專利名稱：含有整聯(lián)蛋白結(jié)合基序的肽和治療骨骼疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及肽的領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及用于治療骨骼疾病的肽及其制劑。
背景技術(shù)：
引起世界范圍內(nèi)的各種明顯的健康問(wèn)題的骨骼組織和礦物質(zhì)代謝的疾病已在文獻(xiàn)中有很好的記載。
在人類中，最大的骨量出現(xiàn)在15-40歲之間，這個(gè)時(shí)期被稱為“峰值骨量”。過(guò)了這個(gè)峰值骨量年齡后，骨量開(kāi)始逐漸減少，骨的機(jī)械強(qiáng)度也因此而減少。結(jié)果，當(dāng)機(jī)械強(qiáng)度減少到某個(gè)水平時(shí)，個(gè)體處于較大危險(xiǎn)的骨折。這種自發(fā)事件被稱為骨質(zhì)疏松，嚴(yán)重的話足以致病。
個(gè)體中出現(xiàn)骨損失的速度不同，尤其是與性別有關(guān)。在女性中，骨損失的速度在絕經(jīng)期后立即增加(參見(jiàn)

圖1)，因?yàn)樗齻兯艿玫降脑诰S持健康的骨代謝方面起關(guān)鍵作用的激素——雌激素明顯減少。絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松成為一個(gè)重要的臨床問(wèn)題，因?yàn)樗狗浅６嗟膵D女深受其苦。值得注意的是，骨質(zhì)疏松患者的男女比例為1∶3。
大多數(shù)骨疾病的特征是骨礦物質(zhì)的損失，使得骨變?nèi)?，結(jié)果增加了骨折的頻率和嚴(yán)重性，這被稱為“病理性骨折”。在老齡人群中，這還產(chǎn)生明顯的社會(huì)問(wèn)題，因?yàn)樵S多骨折患者移動(dòng)困難，這常常導(dǎo)致其它精神和機(jī)體功能的退化，導(dǎo)致癡呆、肌無(wú)力和/或疲勞。此外，血栓形成明顯地增加了發(fā)病率和疼痛，如由于髖部或骨盆骨折的結(jié)果可發(fā)生肺栓塞。
單單在美國(guó)，據(jù)說(shuō)到2000年，將有5千2百萬(wàn)名年齡超過(guò)45歲的婦女患有骨質(zhì)疏松。目前，在全世界范圍內(nèi)，患有骨質(zhì)疏松的人群大約為2億。單單在美國(guó)，病理性骨折的年發(fā)病率大約為150萬(wàn)。據(jù)估計(jì)，每年治療這些骨質(zhì)疏松患者的醫(yī)藥費(fèi)，在美國(guó)和在全世界分別為140億美元和600億美元。
腎衰竭也是一個(gè)與礦物質(zhì)代謝和骨骼形成相關(guān)的重要的健康問(wèn)題，其患者的數(shù)量也在迅速增加。這些患者中，腎功能在幾年到十年的時(shí)期內(nèi)逐漸下降。當(dāng)腎功能下降到健康水平的大約1/4時(shí)，患者被歸類為慢性腎衰竭患者。當(dāng)腎功能下降到大約1/6時(shí)，這些患者需要開(kāi)始透析，并被稱為晚期腎病(ESRD)。在患有慢性腎衰竭的患者中，重要礦物質(zhì)如鈣和磷酸鹽的血清水平損失了他們正常的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致骨骼畸形。這種疾病被稱為腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良(ROD)，這是由腎衰竭導(dǎo)致的一種繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。ROD還可能會(huì)引起病理性骨折，如骨質(zhì)疏松。在美國(guó)，晚期腎病的流行迅速增加，在2000年達(dá)到了大約30萬(wàn)人。ROD影響著大多數(shù)ESRD患者。
還有其它幾種骨骼組織和礦物質(zhì)代謝疾病，如佩吉特病、佝僂病、骨硬化癥、甲狀旁腺功能亢進(jìn)等等，并且有很多患者受到這些疾病的困擾。
從代謝角度看，骨是高度活躍的器官，它們連續(xù)地發(fā)生骨吸收和形成(重塑)。破骨細(xì)胞促進(jìn)了骨吸收，這類細(xì)胞由單核/巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞分化而成。破骨細(xì)胞粘附于骨的表明，通過(guò)分泌酸和酶降解骨組織。破骨細(xì)胞通過(guò)粘附于降解的骨組織并分泌骨基質(zhì)蛋白，從而促進(jìn)了骨形成，這些破骨細(xì)胞大多數(shù)被鈣和磷酸鹽礦化。破骨細(xì)胞分化成骨細(xì)胞，并成為骨組織的一部分。
許多實(shí)驗(yàn)方法都試圖加速骨形成或者消除骨吸收。例如，已知生長(zhǎng)因子如BMP(骨形態(tài)生成蛋白)、TGFβ(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)、IGF(胰島素樣生長(zhǎng)因子)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)在骨形成中具有潛在的生物學(xué)活性。具體而言，BMP的少數(shù)幾種亞類分子如BMP-2被認(rèn)為是用于硬組織的最有潛力的生長(zhǎng)因子之一。但是，這些因子并沒(méi)有被開(kāi)發(fā)用作全身性骨疾病的治療劑。因?yàn)樗鼈冎袥](méi)有任何一種可被選擇性地傳送到骨中，并且其中的一些因子如BMP將軟組織轉(zhuǎn)化成硬組織。這被稱為異位鈣化，當(dāng)它們?nèi)硎褂脮r(shí)，有非常不利的影響。此外，骨形成和吸收的過(guò)程是如此的緊密相關(guān)，因而使得骨形成的選擇性增加或骨吸收的選擇性抑制變得極端地困難。
目前，需要對(duì)骨損失進(jìn)行有效的治療。諸如雌激素、降鈣素、維生素D、氟化物、異丙氧黃酮、二磷酸酯以及少數(shù)其它治療劑都未能提供令人滿意的治療方法〔Gennari等，Drug Saf.(1994)，11(3)179-95〕。
常常給患有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的患者使用雌激素及其類似物。雌激素替代治療涉及恰好在絕經(jīng)期開(kāi)始之前或之后給予雌激素。但是，與使用類固醇激素治療常常出現(xiàn)的情況一樣，長(zhǎng)期使用雌激素也會(huì)產(chǎn)生明顯的不利影響，如乳腺癌和其它婦科癌癥〔Schneider等，Int.J.Fertil.Menopausal Study(1995)，40(1)40-53〕。
降鈣素是甲狀腺產(chǎn)生的一種內(nèi)源性激素，通過(guò)其受體選擇性結(jié)合于破骨細(xì)胞，并將這些細(xì)胞滅活。由于破骨細(xì)胞是僅有的可以將骨組織溶解的細(xì)胞，所以降鈣素結(jié)合會(huì)阻斷或放慢由破骨細(xì)胞引起的骨降解。但是，這種生物學(xué)機(jī)制是非常短暫的，因?yàn)槠乒羌?xì)胞相對(duì)快速地對(duì)這種藥物產(chǎn)生耐受。因此，降鈣素的使用不能提供有效的治療選擇。
當(dāng)將氟化物給予人時(shí)，已顯示出可增加骨量。但是，雖然骨量增加了，骨的機(jī)械強(qiáng)度卻沒(méi)有增加。因此，盡管在表觀骨量上有增加，但是骨折的風(fēng)險(xiǎn)仍存在〔Fratzl等，J.Bone Mineral Res.(1994)，9(10)1541-1549〕。此外，給予氟化物有明顯的健康風(fēng)險(xiǎn)。
在世界上的一些地區(qū)已使用異丙氧黃酮治療骨質(zhì)疏松。但是，這種化合物的實(shí)際療效仍是個(gè)問(wèn)題，因此它未被廣泛接受用作治療骨疾病的有用治療劑。
二磷酸酯是從焦磷酸鹽衍生得到的化合物。其合成涉及用碳取代位于兩個(gè)磷原子之間的氧原子，然后用各種取代基修飾該碳。雖然已知二磷酸酯抑制骨吸收，但是它們對(duì)骨形成的影響小。此外，二磷酸酯粘附于骨表面，并在那里維持非常長(zhǎng)的時(shí)間，導(dǎo)致骨組織更新的長(zhǎng)時(shí)間減少。由于骨組織需要不斷地更新，這種更新的減少最終導(dǎo)致骨退化〔Lufkin等，Osteoporos.Int.(1994)，4(6)320-322；Chapparel等，J.Bone.Miner.Res.(1995)，10(1)112-118〕。
與上述制劑相關(guān)的另一重要的問(wèn)題是，除了氟化物和異丙氧黃酮之外的其它制劑不適合于口服給藥，因而必須是經(jīng)腸胃外給予。由于骨疾病常常是慢性的，而且需要長(zhǎng)期的治療，所以需要適合于口服給予的治療劑。
總之，在可預(yù)防或治療骨損失的治療劑方面存在大量的需求。具體而言，非常需要可選擇性增加骨形成和/或破骨細(xì)胞的數(shù)量而不影響骨吸收或軟組織的新藥物。
另一涉及骨骼和礦物質(zhì)代謝的主要健康問(wèn)題是牙齒。據(jù)估計(jì)，僅在美國(guó)就有六千七百萬(wàn)人受到牙周病的影響，2000年的治療費(fèi)用大約60億美元。據(jù)說(shuō)整個(gè)人群中有90％的人在他們的生命中患有齲齒。僅在美國(guó)，每年為治療齲齒而花的費(fèi)用超過(guò)500億美元。
齲齒是一種常見(jiàn)的疾病，常常影響小孩和成人。另一方面，牙周病主要影響成人，更具體地說(shuō)是年老者。在許多病例中，患者的牙齦發(fā)炎并被破壞，支持牙齒的牙槽骨損壞。組成根的核心的牙骨質(zhì)也受到損傷，結(jié)果導(dǎo)致牙齒脫落。治療牙齒缺失的一種最常用的方法涉及使用牙齒植入物。將人工植入物(骨整合的牙齒植入物)放置在丟失了牙齒的地方。在嚴(yán)重的病例中，要用植入物代替整個(gè)義齒。但是，植入物常常松動(dòng)，或者脫落，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)谘啦酃巧系墓潭ú⒉豢偸浅晒Φ?。由于這些患者的牙槽骨由于某種原因而受到損傷，所以植入物并不總是得到牙槽骨的很好支持。當(dāng)牙槽骨嚴(yán)重受損時(shí)，要進(jìn)行自體的骨移植。對(duì)于這種情況，從同一患者的另一骨組織獲得的骨移植物被移植到該損壞的牙槽骨上，以使硬組織在該處再生，并使該處的竇升高。由于這些治療需要昂貴的可生物相容的材料和/或非常熟煉的技術(shù)，所以治療成本一般都非常高。
據(jù)認(rèn)為齲齒是由口腔中的酸性條件引起的。例如，糖被轉(zhuǎn)化成酸，并在牙齒的表面上溶解。雖然在許多病例中僅僅是釉質(zhì)和部分牙質(zhì)受到影響，但是在嚴(yán)重的病例中，這種損傷可到達(dá)牙髓腔，從而導(dǎo)致明顯的疼痛。最典型的治療是使用不可降解的材料如金屬或金屬氧化物填充齲齒病變。齲齒的治療大多數(shù)依賴于那些材料以及牙醫(yī)所采取的技術(shù)，這些通常是昂貴的。
雖然已開(kāi)發(fā)出少量的治療劑，并用于牙科領(lǐng)域，但是通常它們僅僅是抗炎癥的藥物、鎮(zhèn)痛劑和抗生素。還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出可直接改進(jìn)牙周硬組織的一般有效的治療劑。
與礦物質(zhì)代謝相關(guān)的另一主要臨床問(wèn)題是磷酸鹽(PO4)的過(guò)量損失或浪費(fèi)到體外。磷酸鹽在所有的活生物中起到各種重要的作用。在脊椎動(dòng)物中，磷酸鹽是它們的骨骼的主要成分。在所有的動(dòng)物中，磷酸鹽是建立多核苷酸鏈以及細(xì)胞膜所必需的成分，糖和核苷酸的磷酸化和去磷酸化是能量產(chǎn)生和消耗的最基本的反應(yīng)，蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)的磷酸化和去磷酸化對(duì)于細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)是不可缺少的反應(yīng)。因此，磷酸鹽的短缺甚至可導(dǎo)致死亡。
在哺乳動(dòng)物中，體液中磷酸鹽的濃度被控制在使體內(nèi)所有的生物學(xué)功能正常運(yùn)行的范圍之內(nèi)。腎是控制體內(nèi)磷酸鹽水平的最重要的器官。腎中的腎小球使磷酸鹽恒定滲透到尿中，近端的小管通常再吸收大約80％的這種滲透的磷酸鹽。如果這種再吸收功能受損的話，過(guò)量的磷酸鹽將流失到尿中，導(dǎo)致各種臨床問(wèn)題。
例如，已知大多數(shù)的腎移植患者都會(huì)出現(xiàn)過(guò)量的腎磷酸鹽泄漏，因?yàn)橐浦驳哪I或多或少地僅再吸收尿中的磷酸鹽，使其重新回到循環(huán)中。腎移植患者的這種再吸收活性差的原因已經(jīng)弄清。這種再吸收性差常常導(dǎo)致患者產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)不良和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。這種問(wèn)題不能采用簡(jiǎn)單的外源補(bǔ)給磷酸鹽的方法來(lái)治療。在兒科醫(yī)學(xué)中也常常觀察到其病理特征未知的類似的腎磷酸鹽泄漏，其結(jié)果導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良或生長(zhǎng)延緩。
與循環(huán)的磷酸鹽短缺相關(guān)的健康問(wèn)題并不限于人類。乳牛由于過(guò)量生產(chǎn)牛奶的緣故有時(shí)也患有低磷酸鹽血癥(血液中的磷酸鹽太低)。這不僅使牛奶的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量變差，而且還常常使奶牛無(wú)法產(chǎn)奶。這是牛奶場(chǎng)中比較常見(jiàn)的問(wèn)題。
明顯地，非常需要一種治療劑來(lái)促進(jìn)牙槽骨和/或牙齒的再生、增加幫助形成牙組織的成牙本質(zhì)細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，以及減少腎磷酸鹽分泌。
發(fā)明概要公開(kāi)了一類化合物，這類化合物用于治療或預(yù)防與骨骼損失或軟弱相關(guān)的疾病，和/或減少腎磷酸鹽排泄。這類化合物是肽或其類似物，含有10-50個(gè)單體(如氨基酸)單元。氨基酸序列含有一個(gè)或多個(gè)下述基序整聯(lián)蛋白結(jié)合基序序列；糖胺聚糖結(jié)合基序；和鈣結(jié)合基序。這些氨基酸可以是D或L構(gòu)型?；衔镏惺Ｓ嗟膯误w單元(除了前述基序以外的序列)可以是氨基酸類似物。當(dāng)基序是整聯(lián)蛋白結(jié)合基序時(shí)，剩余的單體單元較佳是具有與天然蛋白質(zhì)——胞外基質(zhì)磷糖蛋白中的RGD序列鄰近的氨基酸序列基本上相同的序列的天然氨基酸〔Rowe等，《基因組學(xué)》(Genomics)(2000)，6756-68〕。
本發(fā)明的一個(gè)方面是一組肽和/或肽類似物。
本發(fā)明的一個(gè)特征是，本發(fā)明的化合物含有一個(gè)或多個(gè)下述基序整聯(lián)蛋白結(jié)合基序序列；糖胺聚糖結(jié)合基序；和鈣結(jié)合基序。這些氨基酸可以是D或L構(gòu)型。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明的化合物增強(qiáng)了骨骼生長(zhǎng)。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明的化合物在新骨骼或牙齒生長(zhǎng)的表面上增加了成骨細(xì)胞的數(shù)量，并且可能也增加成牙本質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是，本發(fā)明的化合物減少磷酸鹽(Pi)從身體中流失，如通過(guò)減少尿中Pi的泄漏所表示。
本發(fā)明的另一方面是提供一種治療用的制劑，該制劑含有足夠濃度的本發(fā)明化合物，可將該制劑給予牙齒的牙髓、牙齒的牙根和牙齦之間的空間，或者牙槽骨，以預(yù)防牙齒和/或牙槽骨上的損傷，或者使受損牙齒和/或牙槽骨中的硬組織再生。
本發(fā)明的另一方面是提供牙膏，該牙膏含有足夠濃度的本發(fā)明的化合物，用于增強(qiáng)已退化區(qū)域上的牙齒和/或牙槽骨的生長(zhǎng)，或者預(yù)防這種退化。
本發(fā)明的又一方面是提供一種漱劑，該漱劑含有足夠濃度的本發(fā)明的化合物，用于增強(qiáng)已退化區(qū)域上的牙齒和/或牙槽骨的生長(zhǎng)，或者預(yù)防這種退化。
本發(fā)明的又一方面是牙線，包涂于其上和/或埋植于其中的是本發(fā)明的化合物，這些化合物的量為反復(fù)施用于牙齒和/或牙槽骨增強(qiáng)已退化區(qū)域上的牙齒和/或牙槽骨的生長(zhǎng)，或者預(yù)防這種退化的量。
本發(fā)明的又一方面是施用于個(gè)體的牙齦組織上的小粘貼片，該粘貼片含有治療有效量的本發(fā)明的化合物。這種化合物被緩慢地從該粘貼片釋放到牙齦上，這樣所釋放的化合物滲透到牙齒的牙根以及牙槽骨和/或顎骨中，以預(yù)防這些骨損失和/或使這些骨再生。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種治療或預(yù)防骨骼或牙骨損失的方法，該方法包括給予/施用本發(fā)明的任何制劑/組合物。
在閱讀下文中關(guān)于本發(fā)明的更詳細(xì)的描述之后，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將更容易地理解本發(fā)明的這些和其它目的、優(yōu)點(diǎn)以及特征。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1是顯示人的骨量和年齡的關(guān)系圖。
圖2是胞外基質(zhì)磷糖蛋白質(zhì)的示意圖，其中，稱為“A”的區(qū)域包括與本發(fā)明的肽匹配的序列，稱為“B”的區(qū)域是與骨-牙齒基質(zhì)磷糖蛋白質(zhì)如骨橋蛋白(OPN)、牙質(zhì)唾液磷蛋白(DSPP)、牙質(zhì)基質(zhì)蛋白質(zhì)1(DMP1)和骨唾液蛋白II(IBSP)高度同源的基序。
圖3A、3B、3C和3D是骨(從7天的小鼠顱蓋器官培養(yǎng)研究中得到)橫截面的實(shí)際照片，分別顯示對(duì)照(圖3A)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1(FGF-1)(圖3B)和本發(fā)明稱為D-00004以及D-00006(分別為圖3C和3D)的兩條肽的效果。
圖4是不同化合物對(duì)顱蓋的影響的比較圖。
圖5是顯示D-00006的體內(nèi)作用的圖。
圖6是顯示D-00006對(duì)尿磷酸鹽泄漏的作用的圖。
發(fā)明的詳細(xì)描述在描述本發(fā)明的肽、類似物、制劑和方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不受到所述的任何具體實(shí)施例的限制，當(dāng)然這些都是可以改變的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述本發(fā)明的目的，而不是限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍應(yīng)由附帶的權(quán)利要求限定。
在給出一個(gè)范圍的值時(shí)，應(yīng)理解在該范圍的上限和下限之間的各個(gè)居中值，除非文中另外清楚地說(shuō)明該居中值為該下限單位的十分之一，否則這些居中值都被具體公開(kāi)。任何指定的值或在指定范圍中的居中值與任何其它指定的值或在該指定范圍中的居中值之間的各較小范圍都包括在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立包括在該范圍之內(nèi)或排除在該范圍之外，任一極點(diǎn)、兩個(gè)極點(diǎn)都或都不包括在此較小范圍內(nèi)的各范圍也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，從屬于所述指定范圍內(nèi)的任何具體排除的限度。在所指定的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)限度的情況下，不包括任一或兩個(gè)這些包含的極點(diǎn)的范圍也包括在本發(fā)明之中。
除非另有描述，否則本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員通常所理解的相同。雖然在實(shí)踐或者測(cè)試本發(fā)明時(shí)，可采用與本文所述類似或等效的任何方法和材料，但是下文所述的是優(yōu)選的方法和材料。通過(guò)公開(kāi)和描述與本文所引用的出版物相關(guān)的方法和/或材料，將這些出版物納入本文作為參考。
必須注意的是，在本文和附帶的權(quán)利要求書(shū)中，除非另有說(shuō)明，否則單數(shù)形式的“一個(gè)”、“和”以及“該”包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，以“一條肽”為例，它包括許多的這類肽，而“該方法”則包括一種或多種方法以及本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的等效形式，等等。
本文所討論的出版物都是本申請(qǐng)的申請(qǐng)日以前公開(kāi)的。在此不能認(rèn)為因這些出版物先于本發(fā)明公開(kāi)而不能給本發(fā)明授權(quán)。此外，所提供的出版日期可能與實(shí)際的出版日期不同，這可能需要單獨(dú)確認(rèn)。
定義術(shù)語(yǔ)“肽”和“肽化合物”在文中互換使用，指長(zhǎng)約10-50個(gè)氨基酸的氨基酸多聚體形式，可包括編碼的或非編碼的氨基酸，化學(xué)修飾的或生物化學(xué)修飾或衍生的氨基酸，L-或D-氨基酸，具有修飾的肽骨架的肽，以及含有氨基酸類似物的肽。肽化合物可以是以下物質(zhì)的聚合物(a)天然的氨基酸殘基；(b)非天然的氨基酸殘基，如N-取代的甘氨酸、氨基酸取代基等等；或者(c)天然的和非天然的氨基酸殘基/取代基。換言之，本發(fā)明的肽化合物可以是肽或類肽(peptoid)。類肽化合物和它們的制備方法在WO 91/19735中公開(kāi)，本文將此出版物的內(nèi)容納入作為參考。
術(shù)語(yǔ)“治療”在本文中指獲得所需的藥理學(xué)上和/或生理學(xué)上的效果。該效果可以是預(yù)防性的，如完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀，和/或可以是治療性的，如部分或完全治愈一種疾病和/或由這種疾病引起的不利的影響，如增強(qiáng)維生素D的效果?！爸委煛痹诒疚闹泻w治療脊椎動(dòng)物尤其是哺乳動(dòng)物、最特別是人的疾病，包括(a)預(yù)防易患上某種疾病但尚未診斷出已經(jīng)患有該疾病的對(duì)象患上該疾??；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或者(c)緩解疾病，即使該疾病消退。
本發(fā)明尤其涉及可治療已患有骨損失或者被認(rèn)為可能患有骨損失的患者的肽，因此，本發(fā)明具體涉及預(yù)防、抑制或緩解骨損失的作用。對(duì)象將被“治療”，只要該對(duì)象存在治療上可檢測(cè)的和有利的效果，這種效果可在各種不同的標(biāo)準(zhǔn)上進(jìn)行測(cè)量，包括增加的骨生長(zhǎng)、增加的骨強(qiáng)度或本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員通常所理解的在治療骨相關(guān)的疾病中所需的其它特征。
術(shù)語(yǔ)“抗體”指能結(jié)合抗原的免疫球蛋白。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中包括能結(jié)合感興趣的抗原或抗原片段的抗體片段〔如F(ab′)2，F(xiàn)ab′和Fab〕。
術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指抗體對(duì)特異性肽——尤其是指本發(fā)明的肽的高親合力和/或高親和力結(jié)合?？贵w與其特異性靶表位結(jié)合要強(qiáng)于該抗體與該肽上其它表位或者其它肽上的其它表位的結(jié)合。特異性與感興趣的肽結(jié)合的抗體能與其它肽結(jié)合1周，而仍處于可檢測(cè)的水平(如感興趣的肽所顯示的結(jié)合的10％或以下)。這種微弱的結(jié)合或背景結(jié)合很容易與感興趣的肽結(jié)合的特異性抗體相區(qū)分，如使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照。
術(shù)語(yǔ)“骨骼損失”指骨骼量、骨骼的物質(zhì)或基質(zhì)或任何成分(如鈣和磷酸鹽)減少，或者骨變?nèi)?如在其抵抗折斷的能力方面)。
術(shù)語(yǔ)“骨骼”包括骨和牙齒。同樣的，術(shù)語(yǔ)“骨骼的”也包括骨和牙齒。
術(shù)語(yǔ)“骨質(zhì)疏松”指涉及骨損失的任何病癥，即涉及由任何原因引起的骨量或物質(zhì)的減少。該術(shù)語(yǔ)具體涉及由骨的去礦化、絕經(jīng)后的或者圍絕經(jīng)期的雌激素減少或神經(jīng)損傷而導(dǎo)致的骨損失。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”、“個(gè)體”、“患者”或“宿主”在文中交替使用，指任何脊椎動(dòng)物，尤其是任何哺乳動(dòng)物，更具體是包括人、家畜以及哺乳動(dòng)物類寵物。肽化合物本發(fā)明的肽化合物是含有10-50個(gè)氨基酸的肽。這些氨基酸優(yōu)選自20個(gè)天然L-氨基酸。但是，D-氨基酸也可作為氨基酸類似物存在。本發(fā)明的肽將含有一個(gè)或多個(gè)下述氨基酸序列基序整聯(lián)蛋白結(jié)合基序，如RGD序列；糖胺聚糖結(jié)合基序；和鈣結(jié)合基序。單獨(dú)的氨基酸在肽中可以L-或D-同種型存在，但較佳是L型。本發(fā)明的肽的C末端可以被酰胺化，或者未被酰胺化，或者在其N末端被羧化或者未被羧化。本發(fā)明的肽可含有或不含有呈L-或D-型的糖胺聚糖結(jié)合基序，如SGDG(SEQ ID NO41)序列。還可用生物學(xué)活性來(lái)進(jìn)一步表征本發(fā)明的化合物，即本發(fā)明化合物增加骨骼生長(zhǎng)，以及成骨細(xì)胞或成牙本質(zhì)細(xì)胞在新的骨骼生長(zhǎng)表面上的生長(zhǎng)或募集。
當(dāng)將有效量的本發(fā)明的肽化合物給予個(gè)體時(shí)，它們具有一個(gè)或多個(gè)以下特性(1)減少骨損失；(2)增加骨量；(3)增加骨強(qiáng)度；(4)減少腎的磷酸鹽排泄；和(5)減少個(gè)體的磷酸鹽損失。
本發(fā)明肽的特殊例子是，在胞外基質(zhì)磷糖蛋白的天然序列的RGD序列的任一側(cè)含有7-47個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明的肽的例子含有從下述序列獲得的序列，并包含以黑體字顯示的RGD序列DSQAQKSPVKSKSTHRIQHIDYLKHLSKVKKIPSDFEGSGYIDLQERGDNDISPFSGDGQPFKDIPGKGEATGPDLEGKDIQTGFAGPSEAESTHL (SEQ ID NO1)含有RGD序列為其末端序列的本發(fā)明肽的特殊例子如下AQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKVKKIPSDFEGSGYTDLQERGD (SEQ ID NO2)RGDAQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKVKKIPSDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO3)DSQAQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKVKKIPSDFEGSGYTDRGD (SEQ ID NO4)RGDSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKVKKIPSDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO5)DSQAQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKVKKIPSDFEGSGRGD (SEQ ID NO6)RGDTHRIQHNIDYLKHLSKVKIPSDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO7)DSQAQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKVKKIPSDFERGD (SEQ ID NO8)RGDLKHLSKVKKIPSDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO9)DSQAQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKVKKIPSRGD (SEQ ID NO10)RGDLSKVKKIPSDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO11)DSQAQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKHLSKRGD (SEQ ID NO12)RGDVKKIPSDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO13)DSQAQKSPVKSKSTHRIQHNIDYLKRGD (SEQ ID NO14)RGDIPSDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO15)DSQAQKSPVKSKSTHRIQHNIDRGD (SEQ ID NO16)RGDDFEGSGYTDLQE (SEQ ID NO17)DSQAQKSPVKSKSTHRRGD (SEQ ID NO18)RGDGSGYTDLQE (SEQ ID NO19)DSQAQKSPVKRGD (SEQ ID NO20)RGDGYTDLQE (SEQ ID NO21)DSQAQKSRGD (SEQ ID NO22)RGDNDISPFSGDGQPFKDTPGKGEATGPDLEGKDIQTGFA (SEQ ID NO23)其RGD在序列之中的本發(fā)明肽的特殊例子如下NDIRGDSPFSGDGQPFKDIPGKGEATGPDLEGKDIQTGFA (SEQ ID NO24)NDISPFRGDSGDGQPFKDIPGKGEATGPDLEGKDI (SEQ ID NO25)NDISPFSGDRGDGQPFKDIPGKGEATGPDL (SEQ ID NO26)FSGDGQPFKDIPGKGEATGPDLEGKDIQTGFAGPSEAESRGDTHL (SEQ ID NO27)IPGKGEATGPDLEGKDIQTGFAGPSERGDAESTHL (SEQ ID NO28)EATGPDLEGKDIQTGFAG RGDPSEAESTHL (SEQ ID NO29)NDISPFSGDGQPFKDRGDIPGKGEATGPDLEGK (SEQ ID NO30)GKGEATGPDLEGKDIRGDQTGFAGPSEAESTHL (SEQ ID NO31)FSGDGQPFKDIPGKGEATG RGDPDLEGKDIQTGFAGPSEA (SEQ ID NO32)DGQPFKDIPGKGEATG RGDPDLEGKDIQTGF (SEQ ID NO33)PFKDIPGKGEATGRGDPDLEGKDIQ (SEQ ID NO34)DIPGKGEATG RGDPDLEGKDIQTGFAGP (SEQ ID NO35)DGQPFKDIPGKGEATG RGDPDLEGKDIQTGF (SEQ ID NO36)GKGEATGRGDPDLEGKDIQTGFAGPSEA (SEQ ID NO37)EATGRGDPDLEGKDIQTGF (SEQ ID NO38)EATGRGDPDLEGK (SEQ ID NO39)EATGRGDPDL (SEQ ID NO40)在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的肽含有糖胺聚糖結(jié)合基序。糖胺聚糖結(jié)合基序具有共有序列SGXG(SEQ ID NO50)，其中X是任何氨基酸。在一些實(shí)施例中，糖胺聚糖結(jié)合基序具有序列SGDG(SEQ ID NO41)。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的肽合有鈣結(jié)合基序。在一些實(shí)施例中，鈣結(jié)合基序具有DNDISPFSGDGQ序列(SEQ ID NO42)?！扳}結(jié)合基序”這個(gè)術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO42有1、2、3、4、5、6、7或8個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。在許多實(shí)施例中特別感興趣的是SEQ ID NO42的保守氨基酸1、3、5、7、9和12。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的肽含有序列DXDXSXFXGXXQ(SEQID NO43)作為其鈣結(jié)合基序，其中X是任何氨基酸或氨基酸類似物。
在其它一些實(shí)施例中，鈣結(jié)合基序具有序列DX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12，其中，X1是任何氨基酸；X2是D、N或S；X3是I、L、V、F、Y或W；X4是D、E、N、S、T或G；X5是D、N、Q、G、H、R或K；X6是G或P；X7是L、I、V、M、C；X8是D、E、N、Q、S、T、A、G或C；X9和X10各自獨(dú)立為任何氨基酸；X11是D或E；和X12是L、I、V、M、F、Y或W。
在其它一些實(shí)施例中，鈣結(jié)合基序具有序列X1X2X3X4C(X5)nC(X6)mX7X8X9X10X11X12X13X14C，其中X1、X3和X4各自獨(dú)立為D、E、Q或N；
X2、X5、X6、X7、X9、X10、X11、X12和X14各自獨(dú)立為任何氨基酸；n為3-14；m為3-7；X8為D或N；和X13為F或Y。
在其它一些實(shí)施例中，鈣結(jié)合基序具有序列X1X2X3X4X5DX6X7X8X9X10X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21，其中，X1和X2各自獨(dú)立為L(zhǎng)、I、V、M、F、Y或W；X3、X4、X6、X7、X8、X10、X11、X12、X15、X18和X19各自獨(dú)立為任何氨基酸；X5為L(zhǎng)或K；X9為D或N；X13為D、N、S或G；X14為F或Y；X16為E或S；X17為F、Y、V或C；X20為L(zhǎng)、I、V、M、F或S；和X21為L(zhǎng)、I、V、M或F。
在其它一些實(shí)施例中，鈣結(jié)合基序具有序列DX1X2X3X4X5X6GX7DX8X9X10GGX11X12X13D，其中，X1、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X10、X11、X12和X13各自獨(dú)立地為任何氨基酸；X2和X9各自獨(dú)立地為L(zhǎng)或I。
鈣結(jié)合基序在本領(lǐng)域中是已知的，并已被詳細(xì)描述。例如可參見(jiàn)Springer等，(2000)Cell，102275-277；Kawasaki和Kretsinger(1995)，Protein Prof.，2305-490；Moncrief等，(1990)，J.Mol.Evol.，30522-562；Chauvaux等，(1990)，Biochem.J.，265261-265；Bairoch和Cox(1990)，F(xiàn)EBS Lett.，269454-456；Davis(1990)，New Biol.，2410-419；Schaefer等(1995)，Genomics，25638-643；和Economou等(1990)，EMBO J.，9349-354。任何已知的鈣結(jié)合基序都可包括在本發(fā)明的肽化合物中。
本發(fā)明的肽可含有一個(gè)或多個(gè)整聯(lián)蛋白結(jié)合基序、糖胺聚糖結(jié)合基序和鈣結(jié)合基序。這些基序相互之間可以任何相對(duì)順序存在于肽中。這些基序可以被1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)或更多個(gè)氨基酸相互分離。此外，一個(gè)基序可用一個(gè)或多個(gè)其它基序重疊。作為一個(gè)非限制性例子，具有序列TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD (SEQ ID NO49)的肽含有所有三種基序，這些基序相互重疊。
上述序列中的所有或者任一氨基酸都可以是D-或L-構(gòu)型，并且可以被等價(jià)的類似物取代。優(yōu)選的實(shí)施例包含天然的L-構(gòu)型氨基酸。
所有或任一上述序列在其C末端可以被酰胺化、未酰胺化或者有其它修飾，或者在其N末端可以被羧化、未羧化或者其它修飾。
此外還提供了任一上述肽的多聚體形式。多聚體包括二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體等等。因此，長(zhǎng)度約為10到50個(gè)氨基酸的本發(fā)明的肽可以被多聚體化，任選地具有一個(gè)插入接頭，這樣主體肽以2、3、4、5、6或更多的拷貝的隨機(jī)陣列存在。此外，本發(fā)明的兩條或多條不同的肽可以相互之間多聚體化，形成“雜多聚體”。因此，例如，一個(gè)多聚體可包含一個(gè)第一肽和一個(gè)第二肽，它們由肽鍵連接在一起，任選地具有一個(gè)接頭分子，如1-10個(gè)甘氨酸殘基。
可采用任何已知方法獲得本發(fā)明的肽化合物，包括例如固相肽合成技術(shù)，這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員已知的。合成肽的方法在本領(lǐng)域中是周知的，并已在許多出版物中有詳細(xì)的描述，例如《肽合成實(shí)踐》(The Practice ofPeptide Synthesis)，M.Bodanszky和A.Bodanszky編輯(1994)，Springer-Verlag；和Jones，《肽的化學(xué)合成》(The Chemical Synthesis of Peptides)(Clarendon出版社，牛津)(1994)。通常，在這些方法中，通過(guò)依次將激活的單體單元加到固相結(jié)合生長(zhǎng)肽鏈上可制得肽。還感興趣的是亞單體在固相合成中的使用，如WO 94/06451所述，本文將該文的公開(kāi)內(nèi)容納入作為參考。
本發(fā)明的肽化合物不采用固相合成制得，而是通過(guò)含有編碼該肽化合物的多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)而獲得?？刹捎萌魏畏奖愕姆椒ǎ@些可采用的方法通常包括含制備有編碼本發(fā)明肽的核苷酸序列的核酸分子、將該編碼區(qū)域?qū)氡磉_(dá)載體、用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以及表達(dá)和回收產(chǎn)物。實(shí)現(xiàn)上述各步驟的規(guī)程在本領(lǐng)域中是已知的。參見(jiàn)Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(Cold SpringHarbor出版社)(1989)。
從導(dǎo)致患者患骨軟化的人腫瘤中克隆出胞外基質(zhì)磷糖蛋白，并將其表征。這種一種極少見(jiàn)的腫瘤，稱為致瘤的低磷酸鹽血癥骨軟化(OncogenicHypophosphatemic Osteomalacia，OHO)腫瘤，已知這種腫瘤引起腎的磷酸鹽泄漏、低磷酸鹽血癥(低的血清磷酸鹽水平)、低的血清骨化三醇(1，25-維生素D3)，以及骨骼礦化中的異常(骨軟化)。在OHO腫瘤患者中，腫瘤的切除導(dǎo)致上述所有癥狀的減輕，已提出從OHO腫瘤中分泌出來(lái)的一種循環(huán)的磷酸鹽沉著因子在骨軟化中起作用。胞外基質(zhì)磷糖蛋白被認(rèn)為是這種磷酸鹽沉著因子的候選物〔Rowe等，Genomics(2000)，6756-68)。
磷酸鹽在許多基本過(guò)程中起主要的作用，這些基本過(guò)程對(duì)于細(xì)胞和骨骼的礦化是必需的。具體而言，骨骼礦化依賴于體內(nèi)磷酸鹽和鈣的的調(diào)節(jié)，磷酸鹽-鈣體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的任何破壞都會(huì)對(duì)骨骼的完整產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。在腎臟中，磷酸鹽被動(dòng)流失到腎小球?yàn)V液中，通過(guò)鈉(Na+)依賴性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)動(dòng)蛋白被主動(dòng)地再吸收。在腸中，磷酸鹽從食物中吸收。已發(fā)現(xiàn)鈉(Na+)依賴性磷酸鹽協(xié)同轉(zhuǎn)動(dòng)蛋白在腸中表達(dá)，并且最近將其克隆了〔Hilfiker，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(24)，(1998)，14564-14569〕。肝、皮膚和腎都涉及到維生素D3轉(zhuǎn)化成其活性代謝物——骨化三醇，這種代謝物在磷酸鹽平衡的維持和骨骼礦化中起積極的作用。
維生素D不足引起兒童的佝僂病和成年人的骨軟化。兩種病癥的特征都是類骨質(zhì)(為骨骼的基質(zhì))的鈣化失敗。
因此，由胞外基質(zhì)磷糖蛋白產(chǎn)生的所有的體液功能，即腎磷酸鹽泄漏、低磷酸鹽血癥(低的血清磷酸鹽水平)、低血清骨化三醇(1，25-維生素D3)，都對(duì)健康的骨骼形成有害。
胞外基質(zhì)磷糖蛋白是一個(gè)具有525個(gè)氨基酸的大多肽，它有短的N末端信號(hào)序列。因此，這種分子非常有可能從其生產(chǎn)細(xì)胞中分泌到體液中，并進(jìn)行循環(huán)。除了這525個(gè)氨基酸序列以外，在其C末端上的23個(gè)氨基酸基序表現(xiàn)出與骨-牙齒礦物基質(zhì)磷糖蛋白〔如骨橋蛋白(OPN)、牙質(zhì)唾液磷蛋白(DSPP)、牙質(zhì)基質(zhì)蛋白質(zhì)1(DMP1)和骨唾液蛋白II(IBSP)〕具有高的相似性。已提出，這些骨-牙齒礦物基質(zhì)磷糖蛋白可能在骨骼礦化中起重要的作用。
盡管有了上面關(guān)于胞外基質(zhì)磷糖蛋白的觀察，但是，含有位于其氨基酸序列內(nèi)但遠(yuǎn)離其C末端序列、與其它骨-牙齒礦物基質(zhì)磷糖蛋白具有高度相似性的整聯(lián)蛋白結(jié)合基序的較小的肽序列，也已證明具有非常潛在的骨骼形成活性，并且增加了這些骨骼形成表面上的成骨細(xì)胞的數(shù)量。這些活性的效力相對(duì)于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。令人驚訝的是，已證明存在于在骨骼上具有破壞功能的較大的蛋白質(zhì)中的小基序具有有效的骨骼形成活性，并且這些基序位于遠(yuǎn)離顯示出與其它已知骨-牙齒基質(zhì)蛋白同源的序列的位置上。
另一令人驚訝的事實(shí)是，本發(fā)明有效的骨骼形成基序含有整聯(lián)蛋白結(jié)合基序，具體而言，RGD序列。已報(bào)道含有該RDG序列的合成肽在胎兒大鼠骨骼的礦化器官培養(yǎng)系統(tǒng)中抑制骨骼形成和再吸收〔Gronowicz等，《骨和礦物研究雜志》(Journal of Bone and Mineral Research)，(2)193-201(1994)〕，這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法與本發(fā)明采用的試驗(yàn)方法非常相似。
此外，由本發(fā)明的小肽提供的骨骼形成活性與完整的生長(zhǎng)因子(如FGF)一樣有效力。治療方法本發(fā)明提供減少骨骼損失的方法、減少腎磷酸鹽泄漏的方法、增加骨量的方法、增加骨強(qiáng)度的方法以及減少Pi排泄的方法，這些方法包括給予本發(fā)明的肽化合物。通常，本發(fā)明的肽化合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制，用于給需要的個(gè)體傳送。
本發(fā)明肽化合物的“有效量”在本文中指與合適的對(duì)照相比，減少骨損失、和/或增加骨強(qiáng)度、和/或增加骨量、和/或減少磷酸鹽損失、和/或減少腎磷酸鹽排泄至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％或者至少約60％或更多的量。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情況中，合適的對(duì)照是指未經(jīng)所述肽處理的動(dòng)物，如用載體處理，或者用不相關(guān)的肽處理；在人的情況中，用安慰劑處理人，或者經(jīng)本發(fā)明的肽處理之前的人。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明肽化合物的有效量是與合適的對(duì)照相比，減少腎磷酸鹽排泄，因此減少個(gè)體的磷酸鹽損失至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％或者至少約60％或更多的量。
可采用任何已知的試驗(yàn)測(cè)量與骨損失減少、骨強(qiáng)度增加、骨量增加、磷酸鹽損失減少和腎磷酸鹽排泄減少相關(guān)的任何已知參數(shù)，從而可以確定一種給定的肽是否減少個(gè)體的骨損失、和/或增加骨強(qiáng)度、和/或增加骨量、和/或減少磷酸鹽損失、和/或減少腎磷酸鹽排泄，這些試驗(yàn)包括但不限于血清和尿中磷的水平(如采用比色測(cè)定)；血清和尿中的鈣水平(如采用比色測(cè)定)；血清和尿中的肌酸酐水平；骨更新標(biāo)記物水平〔如脫氧吡啶諾啉(deoxypyrodinoline)和骨鈣蛋白〕；骨密度(如采用體內(nèi)骨密度測(cè)定法)；骨機(jī)械測(cè)試(如腰椎壓迫測(cè)試；股骨骨體三點(diǎn)彎曲測(cè)試；等等)；等等。這些方法都是本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法。
適合采用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療的個(gè)體是被認(rèn)為存在骨損失、或由骨損失引起的疾病、或者其后遺癥包括骨損失的疾病(包括但不限于齲齒、骨質(zhì)疏松、佩吉特病、腎磷酸鹽泄漏、腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨軟化、有其它原因引起的骨營(yíng)養(yǎng)不良、由癌癥介導(dǎo)的骨質(zhì)溶解、骨折和甲狀旁腺功能亢進(jìn))的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。這類個(gè)體包括老年個(gè)體、絕經(jīng)期后婦女、腎移植受體和具有或存在任一種前述疾病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。給藥途徑采用適合用于藥物傳送的任何可采用的方法和途徑給予本發(fā)明的肽，包括體內(nèi)和離體的方法，以及全身性和局部給藥。
常規(guī)的和藥學(xué)上可接受的給藥途徑包括鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、局部應(yīng)用、靜脈內(nèi)、直腸、鼻、口腔和其它腸胃外的給藥途徑。如果需要，可將給藥的途徑組合，或者根據(jù)免疫調(diào)節(jié)核酸分子和/或?qū)γ庖叻磻?yīng)所需達(dá)到的效果而作出調(diào)整。本發(fā)明的肽可以單劑量或多劑量的方式給予。
可采用適合用于常規(guī)藥物的傳送的任何可采用的常規(guī)方法和途徑給予本發(fā)明的肽，包括全身性的和局部的途徑。通常，本發(fā)明考慮到的給藥途徑包括但不一定限于腸內(nèi)、腸胃外或吸入給藥。
除了吸入給藥以外，腸胃外給藥途徑還包括但不一定限于局部、經(jīng)皮、皮下、肌肉內(nèi)、眼眶內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)和靜脈內(nèi)途徑，即除了通過(guò)消化道給藥以外的其它任何給藥途徑?？蓪?shí)施腸胃外給藥，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明肽的全身性或局部性傳送。當(dāng)需要全身性傳送時(shí)，給藥一般涉及藥物制劑的侵入性或全身性吸收的局部或粘膜給藥。
還可通過(guò)腸給藥傳送本發(fā)明的肽。腸給藥途徑包括但不一定限于口服和直腸(如使用栓劑)傳送。
通過(guò)皮膚或粘膜給予本發(fā)明肽的方法包括但不一定限于局部使用合適的藥物制劑、經(jīng)皮傳送、注射和表皮給藥。還考慮到的傳送本發(fā)明肽的方法是使用在其上含有本發(fā)明肽的貼片。貼片可應(yīng)用于皮膚或其它組織上，如牙齦組織。任何適用于口腔傳送系統(tǒng)的已知的貼片系統(tǒng)都可以使用。例如可參見(jiàn)美國(guó)專利第6146655號(hào)。
還通過(guò)向個(gè)體給予含有編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列的核酸分子，從而將本發(fā)明的肽傳送給個(gè)體。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸分子”在文中交替使用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸的多聚體形式。多核苷酸可含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類似物。為了表達(dá)，可使用表達(dá)盒。表達(dá)載體將提供轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和翻譯起始區(qū)域，這些區(qū)域可以是可誘導(dǎo)的或組成型的，在這種情況下，編碼區(qū)域被可操作性地連接，并處于該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的轉(zhuǎn)錄控制以及轉(zhuǎn)錄和翻譯中止區(qū)域的控制之下。這些控制區(qū)域?qū)τ诰幋a本發(fā)明肽的基因來(lái)說(shuō)是天然的，或者可從外源衍生得到。
表達(dá)載體通常具有方便的限制性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列附近，用于向編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列提供插入位點(diǎn)。可存在于表達(dá)宿主中起作用的可選擇的標(biāo)記物。表達(dá)載體可用于融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，這種情況下，外源的融合肽提供了額外的功能，即蛋白質(zhì)合成、穩(wěn)定性、與指定抗血清、酶標(biāo)記物(如β-半乳糖苷酶，等)的反應(yīng)性增加。
可將表達(dá)盒制成含有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、基因或其片段以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)域。載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、病毒載體、人工染色體(YAC、BAC等)、微型染色體等等。載體已在許多出版物中有詳細(xì)的描述，并已被本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所周知，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Short Protocols in MolecularBiology)，(1999)，F(xiàn).Ausubel等編輯，Wiley & Sons。
可使用表達(dá)載體將編碼本發(fā)明肽的核酸分子導(dǎo)入個(gè)體的細(xì)胞中。這些載體通常具有方便的限制性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列的附近，用于為核苷酸序列提供插入位點(diǎn)?？芍苽滢D(zhuǎn)錄盒，使其含有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、靶基因或其片段以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)域?？蓪⑥D(zhuǎn)錄盒導(dǎo)入各種載體中，如質(zhì)粒；逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒、腺病毒等等；在這種情況下，這些載體能短暫地或穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中，通常至少約1天，更通常至少約幾天到幾周。
可采用各種途徑將含有編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列的表達(dá)載體導(dǎo)入組織或宿主細(xì)胞中，包括病毒感染、微注射或小泡的融合。也可在肌肉內(nèi)給藥中使用噴射注射(jet iniection)，如Furth等(1992)，Anal Biochem，205365-368所述?？蓪⒈磉_(dá)載體包涂在金微粒上，然后采用粒子轟擊裝置或者文獻(xiàn)中所述的“基因槍”〔例如可參見(jiàn)Tang等，(1992)，Nature，356152-154〕經(jīng)皮內(nèi)傳送，在這種情況下，金微粒被表達(dá)載體包涂，并被轟擊到皮膚細(xì)胞中，劑量雖然所使用的劑量根據(jù)所要實(shí)現(xiàn)的臨床目標(biāo)而改變，但是合適的劑量范圍是提供達(dá)到約1μg、約1000μg、約10000μg、約25000μg或者約50000μg的本發(fā)明肽的范圍。本發(fā)明的肽可以單劑量給予，或者整個(gè)期間以若干較小劑量給予?；蛘?，可將肽的目標(biāo)劑量認(rèn)定為在給予宿主該肽后的第1個(gè)24-48小時(shí)之內(nèi)抽取的血液樣品中含有約0.1-1000μM，約1-500μM，或者約5-250μM的肽。
對(duì)骨損失、骨強(qiáng)度、磷酸鹽排泄或者其它參數(shù)的影響可能是劑量依賴性的。因此，為了增加2個(gè)數(shù)量級(jí)的藥效，各單劑量的濃度是雙倍的。為了獲得所需的治療目標(biāo)，可能需要增加劑量。因此，本發(fā)明考慮給予多劑量，以提供并維持對(duì)骨損失、骨強(qiáng)度、磷酸鹽排泄或者其它參數(shù)的影響。當(dāng)給予多劑量時(shí)，在約16周、約12周、約8周、約6周、約4周、約2周、約1周、約5天、約72小時(shí)、約48小時(shí)、約24小時(shí)、約12小時(shí)、約8小時(shí)、約4小時(shí)或者約2小時(shí)之內(nèi)給予后來(lái)的劑量，或以前的劑量中的較小劑量。
根據(jù)本公開(kāi)所提供的講義，臨床領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員將熟悉或者能容易地判斷給藥本發(fā)明肽的合適參數(shù)。制劑通常，在藥學(xué)上可接受的組合物中配制肽，用于傳送給宿主。優(yōu)選用于本發(fā)明的肽的藥學(xué)上可接受的載體可包括非水性溶液、懸浮液以及乳化液的無(wú)菌水溶液。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水溶液、乳化液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽的林格氏或不揮發(fā)的油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如以林格氏葡萄糖為基礎(chǔ)的補(bǔ)充劑)等等。還可采用本領(lǐng)域已知的方法凍干含有本發(fā)明的肽的組合物，以用于本發(fā)明接下來(lái)的重新配制和使用。還感興趣的是用于脂質(zhì)體傳送的制劑，以及含有微膠囊化的肽的制劑。
通常，可將藥物組合物制備成各種形式，如粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、藥膏、洗劑等等。在一些實(shí)施例中，當(dāng)將本發(fā)明的肽傳送給口腔組織時(shí)，可將本發(fā)明的肽配制成牙膏、漱劑的形式，或者可使其包涂在或埋植于牙線中?？墒褂眠m用于口腔或局部使用的藥用級(jí)有機(jī)或無(wú)機(jī)載體和/或稀釋劑來(lái)配制含有治療活性化合物的組合物。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植物油和動(dòng)物油和脂肪?？墒褂梅€(wěn)定劑、增濕劑和乳化劑、用于改變滲透壓的鹽、或者用于保證足夠的pH值的緩沖液、以及皮膚滲透增強(qiáng)劑作為佐劑。也可存在防腐劑和其它添加劑，如抗病原體劑(如抗微生物劑、抗細(xì)菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑等)、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體等等。
本發(fā)明的肽化合物可與用于減少骨損失的其它任何已知制劑一起給予。因此，可以考慮進(jìn)行組合治療?？膳c本發(fā)明的肽一起給予的其它制劑包括但不限于雌激素、降鈣素、維生素D、氟化物、異丙氧黃酮和二膦酸酯。本發(fā)明的肽可以與減少骨損失的其它制劑同時(shí)給予(如與它們混合，或者分開(kāi))，或者可在給予減少骨損失的另一種制劑后約15分鐘、約30分鐘、約60分鐘、約2小時(shí)、約5小時(shí)、約10小時(shí)、約12小時(shí)、約24小時(shí)、約36小時(shí)、約4天、約7天或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)給予。此外，本發(fā)明的兩條或多條肽可同時(shí)給予，或者在給予其中1條肽后的約15分鐘、約30分鐘、約60分鐘、約2小時(shí)、約5小時(shí)、約10小時(shí)、約12小時(shí)、約24小時(shí)、約36小時(shí)、約4天、約7天或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)給予。
實(shí)施例給出下述實(shí)施例，以給本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員提供關(guān)于怎樣制備和使用本發(fā)明的完整的公開(kāi)和描述，但是，這些實(shí)施例并不限定本發(fā)明者所認(rèn)為的范圍，也不表示以下實(shí)施例是本發(fā)明者所進(jìn)行的所有實(shí)施例，或者本發(fā)明者僅僅進(jìn)行這些實(shí)施例。已作出努力以確保所使用的數(shù)據(jù)(如數(shù)量、溫度等)準(zhǔn)確，但是，應(yīng)考慮到一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，否則份為按重量份，分子量為重均分子量，溫度為℃，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
小鼠從SLC日本公司(靜岡，日本)購(gòu)得懷孕的ICR小鼠。
小鼠顱蓋器官培養(yǎng)如Mundy G等，Science，2861946-1949，1999和Traianedes K等，Endocrinology，1393178-3184，1998所述進(jìn)行小鼠顱蓋器官培養(yǎng)。切除4天齡小鼠的顱蓋，沿著矢狀縫將其切成兩半。將每一半顱蓋放在不銹鋼格柵上，然后放到12-孔培養(yǎng)皿(Asahi Glass Techno Corp.，船橋，日本)中。各孔含有1.5毫升的BGj培養(yǎng)基(Sigma，St.Louis，MO)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了0.1％牛血清白蛋白(Sigma)和各化合物。如Mundy等所述將FGF-1用作陽(yáng)性對(duì)照。在第1天和第4天更換該培養(yǎng)基，該試驗(yàn)在第7天停止。
組織形態(tài)學(xué)分析用10％中性緩沖的福爾馬林固定顱蓋，用4.13％EDTA將顱蓋脫鈣，然后埋植在石蠟中。制備4毫米厚的切片，用蘇木精和曙紅染色。使用Image-ProPlus(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)測(cè)量新骨的面積。
測(cè)試實(shí)施例1的6條肽在實(shí)施例2所進(jìn)行的試驗(yàn)中增加骨生長(zhǎng)的能力。不含有RGD序列的肽沒(méi)有顯示出陽(yáng)性結(jié)果。其它四條肽顯示出陽(yáng)性結(jié)果，其中獲得最好結(jié)果的是以下序列D-00004ERGDNDISPFSGDGQ (SEQ ID NO47)和D-00006TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD (SEQ ID NO49)。
最好的結(jié)果顯示在圖3中(分別為圖3C和3D)。將從這些結(jié)果得到的數(shù)據(jù)繪制成圖4。實(shí)施例3體內(nèi)骨形成研究試劑從Peprotech Inc.(Rocky Hill，NJ)購(gòu)得FGF-1。在本發(fā)明者的指導(dǎo)下，使用CS Bio(San Carlos，加利福尼亞)合成RGD-6(在文中稱為D-00006)。
D-00006TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD(SEQ ID NO49)小鼠從SLC日本公司(靜岡，日本)購(gòu)得四周齡小鼠，將其隨機(jī)分成3組(n＝5)。
小鼠顱蓋生長(zhǎng)試驗(yàn)將D-00006(20μg/kg/天)、FGF-1(12.5μg/kg/天)或載體(鹽水)皮下注射到試驗(yàn)動(dòng)物的接近顱蓋的軟組織中。將樣品每天的量分成兩份，每天注射2次，共5天。在最后一次給藥15天后，切除顱蓋并沿著矢狀縫將其切成兩半，提供組織形態(tài)學(xué)分析。
組織形態(tài)學(xué)分析用10％中性緩沖的福爾馬林固定顱蓋，用4.13％EDTA將顱蓋脫鈣，然后埋植在石蠟中。制備4毫米厚的切片，用蘇木精和曙紅染色。使用Image-ProPlus(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)測(cè)量新骨的面積。
結(jié)果與載體處理組相比，經(jīng)FGF-1處理的動(dòng)物的顱蓋切片顯示出明顯的骨區(qū)域擴(kuò)大。經(jīng)D-00006處理的動(dòng)物的切片與載體處理組的切片相比，也顯示出明顯的骨面積擴(kuò)大，并且效果與FGF-1的相等。將從這些結(jié)果獲得的數(shù)據(jù)繪制成圖5。
表1
在開(kāi)始處理的前一天，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉用混合物將這些動(dòng)物麻醉，然后切除第2-5組動(dòng)物的卵巢。在第41天收集代謝籠中的尿。在41天的處理期結(jié)束時(shí)，收集血液和尿液樣品，用于化學(xué)性質(zhì)和骨更新標(biāo)記物檢測(cè)。在收集尿和血液之前，先將動(dòng)物放到代謝籠中，不給它們食物1個(gè)晚上，禁食18小時(shí)。收集尿液樣品，并記錄其體積。然后在離心機(jī)中以大約3000g離心尿樣品10分鐘。過(guò)濾該樣品，除去污染的沉積物。
血清和尿化學(xué)性質(zhì)所有處理組的總血清鈣水平和肌酸酐水平都相同，除了用雌二醇處理的Ovx動(dòng)物其血清鈣有輕微的增加。在D-00006處理組中，血清磷中存在劑量依賴性的增加。所有組在18小時(shí)內(nèi)收集的總的尿體積都相同。圖6顯示所得的尿參數(shù)。
在18小時(shí)尿收集中獲得的磷的總量在D-00006處理組中顯示出明顯的下降。結(jié)果證明，D-00006處理組具有較低的磷酸鹽清除和較高百分?jǐn)?shù)的磷的小管再吸收。D-00006清楚地顯示可以作為將磷保持在循環(huán)中的制劑。
雖然本發(fā)明已結(jié)合其具體的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員應(yīng)理解，在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明作出各種改變，可用各種等效形式取代。此外，可實(shí)施許多修改，以使具體的環(huán)境、材料、物質(zhì)的組成、方法，或步驟適應(yīng)本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有這些修改都包括在附帶的權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
序列表<110>熊谷是成(Kumagai，Yoshinari)R.W.布拉謝(Blacher，Russell Wayne)米田俊之(Yoneda，Toshiyuki)<120>含有整聯(lián)蛋白結(jié)合基序的肽和治療骨骼疾病的方法<130>BEAR-006WO2<140>09/812,485<141>2001-03-19<150>09/641,034<151>2000-08-16<160>50<170>用于Windows 4.0版的FastSEQ<210>1<211>97<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>1Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys20 25 30Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg35 40 45Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys50 5560Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys65 7075 80Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly Pro Ser Glu Ala Glu Ser Thr His85 90 95Leu<210>2<211>47<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>2Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg Ile Gln His15 10 15Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser20 25 30Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp3540 45<210>3<211>47<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>3Arg Gly Asp Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys20 25 30Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu35 40 45<210>4<211>47<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>4Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys20 25 30Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Arg Gly Asp35 40 45<210>5<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>5Arg Gly Asp Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg Ile Gln His1 5 10 15Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser20 25 30Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu35 40<210>6<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>6Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys20 25 30Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Arg Gly Asp3540<210>7<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>7Arg Gly Asp Thr His Arg Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His15 10 15Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr20 25 30Thr Asp Leu Gln Glu35<210>8<211>41<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>8Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys20 25 30Ile Pro Ser Asp Phe Glu Arg Gly Asp3540<210>9<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>9Arg Gly Asp Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp15 10 15Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu20 25<210>10<211>38<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>10Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Val Lys Lys20 25 30Ile Pro Ser Arg Gly Asp35<210>11<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>11Arg Gly Asp Leu Ser Lys Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly15 10 15Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu20<210>12<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>2Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys His Leu Ser Lys Arg Gly Asp20 25 30<210>13<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>13Arg Gly Asp Val Lys Lys Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr15 10 15Thr Asp Leu Gln Glu20<210>14<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>14Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Tyr Leu Lys Arg Gly Asp2025<210>15<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>15Arg Gly Asp Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu15 10 15Gln Glu<210>16<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>16Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Ile Gln His Asn Ile Asp Arg Gly Asp20 25<210>17<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>17Arg Gly Asp Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu15 10 15<210>18<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>18Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Ser Lys Ser Thr His Arg15 10 15Arg Gly Asp<210>19<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>19Arg Gly Asp Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu15 10<210>20<211>3<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>20Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Pro Val Lys Arg Gly Asp15 10<210>21<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>21Arg Gly Asp Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu15 10<210>22<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>22Asp Ser Gln Ala Gln Lys Ser Arg Gly Asp15 10<210>23<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>23Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe15 10 15Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly20 25 30Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala3540<210>24<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>24Asn Asp Ile Arg Gly Asp Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe15 10 15Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly20 25 30Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala3540<210>25<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>25Asn Asp Ile Ser Pro Phe Arg Gly Asp Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe15 10 15Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly20 25 30Lys Asp Ile35<210>26<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>26Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Arg Gly Asp Gly Gln Pro Phe15 10 15Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu2025 30<210>27<211>45<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>27Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu15 10 15Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala20 25 30Gly Pro Ser Glu Ala Glu Ser Arg Gly Asp Thr His Leu35 40 45<210>28<211>35<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>28Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp15 10 15Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly Pro Ser Glu Arg Gly Asp Ala Glu Ser2025 30Thr His Leu35<210>29<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>29Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe15 10 15Ala Gly Arg Gly Asp Pro Ser Glu Ala Glu Ser Thr His Leu20 25 30<210>30<211>33<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>30Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Arg15 10 15Gly Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly20 25 30Lys<210>31<211>33<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>31Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Arg15 10 15Gly Asp Gln Thr Gly Phe Ala Gly Pro Ser Glu Ala Glu Ser Thr His20 25 30Leu<210>32<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>32Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu15 10 15Ala Thr Gly Arg Gly Asp Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr2025 30Gly Phe Ala Gly Pro Ser Glu Ala3540<210>33<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>33Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly15 10 15Arg Gly Asp Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe20 25 30<210>34<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>34Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Arg Gly Asp15 10 15Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln20 25<210>35<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>35Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Arg Gly Asp Pro Asp Leu15 10 15Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly Pro2025<210>36<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>36Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp Ile Pro Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly15 10 15Arg Gly Asp Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln Thr Gly Phe20 25 30<210>37<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>37Gly Lys Gly Glu Ala Thr Gly Arg Gly Asp Pro Asp Leu Glu Gly Lys15 10 15Asp Ile Gln Thr Gly Phe Ala Gly Pro Ser Glu Ala20 25<210>38<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>38Glu Ala Thr Gly Arg Gly Asp Pro Asp Leu Glu Gly Lys Asp Ile Gln15 10 15Thr Gly Phe<210>39<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>39Glu Ala Thr Gly Arg Gly Asp Pro Asp Leu Glu Gly Lys15 10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>肽化合物<400>40Glu Ala Thr Gly Arg Gly Asp Pro Asp Leu15 10<210>41<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>糖胺聚糖結(jié)合基序<400>41Ser Gly Asp Gly1<210>42<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>鈣結(jié)合基序<400>42Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln15 10<210>43<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>鈣結(jié)合基序<221>變體<222>2，4，6，8，10，11<223>Xaa＝任何氨基酸<400>43Asp Xaa Asp Xaa Ser Xaa Phe Xaa Gly Xaa Xaa Gln15 10<210>44<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>D-00001肽<221>酰胺化<222>15<400>44Ile Pro Ser Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu15 10 15<210>45<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>D-00002肽<221>酰胺化<222>15<400>45Asp Phe Glu Gly Ser Gly Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp15 10 15<210>46<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>D-00003肽<221>酰胺化<222>15<400>46Tyr Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe15 10 15<210>47<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>D-00004肽<221>酰胺化<222>15<400>47Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln15 10 15<210>48<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>D-00005肽<221>酰胺化<222>15<400>48Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp15 10 15<210>49<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>D-00006肽<221>酰胺化<222>15<400>49Thr Asp Leu Gln Glu Arg Gly Asp Asn Asp Ile Ser Pro Phe Ser Gly15 10 15Asp Gly Gln Pro Phe Lys Asp20<210>50<211>4<212>PRT<213>肽<220><223>糖胺聚糖結(jié)合基序<221>變體<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>50Ser Gly Xaa Gly權(quán)利要求
1.一種肽化合物，它含有約10-50個(gè)氨基酸的序列，其特征在于，該肽化合物增加骨生長(zhǎng)，其中各氨基酸可以是D-或L-構(gòu)型，且所述序列含有選自整聯(lián)蛋白結(jié)合基序、糖胺聚糖結(jié)合基序和鈣結(jié)合基序的基序。
2.如權(quán)利要求1所述的肽化合物，其特征在于，所述整聯(lián)蛋白結(jié)合基序是RGD序列。
3.如權(quán)利要求1所述的肽化合物，其特征在于，所述糖胺聚糖結(jié)合基序具有序列SGDG。
4.如權(quán)利要求1所述的肽化合物，其特征在于，所述鈣結(jié)合具有具有序列DXDXSXFXGXXQ，其中X是任何氨基酸。
5.如權(quán)利要求4所述的肽化合物，其特征在于，所述鈣結(jié)合基序具有序列DNDISPFSGDGQ。
6.一種多聚體，其特征在于，該多聚體是權(quán)利要求1的肽的多聚體。
7.一種制劑，其特征在于，該制劑含有載體；和治療有效量的權(quán)利要求1的肽。
8.如權(quán)利要求7所述的制劑，其特征在于，所述載體是鹽水溶液，所述制劑是可注射的。
9.如權(quán)利要求7所述的制劑，其特征在于，所述載體是糊狀物，所述制劑是牙膏。
10.如權(quán)利要求7所述的制劑，其特征在于，所述載體是含水增香溶液，所述制劑是漱劑。
11.一種用于口腔傳送化合物的貼片，其特征在于，所述貼片含有權(quán)利要求7所述的制劑。
12.一種減少骨損失的方法，其特征在于，所述方法包括向個(gè)體給予有效量的權(quán)利要求1的肽化合物。
13.一種減少個(gè)體的腎磷酸鹽排泄的方法，其特征在于，該方法包括向個(gè)體給予有效量的權(quán)利要求1所述的肽化合物。
全文摘要
公開(kāi)了含有10－50個(gè)氨基酸的肽序列。這些序列的特征是含有整聯(lián)蛋白結(jié)合基序如RGD序列、糖胺聚糖結(jié)合基序和鈣結(jié)合基序中的至少一種，余下的氨基酸是鄰近胞外基質(zhì)磷糖蛋白的RGD序列的氨基酸?？梢耘渲七@些序列，以用于注射，或者將其分散在牙膏或漱劑或牙齦貼片中，并由此給予這些序列，以提高骨/牙齒生長(zhǎng)和/或減少過(guò)量尿磷酸鹽從體內(nèi)喪失。
文檔編號(hào)C07K14/00GK1458935SQ01815793
公開(kāi)日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2001年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月16日
發(fā)明者熊谷是成, R·W·布拉謝, 米田俊之 申請(qǐng)人:阿克勒斯股份有限公司