電噴射質(zhì)譜法或其它一些合適的電離方法直接分析這些抽提得到的蛋白質(zhì)。或者，可使用質(zhì)譜儀(如HPLC質(zhì)譜儀)在線進(jìn)行進(jìn)一步的分級(jí)分離。
在本發(fā)明這方面的后兩個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式的步驟3和4中，可使消化的蛋白質(zhì)任選地與本發(fā)明附加的質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)。這對(duì)于本發(fā)明同時(shí)分析多份樣品的后一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式更為重要。大多數(shù)的酶消化和一些化學(xué)斷裂方法使游離的胺留在經(jīng)消化的分級(jí)分離的蛋白質(zhì)的所得肽上，這些胺可與質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)。這意味著在所有的肽上將出現(xiàn)相同的標(biāo)記物，并且可選擇性檢測(cè)這些標(biāo)記物，從而使該分析的敏感性最大化。
在本發(fā)明這方面的后兩個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式的步驟6和7中，通過(guò)消化分級(jí)分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的肽的洗脫特征可用于檢索預(yù)先形成的數(shù)據(jù)庫(kù)，以確定這些蛋白質(zhì)以前是否已被鑒別。可采用串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)一步分析從液相色譜柱上洗脫出來(lái)并進(jìn)入質(zhì)譜儀中的肽，以確定可用來(lái)鑒別蛋白質(zhì)的序列信息?？墒褂秒男蛄袛?shù)據(jù)檢索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，或可將其翻譯成核酸序列數(shù)據(jù)，以檢索核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。翻譯后修飾的肽的分離碳水化合物常常以蛋白質(zhì)的翻譯后修飾出現(xiàn)。這些碳水化合物常常具有羰基?？蓪Ⅳ驶鶚?biāo)記，使蛋白質(zhì)攜帶這類修飾，從而將它們檢測(cè)或分離。生物胞素酰肼(Pierce &amp; Warriner Ltd，Chester，UK)與許多碳水化合物種類中的羰基反應(yīng)〔E.A.Bayer等人，Anal.Biochem.，170，271-281，《生物胞素酰肼——采用親和素-生物素技術(shù)進(jìn)行的糖綴合物中的唾液酸、半乳糖和其它糖類的選擇性標(biāo)記物》(“Biocytin hydrazide——a selective label for sialic acid，galactose，and others sugars inglycoconjugates using avidin biotin technology″)，1988〕。從而可將復(fù)雜的混合物中具有碳水化合物修飾的蛋白質(zhì)生物素化。然后可用內(nèi)切蛋白酶(如胰蛋白酶)處理蛋白質(zhì)混合物，以從蛋白質(zhì)中獲得肽。然后，可使用抗生物素蛋白化的固相載體分離生物素化的并由此進(jìn)行碳水化合物修飾的肽?？梢赃@種方式處理一系列的樣品，并使所獲得的肽與本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)，這樣從各樣品得到的肽都具有質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合，這些質(zhì)量標(biāo)記物與從該樣品獲得的肽是相關(guān)的。較佳的是，從各樣品得到的肽具有不同的質(zhì)量標(biāo)記物。然后，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析這些質(zhì)量標(biāo)記的具有碳水化合物的肽。
許多研究組已經(jīng)報(bào)道了與各種蛋白質(zhì)中的磷酸酪氨酸殘基結(jié)合產(chǎn)生的抗體的方法〔例如，參見(jiàn)A.R.Frackelton等人，Methods Enzymol.，201，79-92，《抗磷酸酪酸的單克隆抗體的產(chǎn)生及其在含有磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)的親和純化中的應(yīng)用》(“Generation of monoclonal antibodies against phosphotyrosine and their use foraffinity purification of phosphotyrosine-containing proteins″)，1991，以及MethodsEnzymol.中的其它文章〕。這意味著通過(guò)親和層析，使用這些抗體作為親和柱配體，可分離出已由酪氨酸磷酸化作用進(jìn)行翻譯后修飾的大比例的蛋白質(zhì)。
這些磷酸酪氨酸結(jié)合抗體可用于本發(fā)明的內(nèi)容中，以分離出含有磷酸酪氨酸殘基的肽。因此，可用序列特異性內(nèi)肽酶處理復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生游離的肽。然后，可使這些肽通過(guò)抗磷酸酪氨酸抗體柱，該柱會(huì)留住含有磷酸酪氨酸基團(tuán)的肽?？梢赃@種方式處理一系列的樣品，所獲得的肽與本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物反應(yīng)，這樣，從各樣品獲得的肽具有質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物組合，這些標(biāo)記物與從該樣品得到的肽是相關(guān)的。較佳的是，從各樣品獲得的肽具有不同的質(zhì)量標(biāo)記物。然后，可采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析這些質(zhì)量標(biāo)記的具有磷酸酪氨酸的肽。從蛋白質(zhì)中分離的末端肽本發(fā)明蛋白質(zhì)表達(dá)描述的優(yōu)選方法是，僅僅從樣品的各蛋白質(zhì)中分離出一條肽。如果所分離的肽片段足夠長(zhǎng)，則該片段對(duì)于它的親本蛋白質(zhì)是特異的。在本發(fā)明這個(gè)方面的第一步中，從許多份復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的樣品中的每一份中的各蛋白質(zhì)分離出肽。在這個(gè)方面的一些實(shí)施方式中，較佳是分離出末端的肽。末端肽的分離保證了每種蛋白質(zhì)至一條且僅有一條肽被分離。在PCT/GB98/00201和PCT/GB99/03258中討論了從多肽的末端分離肽的方法。
因此，本發(fā)明的這個(gè)方面提供一種蛋白質(zhì)描述的方法，該方法包括(a)用斷裂劑處理含有一組許多多肽的樣品，已知該斷裂劑識(shí)別多肽鏈中的特殊氨基酸殘基或序列，以在切割位點(diǎn)進(jìn)行解離，從而將該組多肽解離，產(chǎn)生肽段；(b)從其片段化的樣品中分離出一組肽片段，這些片段具有作為參考末端的多肽的N末端或C末端，每條肽在另一端在接近該參考末端處具有切割位點(diǎn)；(c)在分離這些肽片段之前或之后，用從本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列獲得的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合標(biāo)記多肽的每一個(gè)參考末端，其中，各參考末端與它的標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合是相關(guān)的；(d)采用質(zhì)譜法測(cè)定一條或多條分離的片段的特征序列，所述特征序列是從切割位點(diǎn)開(kāi)始有預(yù)定數(shù)量的氨基酸殘基的序列；其中，特征序列表征了各多肽。
本發(fā)明這個(gè)方面提供的另一優(yōu)選的方法是，使用第二種斷裂劑來(lái)產(chǎn)生更多的片段，這些片段可自身被鑒別，并可用于表征它們的親本多肽或蛋白質(zhì)。這種方法包括(a)使含有一條或多條多肽的樣品與第一斷裂劑接觸，產(chǎn)生多肽片段；(b)分離出一條或多條多肽片段，各片段含有從其被片段化的樣品中獲得的多肽的N末端或C末端；(c)在分離多肽片段之前或之后，用從本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列獲得的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合標(biāo)記多肽的每一個(gè)末端，其中，各末端與它的標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合是相關(guān)的；(d)采用質(zhì)譜法鑒別分離的片段；(e)使用第二種斷裂劑，對(duì)該樣品重復(fù)上述步驟(a)-(d)，所述第二種斷裂劑在與第一斷裂劑作用位點(diǎn)不同的位點(diǎn)上解離；(f)由步驟(d)和(e)中鑒別得到的片段表征上述樣品中的一條或多條多肽。
在上述兩種方法中，標(biāo)記參考末端的步驟可在分離片段之前或之后進(jìn)行，如果需要，也可在將這些片段從它們的親本多肽或蛋白質(zhì)解離下來(lái)之前進(jìn)行。
關(guān)于肽片段的分離，在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，可采用下述方法從蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物中分離末端肽，該方法包括以下步驟1.用Lys-C特異性斷裂酶完全消化蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，即在最接近賴氨酸殘基的肽鍵處切割的試劑，該殘基在C末端一側(cè)；2.使所得的肽與活化的固相載體接觸，該載體將與游離的氨基反應(yīng)；3.任選地使俘獲的肽與雙功能性試劑反應(yīng)，該試劑具有至少一個(gè)胺反應(yīng)性官能度；4.使俘獲的肽與一種試劑接觸，該試劑在載體上的各肽的α氨基上進(jìn)行解離。不是C末端的所有的肽具有將它們共價(jià)連接于固相載體的賴氨酸殘基。從而，游離的C末端肽被選擇性釋放；
5.任選地，使所釋放的肽與第二種固相載體接觸，該肽將與步驟3中使用的該雙功能性試劑的第二反應(yīng)性官能度反應(yīng)，以俘獲不與第一載體正確反應(yīng)的任何肽；6.回收在溶液中保持游離的肽。
在本方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)被一種試劑變性、還原及處理，以在蛋白質(zhì)中加上巰基。標(biāo)準(zhǔn)的方法涉及，在pH8.5的具有作為變性劑的高濃度鹽酸胍(6-8M)的緩沖液中，在作為還原劑的過(guò)量的巰基乙醇或二硫蘇糖醇，以及過(guò)量的加帽劑(如乙烯吡啶)存在下，使這些蛋白質(zhì)變性。
在本方法的步驟1中，用Lys-C特異性斷裂酶完全消化蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，該酶可以是如從產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)(Boehringer Mannheim)獲得的內(nèi)肽酶Lys-C。
在本方法的步驟2中，使所得的肽與固相載體接觸，該載體與胺反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該固相載體是用異硫氰酸鹽化合物衍生化得到的。在一個(gè)實(shí)施方式中，使該組肽在堿的存在下與異硫氰酸鹽玻璃(DITC玻璃，Sigma-Aldrich Ltd，Dorset，England)反應(yīng)。這將通過(guò)任何游離的氨基使該載體俘獲所有的肽。
步驟3是任選的，但該步驟是較佳的?？赡芎茈y保證所有的非C末端肽與第一固相載體在賴氨酸側(cè)鏈氨基和N末端α-氨基上完全反應(yīng)。僅通過(guò)賴氨酸側(cè)鏈氨基反應(yīng)的肽在接下去的步驟中將維持著與該載體連接。僅通過(guò)它們的α-氨基反應(yīng)的肽將與C末端肽一起從載體上解離下來(lái)。這個(gè)步驟使非C末端肽與C末端肽得以區(qū)分。在這個(gè)任選的步驟中，雙功能性試劑可是M-琥珀酰亞胺基[4-乙烯基磺?；鵠苯甲酸酯(從Pierce &amp; Warriner Ltd.，Chester，UK獲得的SVSB)。這種化合物含有連接于巰基反應(yīng)性乙烯基砜部分的胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺酯。該化合物非常易于通過(guò)酯官能度與胺反應(yīng)，而不需乙烯基砜的反應(yīng)，并且在較后階段它可單獨(dú)與巰基反應(yīng)。因而，SVSB在弱堿性的條件下與載體上所有的游離胺反應(yīng)。在大大過(guò)量的SVSB化合物存在下，并且假設(shè)載體上的肽是固定的，則SVSB將僅通過(guò)琥珀酰亞胺官能度與肽反應(yīng)，而使乙烯基砜部分保持游離，以用于進(jìn)一步的反應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，任何未反應(yīng)的胺可與偶聯(lián)于胺反應(yīng)性官能度的生物素反應(yīng)，如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)生物素(Sigma-Aldrich Ltd.，Dorset，England)。這使不完全反應(yīng)的肽在隨后被俘獲在抗生物素蛋白化的珠上，或者在親和俘獲柱中的抗生物素蛋白化的樹脂上。
在本發(fā)明的步驟4中，使俘獲的肽與在載體上各肽的α-氨基上解離的試劑接觸。在將DITC玻璃用作胺反應(yīng)性載體的實(shí)施方式中，使肽與適當(dāng)?shù)膿]發(fā)性酸反應(yīng)，如三氟乙酸(TFA)，這種酸將N末端氨基酸從載體上各肽中解離下來(lái)。不是C末端的所有的肽都具有將它們共價(jià)連接于固相載體的賴氨酸殘基。因而，游離的C末端肽被選擇性地釋放。
任選的步驟5是優(yōu)選的，尤其是如果進(jìn)行任選的步驟3的話。通過(guò)此步驟將除去沒(méi)有與胺反應(yīng)性載體完全反應(yīng)的非C末端肽。如果SVSB用于標(biāo)記僅通過(guò)它們的α-氨基反應(yīng)的非C末端肽的話，則它們將具有反應(yīng)性官能度，這種官能度將使它們可與用適當(dāng)?shù)挠H核劑(優(yōu)選巰基)衍生得到的固相載體反應(yīng)。如果在步驟4中使用了DITC玻璃(這種做法是優(yōu)選的)，則可使用TFA將肽從載體上釋放出來(lái)。通過(guò)將TFA蒸發(fā)掉，以三氟乙酸鹽的形式回收釋放的肽。然后，將肽再懸浮在pH約為7的緩沖液中，或者就放在適當(dāng)?shù)闹行匀軇┲?，如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或水與丙酮的混合物。然后，將肽加到經(jīng)巰基衍生化的載體中。在pH7，在SVSB處理的肽上剩余的乙烯基官能度將幾乎專門與巰基載體反應(yīng)，而不與由肽從DITC玻璃載體上解離而暴露出來(lái)的游離胺反應(yīng)。巰基衍生化的Tentagel可從RappPolymere GmbH(Tubingen，德國(guó))購(gòu)得，或者可通過(guò)將硅膠與3-巰基丙基三甲氧基硅烷培育而制備巰基衍生化的載體。
在本方法的步驟6中，回收釋放的肽。如果采用任選的步驟3和5，則肽可能存在于各種各樣的溶劑或緩沖液中。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將選擇具有揮發(fā)性的溶劑或緩沖液。如果直接從第一載體(在優(yōu)選實(shí)施方式中，該載體是DITC玻璃)中回收肽，這些肽有可能存在于可揮發(fā)的TFA中。較佳是采用蒸發(fā)溶劑或緩沖液的方法從這些可揮發(fā)的溶劑或緩沖液中回收這些肽。采用這種方法分離的肽將具有游離的α-氨基，這些氨基可用于與本發(fā)明的標(biāo)記物反應(yīng)。標(biāo)記分離的肽可在本發(fā)明這方面描述的蛋白質(zhì)表達(dá)描述中使用本發(fā)明任一種質(zhì)量標(biāo)記物。圖22和23所示的質(zhì)量標(biāo)記物特別優(yōu)選用于本發(fā)明，尤其是本發(fā)明的這個(gè)方面。這些化合物具有乙烯基砜反應(yīng)性基團(tuán)，該基團(tuán)使這些化合物能與游離的胺和巰基進(jìn)行加成反應(yīng)。如果每條肽僅需一種標(biāo)記物，那么可在用序列特異性內(nèi)肽酶解離前，先用加帽劑處理復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)。苯基、乙基和甲基乙烯基砜將與游離的胺和巰基反應(yīng)，并將它們封住，同時(shí)仍允許胰蛋白酶對(duì)該加帽的蛋白質(zhì)進(jìn)行解離。如果乙烯基砜部分尤其是乙基乙烯基砜和甲基乙烯基砜沒(méi)有被封阻，則賴氨酸的ε胺殘基將與兩個(gè)乙烯基砜部分反應(yīng)。
在連接標(biāo)記物后，這些標(biāo)記的肽將具有一個(gè)質(zhì)量，該質(zhì)量由于該標(biāo)記物的質(zhì)量而變動(dòng)。肽的質(zhì)量可足以鑒別源蛋白質(zhì)。在這個(gè)例子中，僅需對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，這可通過(guò)用三重四極監(jiān)測(cè)進(jìn)行的選擇反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)，下文將有詳細(xì)描述。簡(jiǎn)言之，三重四極的第一四極設(shè)置為讓其質(zhì)荷比對(duì)應(yīng)于感興趣的肽的離子通過(guò)，將其調(diào)整為標(biāo)記物的質(zhì)量。然后，在第二四極中，使所選擇的離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)。在用于肽分析的各種條件下，這些離子將大部分在分子中的酰胺鍵上片段化。圖22和23中的標(biāo)記物具有酰胺鍵，該鍵在斷裂時(shí)釋放出標(biāo)記物的末端預(yù)電離部分。雖然標(biāo)記物都具有相同的質(zhì)量，但是末端部分是不同的，因?yàn)樵邗０锋I的任一側(cè)鏈上的取代基不同。因此，這些標(biāo)記物互不相同。結(jié)合了特定質(zhì)量的離子的標(biāo)記物片段的存在應(yīng)可證實(shí)該離子是肽，并且從不同樣品得到的標(biāo)記物的相對(duì)峰高度將給出肽的樣品中肽的相對(duì)數(shù)量的信息。如果因?yàn)闃悠分性S多末端肽都具有相同的末端質(zhì)量，或者因?yàn)樵撾氖俏粗?，而該質(zhì)量不足以鑒別肽，則可通過(guò)完整的CID質(zhì)譜分析來(lái)測(cè)定序列信息。圖24顯示兩份樣品的肽的理論質(zhì)譜，該肽具有H2N-gly-leu-ala-ser-glu-COOH的序列，其中，各樣品連接于一種具有圖23所示的式子的標(biāo)記物。該質(zhì)譜是理想化的，因?yàn)樗鼉H僅顯示b系列片段，而沒(méi)有顯示其它的片段或任何噪聲峰，但是，它闡述了該質(zhì)譜被清楚地分成對(duì)應(yīng)于肽片段峰的較高質(zhì)量區(qū)域，和對(duì)應(yīng)于質(zhì)量標(biāo)記物峰的較低質(zhì)量區(qū)域。如果需要，該肽片段峰可用于鑒別肽，而該質(zhì)量標(biāo)記物峰則給出關(guān)于肽的相對(duì)數(shù)量的信息。采用色譜法或電泳分離標(biāo)記的肽在本發(fā)明的這個(gè)方面中，較佳的是，在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前的步驟中，先對(duì)標(biāo)記的末端肽進(jìn)行色譜法分離。較佳是進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)，該儀器可直接與質(zhì)譜儀連接，這樣在肽從色譜柱上洗脫下來(lái)后進(jìn)行在線分析?？刹捎肏PLC進(jìn)行各種分離技術(shù)，但較流行的做法是在進(jìn)行質(zhì)譜法之前，采用反向色譜法進(jìn)行肽的分離。毛細(xì)管區(qū)帶電泳是另一分離方法，此方法也可直接與質(zhì)譜儀連接，以自動(dòng)分析洗脫的樣品。這些和其它分級(jí)分離的技術(shù)都可在采用質(zhì)譜法進(jìn)行分析之前應(yīng)用，以減少肽的混合物的復(fù)雜性。采用串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量和鑒別在本發(fā)明這方面的方法中，采用串聯(lián)質(zhì)譜法分析標(biāo)記的分離肽。
如早先所討論的，串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)具有預(yù)定質(zhì)荷比的離子進(jìn)行了選擇和片段化，如通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)。然后，可檢測(cè)這些片段，提供關(guān)于所選擇離子的結(jié)構(gòu)信息。在串聯(lián)質(zhì)譜儀中采用CID分析肽時(shí)，觀察到特征性的斷裂模式，由此可測(cè)定肽的序列。天然的肽通常在肽骨架的酰胺鍵上隨機(jī)地?cái)嗔?，產(chǎn)生一系列成為該肽的特征的離子。通常將離子的電荷保留在該離子的N末端片段上的CID片段序列稱為an、bn、cn等，分別指在第n個(gè)肽鍵上解離得到的片段。類似地，將電荷保留在離子的C末端片段上的片段系列稱為xn、yn、zn等。這種表示法在下述示意圖1中描述 示意圖1胰蛋白酶和凝血酶是用于串聯(lián)質(zhì)譜法的優(yōu)選的斷裂劑，因?yàn)樗鼈冊(cè)诜肿拥膬啥水a(chǎn)生具有堿性基團(tuán)的肽，即在N末端產(chǎn)生α-氨基，在C末端產(chǎn)生賴氨酸或精氨酸側(cè)鏈。這有利于形成帶雙倍電荷的離子，其中，帶電中心在該分子的相反的末端上。這些帶雙倍電荷的離子經(jīng)CID后產(chǎn)生C末端離子系列和N末端離子系列。這有助于確定肽的序列。一般而言，在給定肽的CID質(zhì)譜中觀察到只有一種或兩種可能的離子系列。在以四極為基礎(chǔ)的儀器的典型的低能碰撞中，N末端片的b系列或C末端片段的y系列占優(yōu)。如果分析帶雙倍電荷的離子，則常常檢測(cè)到這兩個(gè)系列。通常，y系列比b系列占優(yōu)。
如果用于本發(fā)明方法的分離肽是如上述采用DITC玻璃分離得到的C末端肽，則這些肽在分離后，在它們的N末端將具有游離的胺，這有利于使用本發(fā)明的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。如上所述，這些標(biāo)記物都可具有相同的質(zhì)量，這樣所分析的每份樣品中的等價(jià)的肽的質(zhì)量將改變相同的量。這些肽的CID將從標(biāo)記物中產(chǎn)生片段。標(biāo)記物片段的強(qiáng)度可表示要測(cè)定的每份樣品中的等價(jià)肽的相對(duì)數(shù)量。只要電荷仍保留在標(biāo)記物上，將本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物共價(jià)連接于分離肽的N末端，將使片段離子的b系列的質(zhì)量被標(biāo)記物的質(zhì)量改變。由于用于每一份分析樣品的標(biāo)記物的質(zhì)量相同，所以只要標(biāo)記的肽的碰撞誘導(dǎo)斷裂在肽骨架上發(fā)生，對(duì)于所有的樣品，將只有一種離子系列產(chǎn)生。這意味著由其片段離子鑒別標(biāo)記的肽是可能的，并且對(duì)于任何給定的肽，不管同時(shí)分析的樣品的數(shù)量是多少，肽的片段系列將只有一種。標(biāo)記物自身的片段化將產(chǎn)生各樣品的峰特征。這些峰將在相對(duì)低的質(zhì)量范圍內(nèi)產(chǎn)生(見(jiàn)圖24)。在三重四極儀器的幫助下，較佳是使用選擇的反應(yīng)監(jiān)測(cè)，以獲得這些峰的最敏感的檢測(cè)。這些峰的相對(duì)敏感性將是原始樣品中獲得的肽的源蛋白質(zhì)的相對(duì)量的指示。在天然的肽中，片段離子的b系列的強(qiáng)度比y系列低。由于具有了包括如季銨中心的適當(dāng)?shù)膲A性質(zhì)量標(biāo)記物或“預(yù)電離”的質(zhì)量標(biāo)記物，離子片段的b系列的強(qiáng)度得以增強(qiáng)。遺憾的是，如果使用C末端肽，則不能保證C末端氨基酸是堿性的，因此y系列的片段離子可能是弱的。使用y系列測(cè)定結(jié)構(gòu)信息可能需要這些肽的C末端攜帶一個(gè)堿基或一個(gè)“預(yù)電離”的基團(tuán)。
所獲得的質(zhì)譜的“噪音”使得采用串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蛋白質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)的混合物進(jìn)行的分析變得復(fù)雜。從生物樣品中分離得到的蛋白質(zhì)通常受到緩沖劑、變性劑和去污劑的污染，所有這些試劑都將峰引入質(zhì)譜中。結(jié)果，在質(zhì)譜中污染峰比肽的峰還要多，從而鑒別出對(duì)應(yīng)于肽的峰就成為一個(gè)主要的問(wèn)題，尤其是難以分離的小樣品蛋白質(zhì)。結(jié)果，在進(jìn)詳細(xì)的CID分析前，先要采用各種方法來(lái)測(cè)定哪個(gè)峰對(duì)應(yīng)于肽。以三重四極為基礎(chǔ)的儀器允許進(jìn)行“前體離子掃描”〔參見(jiàn)WilmM.等人，Anal.Chem.，68(3)527-33，《未分離的肽混合物的母離子掃描》(“Parention scans of unseparated peptide mixtures″)，1996〕。以“單一反應(yīng)監(jiān)測(cè)”的模式進(jìn)行三重四極處理，其中，第一四極掃描整個(gè)質(zhì)量范圍，然后在第二四極中使每一個(gè)通過(guò)的離子進(jìn)行CID處理。將第三四極設(shè)置為僅檢測(cè)一種特異性片段離子，該離子通常是從肽得到的特征性片段離子，如銨離子。采用四極/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的另一方法，通過(guò)鑒別進(jìn)行CID處理時(shí)產(chǎn)生質(zhì)荷比比母離子高的子系離子的離子，從而掃描帶雙倍電荷的離子。鑒別帶雙倍電荷的離子的另一方法是，在光譜中尋找具有適當(dāng)強(qiáng)度比的僅分開(kāi)0.5道爾頓的峰組，這類峰組可能指示該離子是相同的，區(qū)別僅在于分子中存在13C的比例。
通過(guò)使用本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物標(biāo)記肽，可展望獲得一種新形式的前體離子掃描，其中，在對(duì)該標(biāo)記的肽進(jìn)行CID處理后，由對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)記物的片段的存在來(lái)鑒別肽峰。特別是，可使用一種以上質(zhì)量標(biāo)記物標(biāo)記采用本發(fā)明方法從各樣品中分離得到的肽?？墒褂谩扒绑w離子掃描”標(biāo)記物和樣品特異性標(biāo)記物的等摩爾混合物標(biāo)記各樣品中的肽，其中，該“前體離子掃描”用于所有的樣品中。這樣，不同樣品中肽的水平變化將不會(huì)對(duì)前體離子掃描中的肽峰的鑒別產(chǎn)生不利的影響。
鑒別和選擇肽離子后，較佳是對(duì)它們進(jìn)行CID處理。所得的CID質(zhì)譜通常是非常復(fù)雜的，并且確定CID質(zhì)譜中哪些峰對(duì)應(yīng)于有意義的肽片段系列是由質(zhì)譜法確定肽的序列中的另一問(wèn)題。Shevchenko等人，Rapid Commun.Mass Spec.，11，1015-1024(1997)描述了另一種方法，該方法涉及用1∶1的16O/18O水中的胰蛋白酶處理蛋白質(zhì)，以進(jìn)行分析。水解反應(yīng)產(chǎn)生兩組肽，第一組肽的末端羧基含有16O，第二組的末端羧基含有18O。因此，對(duì)于樣品中的每一條肽，應(yīng)有相等強(qiáng)度的雙峰，該雙峰的距離是2道爾頓。這會(huì)被固有的肽同位素峰變得略微復(fù)雜，但可用于雙峰的CID質(zhì)譜的自動(dòng)掃描。可通過(guò)兩個(gè)片段的差別確定雙峰間的質(zhì)量差異，以鑒別其氨基酸。如果分離了N末端肽，那么這種方法可與本發(fā)明的方法一起應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一組兩種或多種質(zhì)量標(biāo)記物，組中各質(zhì)量標(biāo)記物包含通過(guò)可斷裂的連接物連接于質(zhì)量歸一化部分的質(zhì)量指示部分，該質(zhì)量指示部分具有抗碎裂性，其中，組中各標(biāo)記物的聚集質(zhì)量可以相同或不同，組中各標(biāo)記物的質(zhì)量指示部分的質(zhì)量可相同或不同，其中，在組中具有共同質(zhì)量的質(zhì)量指示部分的標(biāo)記物的任何組合中，各標(biāo)記物具有與該組合中的所有其它標(biāo)記物不同的聚集質(zhì)量，并且，在組中具有共同的聚集質(zhì)量的標(biāo)記物的任何組合中，各標(biāo)記物具有其質(zhì)量不同于該組合中所有其它質(zhì)量指示部分的質(zhì)量的質(zhì)量指示部分，這樣組中所有的質(zhì)量標(biāo)記物可通過(guò)質(zhì)譜法得以相互區(qū)分。
2.如權(quán)利要求1所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述組中的各標(biāo)記物含有具有共同質(zhì)量的質(zhì)量指示部分，并且組中各標(biāo)記物具有唯一的聚集質(zhì)量。
3.如權(quán)利要求1所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述組中各標(biāo)記物含有具有獨(dú)特質(zhì)量的質(zhì)量指示部分，并且組中各標(biāo)記物具有共同的聚集質(zhì)量。
4.如權(quán)利要求3所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述組中的各質(zhì)量指示部分具有共同的基本結(jié)構(gòu)，組中各質(zhì)量歸一化部分具有共同的基本結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可與所述質(zhì)量指示部分的共同基本結(jié)構(gòu)相同或不同，并且，組中各質(zhì)量標(biāo)記物包含一個(gè)或多個(gè)質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，該質(zhì)量調(diào)節(jié)部分連接于所述質(zhì)量指示部分和/或質(zhì)量歸一化部分的基本結(jié)構(gòu)上，或位于所述結(jié)構(gòu)中，這樣，組中每一個(gè)質(zhì)量指示部分包含不同數(shù)量的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，且組中每一個(gè)質(zhì)量標(biāo)記物具有相同數(shù)量的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分。
5.如權(quán)利要求4所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述組中的各質(zhì)量標(biāo)記物具有下述結(jié)構(gòu)M(A)y-L-X(A)z式中，M是質(zhì)量歸一化部分，X是質(zhì)量指示部分，A是質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，L是可斷裂的連接物，y和z是0或0以上的整數(shù)，y+z是1或1以上的整數(shù)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述質(zhì)量調(diào)節(jié)部分選自(a)位于所述質(zhì)量指示部分和/或質(zhì)量歸一化部分的基本結(jié)構(gòu)內(nèi)的同位素取代基；(b)連接于所述質(zhì)量指示部分和/或質(zhì)量歸一化部分的基本結(jié)構(gòu)的取代基原子或基團(tuán)。
7.如權(quán)利要求6所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述質(zhì)量調(diào)節(jié)部分選自鹵原子取代基、甲基和2H或13C同位素取代基。
8.如權(quán)利要求7所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述質(zhì)量調(diào)節(jié)部分是氟原子取代基。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，將所述質(zhì)量指示部分連接于所述質(zhì)量歸一化部分的可斷裂連接物是可通過(guò)碰撞而斷裂的連接物。
10.如權(quán)利要求9所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述可斷裂的連接物包含酰胺鍵。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述質(zhì)量指示部分和/或質(zhì)量歸一化部分包含抗斷裂基團(tuán)。
12.如權(quán)利要求11所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述質(zhì)量歸一化部分包含苯基。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述質(zhì)量指示部分包含預(yù)電離的基團(tuán)。
14.如權(quán)利要求13所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述質(zhì)量指示部分包含N-甲基吡啶基，或包含選自以下的基團(tuán)-NH2、-NR2、-NR3+、-SR3+、-SO3-、-PO4-、-PO3-、-CO2- 和 式中，R是氫或取代的或未取代的脂族、芳族、環(huán)狀或雜環(huán)狀基團(tuán)。
15.如權(quán)利要求5-14中任一項(xiàng)所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述組中各標(biāo)記物具有下述結(jié)構(gòu) 式中，R是氫或者是取代的或未取代的脂族、芳族、環(huán)狀的或雜環(huán)狀的基團(tuán)；L是可斷裂的連接物；A是質(zhì)量調(diào)節(jié)部分；每個(gè)p是相同的，并且是0或0以上的整數(shù)；每個(gè)y′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，任一標(biāo)記物的所有y′的總和等于y；每個(gè)z′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，任一標(biāo)記物的所有z′的總和等于z；y+z是1或1以上的整數(shù)。
16.如權(quán)利要求15所述的一組質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，所述R是H，L是酰胺鍵，p＝0，A是氟原子。
17.質(zhì)量標(biāo)記物的陣列，它包含兩組或多組權(quán)利要求3-16中任一項(xiàng)所述的質(zhì)量標(biāo)記物，其特征在于，該陣列中任一組的每一種質(zhì)量標(biāo)記物的聚集質(zhì)量與該陣列中其它每一組的每種質(zhì)量標(biāo)記物的聚集質(zhì)量不同。
18.如權(quán)利要求17所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，至少一組中的每種質(zhì)量標(biāo)記物包含具有共同質(zhì)量的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)，任一組的每種質(zhì)量標(biāo)記物中的該質(zhì)量系列修飾基團(tuán)的質(zhì)量與該陣列中其它任一組的每種質(zhì)量標(biāo)記物中的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)不同。
19.如權(quán)利要求18所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述質(zhì)量系列修飾基團(tuán)連接于所述質(zhì)量標(biāo)記物，這樣，在解離質(zhì)量標(biāo)記物的可斷裂的連接物后，質(zhì)量系列修飾基團(tuán)與所述質(zhì)量指示部分分離。
20.如權(quán)利要求18或19所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述陣列中各組的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)具有共同的基本結(jié)構(gòu)，并且陣列中任一組的每種質(zhì)量標(biāo)記物具有與該組其它質(zhì)量標(biāo)記物相同數(shù)量的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)，且具有與該陣列中其它每一組的質(zhì)量標(biāo)記物不同數(shù)量的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)。
21.如權(quán)利要求20所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述陣列中的每種質(zhì)量標(biāo)記物具有下述任一種結(jié)構(gòu)(S)x-M(A)y-L-X(A)zM(A)y-(S)x-L-X(A)z其中，S是質(zhì)量系列修飾基團(tuán)；M是質(zhì)量歸一化部分；X是質(zhì)量標(biāo)記部分；A是質(zhì)量調(diào)節(jié)部分；L是可斷裂的連接物；x是0或0以上整數(shù)；y和z是0或0以上整數(shù)；y+z是1或1以上整數(shù)。
22.如權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述質(zhì)量系列修飾基團(tuán)包含芳基醚基團(tuán)。
23.如權(quán)利要求21或22所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述陣列中各質(zhì)量標(biāo)記物具有下述任一結(jié)構(gòu) 式中，R是氫或者是取代的或未取代的脂族、芳族、環(huán)狀的或雜環(huán)狀的基團(tuán)；每個(gè)p是相同的，并且是0或0以上的整數(shù)；x是0或0以上的整數(shù)，該陣列的任一組中的每種質(zhì)量標(biāo)記物的x相同，任一組中的x與該陣列中其它每組中的x不同；每個(gè)y′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，任一標(biāo)記物中所有y′的總和等于y；每個(gè)z′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，任一標(biāo)記物中的所有z′的總和等于z；y+z是1或1以上的整數(shù)。
24.如權(quán)利要求18或19所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述陣列中每一組的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)具有共同的基本結(jié)構(gòu)，至少一組的質(zhì)量標(biāo)記物的所述質(zhì)量系列修飾基團(tuán)包含一個(gè)或多個(gè)質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，該質(zhì)量調(diào)節(jié)部分連接于所述質(zhì)量系列修飾基團(tuán)的基本結(jié)構(gòu)上，或位于該結(jié)構(gòu)之中。
25.如權(quán)利要求24所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述陣列中每一組的每種質(zhì)量標(biāo)記物具有相同數(shù)量的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)，其中，任一組的各質(zhì)量標(biāo)記物中的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)與該組其它每種標(biāo)記物中的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)具有相同數(shù)量的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分，其中，任一組的質(zhì)量標(biāo)記物中的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分的數(shù)量與該陣列中其它每一組的標(biāo)記物中的質(zhì)量系列修飾基團(tuán)的不同。
26.如權(quán)利要求25所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述陣列中的每一組包含具有下述任一結(jié)構(gòu)的質(zhì)量標(biāo)記物S(A*)r-M(A)y-L-X(A)zM(A)y-S(A*)r-L-X(A)z式中，S是質(zhì)量系列修飾基團(tuán)；M是質(zhì)量歸一化部分；X是質(zhì)量指示部分；A是所述質(zhì)量指示部分和質(zhì)量歸一化部分的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分；A*可以與A相同或不同，為所述質(zhì)量系列修飾基團(tuán)的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分；L是可斷裂的連接物；r是0或0以上的整數(shù)，陣列中有一組或多組陣列標(biāo)記物的r至少為1；y和z是0或0以上的整數(shù)，y+z是1或1以上整數(shù)。
27.如權(quán)利要求26所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述陣列中每組包含具有下述任一結(jié)構(gòu)的質(zhì)量標(biāo)記物 式中，R是氫或者是取代的或未取代的脂族、芳族、環(huán)狀的或雜環(huán)狀的基團(tuán)；每個(gè)p是相同的，并且是0或0以上的整數(shù)；x是0或0以上的整數(shù)，陣列中所有的質(zhì)量標(biāo)記物的x都相同；每個(gè)y′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)；任一標(biāo)記物所有的y′的總和等于y；每個(gè)z′可以相同或不同，是0-4的整數(shù)，任一標(biāo)記物所有的z′的總和等于z；y+z是1或1以上的整數(shù)；每個(gè)r′可以相同或不同，任一標(biāo)記物所有r′的總和等于r，r是0或0以上的整數(shù)，并且對(duì)于該陣列中的一組或多組質(zhì)量標(biāo)記物，r至少為1。
28.如權(quán)利要求17-27中任一項(xiàng)所述的質(zhì)量標(biāo)記物陣列，其特征在于，所述任一組的質(zhì)量標(biāo)記物的質(zhì)量與該陣列中其它每一組的質(zhì)量標(biāo)記物的質(zhì)量相差4道爾頓或以上。
29.一組兩種或多種探針，其特征在于，組中各探針不同，它們連接于獨(dú)特的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的獨(dú)特組合，所述質(zhì)量標(biāo)記物來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列。
30.含有兩組或多組探針的探針陣列，其特征在于，任一組中的各探針連接于獨(dú)特的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的獨(dú)特組合，所述質(zhì)量標(biāo)記物來(lái)自權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所定義的質(zhì)量標(biāo)記物組，其中，任一組中的探針連接于相同的質(zhì)量標(biāo)記物組的質(zhì)量標(biāo)記物，且每組探針連接于來(lái)自獨(dú)特的質(zhì)量標(biāo)記物組的質(zhì)量標(biāo)記物，該組來(lái)自權(quán)利要求17-28中任一項(xiàng)所定義的質(zhì)量標(biāo)記物陣列。
31.如權(quán)利要求29或30所述的探針組或陣列，其特征在于，所述各探針連接于質(zhì)量標(biāo)記物的獨(dú)特組合，每種組合由該質(zhì)量標(biāo)記物組中每種質(zhì)量標(biāo)記物的存在與否得以區(qū)別，和/或由連接于該探針的各質(zhì)量標(biāo)記物的數(shù)量加以區(qū)別。
32.如權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)所述的探針組或陣列，其特征在于，所述各探針包含生物分子。
33.如權(quán)利要求32所述的探針組或陣列，其特征在于，所述生物分子選自DNA、RNA、寡核苷酸、核酸堿基、蛋白質(zhì)和/或氨基酸。
34.一種分析方法，該方法包括，采用質(zhì)譜法鑒別與分析物相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合，從而檢測(cè)分析物，其特征在于，所述質(zhì)量標(biāo)記物是權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所定義的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，采用質(zhì)譜法鑒別質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合，從而同時(shí)檢測(cè)兩種或多種分析物。
36.如權(quán)利要求34或35所述的方法，其特征在于，由來(lái)自質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物的獨(dú)特組合鑒別每種分析物，各種組合由所述標(biāo)記物組或陣列中的每種標(biāo)記物的存在與否而得以區(qū)別，和/或由各質(zhì)量標(biāo)記物的數(shù)量而加以區(qū)別。
37.如權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)所述的鑒別兩種或多種分析物的方法，其特征在于，在采用質(zhì)譜法檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物之前，先根據(jù)所述分析物的質(zhì)量將它們分離。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，采用色譜法或電泳進(jìn)行分離。
39.如權(quán)利要求34-38中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用于檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物的質(zhì)譜儀包括一個(gè)或多個(gè)質(zhì)量分析儀，這些質(zhì)量分析儀能使具有特定質(zhì)量或質(zhì)量范圍的離子通過(guò)，以進(jìn)行檢測(cè)，和/或能使離子分解。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，使用質(zhì)量分析儀選擇對(duì)一種或多種已知的質(zhì)量標(biāo)記物特異的具有特定質(zhì)量或質(zhì)量范圍的離子，使所選擇的離子分解，然后檢測(cè)分解產(chǎn)物，以鑒別指示所選擇的質(zhì)量標(biāo)記物的離子模型。
41.如權(quán)利要求39或40所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜儀包括三個(gè)四極質(zhì)量分析儀。
42.如權(quán)利要求40或41所述的方法，其特征在于，所述第一質(zhì)量分析儀用于選擇具有特定質(zhì)量或質(zhì)量范圍的離子，第二質(zhì)量分析儀用于分解所選擇的離子，第三個(gè)質(zhì)量分析儀用于檢測(cè)所產(chǎn)生的離子。
43.如權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使一種或多種分析物與一組探針或者探針陣列接觸，其中，所述探針是權(quán)利要求29-33中任一項(xiàng)所定義的探針；(b)通過(guò)檢測(cè)與分析物相關(guān)的探針鑒別分析物。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，在采用質(zhì)譜法檢測(cè)所述質(zhì)量標(biāo)記物前，先將質(zhì)量標(biāo)記物從所述探針上解離下來(lái)。
45.如權(quán)利要求43或44所述的方法，其特征在于，所述方法包括使一種或多種核酸與一組雜交探針接觸。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述一組雜交探針是具有256個(gè)以內(nèi)的四聚體的組，組中各探針具有不同的核酸堿基的組合。
47.一種二維質(zhì)譜分析法，其特征在于，該方法包括(a)提供一種或多種分析物，各分析物用質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合標(biāo)記，其中，這些質(zhì)量標(biāo)記物來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所定義的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列；(b)使所述質(zhì)量標(biāo)記物與所述分析物解離；(c)檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)記物；(d)在質(zhì)譜儀中分解質(zhì)量標(biāo)記物，以從質(zhì)量歸一化部分釋放出質(zhì)量指示部分；(e)檢測(cè)質(zhì)量指示部分；(f)在所述質(zhì)量標(biāo)記物的質(zhì)譜和所述質(zhì)量指示部分的質(zhì)譜的基礎(chǔ)上鑒別分析物。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，在所述(c)步驟中，選擇具有選定的質(zhì)量或質(zhì)量范圍的質(zhì)量標(biāo)記物用于檢測(cè)，和/或在(e)步驟中，選擇具有特定質(zhì)量或特定的質(zhì)量范圍的質(zhì)量指示部分用于檢測(cè)。
49.一種分析的方法，其特征在于，該方法包括(a)在分析物的第一特性的基礎(chǔ)上，對(duì)標(biāo)記的分析物的混合物進(jìn)行第一分離處理；(b)在分析物的第二特性的基礎(chǔ)上，對(duì)所得的分離分析物進(jìn)行第二分離處理；(c)通過(guò)檢測(cè)分析物的標(biāo)記物，從而檢測(cè)該分析物；其中，這些分析物用來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所定義的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列標(biāo)記的質(zhì)量標(biāo)記物標(biāo)記。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，在(a)步驟和/或(b)步驟中，根據(jù)所述分析物的長(zhǎng)度或質(zhì)量將它們分離。
51.如權(quán)利要求49或50所述的方法，其特征在于，在(a)步驟和/或(b)步驟中，根據(jù)所述分析物的等電點(diǎn)將它們分離。
52.如權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分析物包括蛋白質(zhì)、多肽、肽、氨基酸或核酸，或者它們的片段。
53.如權(quán)利要求49-52中任一項(xiàng)所述的雙向凝膠電泳法。
54.一種表征核酸的方法，其特征在于，該方法包括(a)提供一組核酸片段，各片段具有可斷裂地連接于其上、鑒別該片段的特征的質(zhì)量標(biāo)記物，這些質(zhì)量標(biāo)記物來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所定義的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物；(b)在它們的長(zhǎng)度的基礎(chǔ)上分離這些片段；(c)解離各片段，使其釋放出其質(zhì)量標(biāo)記物；(d)采用質(zhì)譜法測(cè)定各質(zhì)量標(biāo)記物，以描述各片段的特征與片段長(zhǎng)度的關(guān)系。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，將該方法用于表征cDNA，其特征在于，它包括(a)使含有一組含一種或多種cDNA或其片段的樣品暴露于斷裂劑中，該斷裂劑識(shí)別預(yù)定的序列，并在距離預(yù)定序列已知偏移位置的基準(zhǔn)位點(diǎn)上進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生一組末端片段，所述預(yù)定序列接近各cDNA或其片段的一端；(b)將銜接子寡核苷酸連接于各基準(zhǔn)位點(diǎn)上，該寡核苷酸含有樣品斷裂劑的識(shí)別位點(diǎn)；(c)將這組末端片段暴露于樣品斷裂劑中，該斷裂劑與上述識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，并在距離該識(shí)別位點(diǎn)已知偏移位置的樣品位點(diǎn)上進(jìn)行切割，從而在各個(gè)末端片段中產(chǎn)生來(lái)自未知序列和預(yù)定長(zhǎng)度達(dá)6個(gè)堿基的粘性末端序列；(d)根據(jù)序列的長(zhǎng)度將該組末端片段分成亞組；(e)如下測(cè)定各粘性末端序列(i)用標(biāo)記的雜交探針陣列探測(cè)，該陣列含有所有可能的預(yù)定長(zhǎng)度的堿基序列；(ii)連接這些雜交到粘性末端序列上的探針；(iii)通過(guò)鑒別標(biāo)記物，較佳是通過(guò)定量標(biāo)記物，測(cè)定哪些探針被連接，其中，這些標(biāo)記物是來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，采用毛細(xì)管電泳、HPLC或凝膠電泳分離末端片段組。
57.一種表征核酸的方法，其特征在于，該方法包括在至少一種標(biāo)記的末端堿基的存在下，從一個(gè)或多個(gè)核酸模板中產(chǎn)生Sanger梯核酸片段，然后鑒別該片段的長(zhǎng)度及其末端堿基，其中該標(biāo)記物與該末端堿基是相關(guān)的，并且是來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的組或陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其特征在于，所述所有四種末端堿基出現(xiàn)在相同的反應(yīng)區(qū)中。
59.如權(quán)利要求59或60所述的方法，其特征在于，該方法包括從出現(xiàn)在相同反應(yīng)區(qū)中的大量核酸模板中產(chǎn)生Sanger梯核酸片段，然后鑒別所產(chǎn)生的各核酸片段的長(zhǎng)度、產(chǎn)生該片段的模板的種類以及該片段的末端堿基，其中，在產(chǎn)生這些片段之前，先使標(biāo)記的引物核苷酸或寡核苷酸雜交到各模板上，各引物上的標(biāo)記物對(duì)該引物所雜交的模板特異，從而允許鑒別該模板。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其特征在于，鑒別模板的標(biāo)記物是來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物。
61.一種核酸測(cè)序的方法，其特征在于，該方法包括(a)獲得靶核酸組，該組包含一條或多條將要測(cè)序的單鏈DNA，每條DNA以唯一的量存在，并具有一個(gè)引物，為核酸提供雙鏈部分用于連接；(b)使核酸組與雜交探針陣列接觸，各探針包含可斷裂地連接于預(yù)定長(zhǎng)度的已知堿基序列上的標(biāo)記物，該陣列包含該預(yù)定長(zhǎng)度的所有可能的堿基序列，這些堿基序列不能相互連接，其中，在連接酶的存在下，在使具有與位于各核酸的雙鏈部分附近的單鏈核酸互補(bǔ)的堿基序列的探針與該雙鏈部分連接的條件下，進(jìn)行接觸，從而形成延伸的雙鏈部分，該部分不能與更多的探針連接；(c)除去所有未連接的探針；接著進(jìn)行如下步驟(d)解離連接的探針，釋放出各標(biāo)記物；(e)記錄各標(biāo)記物的數(shù)量；(f)激活延伸的雙鏈部分，使能夠在其上進(jìn)行連接；其中(g)步驟(b)和(f)作為一輪循環(huán)，重復(fù)進(jìn)行足夠多次，以通過(guò)測(cè)定釋放的各標(biāo)記物的序列來(lái)測(cè)定單鏈核酸或各單鏈核酸的序列；其中，雜交探針的標(biāo)記物是來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的組或陣列中的各標(biāo)記物。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述雜交探針是一組256個(gè)四聚體，組中各探針具有不同組合的核酸堿基。
63.一種表征含有肽、多肽和/或蛋白質(zhì)的樣品的方法，其特征在于，該方法包括(a)提供含有肽、多肽和/或蛋白質(zhì)的樣品，每種肽、多肽和/或蛋白質(zhì)具有可斷裂地連接于其上的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合，所述質(zhì)量標(biāo)記物來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物，其中，各肽、多肽和/或蛋白質(zhì)與其標(biāo)記物或標(biāo)記物組合相關(guān)；(b)分析這些標(biāo)記的肽、多肽和/或蛋白質(zhì)，以檢測(cè)所述標(biāo)記物。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，通過(guò)斷裂劑對(duì)含有多肽和/或蛋白質(zhì)的樣品的作用形成肽，由此提供所述樣品。
65.如權(quán)利要求63或64所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行分析前，先采用色譜法或電泳分離所述標(biāo)記的肽、多肽和/或蛋白質(zhì)。
66.如權(quán)利要求63-65中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，提供多份樣品。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行分析前，先將所述多份樣品集中。
68.如權(quán)利要求63-67中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品中的一種或多種肽、多肽和/或蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)了翻譯后修飾，含有碳水化合物，并且，該方法包括，通過(guò)碳水化合物的羰基連接生物素，使修飾的肽、多肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化。
69.如權(quán)利要求63-67中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品中的一種或多種肽、多肽和/或蛋白質(zhì)經(jīng)由酪氨酸磷酸化作用而被翻譯后修飾，且該方法包括，采用親和層析法，使用抗磷酸酪氨酸抗體分離這些修飾的肽、多肽和/或蛋白質(zhì)。
70.如權(quán)利要求63-69中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括，從各肽、多肽和/或蛋白質(zhì)中分離出單一的肽片段。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述各分離的片段是末端片段。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述方法包括(a)用斷裂劑處理含有一組含許多多肽的樣品，已知該斷裂劑識(shí)別多肽鏈中的特殊氨基酸殘基或序列，以在切割位點(diǎn)進(jìn)行解離，從而將該組多肽解離，產(chǎn)生肽片段；(b)從其所片段化的樣品中分離出一組肽片段，這些片段具有作為參考末端的多肽的N末端或C末端，每條肽在另一端在接近該參考末端處具有切割位點(diǎn)；(c)在分離這些肽片段之前或之后，用來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合標(biāo)記多肽的每一個(gè)參考末端，其中，各參考末端與它的標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合相關(guān)；(d)采用質(zhì)譜法測(cè)定一條或多條分離的片段的特征序列，所述特征序列是從切割位點(diǎn)開(kāi)始有預(yù)定數(shù)量的氨基酸殘基的序列；其中，特征序列表征了各多肽。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述方法包括(a)使含有一條或多條多肽的樣品與第一斷裂劑接觸，產(chǎn)生多肽片段；(b)分離出一條或多條多肽片段，各片段含有片段化樣品的多肽的N末端或C末端；(c)在分離多肽片段之前或之后，用來(lái)自權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的質(zhì)量標(biāo)記物組或陣列的質(zhì)量標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物的組合標(biāo)記多肽的每一個(gè)末端，其中，各末端與它的標(biāo)記物或標(biāo)記物的組合相關(guān)；(d)采用質(zhì)譜法鑒別分離的片段；(e)使用第二種斷裂劑，對(duì)該樣品重復(fù)上述步驟(a)-(d)，所述第二種斷裂劑在與第一斷裂劑作用位點(diǎn)不同的位點(diǎn)上解離；(f)由步驟(d)和(e)中鑒別得到的片段表征上述樣品中的一條或多條多肽。
74.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的標(biāo)記物組或陣列中的質(zhì)量標(biāo)記物在分析方法中的應(yīng)用。
75.如權(quán)利要求74所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在雙向電泳分析中。
76.如權(quán)利要求74所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在二維質(zhì)譜分析中。
77.如權(quán)利要求74-76中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在對(duì)一個(gè)或多個(gè)核酸的測(cè)序方法中。
78.如權(quán)利要求74-76中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在基因表達(dá)描述法中。
79.如權(quán)利要求74-76中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在蛋白質(zhì)表達(dá)描述法中。
80.如權(quán)利要求74-76中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在核酸分類的方法中。
全文摘要
提供了一組兩種或多種質(zhì)量標(biāo)記物，組中各質(zhì)量標(biāo)記物包含通過(guò)可斷裂的連接物連接于質(zhì)量歸一化部分的質(zhì)量指示部分，該質(zhì)量指示部分具有抗碎裂性，其中，組中各標(biāo)記物的聚集質(zhì)量可以相同或不同，組中各標(biāo)記物的質(zhì)量指示部分的質(zhì)量可相同或不同，其中，在組中具有共同質(zhì)量的質(zhì)量指示部分的標(biāo)記物的任何組合中，各標(biāo)記物具有與該組合中的所有其它標(biāo)記物不同的聚集質(zhì)量，并且，在組中具有共同的聚集質(zhì)量的標(biāo)記物的任何組合中，各標(biāo)記物具有其質(zhì)量不同于該組合中所有其它質(zhì)量指示部分的質(zhì)量的質(zhì)量指示部分，這樣組中所有的質(zhì)量標(biāo)記物可由質(zhì)譜法得以相互區(qū)分。
文檔編號(hào)C07B61/00GK1427953SQ0180904
公開(kāi)日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月14日
發(fā)明者G·施密斯, A·H·托馬斯, R·A·W·約翰斯通 申請(qǐng)人:X齊里昂有限兩合公司