專利名稱：由作為靶特異前體藥物的抗體－細(xì)胞因子－細(xì)胞因子抑制劑(選擇因子)組成的融合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有優(yōu)選抗腫瘤的和/或免疫調(diào)制的細(xì)胞因子特性的多肽，它可在體內(nèi)經(jīng)處理而活化，該多肽包含有特異生物活性的中心區(qū)，在中心區(qū)的C-端存在具有處理單元和抑制劑結(jié)構(gòu)域的區(qū)，而在中心區(qū)的N-端存在選擇性識(shí)別細(xì)胞表面大分子或胞外基質(zhì)成分的區(qū)。
采用重組腫瘤壞死因子(TNF)和其它的活性物質(zhì)用于治療如腫瘤病，由于視為治療限制因素的強(qiáng)的全身副作用，至今僅可基于特定的昂貴的治療方案(例如采用所謂的“隔離的肢灌注”)對(duì)非常有限的癥狀(肢的黑素瘤/肉瘤-轉(zhuǎn)移)有效地實(shí)施。從臨床數(shù)據(jù)得知，為達(dá)抗腫瘤活性，與允許的大量全身副作用相比，其需要比MTD(最大允許劑量)約10倍-100倍高的TNF-劑量。
因此本發(fā)明的目的在于，在保持或甚至增強(qiáng)活性物質(zhì)如TNF的例如對(duì)抗腫瘤呈治療有效的特性的同時(shí)，還可避免或減低用治療有效的多肽活性物質(zhì)如含TNF的物質(zhì)治療時(shí)的有害后果。
該目的是通過(guò)在權(quán)利要求中表征的本發(fā)明的實(shí)施方案達(dá)到的。
特別是按本發(fā)明制備一種具有氨基酸序列的多肽，它從N端向C-端含有(1)選擇性識(shí)別細(xì)胞表面上的特定大分子和/或胞外基質(zhì)的成分的區(qū)，(2)包含肽連接體(Petidlinker)的區(qū)，(3)對(duì)特定靶分子具有生物活性的區(qū)，(4)具有至少一個(gè)處理部位的區(qū)，和(5)通過(guò)分子內(nèi)結(jié)合和/或相互作可延緩區(qū)(3)的生物活性的區(qū)，其中，區(qū)(3)的生物活性可通過(guò)區(qū)(4)中至少一個(gè)處理位置的體內(nèi)處理而釋放。
本發(fā)明的多肽(后面也稱為“選擇因子(Selektokin)”)是一種構(gòu)成模塊的活性物質(zhì)，按照特別優(yōu)選的實(shí)施方案，一種具有細(xì)胞因子，優(yōu)選TNF或其生物有效衍生物或生物有效突變體的優(yōu)選同三聚體融合蛋白質(zhì)作為抗腫瘤有效的物質(zhì)或區(qū)(3)，通過(guò)與達(dá)到有病組織(如腫瘤區(qū))的四個(gè)其它功能模塊的偶聯(lián)釋放出生物效應(yīng)。它通過(guò)治療有效物質(zhì)如TNF-分子與用于目標(biāo)組織的特異靶模塊(1)，如對(duì)腫瘤特異的抗體或其衍生物如scFv-抗體的N-端偶聯(lián)和與抗治療有效物質(zhì)的抑制劑(5)，特別是肽-抑制劑的C-端偶聯(lián)達(dá)到，其在目標(biāo)組織如腫瘤區(qū)中通過(guò)結(jié)構(gòu)域(4)的作用選擇性失活，優(yōu)選通過(guò)融合蛋白的有目的的蛋白水解分裂而去除，并由此形成在選擇的靶-模塊上結(jié)合的活性物質(zhì)如TNF。在靶-模塊(如scFv-抗體斷片)和具有治療作用的模塊(如TNF)之間存在肽連接體結(jié)構(gòu)域(2)，優(yōu)選三聚結(jié)構(gòu)域，它保證共價(jià)的二硫橋鍵的形成及由此形成融合蛋白質(zhì)的有規(guī)的和穩(wěn)定的均三聚作用。
用本發(fā)明的構(gòu)型，可達(dá)到治療有效的物質(zhì)如TNF的局部高的有效濃度，并不會(huì)引起全身高的治療含量(如血清中的TNF)及由此引來(lái)的限制治療的副作用。同時(shí)，例如在TNF作為治療有效區(qū)的情況下，通過(guò)靶-模塊-(如抗體-)促成的位置前活化的TNF的呈現(xiàn)達(dá)到相應(yīng)于天然膜-TNF的作用，即導(dǎo)致兩個(gè)TNF-受體-型的共活化。并由此導(dǎo)致TNF的抗腫瘤特性的增加。通過(guò)選擇靶-模塊的特異性，可在各個(gè)腫瘤本體上產(chǎn)生特異性諧調(diào)的/最佳的治療法。
本發(fā)明的多肽的(氨基酸序列-)區(qū)或模塊將在下面按優(yōu)選實(shí)施方案給以詳細(xì)描述。
本發(fā)明的多肽(選擇因子)提供了一種新型前體藥物工藝，并且是一種構(gòu)型，即按本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是一種重組的均三聚的融合蛋白質(zhì)，它原則上包括下列結(jié)構(gòu)成分(在單體中)的確定的順序(N端向C-端)(1)鼠的、人源化的或人的由VH-連接體-VL組成的確定抗原特異性的單鏈抗體片段(scFv)；(2)具有固有三聚特性的肽連接體；(3)TNF-分子，它例如相應(yīng)于野生型-TNF或TNF的胞外區(qū)(成熟17 kDa形式、AAl-157、Swissprot # PO 1375)或由其衍生的生物活性變體；(4)具有特異蛋白酶-分裂位置的可變肽連接體；(5)特異的結(jié)合TNF的蛋白質(zhì)或肽。
靶模塊(1)優(yōu)選對(duì)細(xì)胞表面分子是特異的，該分子在與血管生成過(guò)程有關(guān)的腫瘤病變和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)(exprimiert)。按另一優(yōu)選實(shí)施方案，靶-模塊(1)對(duì)細(xì)胞外的基質(zhì)的一個(gè)成分是特異的，該成分存在于腫瘤病變和/或病理病變的血管生成區(qū)域中。按照更優(yōu)選的實(shí)施方案，靶模塊(1)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞本身的成分是特異的。該區(qū)域模塊(1)包含抗體(如鼠、人源化或人的)或其片段，如Fab-片段或典型的按現(xiàn)有技術(shù)制備的對(duì)例如在腫瘤組織中優(yōu)選或主要表達(dá)(exprimiert)抗原有特異性的來(lái)源于鼠的、經(jīng)CDR-移植的人源化的或完全是人的單鏈抗體片段(scFv)，其中基本上可在惡性細(xì)胞本身上表達(dá)(exprimiert)，但優(yōu)選在腫瘤未惡化的部分、基質(zhì)細(xì)胞或腫瘤內(nèi)皮中表達(dá)(exprimiert)。這種實(shí)體腫瘤(癌)的未惡化的組織部分的抗體一方面在遺傳上是不變的，另一方面在不同的腫瘤本體中是存在的，并由此是普適的腫瘤標(biāo)志。例如這里可列舉VEGFR-配合物或VEGFR/VEGF-配合物(如受體-配位體-配合物)以及整聯(lián)蛋白ανβ3、皮內(nèi)唾酸蛋白、作為腫瘤內(nèi)皮選擇性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的纖連蛋白一同種型bFn和在腫瘤基質(zhì)中存在的作為胞外基質(zhì)成分的選擇性標(biāo)志的所謂成纖維細(xì)胞活化蛋白質(zhì)(FAP)，例如它們可有效地包含在特異的高親合性的scFv中。適用的靶-模塊的另一些實(shí)例是肽、人工抗體和Spiegelmere。
肽連接體區(qū)(2)優(yōu)選是三聚模塊，并且以治療有效的區(qū)(3)連接靶-模塊區(qū)(1)。按照優(yōu)選的實(shí)施方案，三聚模塊包括具有固有三聚合特性的天然存在的或合成的肽。這類肽的特別合適的實(shí)例為腱生蛋白-分子(AA110-139，Swissprot # P10039，(雞)或Swissprot# P 24821(人))的結(jié)構(gòu)域，它產(chǎn)生靶-模塊(1)(例如scFv)和治療劑(3)(例如TNF)之間的聯(lián)系，并同時(shí)確保融合蛋白質(zhì)在生物發(fā)生時(shí)的共價(jià)均三聚偶聯(lián)。
如前所述，治療有效的模塊(3)優(yōu)選包含細(xì)胞因子的氨基酸序列或其治療有效的片段。優(yōu)選區(qū)(3)包含TNF的氨基酸序列，更優(yōu)選為TNF-前體蛋白，最優(yōu)選是與經(jīng)處理的成熟的野生型-TNF-分子(AA 1-157，Swissprot # PO 1375)相同的蛋白質(zhì)，或由其衍生的衍生物或具有選擇性受體鍵合特性的突變體或由此使其特異的生物活性或其它特性(穩(wěn)定性，耐蛋白酶)最佳化的突變體或衍生物。
處理模塊(4)例如是對(duì)蛋白酶敏感的(即處理部位相應(yīng)蛋白酶的識(shí)別序列)和優(yōu)選的是在氨基酸組成和總長(zhǎng)中能通過(guò)三聚模塊和TNF本身引起的融合蛋白質(zhì)均三聚的那種，但同時(shí)也能在TNF-部分上有在分子C-端存在的TNF-抑制劑的高親合的穩(wěn)定的結(jié)合，以致抑制TNF-模塊在細(xì)胞表達(dá)(zellexprimierte)的TNF受體上的鍵合。此外，這種連接體優(yōu)選是含至少一個(gè)或多個(gè)對(duì)這種胞外的或與細(xì)胞有關(guān)的蛋白酶有選擇性的分裂位置，它表明在腫瘤組織中有優(yōu)選的選擇性。適合的分裂位置的實(shí)例是尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)、組織纖溶酶原激活物(tPA)、活性凝血因子VIIa、基質(zhì)-金屬蛋白酶如MMP-2和MMP-9、和在腫瘤的基質(zhì)中高選擇性膜固定表達(dá)(exprimierte)FAP-蛋白酶。特別優(yōu)選的對(duì)蛋白酶敏感的分裂位置是在鏈中與轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)的基質(zhì)-金屬蛋白酶(如MMP-9-識(shí)別序列Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys；SEQ ID NO 18)、優(yōu)選在壞死斑中出現(xiàn)的酶以及與前列腺癌有關(guān)的酶(如PSMA，PSA，可分裂的處理模塊戊二?；?(4-羥丙基)-Ala-Ser-環(huán)己甘氨酰-Gln-Ser-Leu-COOH)。這種連接體的結(jié)構(gòu)如此選擇，使蛋白酶-識(shí)別序列可供自由使用，即通過(guò)特異蛋白酶的有效作用是可能的，并且融合蛋白質(zhì)，有時(shí)在TNF-分子上保留的連接的氨基酸分裂后，治療有效的區(qū)的生物活性不受不利影響。
按本發(fā)明的多肽的優(yōu)選實(shí)施方案，抑制劑模塊(5)是細(xì)胞因子的受體或其片段。此外，抑制劑模塊優(yōu)選地具有至少一個(gè)適于治療有效區(qū)(3)的結(jié)合位置。在區(qū)(3)中應(yīng)用TNF的情況下，抑制劑模塊優(yōu)選包括人的TNF-受體的全部的或部分的胞外結(jié)構(gòu)域，例如huTNFR1(異名p 55/60 TNFR；Swissprot # P19438，AA 1-190；或這種分子的片段，如AA 1-157或AA 60-120)。另外的特異TNF結(jié)合的蛋白質(zhì)，如huTNFR2(EMBL-數(shù)據(jù)庫(kù)#M32315)的胞外域或病毒源的蛋白質(zhì)如T2蛋白質(zhì)以及由此衍生的具有TNF結(jié)合特性和干擾在固定有細(xì)胞膜的TNF-受體上的TNF結(jié)合的合成肽同樣是適合的。基于抑制劑與治療有效的模塊的結(jié)合或相互作用，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)處于生物失活狀態(tài)，即以前體形式(前體藥物)存在。
本發(fā)明的聚肽還可包括其它的域。例如為簡(jiǎn)化重組制備的蛋白質(zhì)的凈化和體外分析，可附加適用的標(biāo)記序列。例如可將由媒介物POPE導(dǎo)出的myc-His6-Tag附加在區(qū)(5)的C-端，優(yōu)選附加在TNFR-片段上。其它的標(biāo)記序列是專業(yè)人員所已知的。
本發(fā)明優(yōu)選的TNF-選擇因子是共價(jià)偶聯(lián)的均三聚分子，它由三個(gè)官能域、對(duì)腫瘤特異的抗體模決、TNF和嵌段的TNF-結(jié)合蛋白質(zhì)(胞外受體域或由其衍生的肽)以及位于其間的具有三聚特性或特異性的蛋白酶-分裂位置的官能連接體的上述詳細(xì)描述的融合組成，它在這種復(fù)雜狀態(tài)下，涉及TNF-作用是非活性的。該選擇因子在體內(nèi)給藥后通過(guò)抗體一部分首先特別在腫瘤區(qū)域濃集，并在那里通過(guò)由腫瘤本身或反應(yīng)性的腫瘤基質(zhì)/腫瘤血管體系形成的蛋白酶(如FAP、uPA、tPA、MMP2、因子VIIa)處理，即分裂抑制的肽(5)。選擇性蛋白酶剪切(proteolytischer Spaltung)后，三聚合的TNF-分子的TNFR-片段/抑制劑肽離解，其后變成生物活性的(即區(qū)的生物活性通過(guò)區(qū)(4)中處理位置的處理而釋放)。如此處理的TNF優(yōu)選在細(xì)胞的TNF-受體上形成，因?yàn)樽鳛榫嗑鄯肿?，它比單體的可溶的受體-片段具有明顯高的親合性。用本發(fā)明的選擇因子，TNF-作用的選擇性也通過(guò)兩個(gè)措施達(dá)到一方面通過(guò)scFv-促成的非活性前體藥物在腫瘤中的選擇性濃集和其在蛋白酶解活化后的保留，另一方面通過(guò)前體藥物經(jīng)蛋白酶的特定地點(diǎn)的轉(zhuǎn)變，這可由唯一的或優(yōu)選的在腫瘤區(qū)域中的明顯活性來(lái)證實(shí)。通過(guò)TNF在有膜的抗原上由scFv促成的鍵合會(huì)達(dá)到選擇因子的更優(yōu)選的作用，即與通常采用的(溶解的)TNF-分子相比，有更好的類似于天然膜-TNF分子的生物作用。通過(guò)經(jīng)scFv固定TNF使在TNFR2上的離解平衡移向更穩(wěn)定的結(jié)合，并由此達(dá)到它的活化。已知兩個(gè)TNFR的同時(shí)活化共價(jià)信號(hào)機(jī)制和由此產(chǎn)生的增強(qiáng)的細(xì)胞反應(yīng)，特別是在腫瘤細(xì)胞中內(nèi)皮細(xì)胞的活化和細(xì)胞死亡的誘發(fā)，在這方面對(duì)于通常應(yīng)用(溶解)的TNF是抗性的。
本發(fā)明的多肽的特別優(yōu)選的實(shí)施方案具有圖1(SEQ ID NO 1)和圖5(SEQ ID NO 3)所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一主題是一種核酸，它包括核苷酸序列，該序列用于本發(fā)明的多肽的編碼。術(shù)語(yǔ)“核酸”意指來(lái)自脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸和/或改性的核苷酸的一種天然的、半合成的、合成的或改性的核酸分子。本發(fā)明優(yōu)選的核酸的實(shí)施方案包括圖1(SEQ ID NO 2)和圖5(SEQ ID NO 4)所示的核酸序列。
此外，按本發(fā)明提供一種含前述定義的核酸的媒介物。該媒介物在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞中可優(yōu)選地用于表達(dá)和/或擴(kuò)增。由此，該媒介物優(yōu)選含有適用的調(diào)控成分，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止序列等。該媒介物也可用于將本發(fā)明的核酸的穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞的基團(tuán)材料中。
本發(fā)明的另一主題是提供一種含上述核酸和/或上述媒介物的宿主細(xì)胞。適用的宿主細(xì)胞例如是所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如COS細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種用于制備本發(fā)明多肽的方法，它包括下列步驟(a)在合適的條件下于培養(yǎng)基中培育存在的宿主細(xì)胞，和(b)從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選地通過(guò)適合的表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)來(lái)制備，優(yōu)選作為細(xì)胞系CHO DG44的可選擇的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子的分泌產(chǎn)物或在COS 7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)后制備。另外的相應(yīng)于現(xiàn)有技術(shù)的真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，如Pichia pastoris、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞也是適用的，如在Brock等人(免疫技術(shù)3173-184，1997)對(duì)哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞所描述的適合分泌作用的各個(gè)細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)媒介物，在酵母Pichiapastoris中用于表達(dá)和分泌作用的pPICZα-媒介物(INVITROGEN)。
本發(fā)明的多肽、核酸和/或媒介物可優(yōu)選地用于制備治療由疾病引起的失調(diào)的藥物組合物。
因此，本發(fā)明的另一主題涉及一種藥物組合物，它以藥物有效量包含本發(fā)明的多肽和/或本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的媒介物，需要時(shí)可含有一種或多種藥物上適用的助劑、稀釋劑和/或載體。該藥物組合物優(yōu)選地用于治療癌和/或感染性疾病和/或代謝性疾病。該藥物組合物的特別優(yōu)選的應(yīng)用范圍是治療實(shí)體瘤以及病理病變中的血管。本發(fā)明的藥物組合物可采用當(dāng)前專業(yè)領(lǐng)域中的每一種適用的已知形式。優(yōu)選的是固態(tài)、液態(tài)或氣溶膠型。
由此，本發(fā)明還包括一種治療方法，包括對(duì)需治療的病人給以足夠治療量的本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明藥物組合物的適用的給藥途徑是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所已知的，例如包括口服、靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、鼻給藥、直腸給藥和局部給藥。靜脈內(nèi)給藥可按連續(xù)的注射間隔以丸劑注射和/或以注入給藥。用本發(fā)明的藥物組合物可治療人類的病，也可治療動(dòng)物的病。該治療方法優(yōu)選用于有前述疾病的病人。


圖1示出本發(fā)明選擇因子前體藥物W24的氨基酸序列(SEQ ID NO1，上)和相應(yīng)的cDNA-核苷酸序列(SEQ ID NO2，下)。
圖2示出用抗-c-myc-mAK培養(yǎng)后的考馬斯染色的SDS-PAGE-凝膠和相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡的照相描述。前體藥物W24在CHO-DG44-細(xì)胞中表達(dá)，并用IMAC純化。純化后的蛋白質(zhì)在還原條件(還原)以及非還原條件下涂布。
圖3示出按抗-c-myc-mAK 9E10檢出的12％ SDS-凝膠的蛋白質(zhì)印跡分析的照相描述，印跡1用PBS培育后的純化的前體藥物W24；印跡2用PBS+tPA培育后的純化的前體藥物W24。
圖4示出使用典型活化的前體藥物W24(■)或非活化的前體藥物W24()時(shí)在Kym-1細(xì)胞上的誘發(fā)細(xì)胞死亡的圖。
圖5示出本發(fā)明的選擇因子前體藥物W33的氨基酸序列(SEQ IDNO3，上)和相應(yīng)的cDNA-核苷酸序列(SEQ ID NO 4，下)。
圖6中(A)示出用抗-c-myc-mAK 9E 10培育后的考馬斯染色的SDS-PAGE-凝膠和相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡的照相描述。前體藥物W32在CHO-DG44-細(xì)胞中表達(dá)并用IMAC純化。純化后的蛋白質(zhì)在還原條件以及非還原條件下涂布。(B)示出用FACS-分析的關(guān)于FAP-結(jié)合的前體藥物W32的KD、app.的測(cè)定結(jié)果。用一系列稀釋的前體藥物W32培育FAP-正性HT 1080 # 33-細(xì)胞(o)和FAP-負(fù)性HT1080-對(duì)照細(xì)胞(●)，并用間接的免疫熒光強(qiáng)度來(lái)探測(cè)形成細(xì)胞的份額。示出所用前體藥物濃度與平均熒光強(qiáng)度(m.f.i)之間的關(guān)系。
圖7中(A)示出在具有非活化前體藥物W32(■)、胰蛋白酶活化的前體藥物W32(口)或野生型-TNF(●)的Kym-1-細(xì)胞情況下，細(xì)胞死亡誘發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖中示出三個(gè)實(shí)驗(yàn)的典型情況。插入IMAC-純化的前體藥物W32的在還原條件下用考馬斯染色的SDS-PAGE-凝膠(左印跡)和胰蛋白酶活化后IMAC-純化的前體藥物W32(右印跡)的照相描述。(B)示出在用呈現(xiàn)前體藥物的FAP-正性細(xì)胞(HT 1080 #33)以及用FAP-負(fù)性-對(duì)照細(xì)胞(HT1080)協(xié)同培養(yǎng)時(shí)的Kym-1-細(xì)胞的細(xì)胞死亡誘發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(B)中示出的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)的圖示為HT1080+非活化前體藥物W32(△)，HT 1080+胰蛋白酶活化的前體藥物W32(口)，HT 1080 # 33+非活化的前體藥物W32(▲)，HT 1080 # 33+胰蛋白酶活化的前體藥物W32(■)。(C)是相應(yīng)(B)中實(shí)驗(yàn)的圖示，但就在結(jié)合到HT-細(xì)胞上后進(jìn)行胰蛋白酶活化，并接著固定。其圖示為HT1080+非活化前體藥物W32(○)，HT1080+胰蛋白酶活化的前體藥物W32(口)，HT1080#33+非活化前體藥物W32(●)，HT1080#33+胰蛋白酶活化的前體藥物W32(■)。在(B)和(C)的圖中總是由三個(gè)實(shí)驗(yàn)的典型情況。
下面將用非限定性實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
2.scFv-TD腱生蛋白-huTNF(AS1-157)-連接體-huTNFR1(AS 60-120)。
在另一方案中，在huTNF-分子中的可能的內(nèi)生分裂位在保留scFV、連接體序列和受體序列的情況下，通過(guò)氨基酸的交換去除(TNFmut I83F，R131Q)，如上述實(shí)例所述。
在不同物種情況下腱生蛋白-C的高保存的卷曲螺旋域(AS 110-139)用作三聚域AS-序列的實(shí)例為雞ACGCAAAPIVKDLLSRLEELEGLVSSLREQ(Swissprot#P10039，SEQ ID NO5)*人ACGCAAAPDVKELLSRLEELENLVSSLREQ(Swissprot#P24821，SEQ ID NO6)#*Nies，D.E；Hemesath，T.J.，Kim，J.H.，Gulcher，J.R.和Stefansson，K.人的hexabrachion(腱生蛋白)的完整cDNA序列。含單一表皮生長(zhǎng)因子復(fù)制的多域蛋白質(zhì)。J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)266(5)，2818-2823(1991)。#Spring，J.，Beck，K.和Chiquet-Ehrismann，R.腱生蛋白的兩個(gè)相反功能由重組腱生蛋白片段的活性位點(diǎn)的剖分。Cell(細(xì)胞)59(2)，325-334(1989)。實(shí)施例2連接體-序列本發(fā)明的處理序列例如是具有適于凝血酶、tPA、因子VIIa和uPA的蛋白酶分解位置的連接體(氨基酸序列如下，SEQ ID NO 7；cDNA核苷酸序列如上，SEQ ID NO 8)TCCGGAATGTACCCCAGAGGATCGATCGGCGCCCCCTTCGGCCGCGGCGCCCCCTTCGTACGCATCS G M Y P R G S I G A P F G R G A P F V R I|凝血酶| | tPA | |因子VIIa|GAGGGTCGGGTCE G R V| uPA |實(shí)施例3TNF-選擇因子前體藥物W24的表達(dá)、純化和功能表征前體藥物W24TNF-選擇因子前體藥物W2 4由下列成分組成(從N端向C-端，氨基酸基團(tuán)(AA)基于SEQ ID NO 1)1.AA 1-19前導(dǎo)肽序列2.AA 20-285ScFv OS4(特異性人的FAP；參看Mersmann(2000)斯圖加特大學(xué)博士論文，Grauer出版社，斯圖加特，ISBN 3-86186-335-9；Rippmann 1999，斯圖加特大學(xué)博士論文，ISBN 3-86186-281-6)3.AA 286-315腱生蛋白的三聚結(jié)構(gòu)域(雞，見上面)AA 316-321連接體(Linker)4.AA 322-486天然的人的TNF-前體蛋白質(zhì)的變異形式(26 kDa膜形式，Swissprot#P01375，233 AA)，缺失N-端56AA和AA 78-89(TNFΔ1-56，78-89)，即缺失胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和TNF-前體多肽的TACE-分裂位置。
5.AA 487-512具有蛋白酶分裂位置的連接體(參看實(shí)施例2)6.AA 513-639含有胞外結(jié)構(gòu)域1-3的人的TNFR1片段(Swissprot#P19438，AA 12-138；參看Himmler等(1990)DNA和Cell Biology(細(xì)胞生物學(xué))9，705-715)，
7.AA 640-652myc-tag8.AA 653-658His-tag圖1中示出氨基酸序列(SEQ ID NO 1)和相應(yīng)的編碼的DNA-序列(SEQ ID NO 2)。該蛋白質(zhì)部分的計(jì)算MW為70.3kDa。表達(dá)和純化前體藥物W24按制造商(Pharmacia)的說(shuō)明從CHO-上層清液以IMAC純化。在用考馬斯染色的SDS-PAGE-凝膠中，在還原和非還原條件下使用400ng(20μl)該物質(zhì)，在有抗-c-myc-mAK 9E10的蛋白質(zhì)印跡中，采用2μl，參看圖2。檢測(cè)單體、二聚物和三聚物的表達(dá)。前體藥物W24由tPA的分裂經(jīng)純化的前體藥物W24(600ng)在PBS(50μl)或在PBS+tPA(5μg tPA在50μl PBS中)于37℃下培養(yǎng)16小時(shí)。在12％ SDS-PAGE(還原)和蛋白質(zhì)印跡之后，用抗-c-myc-mAK 9E10進(jìn)行檢測(cè)，接著用堿性磷酸酶-共軛的山羊抗-小鼠1gG-血清檢測(cè)。接有tPA的在其C-端帶有myc-tag的分裂的TNFR-片段(約17kDa)的預(yù)計(jì)大小的高度中，在33kDa下方的條帶的現(xiàn)象表明前體藥物W24的部分吸收；見圖3?；罨腡NF-選擇因子不能用這種檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)明。前體藥物W24由胰蛋白酶的蛋白水解活化將在50μl標(biāo)準(zhǔn)-培養(yǎng)基(10％ FCS)中的20000 Kym-1-細(xì)胞在前一天散布在有96個(gè)凹穴的平板中(4-倍值)，并在次日加入50μl前體藥物W24-稀釋液。以IMAC-純化的前體藥物W24(2μg)的胰蛋白酶活化是在含最終濃度為100μg/ml的胰蛋白酶的總體積為50μl的PBS中完成的。室溫下用200μl RPMI/10％ FCS培育5分鐘后停止反應(yīng)。未活化的樣品同樣處理，但不含胰蛋白酶。16小時(shí)后通過(guò)MTT-染色確定活性。結(jié)果表明(圖4)，未處理過(guò)的TNF-選擇因子直到濃度約2-3μg/ml都無(wú)生物活性(細(xì)胞死亡誘發(fā))，而胰蛋白酶活化的選擇因子具有與野生型TNF可相比的高特異生物活性(LD50＝0.5ng/ml)。LD50的測(cè)定表明通過(guò)處理可使活性提高約4000倍。實(shí)施例4前體藥物W33前體藥物W33的結(jié)構(gòu)具有與實(shí)施例3的前體藥物W24相同的功能特性，但區(qū)別是具有較長(zhǎng)的對(duì)蛋白酶敏感的連接體(AA 487-520)和較短的TNFR片段(AA 521-582；Swissprot#P19438，人的TNFRl的AA54-115；參見Himmler等人(1990)DNA和細(xì)胞生物學(xué)9，705-715)。前體藥物W33的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)和編碼的cDNA序列(SEQID NO 4)示于圖5。實(shí)施例5TNF選擇因子前體藥物W32的表達(dá)、純化和功能表征前體藥物W32制備了另一種其功能相應(yīng)于實(shí)施例3的前體藥物W24的結(jié)構(gòu)(前體藥物W32)，但含有另外的抗體片段作為靶-模塊(1)(scFv M036)，它是從鼠的Ig基因庫(kù)中獨(dú)立分離出的，并選擇用于交叉反應(yīng)性人/鼠FAP。與此相反，實(shí)施例3的前體藥物W24的靶-特異性基于scFv，它唯一地識(shí)別人的FAP。TNF-選擇因子前體藥物W32的生物化學(xué)表征和抗原-結(jié)合活性對(duì)前體藥物W32進(jìn)行如結(jié)構(gòu)W24(實(shí)施例3)的表達(dá)(exprimiert)用IMAC純化并通過(guò)SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡分析；參看圖6A。
此外，通過(guò)FACS-分析進(jìn)行用于FAP-結(jié)合的前體藥物W32的KD，app.測(cè)定；參看圖6B。KD，app由得到半最大信號(hào)的濃度計(jì)算。得到的值為2.4×10-10M。前體藥物W32的TNF-活性在Kym-1細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)中(參看實(shí)施例3步驟)，活化的前體藥物W32具有與天然存在的TNF可比的活性，而未經(jīng)處理的結(jié)構(gòu)僅在高得多的濃度下才顯示細(xì)胞死亡活性，參看圖7A。
此外，在用對(duì)前體藥物起作用的細(xì)胞的共培育進(jìn)行了活化的前體藥物W32的juxtatrope細(xì)胞死亡誘發(fā)試驗(yàn)。對(duì)此，用一系列稀釋的前體藥物或胰蛋白酶-活化的前體藥物對(duì)FAP-負(fù)性HT 1080-對(duì)比細(xì)胞或FAP-正性HT 1080#33細(xì)胞進(jìn)行培育、洗滌、固定，用Kym-1共培養(yǎng)，并在16小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞的活力，參看圖7B。在另一實(shí)驗(yàn)中，在其它相同的批次(Anstzen)下，進(jìn)行只在結(jié)合到細(xì)胞上并接著細(xì)胞固定之后的胰蛋白酶活化；參看圖7C。在兩種情況下，通過(guò)活化的前體藥物產(chǎn)生明顯的juxtatrope細(xì)胞死亡誘發(fā)作用。實(shí)施例6本發(fā)明的多肽選擇因子W24和W33的形成按如下制備融合蛋白質(zhì)1.單鏈抗體片段(scFv)OS4(其后表示為OS4)是通過(guò)“CDR接枝”的人源化的FAP特異mAb F19類型(Rettig等人，1988)并在Rippmann J.F.(斯圖加特大學(xué)博士論文，Grauer出版社，斯圖加特，1999)和Rippmann等人(Appl EnvMicrobiol 644862-4869，1998)中描述。
2.在具有用于mAb 19的重免疫球蛋白鏈表達(dá)盒的真核的表達(dá)載體pG1D105(描述于EP 0 953639中)中，通過(guò)BstE2和Nael以由scFv OS4；hulgG1的鉸鏈-CH3區(qū)；質(zhì)粒pW7的myc/his-Tag組成的小體OS4盒交換(描述于Wüest，T.，斯圖加特博士論文，2001)。通過(guò)Not1/BamH1吸收選擇性地除去Fc片段(hulgG1的鉸鏈區(qū)和CH3-區(qū))。
3.三聚結(jié)構(gòu)域的cDNA序列(例如雞的腱生蛋白的AA 110-139)借助于引物1(SEQ ID NO 10)和2(SEQ ID NO 11)通過(guò)校對(duì)PCR來(lái)擴(kuò)增，由此引入分裂位置Not1和Kpn1。人的TNF片段從不可分裂的膜的TNF突變體(膜-TNF，TNF delta 1-12，Grell等人，細(xì)胞83793-802，1995)借助引物3(SEQ ID NO 12)和4(SEQ ID NO 13)來(lái)擴(kuò)增，由此在5’端引入分裂位置Kpnl和在3’-端引入分裂位置Acc3和BamH1以及在用于腱生蛋白結(jié)構(gòu)域和TNF結(jié)構(gòu)域編碼的序列段之間引入為肽-連接體TyrGlyGlyGlySer編碼的序列(SEQ ID NO 9)。這兩片段通過(guò)采用Not1-、Kpn1-和BamH1-分裂位置在2.中描述的Not1/BamH1吸收的克隆中間體中嵌入。
4.對(duì)蛋白酶敏感的連接體的克隆和人的TNF-受體1片段的克隆是通過(guò)多個(gè)中間體實(shí)現(xiàn)的。對(duì)此，TNF-受體1片段(富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域1-3；AS 12-138；Swissprot # 10039)從質(zhì)粒pADBTNF-R(Himmler等人，DNA-細(xì)胞生學(xué)物9705-715，1990)用引物5(SEQ ID NO 14)和6(SEQ ID NO 15)PCR擴(kuò)增，由引物7(SEQ ID NO 16)和6(SEQID NO 15)再擴(kuò)增，由此引入分裂位置Acc3，BamH1和TNFR片段的連接體5’，它對(duì)蛋白酶分裂位置編碼。這種片段通過(guò)分裂位置Acc3/BamH1在3.中所描述的中間體中克隆。
5.通過(guò)用引物8(SEQ ID NO 17)和6(SEQ ID NO 15)PCR擴(kuò)增，將蛋白酶敏感的連接體的變化引入連接體-TNFR1-片段中。如此所得的片段通過(guò)分裂位置Clal和BamHl嵌入4.中描述的中間體中，代替了先前得到連接體-TNFR片段。如此制備的真核的表達(dá)質(zhì)粒pW24可表達(dá)TNF-選擇因子-前體藥物W24。
6.在TNF-選擇因子-前體藥物的另一個(gè)實(shí)施方案中，TNF-受體由引物9和10PCR擴(kuò)增，得到具有5’位連接體的、為人的TNFR1的AA54-115編碼的序列。這種片段通過(guò)Sall-和BamH1-分裂位置嵌入pW24中，并代替在那里含有的連接體-TNFR1片段。由此所得的表達(dá)質(zhì)粒pW33可表達(dá)TNF-選擇因子-前體藥物W33。
7.為獲得TNF-選擇因子-前體藥物(W24和W33)，按照制造商的描述以脂轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco-BRL)轉(zhuǎn)染具有在5.和6.中描述結(jié)構(gòu)的CHO-DG44細(xì)胞，并接著通過(guò)不含次黃嘌呤和胸苷的(HT-)CHO-S-SFM介質(zhì)(生命技術(shù))以穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)整合選入基因組中。通過(guò)選擇性試劑氨甲蝶呤的逐漸增加(0.1；1；10μM)來(lái)得到表達(dá)的提高。借助如Rippmann等人(Appl EnvMicrobiol 644862-4869，1998)的固定的金屬親合色譜(IMAC)在無(wú)菌條件下由培養(yǎng)物上層清液純化W24和W33，并在4℃下保存直到進(jìn)一步應(yīng)用。
所有的克隆步驟和PCR-擴(kuò)增步驟均用下面的引物按通常的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。所有結(jié)構(gòu)經(jīng)排序以驗(yàn)證它們的cDNA-序列。相關(guān)的分裂位置以黑體字印刷。引物1(SEQ lD NO 10)Not15’TAA ATA GGG GCC CAC AGC CAG GCG GCC GCC TGT GGC TGT GCG GCTGC3’引物2(SEQ lD 11)Kpn15’ATA AAT GGT ACC CTG CTC CCG GAG GGA GGA 3’引物3(SEQ lD NO 12)Kpn15’GAG AGG GTA CCG GAG GTG GGT CTG GCC CCC AGA GGG AAG AG3’引物 4(SEQ lD NO 13)BamH1Acc35’TTG TTC GGA TCC ACG ACC CTC GAT TCC GGA CAG GGC AAT GAT CCCAAAG 3’引物5(SEQ ID NO 14)BamH15’CTC GGG ATC CGG CGG TGG CAG ATC TGG CGG GGG TGG GGT CGACAG TGT GTG TCC CCA AGG 3’引物6(SEQ ID NO 15)BamH15’CCT GCG GAT CCG GTG CAC ACG GTG TTC TG 3’引物7(SEQ ID NO 16)Acc3Cla15′GCC TTC CGG AAT GTA CCC CAG AGG ATC GAT TGG TGG CAG ATC TGGCGG 3’引物8(SEQ ID NO 17)Cla15′AGT GGA TCG ATC GGC GCC CCC TTC GGC CGC GGC GCC CCC TTC GTACGC ATC GAG GGT CGG GTC GAC AGT GTG TGT C3’序列表序列表<110>斯圖加特大學(xué)，Pfizenmaier，Klaus<120>作為靶特異前體藥物的抗體-細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-抑制劑融合蛋白質(zhì)(選擇因子)<130>U 1125<140><141><150>DE 100 45 592.1<151>2000-09-15<160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>658<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述選擇因子W24氨基酸序列<400>1Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly1 5 10 15Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe35 40 45Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His115 120 125Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala130 135 140Ser Thr Lys Gly Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu phe Ser Glu Ala Arg145 150 155 160Val Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu165 170 175Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr180 185 190Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly195 200 205Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly210 215 220Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu225 230 235 240Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln245 250 255Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu260 265 270Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ala Ala Ala Cys Gly275 280 285Cys Ala Ala Ala Pro Asp Ile Lys Asp Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu290 295 300Leu Glu Gly Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Gly Thr Gly Gly Gly305 310 315 320Ser Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser325 330 335Pro Leu Ala Gln Ala Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu340 345 350Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn355 360 365Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu370 375 380Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser385 390 395 400Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr405 410 415Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg420 425 430Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr435 440 445Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu450 455 460Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr465 470 475 480Phe Gly Ile Ile Ala Leu Ser Gly Met Tyr Pro Arg Gly Ser Ile Gly485 490 495Ala Pro Phe Gly Arg Gly Ala Pro Phe Val Arg Ile Glu Gly Arg Val500 505 510Asp Ser Val Cys pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser515 520 525Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys530 535 540Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser545 550 555 560Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys565 570 575Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp580 585 590Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp595 600 605Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly610 615 620Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Gly625 630 635 640Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser His His His His645 650 655His His<210>2<211>1977<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述選擇因子W24 cDNA-序列<400>2atggactgga cctggcgcgt gttttgcctg ctcgccgtgg ctcctggggc ccacagccag 60gtgcaactag tgcagtccgg cgccgaagtg aagaaacccg gtgcttccgt gaaagtcagc 120tgtaaaacta gtagatacac cttcactgaa tacaccatac actgggttag acaggcccct 180ggccaaaggc tggagtggat aggaggtatt aatcctaaca atggtattcc taactacaac 240cagaagttca agggccgggt caccatcacc gtagacacct ctgccagcac cgcctacatg 300gaactgtcca gcctgcgctc cgaggacact gcagtctact actgcgccag aagaagaatc 360gcctatggtt acgacgaggg ccatgctatg gactactggg gtcaaggaac ccttgtcacc 420gtctcctcag cctccaccaa gggcccaaag cttgaagaag gtgaattttc agaagcacgc 480gtagacattg tgatgaccca atctccagac tctttggctg tgtctctagg ggagagggcc 540accatcaact gcaagtccag tcagagcctt ttatattcta gaaatcaaaa gaactacttg 600gcctggtatc agcagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatcttttg ggctagcact 660agggaatctg gggtacctga taggttcagt ggcagtgggt ttgggacaga cttcaccctc 720accattagca gcctgcaggc tgaagatgtg gcagtttatt actgtcagca atattttagc 780tatccgctca cgttcggaca agggaccaag gtggaaataa aacgtactgt ggctgcacca 840tctgtcttcg cggccgcctg tggctgtgcg gctgccccag acatcaagga cctgctgagc 900agactggagg agctggaggg gctggtatcc tccctccggg agcagggtac cggaggtggg 960tctggccccc agagggaaga gttccccagg gacctctctc taatcagccc tctggcccag 1020gcagtagccc atgttgtagc aaaccctcaa gctgaggggc agctccagtg gctgaaccgc 1080cgggccaatg ccctcctggc caatggcgtg gagctgagag ataaccagct ggtggtgcca 1140tcagagggcc tgtacctcat ctactcccag gtcctcttca agggccaagg ctgcccctcc 1200acccatgtgc tcctcaccca caccatcagc cgcatcgccg tctcctacca gaccaaggtc 1260aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc 1320aagccctggt atgagcccat ctatctggga ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga 1380ctcagcgctg agatcaatcg gcccgactat ctcgactttg ccgagtctgg gcaggtctac 1440tttgggatca ttgccctgtc cggaatgtac cccagaggat cgatcggcgc ccccttcggc 1500cgcggcgccc ccttcgtacg catcgagggt cgggtcgaca gtgtgtgtcc ccaaggaaaa 1560tatatccacc ctcaaaataa ttcgatttgc tgtaccaagt gccacaaagg aacctacttg 1620tacaatgact gtccaggccc ggggcaggat acggactgca gggagtgtga gagcggctcc 1680ttcaccgctt cagaaaacca cctcagacac tgcctcagct gctccaaatg ccgaaaggaa 1740atgggtcagg tggagatctc ttcttgcaca gtggaccggg acaccgtgtg tggctgcagg 1800aagaaccagt accggcatta ttggagtgaa aaccttttcc agtgcttcaa ttgcagcctc 1860tgcctcaatg ggaccgtgca cctctcctgc caggagaaac agaacaccgt gtgcaccgga 1920tccgaacaaa agctgatctc agaagaagat ctatcccatc atcaccatca tcattaa1977<210>3<211>601<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述選擇因子W33氨基酸序列<400>3Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly1 5 10 15Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe35 40 45Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Tbr Ser Ala Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His115 120 125Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser ser Ala130 135 140Ser Thr Lys Gly Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg145 150 155 160Val Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu165 170 175Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr180 185 190Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly195 200 205Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly210 215 220Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu225 230 235 240Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln245 250 255Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu260 265 270Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ala Ala Ala Cys Gly275 280 285Cys Ala Ala Ala Pro Asp Ile Lys Asp Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu290 295 300Leu Glu Gly Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Gly Thr Gly Gly Gly305 310 315 320Ser Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser325 330 335Pro Leu Ala Gln Ala Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu340 345 350Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn355 360 365Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu370 375 380Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser385 390 395 400Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr
405 410 415Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg420 425 430Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr435 440 445Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu450 455 460Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr465 470 475 480Phe Gly Ile Ile Ala Leu Ser Gly Met Tyr Pro Arg Gly Ser Ile Gly485 490 495Ala Pro Phe Gly Arg Gly Ala Pro Phe Val Arg Ile Glu Gly Arg Val500 505 510Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr515 520 525Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg530 535 540Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp545 550 555 560Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu565 570 575Asn Leu Phe Gln Cys Phe Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu580 585 590Asp Leu Ser His His His His His His595 600<210>4<211>1806<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述選擇因子W33 cDNA-序列<400>4atggactgga cctggcgcgt gttttgcctg ctcgccgtgg ctcctggggc ccacagccag 60gtgcaactag tgcagtccgg cgccgaagtg aagaaacccg gtgcttccgt gaaagtcagc 120tgtaaaacta gtagatacac cttcactgaa tacaccatac actgggttag acaggcccct 180ggccaaaggc tggagtggat aggaggtatt aatcctaaca atggtattcc taactacaac 240cagaagttca agggccgggt caccatcacc gtagacacct ctgccagcac cgcctacatg 300gaactgtcca gcctgcgctc cgaggacact gcagtctact actgcgccag aagaagaatc 360gcctatggtt acgacgaggg ccatgctatg gactactggg gtcaaggaac ccttgtcacc 420gtctcctcag cctccaccaa gggcccaaag cttgaagaag gtgaattttc agaagcacgc 480gtagacattg tgatgaccca atctccagac tctttggctg tgtctctagg ggagagggcc 540accatcaact gcaagtccag tcagagcctt ttatattcta gaaatcaaaa gaactacttg 600gcctggtatc agcagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatcttttg ggctagcact 660agggaatctg gggtacctga taggttcagt ggcagtgggt ttgggacaga cttcaccctc 720accattagca gcctgcaggc tgaagatgtg gcattttatt actgtcagca atattttagc 780tatccgctca cgttcggaca agggaccaag gtggaaataa aacgtactgt ggctgcacca 840tctgtcttcg cggccgcctg tggctgtgcg gctgccccag acatcaagga cctgctgagc 900agactggagg agctggaggg gctggtatcc tccctccggg agcagggtac cggaggtggg 960tctggccccc agagggaaga gttccccagg gacctctctc taatcagccc tctggcccag 1020gcagtagccc atgttgtagc aaaccctcaa gctgaggggc agctccagtg gctgaaccgc 1080cgggccaatg ccctcctggc caatggcgtg gagctgagag ataaccagct ggtggtgcca 1140tcagagggcc tgtacctcat ctactcccag gtcctcttca agggccaagg ctgcccctcc 1200acccatgtgc tcctcaccca caccatcagc cgcatcgccg tctcctacca gaccaaggtc 1260aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc 1320aagccctggt atgagcccat ctatctggga ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga 1380ctcagcgctg agatcaatcg gcccgactat ctcgactttg ccgagtctgg gcaggtctac 1440tttgggatca ttgccctgtc cggaatgtac cccagaggat cgatcggcgc ccccttcggc 1500cgcggcgccc ccttcgtacg catcgagggt cgggtcgacg gcggctctgg cggcagtctc 1560gagtgtgaga gcggctcctt caccgcttca gaaaaccacc tcagacactg cctcagctgc 1620tccaaatgcc gaaaggaaat gggtcaggtg gagatctctt cttgcacagt ggaccgggac 1680accgtgtgtg gctgcaggaa gaaccagtac cggcattatt ggagtgaaaa ccttttccag 1740tgcttcggat ccgaacaaaa gctgatctca gaagaagatc tatcccatca tcaccatcat 1800cattaa1806<210>5<211>30<212>PRT<213>Gallus gallus<400>5Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Ile Val Lys Asp Leu Leu Ser Arg1 5 10 15Leu Glu Glu Leu Glu Gly Leu Val Ser Set Leu Arg Glu Gln20 25 30<210>6<211>30<212>PRT<213>人<400>6Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu ser Arg1 5 10 15Leu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln20 25 30<210>7<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述對(duì)于凝血酶、tPA、因子VIIa和uPA的有蛋白酶分裂位置的處理序列<400>7Ser Gly Met Tyr Pro Arg Gly Ser Ile Gly Ala Pro Phe Gly Arg Gly1 5 10 15Ala Pro Phe Val Arg Ile Glu Gly Arg Val20 25<210>8<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述對(duì)于凝血酶、tPA、因子VIIa和uPA編碼的cDNA的有蛋白酶分裂位置的處理序列<400>8tccggaatgt accccagagg atcgatcggc gcccccttcg gccgcggcgc ccccttcgta 60cgcatcgagg gtcgggtc 78<210>9<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述肽-連接體<400>9Tyr Gly Gly Gly Ser1 5<210>10<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于雞的腱生蛋白的三聚結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增的引物1<400>10taaatagggg cccacagcca ggcggccgcc tgtggctgtg cggctgc47<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于雞的腱生蛋白的三聚結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增的引物2<400>11ataaatggta ccctgctccc ggagggagga 30<210>12<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于人的TNF-片段擴(kuò)增的引物3<400>12gagagggtac cggaggtggg tctggccccc agagggaaga g 41<210>13<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于人的TNF-片段擴(kuò)增的引物4<400>13ttgttcggat ccacgaccct cgattccgga cagggcaatg atcccaaag 49<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于TNFR1-片段擴(kuò)增的引物5<400>14ctcgggatcc ggcggtggca gatctggcgg gggtggggtc gacagtgtgt gtccccaagg 60<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于TNFR1-片段擴(kuò)增的引物6<400>15cctgcggatc cggtgcacac ggtgttctg 29<210>16<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于TNFR1-片段再擴(kuò)增的引物7<400>16gccttccgga atgtacccca gaggatcgat tggtggcaga tctggcgg 48<210>17<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述通過(guò)PCR-擴(kuò)增在連接體-TNFR-片段中引入對(duì)蛋白酶敏感的連接體的引物8<400>17agtggatcga tcggcgcccc cttcggccgc ggcgccccct tcgtacgcat cgagggtcgg 60gtcgacagtg tgtgt 75<210>18<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MMP-9-識(shí)別序列<400>18Gly Pro Leu Pro Val Arg Gly Lys1 權(quán)利要求
1.一種具有氨基酸序列的多肽，它從N端向C端含有(1)選擇性識(shí)別細(xì)胞表面上的特定大分子和/或胞外基質(zhì)的成分的區(qū)，(2)包含肽連接體的區(qū)，(3)對(duì)特定靶分子具有生物活性的區(qū)，(4)具有至少一個(gè)處理部位的區(qū)，和(5)通過(guò)分子內(nèi)結(jié)合和/或相互作用延緩區(qū)(3)的生物活性的區(qū)，其中，區(qū)(3)的生物活性可通過(guò)區(qū)(4)中至少一個(gè)處理位置的體內(nèi)處理而釋放。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中區(qū)(3)包含細(xì)胞因子的氨基酸序列或其片段。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中細(xì)胞因子是腫瘤-壞死-因子(TNF)、其生物活性的衍生物或其生物活性的突變型。
4.權(quán)利要求1-3之一的多肽，其中區(qū)(3)的特定靶分子是結(jié)合有細(xì)胞膜的細(xì)胞因子受體。
5.權(quán)利要求3或4的多肽，其中區(qū)(3)包含SEQ ID NO 1的氨基酸基團(tuán)322-486。
6.權(quán)利要求1-5之一的多肽，其中區(qū)(4)中至少一個(gè)處理位置是蛋白酶的分裂位置。
7.權(quán)利要求5的多肽，其中蛋白酶是尿激酶型纖溶酶原活化劑(uPA)、組織纖溶酶原活化劑(tPA)、活化的凝結(jié)因子VIIa、基質(zhì)-金屬蛋白酶或FAP-蛋白酶。
8.權(quán)利要求6或7的多肽，其中區(qū)(4)包含SEQ ID N0 1的氨基酸基團(tuán)487-512或SEQ ID NO 3的氨基酸基團(tuán)487-520。
9.權(quán)利要求1-8之一的多肽，其中區(qū)(5)有至少一個(gè)用于區(qū)(3)的結(jié)合位置。
10.權(quán)利要求9的多肽，其中區(qū)(5)是用于細(xì)胞因子或其片段的受體。
11.權(quán)利要求10的多肽，其中受體包含人的TNF-受體的全部或部分胞外結(jié)構(gòu)域和/或結(jié)合TNF的病毒-蛋白質(zhì)或其突變體或合成的結(jié)合TNF的化合物。
12.權(quán)利要求11的多肽，其中區(qū)(5)包含SEQ ID NO 1的氨基酸基團(tuán)513-639或SEQ ID NO 3的氨基酸基團(tuán)521-582。
13.權(quán)利要求1-12之一的多肽，其中區(qū)(2)中的肽連接體是三聚模塊，并且區(qū)(1)與區(qū)(3)連接。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中三聚模塊包含具有固有的三聚特性的天然存在的或合成的肽。
15.權(quán)利要求14的多肽，其中區(qū)(2)包含SEQ ID NO 5或SEQ IDNO 6的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求1-15之一的多肽，其中區(qū)(1)對(duì)細(xì)胞表面分子是特異的，該分子在與血管生成過(guò)程有關(guān)的腫瘤病變和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
17.權(quán)利要求1-15之一的多肽，其中區(qū)(1)對(duì)胞外基質(zhì)的成分是特異的，該成分存在于腫瘤病變和/或病理病變的血管生成區(qū)域中。
18.權(quán)利要求1-15之一的多肽，其中區(qū)(1)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞本身的成分是特異的。
19.權(quán)利要求1-18之一的多肽，其中區(qū)(1)是具有確定的抗原特異性的鼠、人源化或人的抗體或其片段。
20.權(quán)利要求19的多肽，其中抗體片段是scFv-片段或Fab-片段。
21.權(quán)利要求20的多肽，其中區(qū)(1)包含SEQ ID NO 1的氨基酸基團(tuán)20-285。
22.含有核苷酸序列的核酸，該序列對(duì)權(quán)利要求1-21之一的多肽編碼。
23.媒介物，它含有權(quán)利要求22的核酸。
24.權(quán)利要求23的媒介物，它能在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和/或擴(kuò)增。
25.宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求22的核酸和/或權(quán)利要求23或24的媒介物。
26.一種制備權(quán)利要求1-21之一的多肽的方法，它包括下列步驟(a)在合適的條件下于培養(yǎng)基中培育權(quán)利要求2 5的宿主細(xì)胞，和(b)從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離權(quán)利要求1-21之一的多肽。
27.藥物組合物，它含有藥物有效量的權(quán)利要求1-21之一的多肽和/或權(quán)利要求22的核酸和/或權(quán)利要求23或24的媒介物，需要時(shí)與一種或多種在藥物上可接受的助劑、稀釋劑和/或載體相結(jié)合。
28.權(quán)利要求27的藥物組合物，用于治療病理病變中的實(shí)體瘤和/或血管生成。
29.權(quán)利要求27或28的藥物組合物，它呈固態(tài)、液態(tài)或氣溶膠形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有優(yōu)選抗腫瘤的和/或免疫調(diào)制的細(xì)胞因子特性的多肽，它通過(guò)體內(nèi)處理而活化，該多肽包含有特異生物活性的中心區(qū)，在其C－端所述區(qū)包含具有處理單元和抑制劑結(jié)構(gòu)域的區(qū)，而在N－端包含選擇性識(shí)別細(xì)胞表面大分子或胞外基質(zhì)成分的區(qū)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1458977SQ01815764
公開日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2001年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月15日
發(fā)明者克勞斯·菲曾梅爾, T·維斯特, D·穆斯邁爾, M·格雷爾, P·舍伊里希 申請(qǐng)人:斯圖加特大學(xué), 克勞斯·菲曾梅爾