專利名稱：二羥基酯及其衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及立體選擇性制備二羥基酯及其衍生物的方法。一方面，本發(fā)明提供制備式(1)化合物的方法 式1該方法包括a)、立體選擇性還原式(2)化合物 式2產(chǎn)生式(3)化合物，和 式3b)、在式R″-O-COR′化合物和脂肪酶或水解酶存在下酯化式(3)化合物，由此形成式(1)化合物；或者c)、在式R″-O-COR′化合物和脂肪酶或水解酶存在下酯化式(2)化合物，由此形成式(4)化合物，和 式4d)、立體選擇性還原式(4)化合物，產(chǎn)生式(1)化合物；其中X代表未取代的或取代的烴基連接基，R和R″各獨(dú)立地代表未取代的或取代的烴基，并且R′代表未取代的或取代的烴基，優(yōu)選未取代的或取代的烷基。
由X、R、R′或R″表示的烴基可以被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，并且可以是全取代的，例如全鹵代。取代基的實(shí)例包括鹵素，特別是氟和氯；烷氧基，如C1-4烷氧基；和氧代。
優(yōu)選地，X代表式-(CH2)n-，其中n為1-4，并且最優(yōu)選X代表式-CH2-。
R″可以是烷基，如C1-6烷基；或烷基羰基，如C1-6烷基羰基(例如CH3(C＝O)-或CF3(C＝O)-基)；最優(yōu)選R″為乙烯基或異丙烯基。
優(yōu)選地，R代表C1-6烷基，它可以是直鏈或支鏈的，并且可以是由1個(gè)或多個(gè)取代基取代的。最優(yōu)選地，R代表叔丁基。
R′可代表取代的烷基，通常為C1-6烷基，如CF3-或CF3CH2-基，但優(yōu)選未取代的C1-6烷基，并且尤其最優(yōu)選甲基。
優(yōu)選地，利用化學(xué)或微生物還原方法如氫化、轉(zhuǎn)移氫化、金屬氫化物還原或脫氫酶立體選擇性還原式(2)或(4)化合物。適宜的氫化方法的實(shí)例如Helv.Chim.Acta 69，803，1986中所描述的方法(引入本文供參考)，包括使用溶劑如甲醇、乙醇、叔丁醇、二甲基甲酰胺、叔丁基甲醚、甲苯或己烷，使用0.01-10％(w/w)的催化劑，如在異種支撐物如碳、鋁、硅石上的鉑、鈀或銠，和使用1-10巴的分子氫?；蛘呖梢允褂猛N的氫化催化劑如EP0583171中所描述的那些(引入本文供參考)。
適宜的化學(xué)轉(zhuǎn)移氫化方法的實(shí)例包括在Zassinovich，Mestroni andGladiali，Chem.Rev.1992，92，1051中所描述的那些方法(引入本文供參考)或由Fuji等人在J.Am.Chem.Soc.118，2521，1996中所描述的那些方法(引入本文供參考)。優(yōu)選地，化學(xué)轉(zhuǎn)移氫化方法利用過(guò)渡金屬如釕或銠手性配位體絡(luò)合物，特別是手性二胺配位的中性芳香釕絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述化學(xué)轉(zhuǎn)移氫化方法使用酸特別是甲酸鹽如甲酸三乙基銨作為氫源。
可使用金屬氫化物試劑，如Tet.1993，1997，Tet.Asymm.1990，1，307(引入本文供參考)或J.Am.Chem.Soc.1998，110，3560(引入本文供參考)中所描述的那些。
適宜的微生物還原的實(shí)例包括將式(2)或式(4)化合物與具有微生物特性的生物體接觸，所述微生物選自白僵菌屬優(yōu)選蠶白僵菌、畢赤氏酵母屬優(yōu)選紅橡膠樹(shù)畢赤氏酵母或巴斯德畢赤氏酵母、喜海藻糖畢赤氏酵母、甲蟲(chóng)畢赤氏酵母或膜醭畢赤氏酵母、念珠菌屬優(yōu)選土生假絲酵母、馬鈴薯假絲酵母、季也蒙氏假絲酵母、迪丹氏假絲酵母或弗里德氏假絲酵母、克魯維氏酵母屬優(yōu)選果蠅克魯維氏酵母或有孢圓酵母屬優(yōu)選Torulaspora hansenii。所述還原可通過(guò)將式(2)或(4)化合物與由上述微生物提取的酶接觸實(shí)現(xiàn)。最優(yōu)選地，將式(2)或(4)化合物與選自紅橡膠畢赤氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、季也蒙氏假絲酵母、卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carisbergensis)、喜海藻糖畢赤氏酵母、果蠅克魯維氏酵母和Torulaspora hansenii的微生物或上述微生物的提取物接觸。
優(yōu)選地，本發(fā)明包括利用上述微生物，優(yōu)選紅橡膠畢赤氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、季也蒙氏假絲酵母、卡爾斯伯糖酵母(Saccharomycescarisbergensis)、喜海藻糖畢赤氏酵母、果蠅克魯維氏酵母和Torulaspora hansenii的全細(xì)胞或提取物選擇性還原式(2)化合物來(lái)制備式(3)化合物。
最優(yōu)選地，利用微生物的全細(xì)胞進(jìn)行本發(fā)明，因?yàn)檫@樣避免了分離所需要的酶和提供反應(yīng)輔因子的需要。
可使用任一種上述微生物，但在很多實(shí)例中，發(fā)現(xiàn)使用紅橡膠畢赤氏酵母的酶或全細(xì)胞可獲得高轉(zhuǎn)化率和高選擇性。
通常，輔因子NAD(P)H(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和再生輔因子，例如葡萄糖和葡萄糖脫氫酶的系統(tǒng)與酶一起使用以便驅(qū)動(dòng)反應(yīng)。適宜的輔因子和還原機(jī)構(gòu)存在于全細(xì)胞中，優(yōu)選使用在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的全細(xì)胞，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中優(yōu)選地包含適宜的碳源，所述碳源可包括下列一種或多種糖如麥芽糖、蔗糖或者優(yōu)選葡萄糖，多元醇如丙三醇或山梨糖醇，枸櫞酸或低級(jí)醇如甲醇或乙醇。
如果打算讓全細(xì)胞在反應(yīng)過(guò)程中生長(zhǎng)，那么培養(yǎng)基中應(yīng)該包含氮和磷源以及微量元素。這些可以是培養(yǎng)生物體時(shí)通常使用的那些。
可通過(guò)將式(2)或(4)化合物加到在能夠支持生長(zhǎng)并含有生長(zhǎng)生物體的培養(yǎng)基中或加到活細(xì)胞在包含碳源但缺少一種或多種生長(zhǎng)必需營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中所形成的懸浮液中進(jìn)行本方法。也可以使用死細(xì)胞，前提條件是存在必需的酶和輔因子，如果需要，可將它們加到所述死細(xì)胞中。
如果需要，所述細(xì)胞可固定在一載體上，然后，優(yōu)選地在上述適宜的碳源存在下，將該載體與式(2)或(4)化合物接觸。
適宜的pH為3.5-9，例如4-9，優(yōu)選至多6.5并且更優(yōu)選至多5.5。非常適宜的pH為4-5。本方法可適宜地在10-50℃，優(yōu)選20-40℃并且更優(yōu)選25-35℃的溫度下進(jìn)行。如果上述生物體的活的全細(xì)胞存在，那么優(yōu)選在需氧條件下進(jìn)行所述方法。在上述pH和溫度下使用在標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下測(cè)定時(shí)相當(dāng)于每分鐘每份量培養(yǎng)基通入0.01-1.0份量空氣的充氣速度是適宜的，但應(yīng)該理解，考慮周到的變更是可能的。在生物體生長(zhǎng)過(guò)程中如果將方法分開(kāi)進(jìn)行，可使用類似的pH、溫度和充氣條件。
按照已知的方法，通過(guò)離心解體細(xì)胞的懸浮液并分離澄清的溶液與碎片，以及通過(guò)離子交換色譜法，用離子強(qiáng)度遞增的液體洗脫柱子分離所需要的酶與溶液和/或通過(guò)加入離子物質(zhì)，例如硫酸銨選擇性沉淀來(lái)分離提純的酶。如果需要，可重復(fù)所述操作以便提高純度。
特別優(yōu)選微生物還原式(2)或(4)化合物，并且該方法構(gòu)成本發(fā)明第二方面。
在式(2)或(3)化合物酯化中，優(yōu)選用另一酯進(jìn)行酯基轉(zhuǎn)移，所述另一酯至少與醇等摩爾量并且適宜地為乙烯基酯(在后-反應(yīng)中不涉及副產(chǎn)品乙醛)?；蛘撸墒褂盟狒缫宜狒蛉宜狒蝓ト缫宜嵋阴セ蚍ト缛宜嵋阴?。優(yōu)選在20-75℃，更優(yōu)選25-50℃的溫度下，在含有低于1％(w/w)水的有機(jī)溶劑如乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃、叔丁基甲基醚、甲苯、丁酮、戊酮或己酮中進(jìn)行區(qū)域?qū)Ｒ恍怎セ?。?yōu)選地，所述酯是具有2-8個(gè)碳原子的低級(jí)鏈烷酸的酯或其取代的衍生物?？梢圆皇褂没蚴褂枚栊原h(huán)境，例如可讓氮?dú)饬魍ㄟ^(guò)溶液。
所述酶可以以酶或包含它們的全細(xì)胞形式提供。優(yōu)選固定它們以便促進(jìn)它們與產(chǎn)物的分離，如果需要，可再使用。
優(yōu)選的酶包括脂肪酶如豬胰腺脂肪酶，Candida cylindracea脂肪酶，熒光假單胞菌脂肪酶，Candida antarctica fraction B如以Chirazyme L2為商標(biāo)銷售的那些，由Humicola lanuginosa獲得的脂肪酶，例如以Lipolase為商標(biāo)銷售的那些或由假單孢桿菌屬獲得的脂肪酶，例如以SAM II為商標(biāo)銷售的那些并且更優(yōu)選由Candida antarctica獲得的脂肪酶，例如以Chirazyme為商標(biāo)銷售的那些。
其中R′為CH3，R為未取代的或取代的烴基，X為-(CH2)n-并且n為1-4的式(1)化合物構(gòu)成本發(fā)明第三方面。優(yōu)選地，R為叔丁基并且最優(yōu)選地，X為-CH2-。
式(1)化合物是制備藥用化合物有用的中間體。通常，將它們與1，3-二羥基部分的保護(hù)基如2，2-二甲氧基丙烷反應(yīng)形成丙酮化合物(如合成1998，1713所述)。然后，可通過(guò)在水溶液或含有足以支持水解量水的有機(jī)溶液中用弱堿性醇溶液，例如K2CO3溶液(如US5,278,313所述)或脂肪酶處理選擇性除去R′-(C＝)-基，形成式(5)化合物 式5制備式(5)化合物的方法構(gòu)成本發(fā)明第四方面。
4個(gè)發(fā)酵罐中的每個(gè)發(fā)酵罐中加入250ml培養(yǎng)基并通過(guò)高壓滅菌法滅菌。用7摩爾氫氧化銨溶液調(diào)至pH 4.5，溫度設(shè)定在28℃下，氣流設(shè)定在300ml/分鐘，攪拌速度設(shè)定在1200rpm。將發(fā)酵罐與瓊脂平皿(2％瓊脂，其中除葡萄糖濃度為20g/升外包含上述相同培養(yǎng)基)中采集的細(xì)胞一起培養(yǎng)。在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)22小時(shí)后，通過(guò)加入(5S)叔丁基3-酮基-5，6-二羥基己酸酯開(kāi)始生物還原反應(yīng)；其中兩個(gè)發(fā)酵罐各加入3.75ml而另外兩個(gè)發(fā)酵罐各加入5m。
反應(yīng)再繼續(xù)78小時(shí)直至底物100％轉(zhuǎn)化。在該過(guò)程中，培養(yǎng)基中以1-3g葡萄糖/升培養(yǎng)基/小時(shí)的速度加入50％葡萄糖溶液以便保持細(xì)胞生存力和提供還原力來(lái)源。通過(guò)離心除去細(xì)胞終止反應(yīng)。向回收的不含細(xì)胞上清液中加入氯化鈉至最終濃度20％w/v，混合物用等體積的乙腈提取三次。所收集的乙腈提取液用無(wú)水硫酸鈉干燥，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(水浴溫度45℃)中減壓除去溶劑得到粘性淡黃色油狀物。各反應(yīng)所得到產(chǎn)物確定為(3R，5S)-3，5，6-三羥基己酸叔丁基酯并且各樣品中非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量顯示于下表。
實(shí)施例4制備(3R，5S)-3，5，6-三羥基己酸叔丁基酯在Braun Biostat Q多-發(fā)酵罐系統(tǒng)中，紅橡膠畢赤氏酵母NCYCR230(按照1995年5月18日布達(dá)佩斯條約中有關(guān)食品的內(nèi)容保存)在下列培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(每升含)葡萄糖，20g；硫酸銨，10g；酵母菌提取物(Oxoid)，2g；MgSO4·7H2O，1.2g；KH2PO4，0.69g；K2SO4，0.21g；FeSO4·7H2O，0.05g；H3PO4(濃的)，1ml；EEA 142“foammaster”止泡劑，0.5ml；微量元素溶液，1ml(該溶液每升包含Ca(CH3CO2)2，2.85g；ZnSO4·7H2O，0.1g；MnSO4·H2O，0.075g；CuSO4·5H2O，0.02g；硫酸(濃的)，1ml)。
一個(gè)發(fā)酵罐中加入250ml培養(yǎng)基并通過(guò)高壓滅菌法滅菌。用2摩爾氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 5.0。溫度設(shè)定在28℃下，氣流設(shè)定在250ml/分鐘，攪拌速度設(shè)定在1200rpm。將發(fā)酵罐與2.5ml畢赤氏酵母屬angusta NCYC R320瓊脂平皿中采集細(xì)胞的滅菌去離子水懸浮液一起培養(yǎng)。生長(zhǎng)17小時(shí)后，通過(guò)加入6.36g(5S)-3-酮基-5，6-二羥基己酸叔丁基酯的水溶液開(kāi)始生物還原。同時(shí)以2g葡萄糖/升/小時(shí)的速度向發(fā)酵罐中加入葡萄糖。
反應(yīng)再繼續(xù)78小時(shí)直至達(dá)到底物96％轉(zhuǎn)化點(diǎn)。通過(guò)HPLC檢測(cè)起始物質(zhì)和產(chǎn)物(Hichrom S5 CN-250A柱，溫度35℃，流動(dòng)相TFA水溶液(0.1％)∶乙腈95∶5，流速1ml/分鐘，注射體積5ml，折光率檢測(cè)器)。
通過(guò)在4000×g下離心20分鐘除去細(xì)胞終止反應(yīng)。所回收的不含細(xì)胞的上清液用2M NaOH調(diào)至pH 7.5。將MgSO4·1.6H2O(按無(wú)水物計(jì)算為15％w/v)溶解在不含下表的上清液中，所得到的溶液用等體積的2-戊酮提取2次。收集溶劑相，在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓除去溶劑得到粘性橙色油狀物。該油狀物再溶解在50ml無(wú)水蒸餾的2-戊酮中并再通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到叔丁基3，5，6-三羥基己酸酯(5.08g，80％分離收率)。如下測(cè)定非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量；通過(guò)在過(guò)量三氟乙酸酐中，在室溫下反應(yīng)至少10分鐘得到叔丁基3，5，6-三羥基己酸酯(30mg)樣品，在氮?dú)饬飨聹p壓除去過(guò)量酸酐，所得到的殘余油狀物用二氯甲烷(1ml)稀釋。樣品在140℃(等溫的)下用Chiralcel Dex CB柱(25米)分析。在14.4分鐘(3R，5S非對(duì)映異構(gòu)體)和15.7分鐘(3S，5S非對(duì)映異構(gòu)體)洗脫非對(duì)映異構(gòu)體。通過(guò)該方法測(cè)定的樣品非對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量為99.7％。
權(quán)利要求
1.一種制備式(1)化合物的方法 式1該方法包括a)、立體選擇性還原式(2)化合物 式2產(chǎn)生式(3)化合物，和 式3b)、在式R″-O-COR′化合物和脂肪酶或水解酶存在下酯化式(3)化合物，由此形成式(1)化合物；或者c)、在式R″-O-COR′化合物和脂肪酶或水解酶存在下酯化式(2)化合物，由此形成式(4)化合物，和 式4d)、立體選擇性還原式(4)化合物，產(chǎn)生式(1)化合物；其中X代表未取代的或取代的烴基連接基，R和R″各獨(dú)立地代表未取代的或取代的烴基，并且R′代表未取代的或取代的烴基，優(yōu)選未取代的或取代的烷基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中X代表-CH2-基。
3.任一上述權(quán)利要求的方法，其中R″代表乙烯基或異丙烯基。
4.任一上述權(quán)利要求的方法，其中R′代表取代的或未取代的C1-6烷基。
5.權(quán)利要求4的方法，其中R′代表甲基。
6.任一上述權(quán)利要求的方法，其中通過(guò)與具有選自白僵菌屬、畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、克魯維氏酵母屬或有孢圓酵母屬微生物特性的生物體或由上述生物體提取的酶接觸還原式(2)或(4)化合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)與選自紅橡膠畢赤氏酵母、巴斯德畢赤氏酵母、季也蒙氏假絲酵母、卡爾斯伯糖酵母、喜海藻糖畢赤氏酵母、果蠅克魯維氏酵母和Torulaspora hansenii的生物體或由上述生物體提取的酶接觸將式(2)或(4)化合物還原。
8.權(quán)利要求6或7的任一方法，其中使用全細(xì)胞。
9.權(quán)利要求6、7或8的任一方法，其中在pH4-5下還原式(2)或(4)化合物。
10.任一上述權(quán)利要求的方法，其中在選自豬胰腺脂肪酶、Candidacylindracea脂肪酶、熒光假單胞菌脂肪酶、Candida antarctica fractionB和由Humicola lanuginosa獲得的脂肪酶存在下將式(2)或(4)化合物酯化。
11.任一上述權(quán)利要求的方法，其中式R″-O-COR′化合物為乙烯基乙酸酯。
12.一種制備式(5)化合物的方法 式5該方法包括a)、按照任一上述權(quán)利要求的方法制備式(1)化合物；b)、將式(1)化合物與2，2-二甲氧基丙烷反應(yīng)，形成丙酮化合物；和c)、除去R′-(C＝O)-基；其中X代表未取代的或取代的烴基連接基，R和R″各獨(dú)立地代表未取代的或取代的烴基，并且R′代表未取代的或取代的烴基，優(yōu)選未取代的或取代的烷基。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)用堿性醇溶液處理除去R′-(C＝O)-。
14.式(1)化合物 式1其中R′為CH3，R為未取代的或取代的烴基，X為-(CH2)n-并且n為1-4。
15.權(quán)利要求14的化合物，其中R為叔丁基并且X為-CH2-。
16.一種制備式(1)化合物的方法， 式1該方法包括在式R″-O-COR′化合物和脂肪酶或水解酶存在下酯化式(3)化合物，形成式(1)化合物， 式3其中X代表未取代的或取代的烴基連接基，R和R″各獨(dú)立地代表未取代的或取代的烴基，并且R′代表未取代的或取代的烴基，優(yōu)選未取代的或取代的烷基。
17.一種制備式(4)化合物的方法， 式4該方法包括在式R″-O-COR′化合物和脂肪酶或水解酶存在下酯化式(2)化合物，形成式(4)化合物， 式2其中X代表未取代的或取代的烴基連接基R和R″各獨(dú)立地代表未取代的或取代的烴基，并且R′代表未取代的或取代的烴基，優(yōu)選未取代的或取代的烷基。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中R′為CH3，R為叔丁基并且X為-CH2-。
19.權(quán)利要求16、17或18的方法，其中R″為乙烯基或異丙烯基。
20.權(quán)利要求16-19的方法，其中所述酶選自豬胰腺脂肪酶、Candida cylindracea脂肪酶、熒光假單胞菌脂肪酶、Candida antarcticafraction B和由Humicola lanuginosa獲得的脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明提供制備式(1)化合物的方法，其中R和R′代表未取代的或取代的烴基并且X代表烴基連接基。該方法包括立體選擇性還原二羥基酮前體中的酮基，然后選擇性酯化伯羥基或選擇性酯化二羥基酮前體的伯羥基，然后立體選擇性還原酮基。
文檔編號(hào)C07C67/03GK1440461SQ01812489
公開(kāi)日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2001年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月9日
發(fā)明者R·A·霍爾特, A·J·布拉克, C·D·里夫 申請(qǐng)人:艾夫西亞有限公司