專利名稱：治療和診斷Her-2/neu相關(guān)惡性腫瘤的組合物和方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及癌癥(尤其是乳腺癌)的治療和診斷。更具體地，本發(fā)明涉及至少含有Her-2/Neu蛋白的免疫原性片斷的多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸。這些多肽和多核苷酸可用于藥物組合物(如疫苗)以及其它用于診斷和治療人類惡性腫瘤的組合物。
背景技術(shù)：
盡管財力和人力資源投資巨大，但癌癥仍然是死亡的主要原因之一。例如，癌癥是年齡在35到74歲之間的婦女死亡的主要原因。乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤，而且乳腺癌的發(fā)病率仍在增長。九分之一的婦女診斷有此疾病。治療乳腺癌的標準方法集中在組合采用手術(shù)、放射療法和化學療法。這些方法對某些惡性腫瘤獲得了一些驚人的成功。但是，這些方法并沒有對所有惡性腫瘤都成功，而且當在某一階段以后試圖治療時乳腺癌常常不可治愈。需要預防和治療的替代方法。
惡性腫瘤的共同特征是細胞生長不受控制。癌細胞似乎經(jīng)歷了從正常表型到能自主生長的惡性表型的轉(zhuǎn)化過程。體細胞基因的擴增和過表達被認為是導致正常細胞向癌性細胞轉(zhuǎn)化的共同基本事件。致癌基因編碼的惡性表型特征在細胞分裂過程中傳遞給轉(zhuǎn)化細胞的子代細胞。
與癌基因有關(guān)的研究已經(jīng)鑒定了至少40個在惡性細胞中起作用、并負責轉(zhuǎn)化或與轉(zhuǎn)化有關(guān)的癌基因。根據(jù)基因產(chǎn)物(如癌基因表達的蛋白質(zhì))的推測功能或定位，癌基因被分為不同類群。
據(jù)信癌基因是正常細胞生理某些方面所必需的。在這點上，HER-2/neu癌基因是癌基因的酪氨酸蛋白激酶家族的成員，并與表皮生長因子受體有高度的同源性。推測HER-2/neu在細胞生長和/或分化中起作用。HER-2/neu似乎通過由本質(zhì)上正常的基因產(chǎn)物的增加表達或失控表達引起的定量機制誘導惡性腫瘤。
HER-2/neu(p185)是HER-2/neu癌基因的蛋白產(chǎn)物。在許多癌癥(包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和血癌)中HER-2/neu基因被擴增，HER-2/neu蛋白被過表達。HER-2/neu與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。發(fā)現(xiàn)它在50％-60％導管原位癌(ductal in situ carcinoma)和20％-40％的全部乳腺癌以及相當大比例的卵巢、前列腺、結(jié)腸和肺中發(fā)生的腺癌中存在。HER-2/neu不僅與惡性表型有密切聯(lián)系，而且與惡性腫瘤的進攻性(aggressiveness)有密切聯(lián)系，這在四分之一的全部侵襲性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)。HER-2/neu過表達與乳腺癌和卵巢癌的預后差有關(guān)。HER-2/neu是相對分子量為185kD的跨膜蛋白，大約長1255個氨基酸(aa)。它具有與表皮生長因子受體(EGFR)有40％同源性的約645個氨基酸的細胞外結(jié)合域(ECD)、高度疏水的跨膜錨定域(TMD)和與EGFR有80％同源性的大約580個氨基酸的羧基端細胞質(zhì)域(CD)。
由于與HER-2/neu有關(guān)的癌癥的治療中存在的困難，本領(lǐng)域需要改進的化合物和組合物。本發(fā)明滿足了該需要，并進一步提供其它相關(guān)優(yōu)點。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供具有免疫原性的Her-2/neu多肽和多核苷酸組合物，也就是說，它們能引起免疫應(yīng)答，特別是體液和/或細胞免疫應(yīng)答，如本文進一步所述。在一個優(yōu)選實施方案中，該組合物是包含SEQ ID NO3所示的HLA-B44限制的、天然加工的Her-2/neu表位的多肽序列，或編碼該多肽的多核苷酸組合物。
本發(fā)明進一步提供這里公開的多肽和/或多核苷酸序列的片斷、變體和/或衍生物，其中，所述片斷、變體和/或衍生物優(yōu)選具有這里所示多肽序列免疫原活性(immunogenic activity)水平的至少約50％，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約90％的免疫原性水平。
本發(fā)明還提供包含所述多核苷酸的表達載體和轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了這種表達載體的宿主細胞。
在其它方面，本發(fā)明提供包含上述多肽或多核苷酸和生理可接受載體的藥物組合物。
在本發(fā)明的有關(guān)方面，提供用于預防或治療的藥物組合物，例如疫苗組合物。這些組合物一般含有本發(fā)明的免疫原性多肽或多核苷酸和免疫刺激劑，如佐劑。
本發(fā)明還提供含有下列成分的藥物組合物(a)可與本發(fā)明的多肽或其片段特異結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段；和(b)生理學可接受的載體。
在其它方面，本發(fā)明提供含有下列成分的藥物組合物(a)表達如上所述的多肽的抗原呈遞細胞，和(b)藥學可接受的載體或賦形劑。示例性抗原呈遞細胞包括樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞和B細胞。
在相關(guān)方面，提供含有下列成分的藥物組合物(a)表達如上所述的多肽的抗原呈遞細胞，和(b)免疫刺激劑。
在其它方面，本發(fā)明還提供含有至少一個如上所述多肽的融合蛋白，以及編碼這種融合蛋白的多核苷酸，它們一般是采用藥物組合物的形式，例如疫苗組合物，含有生理學可接受的載體和/或免疫刺激劑。融合蛋白可含有如此處所述的多個免疫原性多肽或其部分/變體，還可含有一個或多個有助于多肽表達、純化和/或免疫原性的多肽片段。
在其它方面，本發(fā)明提供刺激患者免疫應(yīng)答，優(yōu)選地刺激病人的T細胞應(yīng)答的方法，包括施用Her-2/neu多核苷酸組合物，優(yōu)選編碼ICD區(qū)域中一些或全部的Her-2/neu多核苷酸，更優(yōu)選至少編碼HLA-B44限制的、天然加工的SEQ ID NO3所示Her-2/neu表位的多核苷酸。患者可能患有癌癥，在這種情況中，該方法提供對疾病的治療，或者可以預防性地處置認為有患該病危險的患者。
在其它方面，本發(fā)明還提供從生物樣品中除去腫瘤細胞的方法，包括使生物樣品接觸可與本發(fā)明的多肽特異反應(yīng)的T細胞，其中在足以從樣品中去除表達該多肽的細胞的條件下和時間內(nèi)進行此接觸步驟。
在有關(guān)方面，提供抑制患者癌癥發(fā)展的方法，包括對患者施用如上所述處理的生物樣品。
在其它方面，還提供刺激和/或擴增對于本發(fā)明的多肽特異的T細胞的方法，包括在足以刺激和/或擴增T細胞的條件下和時間內(nèi)，使T細胞接觸下列成分中的一種或多種(i)如上所述的多肽；(ii)編碼這種多肽的多核苷酸；和/或(iii)表達這種多肽的抗原呈遞細胞。也提供含有如上所述制備的T細胞的分離的T細胞群體。
在其它方面，本發(fā)明提供抑制患者癌癥發(fā)展的方法，包括對患者施用有效量的如上所述的T細胞群體。
本發(fā)明還提供抑制患者癌癥發(fā)展的方法，包括下列步驟(a)將自患者分離的CD4+和/或CD8+T細胞與下列成分之一或多種一起孵育(i)含有此處公開的多肽的至少免疫原性部分的多肽；(ii)編碼這種多肽的多核苷酸；和(iii)表達這種多肽的抗原呈遞細胞；和(b)對患者施用有效量的增殖T細胞，從而抑制患者癌癥的發(fā)展。在對患者施用前，增殖的細胞可以但不必須克隆化。
在其它方面，本發(fā)明提供確定患者是否患有癌癥(優(yōu)選癌)的方法，包括(a)使從患者獲得的生物樣品接觸能與上述多肽結(jié)合的結(jié)合劑；(b)檢測樣品中可與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽的量；和(c)將多肽的量與預定的截斷值相比較，從而確定患者是否患有癌癥。在優(yōu)選實施方案中，結(jié)合劑是抗體，更優(yōu)選地是單克隆抗體。
在其它方面，本發(fā)明也提供監(jiān)測患者癌癥進展的方法。這些方法包括下列步驟(a)使第一時間點從患者獲得的生物樣品接觸能與上述多肽結(jié)合的結(jié)合劑；(b)檢測樣品中與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽的量；(c)使用在隨后的時間點從患者獲得的生物樣品重復步驟(a)和(b)；和(d)比較步驟(b)和(c)中檢測的多肽的量，從而監(jiān)測患者癌癥的進展。
在其它方面，本發(fā)明提供可與上述多肽結(jié)合的抗體，如單克隆抗體，以及含有這些抗體的診斷試劑盒。也提供含有一種或多種上述寡核苷酸探針或引物的診斷試劑盒。
在參考下列詳述和附圖后，本發(fā)明的這些和其它方面將是顯然的。此處公開的所有參考文獻均在此完整地引入作為參考，就象每一篇文獻單獨引入一樣。
附圖簡述

圖1顯示了51Cr釋放實驗的結(jié)果，說明用AdV致敏的CD8+T細胞系的ICD反應(yīng)性。正常供體PBMC用感染了表達ICD的重組AdV的DC致敏。該實驗是標準的4小時51Cr釋放實驗；靶標是未感染的或感染了表達ICD或EGFP的重組痘苗病毒的自體B-LCL，如圖所標示。
圖2顯示了在MCF-7腫瘤細胞上進行表面Her-2/neu的流式細胞計量分析的結(jié)果。細胞用抗表面Her-2/neu的mAb(單克隆抗體)染色，然后用與PE綴合的(conjugated)第二兔抗小鼠Ig抗體染色。用流式細胞術(shù)分析標記的細胞。平均熒光強度值如下MCF-7＝32；MCF-7+RTV-H2N＝165；MCF-7+Ad-H2N＝683；MCF-7+RTV-H2N+Ad-H2N＝651。
圖3說明了EL4-Her-2/neu的生長被編碼Her-2/neu的質(zhì)粒DNA的接種所抑制。在第0天(d0)和21天(d21)用pVR101 Her-2/neu，pVR1012-ECD或pVR1012-ICD(100μg)免疫(i.m.(肌內(nèi)))小鼠(每組5只)。在第35天(d35)皮下用200,000個EL4-Her-2/neu細胞攻擊小鼠。在腫瘤攻擊后監(jiān)測腫瘤大小25天。
圖4說明了EL4-Her-2/neu的生長被Her-2/neu ICD而不被ECD蛋白亞單位的接種所部分抑制。在第0天(d0)和21天(d21)用Montanide 720中的Her-2/neu ICD或Her-2/neu ECD蛋白質(zhì)(50μg)免疫(s.q.)小鼠(每組4只)。在第35天(d35)皮下用200,000個EL4-Her-2/neu細胞攻擊小鼠。在腫瘤攻擊后監(jiān)測腫瘤大小25天。
序列標識SEQ ID NO1描述了編碼Her-2/neu蛋白質(zhì)的DNA序列。
SEQ ID NO2描述了Her-2/neu蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
SEQ ID NO3描述了Her-2/neu的天然加工的HLA-B44限制性表位的氨基酸序列，相當于Her-2/neu蛋白質(zhì)的第1021-1030位氨基酸。
SEQ ID NO4是克隆HICD_CT_His_coding_region的測定的cDNA。
SEQ ID NO5是克隆HICD_plus_8_HIS的測定的cDNA。
SEQ ID NO6是克隆HICD_native_coding_region的測定的cDNA。
SEQ ID NO7是克隆HICD_in_pPDM_coding_sequence的測定的cDNA。
SEQ ID NO8是SEQ ID NO4公開的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是SEQ ID NO6公開的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO10是SEQ ID NO7公開的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO11是SEQ ID NO5公開的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO12是克隆68499(17D5 T細胞克隆的TCRβ鏈)的測定的cDNA。
SEQ ID NO13是克隆68498(17D5 T細胞克隆的TCRα鏈)的測定的cDNA。
SEQ ID NO14是SEQ ID NO12公開的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO15是SEQ ID NO13公開的cDNA所編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO16是引物PDM-44的DNA序列。
SEQ ID NO17是引物PDM-45的DNA序列。
SEQ ID NO18是引物PDM-591的DNA序列。
SEQ ID NO19是引物PDM-592的DNA序列。
SEQ ID NO20是引物PDM-72的DNA序列。
SEQ ID NO21是引物PDM-61的DNA序列。
SEQ ID NO22是引物TCRVα-16 5’的DNA序列。
SEQ ID NO23是引物TCRα3’的DNA序列。
SEQ ID NO24是引物TCRVβ-14. 5’的DNA序列。
SEQ ID NO25是引物TCRβ3’的DNA序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明一般涉及組合物及其在癌癥(特別是乳腺癌)治療和診斷中的應(yīng)用。如下進一步所述，本發(fā)明的示例性組合物包含但不限于Her-2/neu多肽，特別是免疫原性多肽，編碼這些多肽的多核苷酸，抗體和其它結(jié)合劑，抗原呈遞細胞(APC)和免疫系統(tǒng)細胞(例如T細胞)。
除非特別指明與之不同，本發(fā)明的實施將使用常規(guī)病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學方法和本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的重組DNA技術(shù)，為了舉例說明的目的，其中許多技術(shù)在下面描述。這些技術(shù)在文獻中有充分解釋。參見，例如，Sambrook等人，《分子克隆實驗室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第二版，1989)；Maniatis等人，《分子克隆實驗室指南》(Molecular CloningALaboratory Manual)(1982)；《DNA克隆使用手冊》(DNA CloningA Practical Approach)第I卷和第II卷(D.Glover編寫)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait編寫，1984)；核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization)(B.Hames和S.Higgins編寫，1985)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription and Translation)(B.Hames和S.Higgins編寫，1984)；《動物細胞培養(yǎng)》(AnimalCell Culture)(R.Freshney編寫，1986)；Perbal，《分子克隆實踐指南》(A practical Guide to Molecular Cloning)(1984)。
無論在上文還是在下文引用的所有公開文本、專利和專利申請，在此均完整引用作為參考。
在本說明書和附加權(quán)利要求書中使用時，單數(shù)形式包括復數(shù)形式，除非該內(nèi)容清楚地指明。
Her-2/neu多肽組合物在此使用時，術(shù)語“多肽”為其普通含義，即，是一種氨基酸序列。多肽不限于特定長度的產(chǎn)物；因此，多肽的定義中包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)，這些術(shù)語在此可交換使用，除非另外特別指明。該術(shù)語也并非是指或排除多肽的表達后修飾，例如，糖基化、乙?；⒘姿峄?，以及本領(lǐng)域所知的自然發(fā)生的和非自然發(fā)生的其它修飾。多肽可以是完整的蛋白質(zhì)，或其亞序列。本發(fā)明中的特定目的多肽是含有表位(即主要負責多肽的免疫原性并且能引發(fā)免疫應(yīng)答的抗原決定簇)的氨基酸亞序列。
如上所述，本發(fā)明涉及在溫血動物中引發(fā)和增強對HER-2/neu癌基因表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫(包括對惡性腫瘤)的組合物和方法，其中擴增的HER-2/neu基因與惡性腫瘤有關(guān)聯(lián)。擴增的HER-2/neu基因與惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)并不要求該基因的蛋白表達產(chǎn)物存在于該腫瘤上。例如，蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物的過表達可能與腫瘤的起始有關(guān)，但蛋白質(zhì)表達可能隨后消失。本發(fā)明的一個實施方案涉及體內(nèi)引發(fā)或增強對表達Her-2/neu的癌細胞的有效免疫應(yīng)答。
更具體地，一方面，本發(fā)明公開基于以下事實提供多肽，即，HER-2/neu基因的蛋白表達產(chǎn)物的特定部分(HER-2/neu多肽)可以被胸腺依賴性淋巴細胞(以下稱“T細胞”)識別，因此，可以利用免疫T細胞應(yīng)答預防或治療其中這種蛋白質(zhì)正在或曾經(jīng)過量表達的惡性腫瘤。
在這方面，特別優(yōu)選的多肽組合物來自Her-2/neu蛋白質(zhì)的ICD區(qū)，優(yōu)選含有SEQ ID NO2的大約第676-1255位氨基酸區(qū)域的一些或全部，更優(yōu)選至少含有SEQ ID NO3所示天然加工的HLA-B44限制性Her-2/neu表位。
一般地，CD4+T細胞群被認為在被特定抗原刺激時通過釋放淋巴因子而起輔助者/誘導者的作用；但是，CD4+細胞的一個亞群可充當細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。類似地，CD8+T細胞被認為通過直接溶解抗原靶標而起作用；但是，在許多情況下，它們能分泌淋巴因子以提供輔助細胞或DTH功能。盡管可能功能重疊，但CD4和CD8表型標志與結(jié)合II類或I類MHC抗原的肽的識別相聯(lián)系。II類或I類MHC背景下抗原的識別要求CD4+和CD8+T細胞應(yīng)答不同抗原或不同情況下呈遞的相同抗原。免疫原性肽與II類MHC抗原結(jié)合最常發(fā)生在被抗原呈遞細胞攝取的抗原上。因此，CD4+T細胞一般識別已經(jīng)位于腫瘤細胞外部的抗原。相反，在正常情況下，肽與I類MHC的結(jié)合僅發(fā)生在在胞質(zhì)溶膠中存在和由靶標自身合成的蛋白質(zhì)上，外部環(huán)境中的蛋白質(zhì)被排除在外。這種情況的一個例外是外源肽與以高濃度存在于細胞外的精確的I類結(jié)合基序的結(jié)合。因此，CD4+和CD8+T細胞具有十分不同的功能，并傾向于識別由抗原正常情況下存在位置所反應(yīng)的不同抗原。
正如本發(fā)明所公開的，HER-2/neu癌基因表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的多肽部分被T細胞識別。循環(huán)的HER-2/neu多肽被降解成肽片斷。來自該多肽的肽片斷與主要組織相容性復合物(MHC)抗原結(jié)合。通過與MHC抗原結(jié)合的肽在細胞表面的展示和宿主T細胞對肽加自身MHC抗原之組合的識別，HER-2/neu多肽(包括惡性細胞上表達的那些)對T細胞將是免疫原性的。T細胞受體的強烈特異性使得各T細胞能區(qū)分有單個氨基酸不同的肽。
在對來自該多肽的肽片斷的免疫應(yīng)答過程中，表達對該肽-MHC復合物有高親和性結(jié)合的T細胞受體的T細胞將結(jié)合此肽-MHC復合物，并由此被活化和誘導增殖。在初次遇到肽時，少量的免疫T細胞將分泌淋巴因子、增殖和分化成效應(yīng)和記憶T細胞。將在體內(nèi)發(fā)生初次免疫應(yīng)答，但體外難以檢測。記憶T細胞后來遇到相同抗原將導致更快更強的免疫應(yīng)答。再次應(yīng)答將在體內(nèi)或體外發(fā)生。體外應(yīng)答可以通過測量再次接觸抗原的T細胞群的增殖、細胞因子產(chǎn)生程度或細胞毒活性的產(chǎn)生來容易地評價。T細胞群應(yīng)答特定抗原而大量增殖被認為指示先前被抗原接觸或致敏。
本發(fā)明的某些化合物一般包含指導這些肽表達的HER-2/neu多核苷酸分子，其中該DNA分子可以存在于病毒或其它遞送載體中。如上所述，本發(fā)明多肽包括仍具有刺激免疫應(yīng)答的能力的變體。這些變體包括天然多肽的各種結(jié)構(gòu)形式。例如，由于存在可電離的氨基和羧基基團，HER-2/neu多肽可以是酸式鹽或堿式鹽的形式，或可以是中性形式。還可以通過氧化或還原對各氨基酸殘基進行修飾。
本發(fā)明還包括糖基化或未糖基化的HER-2/neu多肽。酵母或哺乳動物表達系統(tǒng)中表達的多肽可以在分子量和糖基化方式上與天然分子類似或稍有差別，這取決于表達系統(tǒng)。例如，在細菌如大腸桿菌中表達編碼多肽的DNA將典型地提供未糖基化的分子。真核蛋白質(zhì)的N-糖基化位點的特征在于氨基酸三聯(lián)體Asn-A1-Z，其中A1是除Pro之外的任何氨基酸，而Z是ser或Thr。具有失活的N-糖基化位點的HER-2/neu多肽變體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)(如寡核苷酸合成和連接或位點特異性誘變技術(shù))來制備，并屬于本發(fā)明的范圍?；蛘?，可以將N-連接的糖基化位點添加至HER-2/neu多肽之上。
一般地，可以使用編碼HER-2/neu多肽的基因組或cDNA克隆來獲得該蛋白質(zhì)。編碼全長HER-2/neu的基因組序列顯示在SEQ ID NO1中，推導的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO2中。可以通過從適當?shù)谋磉_文庫中篩選表達HER-2/neu蛋白質(zhì)的克隆獲得這些克隆。文庫的制備和篩選一般可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來進行，例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratories，ColdSpring Harbor，NY，1989(在此引入作為參考)中描述的方法。簡而言之，可以將噬菌體表達文庫鋪板，并轉(zhuǎn)移至濾膜。然后可以將濾膜和檢測試劑一起孵育。在本發(fā)明上下文中，“檢測試劑”是能夠和HER-2/neu蛋白質(zhì)結(jié)合然后可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種方法中的任一種檢測的任何化合物。典型的檢測試劑含有與報道基團偶聯(lián)的“結(jié)合劑”，如A蛋白、G蛋白、IgG或凝集素。優(yōu)選的報道基團包括酶、底物、輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、化學發(fā)光基團、熒光基團和生物素。更優(yōu)選該報道基團是辣根過氧化物酶，其可以通過和底物如四甲基聯(lián)苯胺或2，2’-連氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸一起孵育進行檢測。分離含有表達HER-2/neu蛋白質(zhì)的基因組或cDNA序列的噬菌斑并通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)純化。適宜的方法可以參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，ColdSpring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989。
在另一實施方案中，本發(fā)明多肽組合物還可以包含與抗本發(fā)明多肽，尤其是具有此處公開的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片斷或變體而產(chǎn)生的T細胞和/或抗體有免疫反應(yīng)活性的一種或多種多肽。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供包含一種或多種能夠引發(fā)如下T細胞和/抗體的多肽的多肽，所述T細胞和/或抗體與此處描述的一種或多種多肽、或此處公開的多核苷酸序列中所含的連續(xù)核酸序列編碼的一種或多種多肽、或它們的免疫原性片斷或變體、或和這些序列中的一個或多個在中等至高等嚴緊條件下雜交的一個或多個核酸序列編碼的一種或多種多肽有免疫反應(yīng)性。
另一方面，本發(fā)明提供多肽片斷，其包含此處給出的多肽組合物(例如，SEQ ID NOs2-3，8-11和14-15中顯示的那些多肽組合物，或序列SEQ ID NOs1，4-7和12-13中所示多核苷酸序列編碼的那些多肽組合物)的至少約5、10、15、20、25、50或100個或更多個連續(xù)氨基酸(包括所有的中間長度)。
另一方面，本發(fā)明提供本文描述的多肽組合物的變體。本發(fā)明一般所包括的多肽變體典型地表現(xiàn)出在全長范圍內(nèi)與本文給出的多肽序列有至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的一致性(按下述方式確定的)。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供的多肽片斷和變體與能夠和本文具體給出的多肽反應(yīng)的抗體和/或T細胞具有免疫反應(yīng)性。
本文中，術(shù)語多肽“變體”是指典型地與本文具體公開的多肽相差一個或多個替換、缺失、添加和/或插入的多肽。該變體可以是天然的或可以通過合成方式產(chǎn)生，例如通過修飾一個或多個上述本發(fā)明多肽序列并按本文所述和/或利用本領(lǐng)域熟知的眾多技術(shù)中的任一種評價它們的免疫原活性來產(chǎn)生。
例如，本發(fā)明多肽變體的一些例子包括其中一個或多個部分(如N端前導序列或跨膜域)已被除去的那些。變體的其它例子包括已從成熟蛋白質(zhì)的N端和/或C端除去一小部分(例如1-30個氨基酸，優(yōu)選5-15個氨基酸)的變體。
在許多情況下，變體將含有保守替代?！氨Ｊ靥娲笔侵敢环N氨基酸替換為具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸，以致肽化學領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預期該多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)基本上未發(fā)生改變。如上所述，可以對本發(fā)明多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)進行修飾而仍獲得編碼具有期望特征(如具有免疫原性特征)的變體或衍生多肽的功能性分子。當期望改變多肽的氨基酸序列以構(gòu)建本發(fā)明多肽的等價物，或甚至是改良的免疫原性變體或部分時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將典型地按照表1來改變編碼DNA序列的一個或多個密碼子。
例如，可以將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸替換為其它氨基酸而不明顯喪失與諸如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點等結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力。由于蛋白質(zhì)的生物學功能活性是由蛋白質(zhì)的相互作用能力和性質(zhì)定義的，故可以在蛋白質(zhì)序列，當然也可以在其DNA編碼序列中進行某些氨基酸序列替換，而仍獲得具有相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此，可以設(shè)想可能對本文公開的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列進行各種改變而不使其明顯喪失生物學用途或活性。
表1氨基酸密碼子丙氨酸Ala AGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys CUGC UGU天冬氨酸 Asp DGAC GAU谷氨酸Glu EGAA GAG苯丙氨酸 Phe FUUC UUU甘氨酸Gly GGGA GGC GGG GGU組氨酸His HCAC CAU異亮氨酸 Ile IAUA AUC AUU賴氨酸Lys KAAA AAG亮氨酸Leu LUUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 Met MAUG天冬酰胺 Asn NAAC AAU脯氨酸Pro PCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Gln QCAA CAG精氨酸Arg RAGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸Ser SAGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸Thr TACA ACC ACG ACU纈氨酸Val VGUA GUC GUG GUU色氨酸Trp WUGG酪氨酸Tyr YUAC UAU在實施這些改變時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)(hydropathicindex)。氨基酸親水指數(shù)對賦予蛋白質(zhì)相互作用生物學功能所具有重要性是本領(lǐng)域通常明了的(Kyte和Doolittle，1982，在此并入作為參考)。氨基酸的相對親水特性被認為與最終蛋白的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，而這又限定了蛋白質(zhì)與其它分子(如，酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原等)的相互作用。每個氨基酸均基于其疏水性和電荷特征被分配了一個親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)。這些值是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域已知，可以將某些氨基酸替換為具有類似親水指數(shù)或分值的其它氨基酸而仍導致具有相似生物學活性的蛋白質(zhì)，即仍獲得生物學功能等價蛋白。在實施這些改變時，親水指數(shù)相差在±2范圍內(nèi)的氨基酸替換是優(yōu)選的，尤其優(yōu)選±1范圍內(nèi)的替換，甚至更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)的替換。本領(lǐng)域也明了，相似氨基酸的替換可以基于親水性有效地實現(xiàn)。美國專利4,554,101(特此完整地引入此處作為參考)描述了蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性(由相鄰氨基酸的親水性控制)與蛋白質(zhì)的生物學性質(zhì)相關(guān)。
美國專利4,554,101中詳細描述了分配給氨基酸殘基的如下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。應(yīng)當理解，可以將一種氨基酸替換為具有相似親水性值的另一種氨基酸而仍獲得生物學等價物，尤其是免疫學等價蛋白。在這些改變中，優(yōu)選兩者的親水性值相差在±2范圍內(nèi)的氨基酸替換，尤其優(yōu)選±1范圍內(nèi)的替換，甚至更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)的替換。
如上所述，因此氨基酸替換一般以氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等為基礎(chǔ)。考慮了前述各種性質(zhì)的替換的實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
此外，還可以對任何多肽作進一步修飾以增加其體內(nèi)穩(wěn)定性?？赡艿男揎棸?，但不限于，在5’和/或3’末端添加側(cè)翼序列；在主鏈中使用硫代磷酸或2’O-甲基而非磷酸二酯鍵；和/或包括非常規(guī)堿基，如肌苷、queosine和wybutosine，以及乙?；?、甲基-、硫基-和其它修飾形式的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
還可以基于氨基酸殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)方面的相似性進行氨基酸替換。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；而具有不帶電荷的極性頭部基團和相似的親水值的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢赃M行保守改變的其它氨基酸組包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)csy，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。變體還可以，或者是作為備擇方案含有非保守改變。在優(yōu)選實施方案中，變體多肽與天然序列相差5個或更少的氨基酸替換、缺失或添加。還(或者是作為可選擇方案)可以通過例如缺失或添加對多肽的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)有微小影響的氨基酸來修飾變體。
如上所述，多肽可以在蛋白質(zhì)的N端含有信號(或前導)序列，該序列在翻譯時或在翻譯后引導該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移。多肽也可以與接頭或其它序列偶聯(lián)，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如聚-His)，或增強該多肽與固體載體的結(jié)合。例如，多肽可以與免疫球蛋白Fc區(qū)偶聯(lián)。
當比較多肽序列時，如果按如下所述進行比對達到最大一致性時兩種序列的氨基酸序列相同，則稱這兩種序列“一致”。兩種序列的比較一般通過在比較窗口中比較序列以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性來進行。在此使用時，“比較窗口”是指具有至少約20個，通常30至約75個，40至約50個連續(xù)位置的片段，在該片段中可以在一個序列和具有相同數(shù)目連續(xù)位置的參考序列最佳比對后對這兩個序列進行比較。
為了序列比較，可以采用Lasergene生物信息軟件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默認參數(shù)進行序列的最佳比對。該程序體現(xiàn)了以下文獻中所述的幾個比對策略Dayhoff，M.O.(1978)蛋白質(zhì)的進化改變模型-檢測遠緣關(guān)系的矩陣，見Dayhoff，M.O.(編)《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集》(Atlas of ProteinSequence and Structure)，國立生物化學研究基金會，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358頁；Hein J.(1990)比對和系統(tǒng)發(fā)生的統(tǒng)一方法，第626-645頁，《酶學方法》(Methods in Enzymology)第183卷，Academic Press公司，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《數(shù)值分類學-數(shù)值分類學的原理和實踐》(Numerical Taxonomy-the Principles and Practiceof Numerical Taxonomy)，F(xiàn)reeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80726-730。
或者，為了序列比較，可以利用以下方法進行序列的最佳比對Smith和Waterman的局部一致性算法((1982)Add.APL.Math 2482)；Needleman和Wunsch的一致性比對算法((1970)J.Mol.Biol.48443)；Pearson和Lipman的相似性查詢方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)；這些算法的計算機執(zhí)行程序(Wisconsin遺傳學軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目測。
適合于確定序列一致性和序列相似性百分數(shù)的算法的一個優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。采用例如這里所述參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分數(shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。對于氨基酸序列，可以采用評分矩陣計算累積分。當該比對累積分從其最大獲得值降低了量X；由于積累一或多個負分殘基比對，該累積分達到零或更低；或任一序列達到末端時，終止每個方向上字符命中(word hits)的延伸。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了比對的敏感度和速度。
在一個優(yōu)選方法中，“序列一致性百分數(shù)”通過在至少有20個位置的比較窗中比較兩個最佳比對的序列來確定，其中為了獲得兩個序列的最佳比對，與參考序列(不含有插入或缺失)相比，比較窗中的該多肽序列部分可以含有20％或更少，通常5-15％，或10-12％的插入或缺失(即間隔區(qū))。該百分數(shù)的計算方法是確定這兩個序列中出現(xiàn)相同氨基酸殘基的位置的數(shù)目以獲得匹配位置數(shù)，用該匹配位置數(shù)除以參考序列的總位置數(shù)(即窗的大小)，然后將所獲結(jié)果乘以100以產(chǎn)生該序列一致性百分數(shù)。
在其它說明性實施方案中，多肽可以是融合多肽，其含有如此處所述的多個多肽，或者含有至少一個此處所述的多肽和無關(guān)序列，如已知的腫瘤蛋白。例如，融合配偶體(fusion partner)可以幫助提供T輔助細胞表位(免疫學融合配偶體)，優(yōu)選地可被人體識別的T輔助細胞表位，或者可以有助于以高于原始重組蛋白的產(chǎn)量表達該蛋白質(zhì)(表達增強子)。某些優(yōu)選的融合配偶體既是免疫學的又是增強表達的融合配偶體?？梢赃x擇其它融合配偶體，以提高多肽的溶解度，或使多肽能導向希望的胞內(nèi)區(qū)室。再有其它融合配偶體包括有利于多肽純化的親和標簽。
融合多肽一般可以利用包括化學偶聯(lián)(conjugation)在內(nèi)的標準技術(shù)制備。優(yōu)選地，融合多肽表達為一種重組多肽，使得在表達系統(tǒng)中的生產(chǎn)水平高于非融合多肽。簡言之，編碼多肽成分的DNA序列可以分開裝配，并連接到合適的表達載體中。編碼一種多肽成分的DNA序列的3’端在有或沒有肽接頭的情況下與編碼第二多肽成分的DNA序列的5’端連接，使序列的閱讀框同步。這導致翻譯為保留了兩種成分多肽的生物活性的一種融合多肽。
可以采用肽接頭序列將該第一和第二多肽成分分開一段足夠長的距離，以保證每一個多肽都折疊成其二級和三級結(jié)構(gòu)。該多肽接頭序列可以采用本領(lǐng)域熟知的標準技術(shù)并入融合蛋白中。適合的肽接頭序列可以基于以下因素進行選擇(1)其能夠采取柔性伸展構(gòu)象；(2)不能采取能與該第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)；和(3)缺乏可以和該多肽的功能性表位反應(yīng)的疏水或帶電荷殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含有Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于該接頭序列中。可以用作接頭的有用氨基酸序列包括那些公開于如下文獻中的序列Maratea等，基因(Gene)4039-46，1985；Murphy等，美國國家科學院院刊838258-8262，1986；美國專利4,935,233和美國專利4,751,180。接頭序列一般可以長1-約50個氨基酸。當該第一和第二多肽具有能夠用以分開這些功能域并防止空間干擾的非必需N端氨基酸區(qū)域時，則無需接頭序列。
將這些相連的DNA序列可操作地與適當?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件連接在一起。負責DNA表達的調(diào)節(jié)元件僅置于編碼該第一多肽的DNA序列的5’端。同樣，終止翻譯所必需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號僅存在于編碼該第二多肽的DNA序列的3’端。
融合多肽能含有如此處所述的多肽和無關(guān)免疫原性蛋白質(zhì)，如一種能引發(fā)回憶反應(yīng)的免疫原性蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)的例子包括破傷風、結(jié)核和肝炎蛋白(參見，例如，Stoute等人，New Engl.J.Med.33686-91，1997)。
在一個優(yōu)選實施方案中，免疫融合配偶體來源于分枝桿菌屬的種，如來自結(jié)核分枝桿菌的Ra12片段。美國專利申請60/158,585描述了Ra12組合物和方法提高異源多核苷酸/多肽序列的表達和/或免疫原性的用途，其公開內(nèi)容在此完整引用作為參考。簡言之，Ra12是指一個多核苷酸區(qū)，它是結(jié)核分枝桿菌MTB32A核酸的亞序列。MTB32A是一種分子量為32KD的絲氨酸蛋白酶，由結(jié)核分枝桿菌的毒力株和無毒力株的基因編碼。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已經(jīng)描述(例如，美國專利申請60/158,585；參見Skeiky等人，Infection and Immun.(1999)673998-4007，在此引用作為參考)。MTB32A編碼序列的C端片段高水平表達，在純化過程中保持為可溶性多肽。而且，Ra12可以提高與之融合的異源免疫原性多肽的免疫原性。一種優(yōu)選的Ra12融合多肽含有對應(yīng)于MTB32A的氨基酸殘基192-323的14KD的C端片段。其它優(yōu)選的Ra12多核苷酸一般含有編碼Ra12多肽之一部分的至少約15個連續(xù)核苷酸，至少約30個核苷酸，至少約60個核苷酸，至少約100個核苷酸，至少約200個核苷酸，或至少約300個核苷酸。Ra12多核苷酸可以含有天然序列(即，編碼一種Ra12多肽或其部分的內(nèi)源序列)，或者可以含有該序列的一種變體。Ra12多核苷酸變體可以含有一個或多個置換、添加、缺失和/或插入，使得編碼的融合多肽的生物活性基本上不低于含有天然Ra12多肽的融合多肽。這些變體優(yōu)選地顯示與編碼天然Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列有至少約70％的一致性，更優(yōu)選地至少約80％的一致性，最優(yōu)選地至少約90％的一致性。
在其它優(yōu)選實施方案中，免疫融合配偶體來源于蛋白D——革蘭氏陰性菌B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza)的一種表面蛋白(WO 91/18926)。優(yōu)選地，蛋白D衍生物含有該蛋白質(zhì)的大約前三分之一(例如，N端前100-110個氨基酸)，蛋白D衍生物可以脂化。在某些優(yōu)選實施方案中，在N端含有脂蛋白D融合配偶體的前109個殘基，以產(chǎn)生含有其它外源T細胞表位的多肽，并提高在大腸桿菌中的表達水平(從而作為表達增強子)。脂質(zhì)尾確?？乖蚩乖蔬f細胞最佳遞呈。其它融合配偶體包括來源于流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。一般使用N端81個氨基酸，但也可使用含有T輔助細胞表位的不同片段。
在另一個實施方案中，免疫融合配偶體是被稱作LYTA的蛋白質(zhì)或其部分(優(yōu)選地C端部分)。LYTA來源于肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，該菌合成一種N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，被稱作酰胺酶LYTA(由LytA基因編碼；Gene 43265-292，1986)。LYTA是一種自溶素，可特異性降解肽聚糖主鏈中的某些鍵。LYTA蛋白的C端域負責與膽堿或某些膽堿類似物(如DEAE)的親和力。這種性質(zhì)已用于發(fā)展用于融合蛋白表達的大腸桿菌C-LYTA表達質(zhì)粒。在氨基端含C-LYTA片段的雜種蛋白的純化已有描述(參見，Biotechnology10795-798，1992)。在一個優(yōu)選實施方案中，LYTA的重復部分可以摻入融合蛋白中。在C端區(qū)中發(fā)現(xiàn)一個開始于殘基178的重復部分。一個特別優(yōu)選的重復部分含有殘基188-305。
另一個示例性實施方案涉及融合多肽，和編碼它們的多核苷酸，其中融合配偶體含有能將多肽導向內(nèi)體/溶酶體區(qū)室的導向信號，如美國專利號5,633,234所述。本發(fā)明的免疫原性多肽當與這種導向信號融合時，將更有效地與MHC II類分子結(jié)合，從而使該多肽特異的CD4+T細胞的體內(nèi)刺激增強。
本發(fā)明的多肽利用本領(lǐng)域周知的多種合成和/或重組技術(shù)制備，后者在下面有進一步的描述。一般少于約150個氨基酸的多肽、部分和其它變體能利用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)通過合成法產(chǎn)生。在一個說明性實例中，利用可商業(yè)獲得的固相技術(shù)，如Merrifield固相合成法合成這些多肽，其中向延長的氨基酸鏈中連續(xù)添加氨基酸。參見Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963。多肽自動合成裝置可購自供應(yīng)商，如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City，CA)，可以按照使用說明書操作。
本發(fā)明的多肽組合物(包括融合多肽)通常是分離的。“分離的”多肽是從其原始環(huán)境中分離出的多肽。例如，如果將一種自然存在的蛋白質(zhì)或多肽與自然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開，則該蛋白質(zhì)或多肽是分離的。優(yōu)選地，這些多肽也是純化的，例如，純度至少約90％，更優(yōu)選地至少約95％，最優(yōu)選地至少約99％。
多核苷酸組合物在其它方面，本發(fā)明提供Her-2/neu多核苷酸組合物。術(shù)語“DNA”和“多核苷酸”在此基本上可交換使用，是指已經(jīng)分離不含特定物種的總基因組DNA的DNA分子?！胺蛛x的”在此使用時是指多核苷酸基本上不含其它編碼序列，而且DNA分子不含無關(guān)編碼DNA的較大部分(如大染色體片段或其它功能基因或多肽編碼區(qū))。當然，是指最初分離的DNA分子，不排除后來人工加到該片段中的基因或編碼區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，本發(fā)明的多核苷酸組合物能包含基因組序列、基因組外和質(zhì)粒編碼的序列，和較小的工程化基因片段，它們表達或者可以被改造表達蛋白質(zhì)、多肽、肽等。這些片段可以是自然分離的，或是人工合成修飾的。
熟練技術(shù)人員也應(yīng)當認識到，本發(fā)明的多核苷酸可以是單鏈(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈的，可以是DNA(基因組DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子可包括含有內(nèi)含子并一一對應(yīng)于DNA分子的HnRNA分子，和不含內(nèi)含子的mRNA分子。本發(fā)明的多核苷酸中可以但不必須存在其它編碼或非編碼序列，多核苷酸可以但不必須與其它分子和/或支持材料連接。
多核苷酸可以含有天然序列(即，編碼本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)或其部分的內(nèi)源序列)，或可以含有編碼該序列的變體或衍生物(優(yōu)選地是一種免疫原性變體或衍生物)的序列。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有下列多核苷酸序列一部分或全部的多核苷酸組合物SEQ ID NO1、4-7和12-13所示的多核苷酸序列，SEQ ID NO1、4-7和12-13所示多核苷酸序列的互補序列，和它們的簡并變體。在某些優(yōu)選實施方案中，此處所述的Her-2/neu多核苷酸序列編碼Her-2/neu蛋白質(zhì)ICD區(qū)域的免疫原性表位序列，優(yōu)選SEQ ID NO3中所示的表位序列。
在其它有關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供與本文公開的序列基本一致的多核苷酸變體，例如，通過用此處所述的方法(例如使用標準參數(shù)的BLAST分析，如下所述)與本發(fā)明的多核苷酸序列比較，具有至少70％的序列一致性，優(yōu)選地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可以適當?shù)卣{(diào)節(jié)這些值，以便在考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等之后，確定兩種核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)一致性。
多苷酸變體一般含有一個或多個置換、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選地使變體多核苷酸編碼的多肽的免疫原性基本上不低于此處具體給出的多核苷酸序列編碼的多肽。應(yīng)當理解，術(shù)語“變體”也包括異種來源的同源基因。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供含有以下序列各種不同長度的連續(xù)序列段的多核苷酸片段，該序列與這里公開的一種或多種序列相同或互補。例如，本發(fā)明提供這樣的多核苷酸它們含有這里公開的一種或多種序列的至少約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000個或更多連續(xù)核苷酸，以及所有中間長度。應(yīng)當理解，“中間長度”在本文中是指介于所述值之間的任何長度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1000等等之間的所有整數(shù)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供在中度到高度嚴緊條件下能與此處所述多核苷酸序列或其片段或其互補序列雜交的多核苷酸組合物。雜交技術(shù)在分子生物學領(lǐng)域眾所周知。為舉例說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊條件包括用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌20分鐘兩次。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，能容易地操作雜交嚴格性，如通過改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴格雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。
在某些優(yōu)選實施方案中，上述多核苷酸，如多核苷酸變體、片段和雜交序列，編碼與此處所述Her-2/neu多肽序列有免疫學交叉反應(yīng)性的多肽。在其它優(yōu)選實施方案中，這些多核苷酸編碼免疫原活性水平為此處所述多肽序列的至少約50％、優(yōu)選地至少約70％、更優(yōu)選地至少約90％的多肽。
本發(fā)明的多核苷酸或其片段，無論編碼序列本身的長度如何，都可以與其它DNA序列(如啟動子、聚腺苷酸化信號、其它限制酶位點、多克隆位點、其它編碼片段等)結(jié)合，使其總長度可能大大改變。因此預期可以使用幾乎任何長度的核酸片段，總長度優(yōu)選地受限于制備和在預期重組DNA方案中的應(yīng)用的容易程度。例如，總長度為約10000、約5000、約3000、約2000、約1000、約500、約200、約100、約50個堿基對等(包括所有中間長度)的示例性多核苷酸片段考慮可用于本發(fā)明許多實施方案中。
當比較多核苷酸序列時，如果在如下所述比對最大對應(yīng)性時兩種序列的核苷酸序列相同，則稱這兩種序列“一致”。兩種序列的比較一般通過在比較窗口中比較序列，鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域來進行。在此使用時，“比較窗口”是指至少約20個，通常30至約75個，優(yōu)選地40至約50個連續(xù)位置的片段，其中可以在最佳比對兩種序列后將一種序列與連續(xù)位置數(shù)量相同的參照序列相比較。
序列的最佳比對可以利用Lasergene生物信息學軟件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序進行，使用缺省參數(shù)。該程序包括下列參考文獻中所述的幾種比對方案Dayhoff，MO(1978)“蛋白質(zhì)進化改變模型-用于檢測遠緣關(guān)系的矩陣”，在Dayhoff，M.O.編寫的《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖譜》中，國家生物醫(yī)學研究基金會，華盛頓，第5卷，增3，345-358；Hein J.(1990)“比對與系統(tǒng)發(fā)生的統(tǒng)一方法”，626-645，《酶學方法》，183卷，學院出版社，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS5151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 411-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《數(shù)量分類學——數(shù)量分類學原理與實踐》，F(xiàn)reeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80726-730。
或者，序列的最佳對比也可以如下進行利用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2482的局部一致性算法、利用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的一致性比對算法、利用Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的相似性檢索法、通過這些算法的計算機實現(xiàn)方法(GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA和TFASTA，Wisconsin遺傳學軟件包，遺傳學計算機組(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過觀察。
適于確定百分序列一致性和序列相似性的算法的一個優(yōu)選實例是BLAST和BLAST 2.0算法，分別在Altschul等人(1977)Nucl.AcidsRes.253389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410描述。例如能以此處所述的參數(shù)使用BLAST和BLAST 2.0，確定本發(fā)明的多核苷酸的百分序列一致性。進行BLAST分析的軟件可以通過國家生物技術(shù)信息中心公開獲得。在一個示例性實施例中，對于核苷酸序列，能用參數(shù)M(匹配殘基對的獎分＞0)和N(錯配殘基的罰分；總是＜0)計算累積得分。在下列情況時每個方向的字段命中延伸停止累積比對得分從獲得的最大值降低數(shù)值X時；由于一個或多個負分殘基比對的積累，累積得分為0或更低時；或到達每個序列的末端時。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定該算法的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默認使用11的字長(W)、10的期望值(E)，BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)比對，(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，比較兩條鏈。
優(yōu)選地，通過在至少20個位置的比較窗口上比較兩種最佳比對的序列測定“百分序列一致性”，其中與用于最佳比對兩種序列的參照序列(不含添加或缺失)相比，比較窗口中多核苷酸序列的部分可含有20％或更低、通常5％-15％或10％-12％的添加或缺失(即缺口)。此百分數(shù)的計算方法是測定在兩種序列中存在相同核酸堿基的位置數(shù)，得到匹配的位置數(shù)，匹配位置數(shù)除以參照序列中的位置總數(shù)(即窗口大小)，結(jié)果乘以100，得到百分序列一致性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，由于遺傳密碼的簡并性，存在許多編碼此處所述的多肽的核苷酸序列。其中一些與任一天然基因的核苷酸序列有最小同源性。但是，本發(fā)明特別涉及由于密碼子使用的差異而不同的多核苷酸。另外，含有此處所述多核苷酸序列的基因的等位基因也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。等位基因是由于核苷酸的一個或多個突變(如核苷酸的缺失、添加或置換)而改變的內(nèi)源基因。得到的mRNA和蛋白質(zhì)可能，但不必須具有改變的結(jié)構(gòu)或功能。等位基因可用標準技術(shù)(如雜交、擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)鑒定。
因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，利用誘變法(如位點特異性誘變)制備此處所述多肽的免疫原性變體和/或衍生物。使用該方法，能通過誘變編碼多肽的基本多核苷酸進行多肽序列的特定修飾。這些技術(shù)提供制備和檢測序列變體的直接方法，例如，通過向多核苷酸中引入一個或多個核苷酸序列改變，摻入前述一個或多個考慮。
位點特異性誘變可產(chǎn)生突變體，這是通過使用編碼帶有希望突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列，以及足夠量的相鄰核苷酸，以提供足夠大小和序列復雜性的引物序列，在橫穿的缺失連接處兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙鏈來進行的?？梢栽谶x擇的多核苷酸序列中應(yīng)用突變，以提高、改變、降低、修飾或以其它方式改變多核苷酸本身的性質(zhì)，和/或改變編碼的多肽的性質(zhì)、活性、組成、穩(wěn)定性或一級序列。
在本發(fā)明的某些實施方案中，發(fā)明者想誘變公開的多核苷酸序列以改變編碼的多肽的一種或多種性質(zhì)，如多肽疫苗的免疫原性。位點特異性誘變技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，廣泛用于產(chǎn)生多肽和多核苷酸的變體。例如，位點特異性誘變通常用于改變DNA分子的特定部分。在這些實施方案中，使用一般含有大約14-25個核苷酸的引物，待改變序列連接處兩側(cè)有約5-約10個殘基。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，位點特異性誘變技術(shù)通常使用存在單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體。在位點特異性誘變中有用的典型載體包括載體，如M13噬菌體。這些噬菌體易于購得，它們的使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。在定點誘變中也通常使用雙鏈質(zhì)粒，這省去了從質(zhì)粒向噬菌體轉(zhuǎn)移目的基因的步驟。
此處所述的定點誘變通常如下進行首先獲得單鏈載體，或者解開雙鏈載體的兩條鏈，在載體的序列中包含編碼希望的多肽的DNA序列。制備(通常是合成)含有希望的突變序列的寡核苷酸引物。該引物然后與單鏈載體退火，與DNA聚合酶(如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段)反應(yīng)，以完成含突變鏈的合成。于是形成異源雙鏈，其中一條鏈編碼原始的未突變序列，第二條鏈含有希望的突變。然后用該異源雙鏈載體轉(zhuǎn)化合適的細胞，如大腸桿菌細胞，選擇包含具有突變序列排列的重組載體的克隆。
利用定點誘變制備選擇的肽編碼DNA片段的序列變體提供了一種產(chǎn)生可能有用的種類的方法，并非意在限制，因為存在獲得肽的序列變體和編碼它們的DNA序列的其它方法。例如，可以用誘變劑(如羥胺)處理編碼希望的肽序列的重組載體，獲得序列變體。關(guān)于這些方法和方案的具體細節(jié)見Maloy等人，1994；Segal，1976；Prokop和Bajpai，1991；Kuby，1994；Maniatis等人，1982所述，在此均引用作為參考。
在此使用時，術(shù)語“寡核苷酸指導的誘變法”是指模板依賴的方法和載體介導的繁殖，它導致特異核酸分子的濃度比最初的濃度提高，或者可檢測信號的濃度提高(如擴增)。在此使用時，術(shù)語“寡核苷酸指導的誘變法”是指涉及引物分子依賴模板延長的方法。術(shù)語依賴模板的方法是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列遵循眾所周知的互補堿基配對原則(參見，例如，Watson，1987)。載體介導的方法一般包括向DNA或RNA載體中導入核酸片段，載體的克隆性擴增，擴增的核酸片段的回收。美國專利號4,237,224中給出了這些方法的實例，在此完整引用作為參考。
在制備本發(fā)明的多肽變體的另一種方法中，如美國專利號5,837,458所述，可以使用循環(huán)序列重組(recursive sequencerecombination)。在該方法中，進行重組和篩選或選擇的重復循環(huán)，以“進化”本發(fā)明的多核苷酸變體，它們具有例如提高的免疫原性。
在本發(fā)明的其它實施方案中，此處所述的多核苷酸序列能方便地用作核酸雜交的探針或引物。因而，含有至少約15個連續(xù)核苷酸的序列區(qū)(其與此處公開的15個核苷酸長的連續(xù)序列有相同序列或與之互補)的核酸片段預計將特別有用。更長的相同或互補的連續(xù)序列，例如約20、30、40、50、100、200、500、1000(包括所有中間長度)、甚至可達全長的序列，在某些實施方案中也是有用的。
這些核酸探針與目的序列特異性雜交的能力將使它們能用于檢測特定樣品中互補序列的存在。然而，也可設(shè)想有其它用途，如序列信息的應(yīng)用，用于制備突變種引物，或可用于制備其它遺傳構(gòu)建體的引物。
具有由與此處公開的多核苷酸序列相同或互補的大約10-14、15-20、30、50乃至100-200個核苷酸的連續(xù)核苷酸段(也包括中間長度)組成的序列區(qū)的多核苷酸分子特別可用作雜交探針，例如用于Southern和Northern印跡。這將能分析基因產(chǎn)物或其片段，無論是在不同細胞類型中還是在不同細菌細胞中。片段的總大小以及互補延伸片段的大小最終取決于特定核酸片段的預期用途。較小的片段一般用于雜交實施方案，其中連續(xù)互補區(qū)的長度可能不同，如約15-約100個核苷酸，但是也可以根據(jù)希望檢測的互補序列的長度，使用較大的相鄰互補序列段。
利用長度約為15-25個核苷酸的雜交探針能形成既穩(wěn)定又具選擇性的雙鏈分子。通常優(yōu)選在長度超過15個堿基的序列段上含有連續(xù)互補序列的分子，以提高雜合體的穩(wěn)定性和選擇性，從而提高獲得的特異雜種分子的質(zhì)量和程度。通常優(yōu)選設(shè)計含有15-25個連續(xù)核苷酸乃至更長(希望時)的基因互補序列段的核酸分子。
雜交探針可以選自此處公開的任一序列的任一部分。所需要的只是檢查希望用作探針或引物的此處所述的序列，或者這些序列的連續(xù)部分，長度從約15-25個核苷酸到包括全長序列。探針和引物序列的選擇可取決于多種因素。例如，可能希望使用朝向全序列末端的引物。
例如可以通過化學法直接合成片段，容易地制備小的多核苷酸片段，通常應(yīng)用自動寡核苷酸合成儀。也可通過應(yīng)用核酸增殖技術(shù)，如美國專利4,683,202(在此引用作為參考)的PCRTM技術(shù)，通過向用于重組生產(chǎn)的重組載體中導入選擇的序列，通過分子生物學領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它重組DNA技術(shù)，獲得這些片段。
可以根據(jù)與完整基因或目的基因片段的互補片段選擇性形成雙鏈分子的能力，使用本發(fā)明的核苷酸序列。根據(jù)目的用途，典型地希望使用不同的雜交條件實現(xiàn)探針對靶序列的不同程度的選擇性。對于需要高選擇性的應(yīng)用，一般希望使用相對嚴格的條件形成雜合體，例如，選擇相對低鹽和/或高溫的條件，如約0.02M-約0.15M的鹽和約50℃-約70℃的溫度產(chǎn)生的條件。這種選擇性條件允許極少的(如果有的話)探針與模板或靶鏈之間的錯配，特別適用于分離有關(guān)序列。
當然，對于某些用途，例如，在希望利用可與基本模板雜交的突變引物鏈制備突變體時，一般需要較低的嚴格(嚴格性降低)雜交條件形成異源雙鏈。在這些情況中，可能希望使用0.15M-約0.9M的鹽和約20℃-約55℃的溫度。從而能把交叉雜交種容易地確定為相對于對照雜交的陽性雜交信號。在任何情況下，一般認為，通過添加含量提高的甲酰胺——用來以與溫度升高相同的方式使雜合雙鏈去穩(wěn)定，能使條件更加嚴格。因此，雜交條件能容易地操作，一般是根據(jù)希望的結(jié)果進行選擇的方法。
多核苷酸鑒定、表征和表達可以使用多種成熟技術(shù)中的任一種(一般參見，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，1989，和其它類似參考文獻)鑒定、制備和/或操作本發(fā)明的多核苷酸組合物。
許多依賴模板的方法可用來擴增樣品中存在的靶序列。最著名的擴增方法之一是聚合酶鏈反應(yīng)(PCRTM)，在美國專利號4,683,195、4,683,202、4,800,159中有詳細描述，均在此引用作為參考。簡言之，在PCRTM中，制備兩條與靶序列相對互補鏈上的區(qū)域互補的引物序列。向反應(yīng)混合物中加入過量的脫氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。如果樣品中存在靶序列，引物將與靶序列結(jié)合，聚合酶將通過加入核苷酸使引物沿靶序列延伸。提高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物就可從靶序列上分離下來，形成反應(yīng)產(chǎn)物，過量的引物將與靶序列和反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合，該過程重復進行。為了確定擴增的mRNA的量，優(yōu)選地可以進行反轉(zhuǎn)錄和PCRTM擴增過程。聚合酶鏈反應(yīng)方法在本領(lǐng)域眾所周知。
其它許多依賴模板的方法在本領(lǐng)域已知并可使用，其中許多是PCRTM擴增技術(shù)的變型。例如，這些方法包括連接酶鏈反應(yīng)(稱為LCR)，如歐洲專利申請公開號320,308和美國專利號4,883,750所述；Qβ復制酶，如PCT國際專利申請公開號PCT/US87/00880所述；鏈置換擴增(SDA)和修復鏈反應(yīng)(RCR)。英國專利申請?zhí)?202328和PCT國際專利申請公開號PCT/US89/01025還描述了其它擴增方法。其它核酸擴增方法包括基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(TAS)(PCT國際專利申請公開號WO 88/10315)，包括基于核酸序列的擴增(NASBA)和3SR。歐洲專利申請公開號329,822描述了一種核酸擴增方法，它包括循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)。PCT國際專利申請公開號WO 89/06700描述了一種核酸序列擴增方法，它是基于啟動子/引物序列與單鏈靶DNA(“ssRNA”)雜交，隨后該序列的許多RNA拷貝轉(zhuǎn)錄。其它擴增方法如“RACE”(Frohman，1990)和“單向PCR”(Ohara，1989)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。
利用眾所周知的技術(shù)，本發(fā)明的多核苷酸的擴增部分可用來從適當?shù)奈膸?例如腫瘤cDNA文庫)中分離全長基因。在這些技術(shù)中，用一種或多種多核苷酸探針或適于擴增的引物篩查文庫(cDNA或基因組文庫)。優(yōu)選地，按大小選擇文庫，使之包含較大的分子。為了鑒定基因的5’和上游區(qū)，也優(yōu)選隨機引物文庫。為了獲得內(nèi)含子和延伸的5’序列，優(yōu)選基因組文庫。
對于雜交技術(shù)，部分序列可以用眾所周知的技術(shù)標記(例如通過切口平移或用32P末端標記)。通過用標記探針與含有變性菌落(或含有噬斑的菌苔)的濾紙雜交，篩查細菌或噬菌體文庫(參見，Sambrook等人，《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室，冷泉港，NY，1989)。篩選并擴增雜交菌落或噬斑，分離DNA進一步分析。例如，可以使用來自部分序列的引物或來自載體的引物進行PCR，分析cDNA克隆，確定其它序列的含量。可產(chǎn)生限制酶切圖譜和部分序列，鑒定一種或多種重疊克隆。然后可利用標準技術(shù)確定完整序列，這可能包括產(chǎn)生一系列缺失克隆。然后將產(chǎn)生的重疊序列裝配為一個連續(xù)序列。利用眾所周知的技術(shù)，通過連接合適的片段，產(chǎn)生全長cDNA分子。
或者，還能利用如上所述的擴增技術(shù)由部分cDNA序列獲得全長編碼序列。一種這樣的擴增技術(shù)是反向PCR(參見，Triglia等人，Nucl.Acids Res.168186，1988)，它使用限制酶產(chǎn)生已知基因區(qū)中的一條片段。然后通過分子內(nèi)連接環(huán)化該片段，在使用來源于已知區(qū)的趨異引物的PCR中用作模板。在一種備選方法中，通過利用接頭序列的引物和對已知區(qū)域特異的引物擴增，可得到與部分序列相鄰的序列。通常利用相同的接頭引物和已知區(qū)域特異的第二條引物，對擴增的序列進行第二輪擴增。WO 96/38591描述了該方法的一種變型，它使用兩條引物，起始從已知序列以相反方向延伸。另一種這樣的技術(shù)被稱為“快速cDNA末端擴增”或RACE。該技術(shù)包括利用可與polyA區(qū)或載體序列雜交的內(nèi)部引物和外部引物鑒定位于已知序列5’和3’的序列。其它技術(shù)包括捕獲PCR(Lagerstrom等人，PCR Methods Applic.1111-119，1991)和步移PCR(Parker等人，Nucl.Acids Res.193055-60，1991)。也可利用其它擴增方法獲得全長cDNA序列。
在本發(fā)明的其它實施方案中，可以在重組DNA分子中使用編碼本發(fā)明的多肽或融合蛋白或其功能相當物的多核苷酸序列或其片段，指導該多肽在適當宿主細胞中表達。由于遺傳密碼固有的簡并性，可能產(chǎn)生編碼基本上相同或功能相當?shù)陌被嵝蛄械钠渌麯NA序列，這些序列可用來克隆和表達特定多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，在某些情況下產(chǎn)生含有非自然存在的密碼子的多肽編碼核苷酸序列是有利的。例如，能選擇特定原核或真核宿主優(yōu)選的密碼子，來提高蛋白質(zhì)表達的速度，或產(chǎn)生具有希望的特性(如半衰期長于由自然存在的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。
而且，也能利用本領(lǐng)域周知的方法改造本發(fā)明的多核苷酸序列，以期為了多種原因改變多肽編碼序列，包括但不限于基因產(chǎn)物克隆、加工和/或表達的改變。例如，可以利用通過隨機片段化及基因片段和合成寡核苷酸的PCR再裝配的DNA改組改造核苷酸序列。另外，也可利用定點誘變插入新的限制位點，改變糖基化模式，改變密碼子偏倚性，產(chǎn)生剪接變體或引入突變，等等。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，天然、修飾或重組的核酸序列可以與異源序列連接，使之編碼一種融合蛋白。例如，為了從肽庫篩選多肽活性的抑制劑，可有利地編碼能被購得的抗體識別的嵌合蛋白。也可改造融合蛋白，使之在多肽編碼序列與異源蛋白質(zhì)序列之間含有一個酶切位點，以便將該多肽從異源部分上切下并純化。
可以利用本領(lǐng)域眾所周知的化學方法整個或部分地合成編碼希望的多肽的序列(參見，Caruthers，M.H.等人，(1980)Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.215-223，Horn，T.等人，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)。或者，利用化學方法合成多肽的氨基酸序列或其一部分也可產(chǎn)生蛋白質(zhì)本身。例如，肽合成能用多種固相技術(shù)進行(Roberge，J.Y.等人(1995)Science 269202-204)，自動合成例如可用ABI 43A肽合成儀(Perkin Elmer，Palo Alto，CA)完成。
一種新合成的肽可以用制備型高效液相層析(例如Creighton，T.(1983)《蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)和分子原理》WH Freeman and Co.，紐約，N.Y.)或本領(lǐng)域使用的其它類似技術(shù)充分純化。合成肽的組成可通過氨基酸分析或測序(例如Edman降解法)證實。此外，在直接合成過程中也可改變多肽的氨基酸序列或其任一部分，和/或利用化學方法與其它蛋白質(zhì)的序列或其任一部分組合，產(chǎn)生一種變體多肽。
為了表達希望的多肽，編碼多肽或功能相當物的核苷酸序列可以插入適當?shù)谋磉_載體中，即，含有插入的編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所需元件的載體。可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法構(gòu)建含有編碼目的多肽的序列和適當轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。例如，Sambrook，J.等人，(1989)《分子克隆實驗室指南》，冷泉港實驗室，Plainview，NY，和Ausubel，F(xiàn).M.等人(1989)《現(xiàn)代分子生物學方法》，John Wiley &Sons，紐約，N.Y.描述了這些技術(shù)。
可利用大量表達載體/宿主系統(tǒng)含有和表達多核苷酸序列。這些包括但不限于微生物，如用重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌；用酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達載體(例如桿狀病毒)轉(zhuǎn)化的昆蟲細胞；用病毒表達載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或細菌表達載體(例如Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)。
表達載體中存在的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)——增強子、啟動子、5’和3’非翻譯區(qū)——它們與宿主細胞蛋白質(zhì)相互作用，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些元件的強度和特異性可能不同。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的適當轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導型啟動子。例如，當克隆于細菌系統(tǒng)中時，可以使用誘導型啟動子，如PBLUESCRIPT噬粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1質(zhì)粒(Gibco BRI，Gaithersburg，MD)等的雜合lacZ啟動子。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，通常優(yōu)選來自哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。如果必須產(chǎn)生含有多個拷貝的多肽編碼序列的細胞系，可以方便地使用含有適當選擇性標記、基于SV40或EBV的載體。
在細菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)表達的多肽的目的用途選擇許多表達載體。例如，當需要大量時，例如為了誘生抗體，可以使用指導易于純化的融合蛋白高水平表達的載體。這些載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達載體，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中編碼目的多肽的序列可以與β-半乳糖苷酶的氨基端Met的序列和隨后的7個殘基連接于載體中，產(chǎn)生雜種蛋白；pIN載體(van Heeke，G和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)；等等。也可以利用pGEX載體(Promega，Madison，Wis.)表達外源多肽，作為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。這些融合蛋白通常是可溶的，通過吸附于谷胱甘肽-瓊脂糖珠，隨后在谷胱甘肽存在下洗脫，易于從裂解的細胞中純化。這些系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可設(shè)計為包含肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切位點，以便能隨意從GST部分釋放克隆的目的多肽。
對于酵母，釀酒酵母，可以使用許多含有組成型或誘導型啟動子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的載體。綜述見Ausubel等人(見上文)和Grant等人(1987)Methods Enzymol.153516-544。
在使用植物表達載體時，編碼多肽的序列的表達可以由大量啟動子中的任一種驅(qū)動。例如，可以單獨使用病毒啟動子，如CaMV的35S和19S啟動子，或與TMV的ω前導序列組合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6307-311)?；蛘?，也可使用植物啟動子，如RUBISCO的小亞基或熱休克啟動子(Coruzzi，G.等人(1984)EMBO.J.31671-1680；Broglie，R.等人(1984)Science 224838-843；Winter，J.等人(1991)Results Probl.Cell Differ.1785-105)。這些構(gòu)建體能通過直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導的轉(zhuǎn)染導入植物細胞中。這些技術(shù)在大量綜述中有描述(參見，例如，Hobbs，S.或Murry，L.E.《McGraw Hill科學技術(shù)年鑒》(1992)McGraw Hill，紐約，N.Y.；191-196頁)。
也可以利用昆蟲系統(tǒng)表達目的多肽。例如，在這樣一種系統(tǒng)中，用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)作為載體在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞或夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達外源基因。編碼該多肽的序列可以克隆到病毒的非必需區(qū)，如多角體蛋白基因，并置于多角體蛋白啟動子控制下。多肽編碼序列的成功插入將使多角體蛋白基因失活，產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒。然后可用該重組蛋白感染如草地夜蛾細胞或夜蛾幼蟲，其中可以表達目的多肽(Engelhard，E.K.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.913224-3227)。
在哺乳動物宿主細胞中，通?？梢允褂枚喾N基于病毒的表達系統(tǒng)。例如，在使用腺病毒作為表達載體時，編碼目的多肽的序列可以連接到由晚期啟動子和三聯(lián)前導序列組成的腺病毒/轉(zhuǎn)錄翻譯復合物中。在非必需E1或E3區(qū)中插入病毒基因組可以用來獲得能在感染的宿主細胞中表達該多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，T.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659)。另外，也可利用轉(zhuǎn)錄增強子如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強子增強在哺乳動物宿主細胞中的表達。
也可用特異起始信號實現(xiàn)編碼目的多肽的序列的更有效翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。在編碼多肽的序列、其起始密碼子和上游序列插入適當表達載體中時，可不需要其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號。然而，在只插入編碼序列或其部分時，應(yīng)當使用外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子應(yīng)當在正確的閱讀框內(nèi)，以確保整個插入片段的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是不同來源的，包括自然的和合成的。含有適于所用特定細胞系統(tǒng)的增強子，如文獻中所述的增強子(Scharf，D.等人(1994)ResultsProbl.Cell Differ.20125-162)，可提高表達效率。
另外，也可以根據(jù)調(diào)節(jié)插入序列表達或以希望的方式加工表達蛋白的能力，選擇宿主細胞株。多肽的這類修飾包括但不限于乙?；?、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。也可以利用切割蛋白質(zhì)的“前原”形式的翻譯后加工促進正確的插入、折疊和/或功能?？梢赃x擇不同的宿主細胞，如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，它們具有翻譯后活性的特殊細胞機器和特有機制，來確保外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。
為了長期、高產(chǎn)量地生產(chǎn)重組蛋白，通常優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，可以用在相同或不同載體上含有病毒來源的復制起點和/或內(nèi)源表達元件和選擇性標記基因的表達載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達目的多核苷酸的細胞系。在載體導入后，細胞在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。選擇性標記的目的在于提供對選擇的抗性，它的存在允許培養(yǎng)和回收成功表達導入序列的細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細胞的抗性克隆可以用適于該細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖。
許多篩選系統(tǒng)可用來回收轉(zhuǎn)化的細胞系。包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Wowy，I.等人(1990)Cell 22817-23)基因，它們分別能在tk.sup-或aprt.sup.-細胞中使用。抗代謝物、抗生素或除草劑抗性也能用作選擇根據(jù)；例如，賦予氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；賦予氨基糖苷類、新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn).等人(1981)J.Mol.Biol.1501-4)；和分別賦予chlorsulfuron和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性的als或pat(Murry，同上文)。也描述了其它選擇性基因，例如trpB，它允許細胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它允許細胞利用組氨醇代替組氨酸(Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51)。應(yīng)用可見標記受到歡迎，如花色素苷、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS、螢光素酶及其底物螢光素，它們不僅廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化子，而且用于定量由特定載體系統(tǒng)引起的瞬時或穩(wěn)定蛋白質(zhì)表達的量(Rhodes，C.A.等人(1995)Methods Mol.Biol.55121-131)。
盡管標記基因表達的存在/不存在提示也存在目的基因，但是它的存在和表達可能需要證實。例如，如果在標記基因序列中插入編碼多肽的序列，能根據(jù)標記基因功能的缺乏鑒定含有這些序列的重組細胞。或者，標記基因也能與多肽編碼序列串聯(lián)置于一個啟動子控制下。由誘導或選擇引起的標記基因的表達通常也表明串聯(lián)基因的表達。
或者，含有并表達希望的多核苷酸序列的宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的多種方法鑒定。這些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質(zhì)生物測定或免疫測定技術(shù)，包括如基于膜、溶液或芯片的技術(shù)，用于核酸或蛋白質(zhì)的檢測和/或定量。
利用產(chǎn)物特異的多克隆或單克隆抗體檢測和測定多核苷酸編碼產(chǎn)物的多種方法在本領(lǐng)域周知。例子包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)和熒光激活細胞分選(FACS)。利用與特定多肽上兩個不干擾表位有反應(yīng)性的單克隆抗體、基于單克隆的雙向免疫測定法對于某些用途可能是優(yōu)選的，但是也可使用競爭結(jié)合測定。Hampton，R.等人(1990；《血清學方法，實驗室手冊》，APS出版社，St Paul.Minn.)和Maddox，D.E.等人(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)描述了這些及其它測定法。
許多標記和結(jié)合技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以在多種核酸和氨基酸測定中使用。為檢測多核苷酸相關(guān)序列產(chǎn)生標記的雜交或PCR探針的方法包括寡聚物標記、切口平移、末端標記或使用標記核苷酸的PCR擴增。或者，這些序列或其任一部分也可克隆到一個載體中，用于產(chǎn)生mRNA探針。這些載體在本領(lǐng)域周知，可商業(yè)獲得，并且可以用來通過加入適當RNA聚合酶(如T7、T3或SP6)和標記的核苷酸在體外合成RNA探針。這些方法可以用多種商品試劑盒進行?？梢詰?yīng)用的合適的報道分子或標記物包括放射性核素、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑或發(fā)色劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。
用目的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以在適于從細胞培養(yǎng)物中表達和回收蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)。根據(jù)序列和/或所用的載體，重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以分泌或包含于細胞內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，含有本發(fā)明的多核苷酸的表達載體可以設(shè)計為含有信號序列，該信號序列引導編碼的多肽通過原核或真核細胞膜分泌。其它重組構(gòu)建可用來將編碼目的多肽的序列與編碼有助于可溶性蛋白質(zhì)純化的多肽域的核苷酸序列連接。這些便于純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于金屬螯合肽，如允許在固定金屬上純化的組氨酸-色氨酸分子，允許在固定免疫球蛋白上純化的蛋白A域，在FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)中使用的域。在純化域與編碼的多肽之間含有可切割的連接序列(如因子XA或腸激酶(Invitrogen.San Diego，Calif.)特異序列)有利于純化。一種這樣的表達載體用于表達含有目的多肽和在硫氧還蛋白或腸激酶酶切位點之前編碼6組氨酸殘基的核酸的融合蛋白。組氨酸殘基有利于在如Porath，J.等人(1992，Prot.Exp.Purif.3263-281)所述的IMIAC(固定金屬離子親和層析)上純化，而腸激酶酶切位點提供了從融合蛋白中純化希望的多肽的方法。Kroll，D.J.等人(1993；DNA Cell Biol.12441-453)討論了含有融合蛋白的載體。
除了重組生產(chǎn)方法外，還可以利用固相技術(shù)通過直接肽合成產(chǎn)生本發(fā)明的多肽及其片段(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。蛋白質(zhì)合成可以利用手工技術(shù)或自動進行。自動合成可以用例如Applied Biosystems 431A肽合成儀(Perkin Elmer)實現(xiàn)。此外，也可以利用化學法分別化學合成不同片段，然后組合，產(chǎn)生全長的分子。
抗體組合物、其片段及其它結(jié)合劑根據(jù)另一方面，本發(fā)明還提供結(jié)合劑，如抗體及其抗原結(jié)合片段，它們顯示與此處公開的腫瘤多肽或與其部分、變體或衍生物免疫學結(jié)合。如果一種抗體或其抗原結(jié)合片段與本發(fā)明的多肽以可檢測的水平反應(yīng)(例如在ELISA測定中)，而在類似條件下不與無關(guān)多肽可檢測地反應(yīng)，則稱其可與該多肽“特異結(jié)合”、“免疫學結(jié)合”和/或是“免疫反應(yīng)性的”。
在此使用時，免疫結(jié)合通常是指在免疫球蛋白分子與免疫球蛋白特異的抗原之間發(fā)生的非共價作用。免疫結(jié)合作用的強度和親和力能用相互作用的解離常數(shù)(Kd)表示，其中較小的Kd表示較大的親和力。選擇的多肽的免疫結(jié)合性質(zhì)能用本領(lǐng)域周知的方法定量。一種這樣的方法需要測定抗原結(jié)合位點/抗原復合物形成和解離的速率，其中這些速率取決于復合物配偶體的濃度、相互作用的親和力和在兩個方向同樣影響該速率的幾何參數(shù)(geometric parameters)。因此，通過計算濃度及結(jié)合和解離的實際速率能確定“形成速率常數(shù)(on rateconstant)”(Kon)“解離速率常數(shù)(off rate constant)”(Koff)。Koff/Kon之比能消除與親和力無關(guān)的所有參數(shù)，因而等同于解離常數(shù)Kd。參見Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59439-473。
抗體的“抗原結(jié)合位點”或“結(jié)合部分”是指免疫球蛋白分子參與抗原結(jié)合的部分?？乖Y(jié)合位點由重鏈( “H”)和輕鏈(“L”)N端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成。重鏈和輕鏈V區(qū)內(nèi)的三個非常趨異的區(qū)段被稱為“超變區(qū)”，它們分散于被稱為“構(gòu)架區(qū)”或“FR”的多個保守側(cè)翼區(qū)段之間。因此術(shù)語“FR”是指在免疫球蛋白超變區(qū)之間和與之相鄰處自然發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個超變區(qū)和重鏈的三個超變區(qū)在三維空間上彼此相對排列，形成一個抗原結(jié)合表面。該抗原結(jié)合表面互補于結(jié)合抗原的三維表面，每個重鏈和輕鏈的三個超變區(qū)被稱為“互補決定區(qū)”或“CDR”。
利用此處所述的典型測定法，結(jié)合劑還能區(qū)分患有或未患癌癥(如乳腺癌)的患者。例如，可與腫瘤蛋白結(jié)合的抗體或其它結(jié)合劑優(yōu)選地在至少約20％的疾病患者中，更優(yōu)選地在至少約30％的患者中產(chǎn)生表明存在癌癥的信號?；蛘撸虼送?，該抗體將在至少約90％的無癌癥個體中產(chǎn)生表明未患病的陰性信號。為了確定一種結(jié)合劑是否滿足這一要求，可以如此處所述測定患有或未患癌癥的患者(用標準臨床試驗確定)的生物樣品(例如血液、血清、痰、尿和/或腫瘤活檢)中是否存在能與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽。優(yōu)選地，應(yīng)當測定統(tǒng)計學顯著數(shù)量的患有或未患疾病的樣品。每種結(jié)合劑都應(yīng)滿足以上標準；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當認識到，為了提高靈敏度，可組合使用結(jié)合劑。
滿足以上要求的任何試劑都可以是結(jié)合劑。例如，結(jié)合劑可以是含或不含肽成分的核糖體，RNA分子或多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段?？贵w可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的多種技術(shù)制備。參見，例如，Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，1988。通常能用細胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生抗體，包括此處所述的單克隆抗體的產(chǎn)生方法，或通過抗體基因轉(zhuǎn)染合適的細菌和哺乳動物細胞宿主，產(chǎn)生重組抗體。在一種技術(shù)中，首先用含多肽的免疫原注射任一種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔、綿羊或山羊)中。在該步驟中，本發(fā)明的多肽可不加修飾作為免疫原?；蛘撸貏e是對于相對較短的多肽，如果多肽與一種載體蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔血藍蛋白)連接，可引發(fā)較強的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地按照包括一次或多次加強免疫的預定方案，對動物宿主注射免疫原，并且定期對動物采血。然后利用與適當固體載體偶聯(lián)的多肽，通過親和層析法，從這些抗血清中純化該多肽特異的多克隆抗體。
目的抗原性多肽特異的單克隆抗體可用Kohler和Milstein，Eur，J.Immunol.6511-519，1976的技術(shù)及其改進方法制備。簡言之，這些方法包括制備能產(chǎn)生具有希望特異性(即與目的多肽的反應(yīng)性)的抗體的無限增殖化細胞系。例如，可以用從如上所述免疫的動物中獲得的脾細胞產(chǎn)生這些細胞系。然后通過例如與骨髓瘤細胞融合配偶體融合，優(yōu)選地與免疫動物同源的骨髓瘤細胞融合配偶體融合，使脾細胞無限增殖化?？梢允褂枚喾N融合技術(shù)。例如，脾細胞和骨髓瘤細胞可以與非離子型去污劑結(jié)合幾分鐘，然后以低密度接種于支持雜種細胞生長但不支持骨髓瘤細胞生長的選擇性培養(yǎng)基中。一種優(yōu)選的篩選技術(shù)使用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)篩選。經(jīng)足夠的時間后，通常1至2周，觀察到雜種集落。選擇單集落，檢測其培養(yǎng)上清液對多肽的結(jié)合活性。優(yōu)選具有高反應(yīng)性和特異性的雜交瘤。
可從生長的雜交瘤集落的上清液中分離單克隆抗體。另外，也可以利用多種技術(shù)提高產(chǎn)量，如向合適的脊椎動物宿主(如小鼠)的腹膜腔中注射雜交瘤細胞系。然后從腹水或血液中收集單克隆抗體?？梢岳贸Ｒ?guī)技術(shù)，如層析、凝膠過濾、沉淀和抽提，從抗體中除去雜質(zhì)。本發(fā)明的多肽可在純化方法(如親和層析步驟)中使用。
許多治療上有用的分子在本領(lǐng)域已知，它們含有能顯示抗體分子的免疫結(jié)合性質(zhì)的抗原結(jié)合位點。蛋白水解酶木瓜蛋白酶優(yōu)先切割I(lǐng)gG分子，產(chǎn)生幾個片段，其中兩個(“F(ab)”片段)均含有一個含有完整抗原結(jié)合位點的共價異二聚體。胃蛋白酶能切割I(lǐng)gG分子，產(chǎn)生幾個片段，包括含有兩個抗原結(jié)合位點的“F(ab’)2”片段。“Fv”片段能通過優(yōu)先蛋白切割I(lǐng)gM、在極少數(shù)情況中切割I(lǐng)gG或IgA免疫球蛋白分子產(chǎn)生。然而，F(xiàn)v片段更常見地是利用本領(lǐng)域周知的重組技術(shù)產(chǎn)生。Fv片段包含非共價VH:VL異二聚體，它含有一個抗原結(jié)合位點，后者保留原始抗體分子的許多抗原識別和結(jié)合能力。Inbar等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692659-2662；Hochman等人(1976)Biochem 152706-2710；Ehrlich等人(1980)Biochem194091-4096。
單鏈Fv(“sFv”)多肽是一種共價連接的VH∷VL異二聚體，它從包括通過編碼肽的接頭連接起來的VH編碼基因和VL編碼基因的基因融合物表達而來。Huster等Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16)5879-5883。已經(jīng)描述了許多方法鑒別化學結(jié)構(gòu)用于將天然聚集但化學上分離的輕和重多肽鏈從抗體V區(qū)轉(zhuǎn)化成將折疊為基本上類似于抗原結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)的sFv分子。參見美國專利5,091,513和5,132,405，Huston等；和美國專利4,946,778，Ladner等。
上述每一種分子都含有重鏈和輕鏈CDR組，后者分別插入重鏈與輕鏈FR組之間，F(xiàn)R組提供對CDRS的支持，并確定CDR相對于彼此的空間聯(lián)系。在此使用時，術(shù)語“CDR組”是指重鏈或輕鏈V區(qū)的三個超變區(qū)。這些區(qū)域從重鏈或輕鏈的N端起，分別被稱為“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原結(jié)合位點包含6個CDR，含有來自每個重鏈和輕鏈V區(qū)的CDR組。含有一個CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在此被稱為“分子識別單位”。對大量抗原-抗體復合物的結(jié)晶分析證明，CDR的氨基酸殘基形成與結(jié)合抗原的廣泛接觸，其中最廣泛的抗原接觸是與重鏈CDR3。因此，分子識別單位主要負責抗原結(jié)合位點的特異性。
在此使用時，術(shù)語“FR組”是指4種側(cè)翼氨基酸序列，它們構(gòu)成重鏈或輕鏈V區(qū)的CDR組CDR的框架。某些FR殘基可接觸結(jié)合抗原；然而，F(xiàn)R主要負責將V區(qū)折疊為抗原結(jié)合位點，特別是直接與CDRS相鄰的FR殘基。在FR內(nèi)，某些氨基酸殘基和某些結(jié)構(gòu)特征非常保守。在這點上，所有V區(qū)序列都含有一個約90個氨基酸殘基的內(nèi)部二硫環(huán)。當V區(qū)折疊為結(jié)合位點時，CDR表現(xiàn)為凸出的環(huán)形基序，形成抗原結(jié)合表面。一般認為存在保守的FR結(jié)構(gòu)區(qū)，它們影響CDR環(huán)折疊為某些“典型”結(jié)構(gòu)，而無論精確的CDR氨基酸序列如何。另外，已知某些FR殘基參與非共價域間接觸，這穩(wěn)定了抗體重鏈和輕鏈的相互作用。
已經(jīng)描述了含有來自非人類免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的大量“人源化”抗體分子，包括嵌合抗體，其含有與人類恒定域融合的嚙齒動物V區(qū)和相關(guān)CDR(Winter等人(1991)Nature 349293-299；Lobuglio等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864220-4224；Shaw等人(1987)J Immunol.1384534-4538；Brown等人(1987)Cancer Res.473577-3583)，在與適當人類抗體恒定域融合之前嫁接到人支持FR中的嚙齒動物CDR(Riechmann等人(1988)Nature332323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 2391534-1536；Jones等人(1986)Nature 321522-525)和重組鑲飾嚙齒動物FR支持的嚙齒動物CDR(1992年12月23日公布的歐洲專利申請?zhí)?19,596)。這些“人源化”分子設(shè)計為使對嚙齒動物抗人抗體分子的不希望的免疫應(yīng)答降至最低，這種應(yīng)答限制這些部分在人類受體中的治療用途的持續(xù)時間和有效性。
在此使用時，術(shù)語“鑲飾FR(veneered FRs)”和“重組鑲飾FR”是指將例如嚙齒動物重鏈或輕鏈V區(qū)的FR殘基選擇性置換為人類FR，以期產(chǎn)生含有抗原結(jié)合位點、基本上保留全部天然FR多肽折疊結(jié)構(gòu)的異種分子。鑲飾(veneering)技術(shù)基于這一認識抗原結(jié)合位點的配體結(jié)合特征主要由抗原結(jié)合表面內(nèi)重鏈和輕鏈CDR組的結(jié)構(gòu)和相對位置決定。Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59439-473。因此，抗原結(jié)合特異性只能在如下情況下保持在人源化抗體中，其中謹慎保留CDR結(jié)構(gòu)、它們彼此之間的相互作用和與其余V區(qū)結(jié)構(gòu)域的相互作用。利用鑲飾技術(shù)將免疫系統(tǒng)容易遇到的外部(例如溶劑可達的)FR殘基選擇性替換為人類殘基，產(chǎn)生含有弱免疫原性或基本上無免疫原性的鑲飾表面的雜種分子。
鑲飾方法利用可獲得的人類抗體可變域的序列數(shù)據(jù)庫(Kabat等人匯編，《具有免疫學意義的蛋白質(zhì)的序列》第4版(美國衛(wèi)生與人類部，美國政府印刷所，1987))，Kabat數(shù)據(jù)庫的更新版和其它可獲得的美國和國外數(shù)據(jù)庫(核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)。V區(qū)氨基酸的溶劑可及性能由人和鼠抗體片段的已知三維結(jié)構(gòu)推斷。鑲飾鼠抗原結(jié)合位點一般包括兩個步驟。首先，將目的抗體分子可變域的FR與由上述來源獲得的人可變域的相應(yīng)FR序列相比較。然后將同源性最大的人類V區(qū)與相應(yīng)的鼠氨基酸逐個殘基地比較。利用本領(lǐng)域周知的重組技術(shù)將鼠FR中不同于人類相應(yīng)殘基的殘基替換為人類部分中存在的殘基。只對至少部分暴露(溶劑可及)的部分進行殘基變換，在替換對V區(qū)結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)可能有明顯影響的氨基酸殘基(如脯氨酸、甘氨酸和帶電氨基酸)時加以注意。
這樣，產(chǎn)生的“鑲飾”鼠抗原結(jié)合位點保留鼠CDR殘基，與CDR基本相鄰的殘基，確定為掩蓋或大部分掩蓋(溶劑不可及)的殘基，認為參與重鏈與輕鏈域非共價(例如靜電和疏水)接觸的殘基，被認為影響CDR環(huán)“典型”三級結(jié)構(gòu)的FR保守結(jié)構(gòu)區(qū)的殘基。這些設(shè)計標準用來制備重組核苷酸序列，將鼠抗原結(jié)合位點的重鏈和輕鏈的CDR組合到類似人類的FR中，它能用來轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，用于表達顯示鼠抗體分子的抗原特異性的重組人類抗體。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體可與一種或多種治療劑偶聯(lián)。就此而言，合適的治療劑包括放射性核素、分化誘導劑、藥物、毒素及其衍生物。優(yōu)選的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。優(yōu)選的藥物包括氨甲喋呤和嘧啶和嘌呤類似物。優(yōu)選的分化誘導劑包括佛波醇酯和丁酸。優(yōu)選的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、假單胞菌內(nèi)毒素、志賀菌毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
治療劑可與合適的單克隆抗體直接或間接(例如通過連接基團)偶聯(lián)(例如共價鍵合)。當治療劑和抗體均含有能彼此反應(yīng)的取代基時，它們的直接反應(yīng)是可能的。例如，一個上的親核基團，如氨基或巰基，能與另一個上的含羰基基團(如酐或?；u)，或含有容易離去的基團(如鹵化物)的烷基反應(yīng)。
或者，可能希望通過連接基團偶聯(lián)治療劑與抗體。連接基團能作為間隔區(qū)使抗體遠離治療劑，以避免對結(jié)合能力的干擾。連接基團也能用來提高治療劑或抗體上取代基的化學反應(yīng)性，從而提高偶聯(lián)效率?；瘜W反應(yīng)性的提高也可促進治療劑或治療劑官能團的應(yīng)用，這種應(yīng)用本來是不可能的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，許多相同及不同功能的雙功能或多功能試劑(如Pirece Chemical Co.，Rockford，IL目錄所述)可用作連接基團。例如，通過氨基、羧基、巰基或氧化的碳水化合物殘基可實現(xiàn)偶聯(lián)。有大量參考文獻描述了這些方法，如授予Rodwell等人的美國專利號4,671,958。
當不含本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物的抗體部分時，治療劑更加有效，此時可能希望使用一種在細胞內(nèi)化期間或之后能被切割的連接基團。曾經(jīng)描述了大量不同的可切割連接基團。從這些連接基團胞內(nèi)釋放治療劑的機制包括通過二硫鍵還原(例如，授予Spitler的美國專利號4,489,710)、通過照射光不穩(wěn)定鍵(例如，授予Senter等人的美國專利號4,625,014)、通過衍生的氨基酸側(cè)鏈的水解(例如，授予Kohn等人的美國專利號4,638,045)、通過血清補體介導的水解(例如，授予Rodwell等人的美國專利號4,671,958)和酸催化的水解(參見，授予Blattler等人的美國專利號4,569,789)切割。
將一種以上的試劑與一種抗體偶聯(lián)可能是希望的。在一個實施方案中，一種試劑的多個分子與一個抗體分子偶聯(lián)。在另一個實施方案中，一種以上的試劑與一個抗體偶聯(lián)。無論特定實施方案如何，可用多種方法制備含一個以上試劑的免疫偶聯(lián)物。例如，一個以上的試劑可直接與抗體分子偶聯(lián)，或者能使用提供多個連接位點的接頭?；蛘?，也能使用載體。
載體可能以多種方式攜帶試劑，包括直接或通過連接基團共價鍵合。合適的載體包括蛋白質(zhì)如白蛋白(例如，授予Kato等人的美國專利號4,507,234)、肽和多糖如氨基葡聚糖(例如，授予Shih等人的美國專利號4,699,784)。載體也可通過非共價結(jié)合或通過包封于如脂質(zhì)體囊中攜帶試劑(例如，美國專利號4,429,008和4,873,088)。放射性核素試劑特異的載體包括放射性鹵化小分子和螯合化合物。例如，美國專利號4,735,792公開了代表性的放射性鹵化小分子及其合成。放射性核素螯合物可由螯合化合物形成，包括含有氮及硫原子作為供體原子的螯合化合物，用于結(jié)合金屬或金屬氧化物、放射性核素。例如，授予Davison等人的美國專利號4,673,562公開了代表性螯合化合物及其合成。
T細胞組合物另一方面，本發(fā)明提供對于此處公開的Her-2/neu多肽或其變體或衍生物特異的T細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，該T細胞對SEQ IDNO3所示Her-2/neu肽具有特異性。這些細胞一般可用標準方法在體外或離體制備。例如，可用購得的細胞分離系統(tǒng)，如可購自NexellTherapeutics，Inc.的IsolexTM系統(tǒng)(Irvine，CA；參見美國專利號5,240,856；美國專利號5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO92/07243)，從患者的骨髓、外周血或骨髓或外周血級分中分離T細胞?；蛘?，也可由有關(guān)和無關(guān)的人、非人類哺乳動物、細胞系或培養(yǎng)物產(chǎn)生T細胞。
可以用多肽、編碼多肽的多核苷酸和/或表達這種多肽的抗原呈遞細胞(APC)刺激T細胞。這種刺激在足以產(chǎn)生目的多肽特異的T細胞的條件下和時間內(nèi)進行。優(yōu)選地，本發(fā)明的腫瘤多肽或多核苷酸存在于輸送載體(如小球體)中，以促進特異性T細胞的產(chǎn)生。
如果T細胞特異增殖、分泌細胞因子或殺傷由多肽包被的或表達編碼該多肽的基因的靶細胞，則認為這種T細胞對于本發(fā)明的多肽是特異的。T細胞特異性可以用多種標準技術(shù)評價。例如，在鉻釋放測定或增殖測定中，裂解和/或增殖比陰性對照提高兩倍以上的刺激指數(shù)表明T細胞特異性。這些測定可如Chen等人，Cancer Res.541065-1070，1994所述進行。或者，對T細胞增殖的檢測也可利用多種已知技術(shù)進行。例如，通過測定DNA合成率的提高(例如，通過用氚化胸苷脈沖標記T細胞培養(yǎng)物，并測定摻入DNA中的氚化胸苷的量)，能檢測T細胞的增殖。與腫瘤多肽(100ng/ml-100μg/ml，優(yōu)選地200ng/ml-25μg/ml)接觸3-7天一般將導致T細胞增殖至少提高2倍。如上所述接觸2-3小時將導致T細胞激活，如用標準細胞因子測定所測，其中細胞因子釋放(例如TNF或IFN-γ)水平提高2倍表明T細胞激活(參見Coligan等人，《現(xiàn)代免疫學方法》，第一卷，Wiley Interscience(Greene 1998))。由腫瘤多肽、多核苷酸或表達多肽的APC激活的T細胞可以是CD4+和/或CD8+。腫瘤多肽特異的T細胞可用標準技術(shù)擴增。在優(yōu)選實施方案中，T細胞來自患者、有關(guān)或無關(guān)供體，在刺激和擴增后對患者施用。
為了治療目的，響應(yīng)腫瘤多肽、多核苷酸或APC增殖的CD4+或CD8+T細胞能在體外或體內(nèi)大量擴增。這些T細胞的體外增殖可用多種方法實現(xiàn)。例如，可使T細胞重復暴露于腫瘤多肽，或?qū)?yīng)于這種多肽免疫原性部分的短肽，可加入或不加T細胞生長因子，如白介素-2，和/或可合成腫瘤多肽的刺激細胞。或者，也能通過克隆大量擴增在腫瘤多肽存在下增殖的一種或多種T細胞?？寺〖毎姆椒ㄔ诒绢I(lǐng)域眾所周知，包括有限稀釋法。
T細胞受體組合物T細胞受體(TCR)由2個不同的高變多肽鏈(稱為T細胞受體α和β鏈)組成，這兩條鏈通過二硫鍵連接(Janeway，Travers，Walport，Immunobiology，第4版，148-159，Elsevier Science Ltd/GarlandPublishing，1999)。此α/β異二聚體與細胞膜上的恒定CD3鏈復合。該復合物識別與MHC分子結(jié)合的特異抗原肽。TCR特異性的巨大多樣性與免疫球蛋白的多樣性極為相似，均是由體細胞基因重排造成的。β鏈基因含有50多個可變(V)區(qū)段、2個多樣性(D)區(qū)段、10多個連接(J)區(qū)段和2個恒定區(qū)區(qū)段(C)。α鏈基因含有70多個V區(qū)段和60多個J區(qū)段以及一個C區(qū)段，但沒有D區(qū)段。當T細胞在胸腺中發(fā)育時，β鏈的D和J基因發(fā)生重排，之后V基因區(qū)段和DJ之間發(fā)生重排。這種功能性的VDJβ外顯子在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)剪切與Cβ連接。對于α鏈，Vα基因區(qū)段和Jα基因區(qū)段重排形成功能性外顯子，然后該外顯子轉(zhuǎn)錄并與Cα拼接。在重組過程中，P和N核苷酸在β鏈的V、D和J區(qū)段之間和α鏈的V和J區(qū)段之間的隨機添加使得多樣性進一步增加(Janeway，Travers，Walport，Immunobiology，第4版，98和150，ElsevierScience Ltd/Garland Publishing，1999)。
另一方面，本發(fā)明提供對此處公開的Her-2/Neu多肽、或其變體或衍生物具有特異性的TCR。具體地，本發(fā)明提供確定給定TCR的特異性的VJ或VDJ連接序列的核酸和氨基酸序列。例如，可以從對Her-2/Neu多肽具有特異性的T細胞中使用標準分子生物學和重組DNA技術(shù)分離對Her-2/Neu肽有特異性的TCR的編碼cDNA。
本發(fā)明還提供適宜的哺乳動物宿主細胞，例如非特異性T細胞，該宿主細胞已用對此處描述的Her-2/Neu多肽具有特異性的TCR的編碼多核苷酸轉(zhuǎn)染，由此使該宿主細胞對Her-2/Neu多肽具有特異性。TCR的α和β鏈可以包含在不同的表達載體上，或者作為可選擇方案包含在一個表達載體上，而該表達載體還含有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)從而使得IRES下游的基因可以發(fā)生帽子不依賴性翻譯?？梢允褂帽磉_Her-2/Neu多肽特異性TCR的所述宿主細胞進行Her-2/Neu相關(guān)惡性腫瘤的過繼免疫治療，見以下詳細討論。
在本發(fā)明的其它方面，可以在診斷Her-2/Neu相關(guān)癌癥的試劑盒中使用此處所述對Her-2/Neu多肽具有特異性的克隆化TCR。例如，可以將Her-2/Neu相關(guān)腫瘤特異性TCR的核酸序列或其部分用作探針或引物以檢測生物樣品中編碼該特異TCR的重排基因的表達。因此，本發(fā)明還提供用于檢測編碼Her-2/Neu多肽特異性TCR的信使RNA或DNA的測試方法。
藥物組合物在其它實施方案中，本發(fā)明涉及此處公開的一種或多種多核苷酸、多肽、T細胞和/或抗體組合物在藥學可接受的載體中的制劑，用于單獨或與一種或多種其它治療形式組合對細胞或動物施用。
應(yīng)當理解，希望時，此處公開的組合物也可以與其它試劑(如其它蛋白質(zhì)或多肽或不同的藥學活性劑)組合施用。實際上，假定其它試劑在接觸靶細胞或宿主組織后不引起明顯的負面影響，則對可能包含的其它成分沒有限制。因此在特定情況需要時，這些組合物可與其它不同的試劑一起施用。這些組合物可從宿主細胞或其它生物來源純化，或者也可如此處所述化學合成。這些組合物也可能進一步包括取代的或衍生的RNA或DNA組合物。
因此，本發(fā)明另一方面提供藥物組合物，其含有一種或多種此處所述的多核苷酸、多肽、抗體和/或T細胞組合物，以及生理學可接受的載體。在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的免疫原性多核苷酸和/或多肽組合物，用于預防和治療疫苗用途。疫苗的制備如M.F.Powell和M.J.Newman編著的《疫苗設(shè)計(亞基和佐劑方法)》，Plenum出版社(NY，1995)所概述。這些組合物通常含有一種或多種本發(fā)明的免疫原性多核苷酸和/或多肽組合物以及一種或多種免疫刺激劑。
顯然此處所述的任何藥物組合物可含有本發(fā)明的多核苷酸和多肽的藥學可接受的鹽。這些鹽能由藥學可接受的無毒堿制備，包括有機堿(例如伯胺、腫胺和叔胺和堿性氨基酸的鹽)和無機堿(例如鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的示例性免疫原性組合物(如疫苗組合物)含有編碼一種或多種上述多肽的DNA，使得多肽原位產(chǎn)生。如上所述，該多核苷酸可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任一種輸送系統(tǒng)內(nèi)施用。的確，大量基因輸送技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知，如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15143-198，1998和此處引用的參考文獻所述。合適的多核苷酸表達系統(tǒng)當然含有在患者中表達所必需的DNA調(diào)節(jié)序列(如合適的啟動子和終止信號)?；蛘?，細菌輸送系統(tǒng)還包括施用在細胞表面表達多肽免疫原性部分或分泌這種表位的細菌(如卡介苗)。
因此，在某些實施方案中，利用周知的多種基于病毒的系統(tǒng)之一，將編碼此處所述免疫原性多肽的多核苷酸導入適當哺乳動物宿主細胞中表達。在一個說明性實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了一種方便、有效的基因輸送系統(tǒng)平臺。能利用本領(lǐng)域周知的技術(shù)將選擇的編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列插入載體并包裝于逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后能分離重組病毒并對患者施用。曾經(jīng)描述了大量說明性逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(例如美國專利號5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy15-14；Scarpa等人(1991)Virology 180849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908033-8037；Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109)。
另外也描述了許多基于腺病毒的示例性系統(tǒng)。與整合到宿主基因組中的逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，腺病毒存在于染色體外，從而使得與插入誘變有關(guān)的危險最小(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等人(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等人(1994)Human Gene Therapy 5717-729；Seth等人(1993)J.Virol.68933-940；Barr等人(1994)Gene Therapy 151-58；Berkner，K.L.(1998)BioTechniques 6616-629；Rich等人(1993)Human GeneTherapy 4461-476)。
也發(fā)展了用于多核苷酸輸送的多種腺伴隨病毒(AAV)載體系統(tǒng)。AAV載體能用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)容易地構(gòu)建。參見，例如，美國專利號5,173,414和5,139,941；國際公開號WO 92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines 90(冷泉港實驗室出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1165-169；Zhou等人(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
可用于通過基因轉(zhuǎn)移輸送編碼本說明的多肽的多核苷酸的其它病毒載體包括來自痘病毒科的載體，如痘苗病毒和禽痘病毒。例如，表達新分子的痘苗病毒重組體能如下構(gòu)建。首先將編碼多肽的DNA插入適當載體中，使它與痘苗啟動子和側(cè)翼痘苗DNA序列(如編碼胸苷激酶(TK)的序列)相鄰。然后用該載體轉(zhuǎn)染同時用痘苗病毒感染的細胞。利用同源重組向病毒基因組中插入痘苗啟動子加編碼目的多肽的基因。通過在5-溴脫氧尿苷存在下培養(yǎng)細胞并挑取對它有抗性的病毒噬斑，篩選產(chǎn)生的TK.sup.(-)重組體。
以痘苗病毒為基礎(chǔ)的感染/轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能方便地用于引起此處所述的一種或多種多肽在生物宿主細胞中誘導型、瞬時表達或共表達。在這種特定系統(tǒng)中，首先用編碼噬菌體T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重組體體外感染細胞。該聚合酶顯示強烈的特異性，因為它只轉(zhuǎn)錄含有T7啟動子的模板。在感染后，用T7啟動子驅(qū)動的目的多核苷酸轉(zhuǎn)染細胞。痘苗病毒重組體在細胞質(zhì)中表達的聚合酶把轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，然后由宿主翻譯機器翻譯為多肽。該方法導致大量RNA及其翻譯產(chǎn)物的高水平、瞬時、細胞質(zhì)的產(chǎn)生。參見，例如，Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)876743-6747；Fuerst等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)838122-8126。
或者，也能利用禽痘病毒(如雞痘和金絲雀痘病毒)輸送目的編碼序列。已知表達哺乳動物病原體的免疫原的重組禽痘病毒在對非禽類物種施用時可引起保護性免疫。在人和其它哺乳動物種中使用禽痘病毒載體是特別希望的，因為禽痘病毒屬的成員只能在易感禽類種中生產(chǎn)性復制，因此不感染哺乳動物細胞。產(chǎn)生重組禽痘病毒的方法在本領(lǐng)域周知，使用遺傳重組，如上文對于痘苗病毒的產(chǎn)生所述。參見，例如，WO 91/12882；WO 89/03429；WO 92/03545。
許多甲病毒也能用于輸送本發(fā)明的多核苷酸組合物，如美國專利號5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694所述的載體。也能使用某些基于委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)的載體，其示例性例子見美國專利號5,505,947和5,643,576。
此外，分子偶聯(lián)載體，如Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)2686866-6869和Wanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)896099-6103所述的腺病毒嵌合載體也能用于本發(fā)明的基因輸送。
關(guān)于這些和其它基于病毒的已知輸送系統(tǒng)的其它說明性信息可見于，例如Fisher-Hoch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86317-321，1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.56986-103，1989；Flexner等人，Vaccine 817-21，1990；美國專利號4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美國專利號4,777,127；GB2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，Biotechniques6616-627，1988；Rosenfeld等人，Science 252431-434，1991；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219，1994；Kass-Eisler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011498-11502，1993；Guzman等人，Circulation 882838-2848，1993；Guzman等人，Cir.Res.731202-1207，1993。
在某些實施方案中，多核苷酸可以整合到靶細胞的基因組中。這種整合可以以特定位置和方向經(jīng)同源重組(基因置換)，或者可以非特定位置地隨機整合(基因擴增)。在其它實施方案中，多核苷酸在細胞中可穩(wěn)定保持為分開的附加型DNA片段。這些多核苷酸片段或“附加體”編碼足以不依賴于宿主細胞周期或與之同步保持和復制的序列。向細胞輸送表達構(gòu)建體的方式和細胞中該多核苷酸保持的位置取決于所使用的表達構(gòu)建體的類型。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，如Ulmer等人，Science2591745-1749，1993所述，和Cohen，Science 2591691-1692，1993所綜述，多核苷酸也可以作為“裸露的”DNA施用/輸送。將DNA包被于可生物降解的珠上可提高裸露DNA的攝取，這種珠能被有效地輸送到細胞內(nèi)。
在另一實施方案中，本發(fā)明的組合物能通過粒子轟擊法輸送，其中許多已經(jīng)描述。在一個說明性實例中，能用如PowderjectPharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison，WI)制造的裝置實現(xiàn)氣體驅(qū)動的粒子加速，美國專利號5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；歐洲專利號0500799描述了其中一些實例。該方法提出一種無針輸送法，其中用手持式裝置產(chǎn)生的氦氣氣流將顯微顆粒(如多核苷酸或多肽顆粒)的干粉制劑加速到高速，推動顆粒進入靶組織。
在有關(guān)實施方案中，可用于氣體驅(qū)動無針注射本發(fā)明的組合物的其它裝置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)所提供的，美國專利號4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中描述了其中一些實例。
根據(jù)另一個實施方案，此處所述的藥物組合物除本發(fā)明的免疫原性多核苷酸、多肽、抗體、T細胞和/或APC組合物外還含有一種或多種免疫刺激劑。免疫刺激劑是指增強或加強對外源抗原的免疫應(yīng)答(抗體和/或細胞介導的)的基本上所有的物質(zhì)。一種優(yōu)選的免疫刺激劑包含佐劑。許多佐劑含有用來保護抗原免于快速分解代謝的物質(zhì)，如氫氧化鋁或礦物油，和免疫應(yīng)答的刺激物，如脂質(zhì)A、Bortadellapertussis或結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)來源的蛋白質(zhì)。某些佐劑可以購得，如弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories，Dtroit，MI)；Merck佐劑65(Merck Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；鋁鹽，如氫氧化鋁膠體(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；?；野彼岬牟豢扇軕乙?；?；?；陽離子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的小球體；單磷酰脂類A和quil A。細胞因子如GM-CSF、白介素-2、-7或-12和其它類似生長因子也可用作佐劑。
在本發(fā)明的某些實施方案中，佐劑組合物優(yōu)選地誘導以Th1型為主的免疫應(yīng)答。高水平的Th1型細胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)傾向于利于誘導針對施用抗原的細胞介導的免疫應(yīng)答。相反，高水平的Th2型細胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)傾向于誘導體液免疫應(yīng)答。在施用此處所述的疫苗后，患者將支持包括Th1型和Th2型應(yīng)答的免疫應(yīng)答。在一個優(yōu)選實施方案中，其中應(yīng)答主要是Th1型，Th1型細胞因子的水平將增加到比Th2型細胞因子水平更高的程度。這些細胞因子的水平可用標準測定法評價。關(guān)于細胞因子家族的綜述參見Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7145-173，1989。
用于引發(fā)以Th1型為主的應(yīng)答的某些優(yōu)選佐劑包括，例如，單磷酰脂類A(優(yōu)選地3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ怉)與鋁鹽的組合。MPL佐劑可從Corixa公司(Seattle，WA)獲得(參見，例如，美國專利號4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也誘導以Th1為主的應(yīng)答。這些寡核苷酸眾所周知，例如在WO 96/02555、WO 99/33488和美國專利號6,008,200和5,856,462中描述。例如，Sato等人，Science 273352，1996也描述了免疫刺激性DNA序列。另一種優(yōu)選佐劑含有皂角苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila BiopharmaceuticalsInc.，F(xiàn)ramingham，MA)、七葉皂苷、毛地黃皂苷或Gypsophila或Chenopodium quinoa皂角苷。其它優(yōu)選的制劑包括在本發(fā)明的佐劑組合中的一種以上的皂角苷，例如QS21、QS7、Quil A、β-七葉皂苷或毛地黃皂苷中的至少兩種的組合。
或者，皂角苷制劑也可與疫苗載體組合，這些載體包含殼聚糖或其它聚陽離子聚合物、聚交酯和聚交酯-共-乙交酯顆粒、基于聚-N-乙酰葡糖胺的聚合基質(zhì)、由多糖或化學修飾的多糖組成的顆粒、基于脂質(zhì)體和脂類的顆粒、由甘油單酯組成的顆粒等。皂角苷也可在膽固醇存在下配制，以形成顆粒結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體或ISCOM。此外，皂角苷也可與聚氧乙烯醚或酯在非顆粒溶液或懸液中配制，或為顆粒結(jié)構(gòu)如少層(paucilamelar)脂質(zhì)體或ISCOM。皂角苷也可與賦形劑(如CarbopolR)配制以提高粘度，或者可以以干粉形式與粉末賦形劑(如乳糖)配制。
在一個優(yōu)選實施方案中，佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂類A和皂角苷衍生物的組合，如QS21和3D-MPL佐劑的組合，如WO 96/00153所述，或用膽固醇滅活QS21的低反應(yīng)性組合物，如WO 96/33739所述。其它優(yōu)選制劑含有水包油乳劑和生育酚。在WO 95/17210中描述了在水包油乳劑中應(yīng)用QS21、3D-MPL佐劑和生育酚的一種特別優(yōu)選的佐劑制劑。
另一種增強的佐劑系統(tǒng)包括含CpG寡核苷酸與皂角苷衍生物的組合，特別是WO 00/09159中公開的CpG與QS21的組合。優(yōu)選地，該制劑還含有水包油乳劑和生育酚。
用于本發(fā)明的藥物組合物的其它說明性佐劑包括Montanide ISA720(Seppic，法國)、SAF(Chiron，加利福尼亞，美國)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐劑(例如SBAS-2或SBAS-4，可獲自SmithKline Beecham，Rixensart，比利時)、Detox(Enhanzyn；Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)，如未決的美國專利申請系列號08/853,826和09/074,720所述，其公開內(nèi)容在此引用作為參考，和如WO 99/52549A1所述的聚氧乙烯醚佐劑。
其它優(yōu)選佐劑包括通式(I)HO(CH2CH2O)n-A-R的佐劑分子，其中n是1-50，A是一個鍵或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本發(fā)明的一個實施方案包括含有通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗制劑，其中n是1-50，優(yōu)選地是4-24，最優(yōu)選地是9；R成分是C1-50，優(yōu)選地是C4-C20烷基，最優(yōu)選地是C12烷基，A是一個鍵。聚氧乙烯醚的濃度應(yīng)當為0.1-20％，優(yōu)選地0.1-10％，最優(yōu)選地0.1-1％。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。Merck目錄(第12版條目7717)描述了聚氧乙烯醚，如聚氧乙烯月桂醚。WO 99/52549中描述了這些佐劑分子。
根據(jù)通式(I)的聚氧乙烯醚希望時可與另一種佐劑組合。例如，優(yōu)選的佐劑組合是優(yōu)選地與如未決的英國專利申請GB 9820956.2所述的CpG組合。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，通過抗原呈遞細胞(APC)向宿主輸送此處所述的免疫原性組合物，APC如樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、單核細胞和可改造為有效APC的其它細胞。這些細胞可以但不是必須遺傳修飾來提高遞呈抗原的能力，促進T細胞應(yīng)答的激活和/或保持，本身具有抗腫瘤作用，和/或與受體免疫學相容(即匹配的HLA單體型)。APC一般可從多種生物液體和器官(包括腫瘤和腫瘤周圍組織)中分離，可以是自體、異體、同源或異種的細胞。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案使用樹突細胞或其祖細胞作為抗原呈遞細胞。樹突細胞是十分有效的APC(Banchereau和Steinman，Nature 392245-251，1998)，作為生理佐劑可有效地引發(fā)預防或治療性抗腫瘤免疫(參見Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50507-529，1999)。通?？筛鶕?jù)典型形狀(原位星形，在體外可見的明顯的胞質(zhì)突起(樹突))、高效吸收、加工和遞呈抗原的能力及其激活幼稚T細胞應(yīng)答的能力鑒定樹突細胞。當然可以改造樹突細胞，使之表達在體內(nèi)或離體的樹突細胞上不常見到的特異性細胞表面受體或配體，本發(fā)明涉及這些修飾的樹突細胞。作為樹突細胞的一個備選方案，在疫苗中可使用分泌的載有囊泡抗原的樹突細胞(稱為外來體)(參見Zitvogel等人，Nature Med.4594-600，1998)。
樹突細胞及其祖細胞可從外周血、骨髓、腫瘤浸潤細胞、腫瘤周圍組織浸潤細胞、淋巴結(jié)、脾臟、皮膚、臍帶血或其它任何合適的組織或液體中獲得。例如，通過向從外周血中收集的單核細胞的培養(yǎng)物中加入細胞因子，如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的組合，樹突細胞可以離體分化?；蛘?，通過向培養(yǎng)基中加入GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或可誘導樹突細胞分化、成熟和增殖的其它化合物的組合，從外周血、臍帶血或骨髓中收集的CD34陽性細胞也可分化為樹突細胞。
樹突細胞常規(guī)分類為“未成熟”和“成熟”的細胞，這是區(qū)別兩種明確表征的表型的一種簡單方法。然而，這種命名法不應(yīng)被視為排除分化中所有可能的中間階段。未成熟樹突細胞被表征為具有高抗原攝取和加工能力的APC，這與Fcγ受體和甘露糖受體的高表達有關(guān)。成熟表型的特征一般在于這些標記的表達較低，但負責T細胞激活的細胞表面分子如I類和II類MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表達。
通常可以用本發(fā)明的多核苷酸(或其部分或其它變體)轉(zhuǎn)染APC，使得編碼的多肽或其免疫原性部分在細胞表面表達。如此處所述，這種轉(zhuǎn)染可以離體發(fā)生，含有這些轉(zhuǎn)染細胞的藥物組合物可用于治療目的。或者，也可以向患者施用導向樹突或其它抗原呈遞細胞的基因輸送載體，引發(fā)在體內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)染。例如，樹突細胞的體內(nèi)和離體轉(zhuǎn)染通?？捎帽绢I(lǐng)域周知的任何方法進行，如WO 97/24447所述的方法，或Mahvi等人，Immunology and Cell Biology 75456-460，1997所述的基因槍法。樹突細胞負載抗原可如下實現(xiàn)將樹突細胞或祖細胞與腫瘤多肽、(裸露的或質(zhì)粒載體內(nèi)的)DNA或RNA或與表達抗原的重組細菌或病毒(例如，痘苗、禽痘、腺病毒或慢病毒載體)溫育。在負載前，多肽可與提供T細胞幫助的免疫配偶體(例如載體分子)共價結(jié)合?；蛘撸瑯渫患毎部梢杂梦唇Y(jié)合的免疫配偶體脈沖單獨地或在多肽存在下脈沖。
盡管在本發(fā)明的藥物組合物中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何適當載體，但載體的類型一般因施用方式而不同?？蔀榱巳魏魏线m的施用方式配制本發(fā)明的組合物，包括，例如，局部、口服、鼻、粘膜、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和肌內(nèi)施用。
這些藥物組合物中使用的載體是生物相容的，也可以是可生物降解的。在某些實施方案中，該制劑優(yōu)選地引起相對恒定水平的活性成分釋放。然而在其它實施方案中，施用后更快的釋放速度可能是希望的。這些組合物的配制為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在這方面有用的說明性載體包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、乳膠、淀粉、纖維素、葡聚糖等的微粒。其它說明性緩釋載體包括超分子生物載體，它含有非脂親水性核心(例如交聯(lián)的多糖或寡糖)，和任選地一個含有兩親性化合物(如磷脂)的外層(參見，例如，美國專利號5,151,254和PCT申請WO 94/20078、WO 94/23701和WO 96/06638)。緩釋制劑中所含的活性成分的量取決于植入部位、釋放速度和預期的持續(xù)時間和將要治療或預防的病情。
在另一個說明性實施方案中，用可生物降解的小球體(例如polylactate polyglycolate)作為本發(fā)明的組合物的載體。例如，美國專利號4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609和5,942,252中公開了合適的可生物降解的小球體。修飾的乙型肝炎核心蛋白載體系統(tǒng)，如WO 99/40934和此處引用的參考文獻所述，也可用于多種用途。另一種說明性載體/輸送系統(tǒng)使用一種含有顆粒-蛋白質(zhì)復合物的載體，如美國專利號5,928,647所述，它能在宿主中誘發(fā)I類限制的細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答。
本發(fā)明的藥物組合物通常還含有一種或多種緩沖液(例如，中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽溶液)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑(如EDTA)或谷胱甘肽、佐劑(如氫氧化鋁)、使制劑相對于受體血液等滲、低滲或弱高滲的溶質(zhì)、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑。或者，本發(fā)明的組合物也可配制為凍干品。
此處所述的藥物組合物可存在于單劑量或多劑量的容器中，如密封的安瓿或小瓶中。這些容器一般密封，以在使用前保持制劑的無菌和穩(wěn)定性。制劑通?？少A存為油狀或水狀載體中的懸液、溶液或乳液。此外，藥物組合物也可在凍干條件下貯存，在臨用前只需加入無菌液體載體。
為了在多種治療方案中使用此處所述的特定組合物，發(fā)展適當給藥和治療方案，包括例如口服、腸胃外、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)和肌內(nèi)施用和配制，為本領(lǐng)域眾所周知，為舉例說明，其中一些在下面簡要描述。
在某些用途中，可以通過口服向動物施用此處公開的藥物組合物。這樣，這些組合物可以用惰性稀釋劑或可同化的食用載體配制，或者可以包封于硬殼或軟殼的明膠膠囊中，或者可以壓制成片劑，或者可以直接摻入食物中。
活性化合物中甚至可以摻入賦形劑，并以可攝入的片劑、頰含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿、薄膜等的形式使用(參見，例如，Mathiowitz等人，Nature 1997 Mar 27；386(6623)410-4；Hwang等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998；15(3)243-84；美國專利5,641,515；美國專利5,580,579；美國專利5,792,451)。片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可含有多種其它成分，例如，粘合劑，如黃蓍樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸二鈣；崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；甜味劑，如可以加入蔗糖、乳糖或糖精，或增香劑，如薄荷、冬青油或櫻桃香料。當單位劑型是膠囊時，除上述材料之外還可含有液體載體。其它不同材料可以是包被或以其它方式修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可以用紫膠、糖或其兩者包被。當然，在制備任何單位劑型中使用的任何材料都應(yīng)當是藥物純的，并且所使用的量基本上無毒。另外，也可以向緩釋制劑中摻入活性化合物。
這些制劑一般含有至少約0.1％的活性化合物或更多，盡管活性成分的百分數(shù)肯定會變化，通常為總制劑重量或體積的約1或2％到約60％或70％或更多。一般按照在給定單位劑量的化合物中獲得適當劑量，準備每種治療上有用的組合物中活性化合物的量。制備這些藥用制劑的技術(shù)人員應(yīng)當考慮溶解度、生物利用率、生物半衰期、施用途徑、產(chǎn)品保存期及其它藥理學因素，因此，多種劑量和治療方案可能是希望的。
對于經(jīng)口施用，本發(fā)明的組合物還可以與一種或多種賦形劑結(jié)合，為漱口藥、潔齒劑、頰含片、噴口劑或舌下經(jīng)口施用制劑的形式?；蛘撸钚猿煞忠部梢該饺肟诜芤?如含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的溶液)中，或分散于潔齒劑中，或以治療有效的量加入可含有水、粘合劑、研磨劑、增香劑、發(fā)泡劑和濕潤劑的組合物中。此外，組合物也可制成可置于舌下或以其它方式溶解于口中的片劑或溶液形式。
在某些情況下，希望經(jīng)腸胃外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)乃至腹膜內(nèi)施用此處公開的藥物組合物。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，其中一些例如在美國專利5,543,158；美國專利5,641,515和美國專利5,399,363中進一步描述。在某些實施方案中，活性化合物作為游離堿或藥理學可接受的鹽的溶液可以在與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適當混合的水中制備。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備分散體。在普通貯存和使用條件下，這些制劑通常含有防腐劑防止微生物生長。
適于注射用的說明性藥物形式包括無菌水溶液或分散體和用于臨時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末(例如，參見美國專利5,466,468)。在所有情況中，該形式必須是無菌的，必須是易注射的液體。在生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn)定，必須能防止微生物(如細菌和真菌)的污染作用。載體可以是溶劑或分散基質(zhì)，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們的適當混合液和/或植物油。例如，利用包被，如卵磷脂，在分散的情況下保持需要的顆粒大小，和/或利用表面活性劑，可以保持適當?shù)牧鲃有?。利用各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如paraben、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，有利于防止微生物的作用。在許多情況中，優(yōu)選地含有等滲劑，如糖或氯化鈉。在組合物中使用延緩吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠，能使注射組合物的吸收延長。
在一個實施方案中，對于水溶液的腸胃外施用，必要時溶液應(yīng)當適當?shù)鼐彌_，首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些水溶液特別適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。就此而言，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可了解能夠使用的無菌水介質(zhì)。例如，一劑量可溶解于1ml等滲NaCl溶液中，并加入1000ml皮下灌注液中或在所述注射部位注射(參見，例如，《Remington藥物學》第15版，1035-1038和1570-1580頁)。根據(jù)治療的患者病情，必須進行劑量上的某些改變。此外，對于人體施用，制品必須優(yōu)選地滿足FDA生物制劑標準所要求的無菌、致熱性和一般安全性和純度標準。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，此處公開的組合物可配制為中性或鹽形式。示例性藥學可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，其是與無機酸(如鹽酸或磷酸)或有機酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的。與游離羧基形成的鹽也能來自于無機堿，如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，和有機堿，如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等。在配制后，以與劑量制劑相容的方式并以治療有效的量施用該溶液。
載體還能含有任一種和所有溶劑、分散介質(zhì)、載體、包衣、稀釋劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩沖液、載體溶液、懸液、膠體等。這些介質(zhì)和試劑用于藥學活性物質(zhì)的應(yīng)用在本領(lǐng)域眾所周知。除了任何常規(guī)介質(zhì)和試劑與活性成分不相容的情況，考慮它在治療組合物中的使用。補充的活性成分也能加入組合物中。術(shù)語“藥學可接受的”是指在對人體施用時不引起過敏或類似的不利反應(yīng)的分子體和組合物。
在某些實施方案中，可以通過鼻內(nèi)噴霧、吸入和/或其它氣溶膠輸送載體施用藥物組合物。例如，美國專利5,756,353和美國專利5,804,212中描述了通過經(jīng)鼻氣溶膠噴霧直接向肺輸送基因、核酸和肽組合物的方法。利用鼻內(nèi)微粒樹脂(Takenaga等人，J ControlledRelease 1998 Mar 2；52(1-2)81-7)和溶血磷脂酰甘油(美國專利5,725,871)輸送藥物在制藥領(lǐng)域也是眾所周知的。美國專利5,780,045也描述了聚四氟乙烯支持基質(zhì)形式的說明性穿粘膜藥物輸送。
在某些實施方案中，利用脂質(zhì)體、納米囊(nanocapsule)、微粒、脂質(zhì)顆粒、囊泡等向合適的宿主細胞/生物導入本發(fā)明的組合物。特別是，為了輸送可以配制包封于脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球或納米顆粒等中的本發(fā)明的組合物。此外，本發(fā)明的組合物也能與這類載體表面共價或非共價結(jié)合。
脂質(zhì)體和脂質(zhì)體樣制品的形成及作為可能的藥物載體的應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知(參見，例如，Lasic，Trends Biotechnol 1998Jul；16(7)307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998Mar；56(3)691-5；Chandran等人，Indian J Exp Biol.1997Aug；35(8)801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)233-61；美國專利5,567,434；美國專利5,552,157；美國專利5,565,213；美國專利5,738,868和美國專利5,795,587，均在此引用作為參考)。
脂質(zhì)體已經(jīng)成功地用于通常難以用其它方法轉(zhuǎn)染的大量細胞類型，包括T細胞懸液、原代肝細胞培養(yǎng)物和PC 12細胞(Renneisen等人，J Biol Chem.1990 Sep 25；265(27)16337-42；Muller等人，DNA Cell Biol.1990 Apr；9(3)221-9)。另外，脂質(zhì)體沒有基于病毒的輸送系統(tǒng)所具有的DNA長度限制。脂質(zhì)體已經(jīng)有效地用于向多種培養(yǎng)細胞系和動物中導入基因、不同藥物、放療劑、酶、病毒、轉(zhuǎn)錄因子、變構(gòu)效應(yīng)物等。此外，脂質(zhì)體的應(yīng)用似乎與全身施用后的自身免疫反應(yīng)或無法接受的毒性無關(guān)。
在某些實施方案中，由分散于水介質(zhì)中的磷脂形成脂質(zhì)體，并且自發(fā)形成多層同心雙層小泡(也稱為多層小泡(MLV))。
或者，在其它實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物的藥學可接受的納米囊制劑。納米囊通常能以穩(wěn)定和可重復的方式包封化合物(參見，例如，Quintanar-Guerrero等人，Drug Dev Ind Pharm.1998Dec；24(12)1113-28)。為了避免胞內(nèi)聚合物過載引起的副作用，可以利用能在體內(nèi)降解的聚合物設(shè)計這些超細顆粒(大小約為0.1μm)。能如Couvreur等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1988；5(1)1-20；zur Muhlen等人，Eur J Pharm Biopharm.1998Mar；45(2)149-55；Zambaux等人，J Controlled Release 1998 Jan2；50(1-3)31-40；和美國專利5,145,684所述制備這種顆粒。
癌癥治療方法在本發(fā)明的其它方面，此處所述的藥物組合物可用于癌癥的治療，特別是乳腺癌和其它Her-2/neu相關(guān)惡性腫瘤的免疫治療。在這些方法中，對患者，一般是溫血動物，優(yōu)選地是人，施用此處所述的藥物組合物。患者可患有或未患癌癥。因此，上述藥物組合物可用于防止癌癥的發(fā)展或治療癌癥患者。藥物組合物和疫苗可在手術(shù)切除原發(fā)腫瘤和/或治療(如施以放療或常規(guī)化療藥物)之前或之后施用。如上所述，藥物組合物可以通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、肛門、陰道、局部和口服途徑施用。
在某些實施方案中，免疫治療可以是主動免疫治療，其中治療依賴于施用免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(如此處所述的多肽和多核苷酸)體內(nèi)刺激內(nèi)源宿主免疫系統(tǒng)，使之對腫瘤反應(yīng)。
在其它實施方案中，免疫治療也可以是被動免疫治療，其中治療包括施用具有明確的腫瘤免疫反應(yīng)性的試劑(如效應(yīng)細胞或抗體)，它們能直接或間接地介導抗腫瘤作用，而不必依賴完整的宿主免疫系統(tǒng)。效應(yīng)細胞的例子包括如上所述的T細胞、T淋巴細胞(例如CD8+細胞毒性T淋巴細胞和CD4+T輔助腫瘤浸潤淋巴細胞)、殺傷細胞(如自然殺傷細胞和淋巴因子活化的殺傷細胞)、B細胞或和表達此處所述的多肽的抗原呈遞細胞(如樹突細胞和巨噬細胞)。可以克隆、表達對于此處所述多肽特異的T細胞受體和抗體受體，并轉(zhuǎn)移到其它載體或效應(yīng)細胞中，進行過繼免疫治療。也可以利用此處所述的多肽產(chǎn)生抗體或抗獨特型抗體(如上文及美國專利號4,918,164所述)進行被動免疫治療。
如此處所述，通過在體外生長，一般能獲得足以進行過繼免疫治療的效應(yīng)細胞。使單個抗原特異性效應(yīng)細胞擴充為幾十億個而保留體內(nèi)抗原識別能力的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中周知。這些體外培養(yǎng)條件一般在細胞因子(如IL-2)和不分裂的飼養(yǎng)細胞存在下用抗原斷續(xù)刺激。如上所述，此處所述的免疫反應(yīng)性多肽可用來快速擴充抗原特異性T細胞培養(yǎng)物，以產(chǎn)生足以進行免疫治療的細胞。特別是，抗原呈遞細胞，如樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞和/或B細胞，可以利用本領(lǐng)域周知的多種標準技術(shù)，用免疫反應(yīng)性多肽脈沖，或用一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)染。例如，抗原呈遞細胞可用一種多核苷酸轉(zhuǎn)染，該多核苷酸含有適于增強在重組病毒或其它表達系統(tǒng)中表達的啟動子。在治療中使用的培養(yǎng)的效應(yīng)細胞必須能夠生長且廣泛分布，并能在體內(nèi)長期存活。研究表明，通過用補充有IL-2的抗原重復刺激，能誘導培養(yǎng)的T細胞在體內(nèi)生長，并且能大量地長期存活(參見，例如，Cheever，M.等人，Immunological Reviews 157177，1997)。
或者，也可將表達此處所述多肽的載體導入取自患者的抗原呈遞細胞中，并離體無性繁殖，用于移植回相同患者?？梢岳帽绢I(lǐng)域周知的任何方法將轉(zhuǎn)染細胞重新導入患者中，優(yōu)選地以無菌形式通過靜脈內(nèi)、腔內(nèi)、腹腔內(nèi)或腫瘤內(nèi)施用。
此處所述的治療組合物的施用途徑和頻率以及劑量因個體而異，可用標準技術(shù)確定。藥物組合物和疫苗通常通過注射(例如，皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、鼻內(nèi)(例如吸入)或經(jīng)口施用。優(yōu)選地，可在52周內(nèi)施用1-10次。優(yōu)選地，以1個月的間隔施用6次，之后可定期進行加強接種。備選方法可能適于個體患者。一種合適的劑量是，當如上所述施用時，能增強抗腫瘤免疫應(yīng)答，并且比基礎(chǔ)(即未處理)水平至少高10-50％的化合物的量。這種應(yīng)答可如下監(jiān)測測量患者中的抗腫瘤抗體，或能在體外殺傷患者腫瘤細胞的溶細胞效應(yīng)細胞的疫苗依賴的產(chǎn)生。這些疫苗應(yīng)該也能引起免疫應(yīng)答，致使接種患者的臨床后果比未接種患者改善(例如，更頻繁的緩解，完全或部分或更長的無病存活)。通常，對于含有一種或多種多肽的藥物組合物和疫苗，劑量中所含的每種多肽的量約為每kg宿主約25μg至5mg。合適的劑量大小因患者體重而異，但一般為約0.1mL至約5mL。
合適的劑量和治療方案一般提供足以提供治療和/或預防益處的量的活性化合物。通過確定治療患者比未治療患者改善的臨床后果(例如，更頻繁的緩解，完全或部分或更長的無病存活)，能監(jiān)測這種反應(yīng)。預先存在的對腫瘤蛋白免疫應(yīng)答的增強一般與改善的臨床結(jié)果有關(guān)。這些免疫應(yīng)答一般可用標準增殖、細胞毒性或細胞因子測定法評價，這些方法可用治療前和治療后從患者中獲得的樣品進行。
癌癥檢測和診斷組合物、方法和試劑盒另一實施方案中，可根據(jù)在患者的生物樣品(例如血液、血清、痰、尿和/或腫瘤活檢)中存在一種或多種Her-2/neu蛋白和/或編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸，檢測患者的癌癥。換言之，本發(fā)明的多肽和多核苷酸可用作標志，表明癌癥的存在與否。此處所述的結(jié)合劑一般允許檢測生物樣品中可與該試劑結(jié)合的抗原的水平。可以利用多核苷酸引物和探針檢測編碼腫瘤蛋白的mRNA水平，這也表明癌癥的存在與否。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種測定法，利用結(jié)合劑檢測樣品中的多肽標志。參見，例如，Harlow和Lane，《抗體實驗室手冊》，冷泉港實驗室，1988?；颊咧邪┌Y的存在與否通常如下確定(a)將從患者中獲得的生物樣品與結(jié)合劑接觸；(b)檢測樣品中可與該結(jié)合劑結(jié)合的多肽的水平；(c)將多肽水平與預定的截斷值相比較。
在一個優(yōu)選實施方案中，該測定法包括用固定于固體載體上的結(jié)合劑結(jié)合并從剩余的樣品中除去多肽。然后可用一種含有報道基團并可與結(jié)合劑/多肽復合物特異結(jié)合的檢測試劑檢測結(jié)合的多肽。這些檢測試劑可包括，例如，可與該多肽特異結(jié)合的結(jié)合劑，或可與該結(jié)合劑特異結(jié)合的抗體或其它試劑，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。或者，也可使用競爭測定法，其中多肽用報道基團標記，并在結(jié)合劑與樣品溫育后使之與固定的結(jié)合劑結(jié)合。樣品成分抑制標記多肽與結(jié)合劑結(jié)合的程度表明樣品對固定的結(jié)合劑的反應(yīng)性。固體載體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的、腫瘤蛋白可以附著的任何材料。例如，固體載體可以是微量板中的檢測孔，或硝酸纖維素或其它合適的膜。此外，載體也可以是珠或盤，如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料材料，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。載體也可以是磁粉或光纖傳感器，如美國專利號5,359,681所公開的?？梢岳脤＠涂茖W文獻中詳述的、本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的多種技術(shù)將結(jié)合劑固定于固體載體上。在本發(fā)明中，術(shù)語“固定”是指非共價結(jié)合如吸附和共價結(jié)合(可以是試劑與載體上功能基團之間的直接連接，或者可以是通過交聯(lián)劑的連接)。通過吸附固定于微量板孔或膜上是優(yōu)選的。在這些情況中，可通過使適當緩沖液中的結(jié)合劑與固體載體接觸適當時間實現(xiàn)這種吸附。接觸時間因溫度而異，但一般為約1小時至約1天。塑料微量板孔(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)與約10ng至約10μg、優(yōu)選地約100ng至約1μg的結(jié)合劑接觸通常足以固定足量的結(jié)合劑。
結(jié)合劑與固體載體共價結(jié)合一般可如下實現(xiàn)首先使載體與可與載體和結(jié)合劑的功能基團(如羥基或氨基)反應(yīng)的雙功能試劑反應(yīng)。例如，使用苯醌，或通過載體上的醛基與結(jié)合配偶體上的氨和活性氫縮合，結(jié)合劑可與帶有適當聚合物包被的載體共價結(jié)合(參見，例如，Pierce免疫技術(shù)目錄和手冊，1991，A12-A13)。
在某些實施方案中，測定法是雙抗體夾心測定。這種測定法可如下進行首先使固定于固體載體(通常是微量板孔)上的抗體與樣品接觸，使樣品中的多肽與固定的抗體結(jié)合。然后從固定的多肽-抗體復合物中除去未結(jié)合的樣品，加入含有報道基團的檢測試劑(優(yōu)選地是能與該多肽上不同部位結(jié)合的第二抗體)。然后利用適于特定報道基團的方法測定結(jié)合于固體載體上的檢測試劑的量。
更具體而言，一旦抗體固定于如上所述的載體上，一般就封閉載體上其余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任何合適的封閉劑，如牛血清白蛋白或吐溫20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后使固定的抗體與樣品一起溫育，使多肽與抗體結(jié)合。在溫育前樣品可用合適的稀釋劑如磷酸緩沖液(PBS)稀釋。適當?shù)慕佑|時間(即溫育時間)一般為足以檢測到取自乳腺癌患者的樣品中存在多肽的時間。優(yōu)選地，接觸時間足以實現(xiàn)一定水平的結(jié)合，該水平至少為結(jié)合與未結(jié)合多肽之間平衡時所達到的95％。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，通過測定一段時間中發(fā)生的結(jié)合水平可輕易地確定達到平衡所需的時間。在室溫下，約30分鐘的溫育時間一般足夠。
然后可利用合適的緩沖液(如含有0.1％吐溫20TM的PBS)洗滌固體載體，去除未結(jié)合的樣品。然后向固體載體上加入含有報道基團的第二抗體。優(yōu)選的報道基團包括以上所述的基團。
然后將檢測試劑與固定的抗體-多肽復合物溫育，持續(xù)足以檢測到結(jié)合多肽的一段時間。適當?shù)臅r間長度一般可通過測定一段時間中發(fā)生的結(jié)合水平確定。然后去除未結(jié)合的檢測試劑，并用報道基團檢測結(jié)合的檢測試劑。用于檢測報道基團的方法取決于報道基團的性質(zhì)。對于放射性基團，閃爍計數(shù)或放射自顯影法一般是合適的。分光法可用來檢測染料、發(fā)光基團和熒光基團。生物素可以用與不同報道基團(通常是放射性或熒光基團或酶)偶聯(lián)的親和素檢測。酶報道基團一般可通過加入底物(一般經(jīng)過特定的一段時間)，隨后對反應(yīng)產(chǎn)物進行分光或其它分析來檢測。
為了確定癌癥(如乳腺癌)的存在與否，通常將保持與固體載體結(jié)合的報道基團的檢測信號與對應(yīng)于預定的截斷值的信號相比較。在一個優(yōu)選實施方案中，檢測癌癥的截斷值是當固定抗體與來自非癌癥患者的樣品溫育后獲得的平均信號。通常，產(chǎn)生的信號比預定截斷值高三個標準差的樣品被認為是癌癥陽性。在另一個優(yōu)選實施方案中，按照Sackett等人，《臨床流行病學臨床醫(yī)學基礎(chǔ)科學》，Little Brownand Co.，1985，106-107的方法，用接收工作曲線(Receiver OperaterCurve)確定截斷值。簡言之，在該實施方案中，根據(jù)對應(yīng)于診斷檢查結(jié)果的每一可能截斷值的成對真陽性率(即敏感度)和假陽性率(100％特異性)的圖，可確定截斷值。圖上最接近左上角的截斷值(即，包圍最大面積的值)是最精確的截斷值，產(chǎn)生的信號高于用該方法所確定的截斷值的樣品被認為是陽性。此外，截斷值也可沿曲線轉(zhuǎn)移到左側(cè)，使假陽性率最低，或移到右側(cè)，使假陰性率最低。產(chǎn)生的信號高于用該方法確定的截斷值的樣品通常被認為是癌癥陽性。
在一個相關(guān)實施方案中，以流過(flow-through)或條形試驗形式進行測定，其中結(jié)合劑固定于膜(如硝酸纖維素)上。在流過試驗中，當樣品通過膜時，樣品中的多肽與固定的結(jié)合劑結(jié)合。然后當含有第二結(jié)合劑的溶液流經(jīng)該膜時，標記的第二結(jié)合劑與結(jié)合劑-多肽復合物結(jié)合。然后可如上所述對結(jié)合的第二結(jié)合劑進行檢測。在條形試驗中，與結(jié)合劑結(jié)合的膜的一端浸于含有樣品的溶液中。樣品沿膜遷移，通過含有第二結(jié)合劑的區(qū)域到達固定結(jié)合劑的區(qū)域。固定抗體區(qū)域中第二結(jié)合劑的濃度表明癌癥的存在。一般而言，該部位中第二結(jié)合劑的濃度產(chǎn)生一種可目測的模式，如一條線。沒有這種模式表明為陰性結(jié)果。一般選擇固定于膜上的結(jié)合劑的量，使得當生物樣品含有足以在上述形式的雙抗體夾心測定中產(chǎn)生陽性信號的多肽水平時，能產(chǎn)生可目視辨別的模式。在這些測定中使用的優(yōu)選結(jié)合劑是抗體及其抗原結(jié)合片段。優(yōu)選地，固定于膜上的抗體的量約25ng至約1μg，更優(yōu)選地約50ng至約500ng。這些試驗一般可用極少量的生物樣品進行。
當然，存在大量其它測定方法適用于本發(fā)明的腫瘤蛋白或結(jié)合劑。以上敘述只是旨在舉例。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，可容易地修改上述方法，利用腫瘤多肽檢測生物樣品中可與這些多肽結(jié)合的抗體。這些腫瘤蛋白特異性抗體的檢測可能與癌癥的存在有關(guān)。
也可或作為替代方案根據(jù)生物樣品中存在與腫瘤蛋白特異反應(yīng)的T細胞檢測癌癥。在某些方法中，從患者中分離的含有CD4+和/或CD8+T細胞的生物樣品與腫瘤多肽、編碼該多肽的多核苷酸和/或表達該多肽的至少免疫原性部分的APC溫育，檢測是否存在T細胞的特異激活。合適的生物樣品包括但不限于分離的T細胞。例如，可用常規(guī)技術(shù)(如Ficoll/Hypaque密度梯度離心外周血淋巴細胞)從患者中分離T細胞。T細胞可在37℃下與多肽(例如5-25μg/ml)體外溫育2-9天(典型4天)。在不含Her-2/neu多肽的情況下溫育另一等份T細胞樣品，作為對照。對于CD4+T細胞，優(yōu)選地通過評價T細胞增殖檢測其激活。對于CD8+T細胞，優(yōu)選地通過評價溶細胞活性檢測其激活。增殖水平比無病患者至少高2倍和/或溶細胞活性至少高20％表明患者患有癌癥。
如上所述，也可或備選地根據(jù)生物樣品中編碼腫瘤蛋白的mRNA水平檢測癌癥。例如，在基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的測定中可利用至少兩條寡核苷酸引物擴增來源于生物樣品的腫瘤cDNA的一部分，其中至少一條寡核酸引物對于編碼腫瘤蛋白的多核苷酸特異(即，可與之雜交)。然后用本領(lǐng)域周知的技術(shù)(如凝膠電泳)分離并檢測擴增的cDNA。類似地，在雜交測定中可以利用可與編碼腫瘤蛋白的多核苷酸特異雜交的寡核苷酸探針檢測生物樣品中是否存在編碼該腫瘤蛋白的多核苷酸。
為了可在測定條件下雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)當含有一種寡核苷酸序列，該序列與編碼本發(fā)明的腫瘤蛋白的多核苷酸的一部分(長度至少為10個核苷酸，優(yōu)選地至少20個核苷酸)有至少約60％、優(yōu)選地至少約75％、更優(yōu)選地至少約90％的一致性。優(yōu)選地，在如上所述的中度嚴緊條件下，寡核苷酸引物和/或探針可與編碼此處所述多肽的多核苷酸雜交。在此處所述的診斷方法中有用的寡核苷酸引物和/或探針長度優(yōu)選地為至少10-40個核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸引物含有具有此處公開序列的DNA分子的至少10個連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選地至少15個連續(xù)核苷酸?；赑CR的測定和雜交測定技術(shù)在本領(lǐng)域周知(參見，例如Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51263，1987；Erlich編寫，《PCR技術(shù)》，Stockton出版社，NY，1989)。
一種優(yōu)選的測定使用RT-PCR，其中PCR與反轉(zhuǎn)錄聯(lián)合使用。一般從生物樣品(如活檢組織)中提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA分子。應(yīng)用至少一條特異引物的PCR擴增將產(chǎn)生cDNA分子，它可利用如凝膠電泳分離并顯示?？梢詫碜允茉嚮颊吆臀椿及┌Y的患者的生物樣品進行擴增?？梢詫M跨兩個數(shù)量級的幾個稀釋度的cDNA進行擴增反應(yīng)。受試患者樣品的幾個稀釋度中的表達比非癌樣品相同稀釋度中的表達高兩倍或以上一般認為是陽性。
在另一個實施方案中，此處所述的組合物可用作癌癥進展的標志。在該實施方案中，如上所述用于癌癥診斷的測定可以在一段時間內(nèi)進行，并評價反應(yīng)性多肽或多核苷酸水平的改變。例如，可以在6個月到1年時間內(nèi)，每24-72小時進行測定，之后在需要時進行。在檢測到多肽或多核苷酸水平隨時間推移而提高的患者中，癌癥通常發(fā)展。相反，當反應(yīng)性多肽或多核苷酸水平經(jīng)一段時間仍恒定或降低時，癌癥未發(fā)展。
可直接對腫瘤進行某些體內(nèi)診斷測定。一種這樣的測定包括使腫瘤細胞接觸結(jié)合劑。然后可通過報道基團直接或間接檢測結(jié)合的結(jié)合劑。這類結(jié)合劑也可用于組織學用途?；蛘?，在這些用途中也可使用多核苷酸探針。
如上所述，為了提高靈敏度，可以測定一種給定樣品中的多種腫瘤蛋白標志。顯然，在一種測定中可以組合使用對于此處所述不同蛋白質(zhì)特異的多種結(jié)合劑。而且，可以同時使用多種引物或探針。腫瘤蛋白標志的選擇可基于確定產(chǎn)生最佳靈敏度的組合的常規(guī)實驗。另外，或作為備選方案，測定此處所述的腫瘤蛋白可與測定其它已知腫瘤抗原相結(jié)合。
本發(fā)明還提供可在上述任何診斷方法中使用的試劑盒。這些試劑盒一般含有兩種或多種進行診斷測定所必需的成分。這些成分可以是化合物、試劑、容器和/或裝置。例如，試劑盒中的一個容器可含有一種可與腫瘤蛋白特異結(jié)合的單克隆抗體或其片段。這些抗體或片段可以如上所述與支持材料結(jié)合。另外一個或多個容器可包封將在測定中使用的成分，如試劑或緩沖液。這些試劑盒也可作為備選方案含有如上所述的檢測試劑，該試劑含有適于直接或間接檢測抗體結(jié)合的報道基團。
或者，可設(shè)計試劑盒用來檢測生物樣品中編碼腫瘤蛋白的mRNA的水平。這些試劑盒一般含有至少一種如上所述的寡核苷酸探針或引物，它可與編碼腫瘤蛋白的多核苷酸雜交。這種寡核苷酸例如可在PCR或雜交測定中使用。這些試劑盒內(nèi)可能含有的其它成分包括第二種寡核苷酸和/或診斷試劑或容器，以利于檢測編碼腫瘤蛋白的多核苷酸。
下列實施例只是為了舉例說明，絕非意在限制。
實施例實施例1使用重組腺病毒感染的樹突細胞致敏Her-2/neu特異性CD8+T細胞構(gòu)建缺失EIA并與Her-2/neu的細胞內(nèi)域(ICD；SEQ ID NO1的大約第2026-3765位核苷酸)重組的腺病毒(AdV)載體，將其用于感染從健康供體獲得的樹突細胞(DC)。最初的致敏培養(yǎng)物含有AdV-ICD感染的DC作為刺激物及自體PBMC作為應(yīng)答者。在第一次重復刺激之前，富集培養(yǎng)物中的CD8+細胞，然后用AdV-ICD感染的DC再刺激此CD8+富集群體。隨后的再刺激在用ICD重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的自體成纖維細胞上進行。第4次體外刺激后，通過標準的4小時51Cr釋放試驗檢測所獲T細胞系的ICD特異性CTL活性。如圖1所示，粗T細胞系含有ICD特異性活性，因為該細胞系裂解痘苗-ICD感染的自體B-LCL但不裂解痘苗-EGFP感染的C-LCL或未感染的B-LCL靶標。圖1中各數(shù)據(jù)點是3次測量的平均值。
再經(jīng)過兩次刺激之后，測試T細胞系響應(yīng)表達ICD的自體成纖維細胞而分泌γ-IFN的能力。γ-IFN ELISPOT分析使用應(yīng)答者ICD致敏的CD8+T細胞系針對ICD或EGFP轉(zhuǎn)導的自體成纖維細胞進行。在該分析中，按一式三份，每孔接種2×103個成纖維細胞刺激物和2×104個應(yīng)答T細胞。對于三份重復孔，ICD成纖維細胞的平均Elispot數(shù)目為344，而EGFP成纖維細胞的平均Elispot數(shù)目為22。由此，證實該T細胞系有ICD特異性-γ-IFN分泌。
為了研究該CD8+ICD特異性T細胞系的I類限制，使用特異針對各種I類分子的抗體進行抗體阻斷實驗。刺激物與單克隆抗體W6/32(HLA-A，-B和-C反應(yīng)性的)、單克隆抗體BB123.2(HLA-B和-C反應(yīng)性的)或單克隆抗體BB7.2(HLA-A2特異的)一起預孵育。使用標準過夜γ-IFN Elispot試驗測定T細胞應(yīng)答。應(yīng)答細胞是體外培養(yǎng)7個刺激循環(huán)后的ICD特異性CTL細胞系，每孔使用15,000個細胞。刺激物是用ICD或EGFP通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的自體成纖維細胞，每孔使用2,000個細胞。刺激物和所指明的mAb(50μg/ml)一起孵育20分鐘，之后加入到試驗中。一式三份地進行該試驗。
如表2所示，刺激細胞和W6/32或BB123.2抗體一起孵育完全阻斷了對ICD轉(zhuǎn)導的成纖維細胞的識別，而與BB7.2一起孵育對γ-IFN的分泌沒有影響。這些結(jié)果說明，ICD特異性活性受HLA-B或-C等位基因的限制。
表2I類HLA抗體對ICD特異性γ-IFN分泌的阻斷

擴增從該粗細胞系分離的ICD特異性克隆，并進一步表征其識別全長Her-2/neu的能力。此外，使用I類HLA特異的單克隆抗體檢測該克隆的HLA限制。該實驗是標準過夜γ-IFN Elispot試驗。應(yīng)答細胞是ICD特異性T細胞克隆17D5。刺激物是未轉(zhuǎn)導的或通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導了EGFP、ICD或全長Her-2/neu(H2N)的自體成纖維細胞。每孔使用10,000個17D5細胞和10,000個刺激細胞。在該實驗中以25μg/ml使用抗體。試驗按一式三份進行，標準差對于三次重復試驗為0至±18。
如表3所示，該克隆特異地識別ICD或全長Her-2/neu轉(zhuǎn)導的自體成纖維細胞，但不識別未轉(zhuǎn)導的成纖維細胞和無關(guān)抗原EGFP轉(zhuǎn)導的成纖維細胞。而且，該反應(yīng)性被加入的泛I類HLA單克隆抗體w6/32和特異針對HLA-B和-C等位基因的單克隆抗體(BB123.2)完全阻斷，但不被HLA-A2特異性抗體(BB7.2)阻斷。這些結(jié)果說明，此Her-2/neu特異性克隆是HLA-B或-C等位基因限制性的，在該克隆來源的粗細胞系中也觀察到同樣的HLA限制方式。
進一步的分析說明，該應(yīng)答是HLA-B4402限制性的。這些分析通過測試克隆17D5對一組同種異體成纖維細胞的識別能力來實施，該組細胞在不同的HLA-B和-C等位基因上匹配并感染了AdV-ICD或AdV-EGFP。使用轉(zhuǎn)導了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或感染了重組AdV的自體成纖維細胞作為對照。
表3用γ-IFN Elispot試驗測定ICD特異性克隆17DS的Her-2/neu反應(yīng)性的HLA限制

我們測試了Her-2/neu特異性克隆對表達Her-2/neu的人腫瘤細胞的識別能力。乳腺癌細胞系MCF-7天然在細胞表面表達低水平的Her-2/neu，也表達HLA-b4402。用Her-2/neu的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導MCF-7時，在用Her-2/neu特異性單克隆抗體染色后使用流式細胞術(shù)分析進行測定，表面Her-2/neu水平增加大約5倍。用AdV-Her-2/neu感染MCF-7細胞導致腫瘤細胞表面的Her-2/neu增加20倍。這些結(jié)果顯示在圖2中。
該T細胞克隆響應(yīng)感染了編碼Her-2/neu的腺病毒的MCF-7細胞分泌γ-IFN。然而，該克隆看來不識別MCF-7細胞或轉(zhuǎn)導了表達Her-2/neu的逆轉(zhuǎn)錄病毒的MCF-7細胞。由于該克隆確實能夠識別ICD或Her-2/neu轉(zhuǎn)導的人成纖維細胞，而且由于該轉(zhuǎn)導的成纖維細胞與轉(zhuǎn)導的MCF-7細胞表達相似水平的蛋白質(zhì)，所以此結(jié)果不可能僅是由抗原表達水平造成。
實施例2鑒定Her-2/neu的HLA-B44限制性天然加工表位本實施例描述了可被上述一個T細胞克隆17D5識別的表位的表征。該克隆識別表達ICD或全長Her-2/neu蛋白質(zhì)的APC。我們使用在各種HLA等位基因上和該T細胞克隆匹配的一組同種異體細胞作為APC在γ干擾素Elispot試驗中確定了該克隆的HLA限制元件是HLA-B4402。這被采用B4402重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導HLA-B44陰性、Her-2/neu陽性APC可賦予識別所證實。使用表達一系列5個ICD片斷的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導B44+APC，縮小了該克隆識別的ICD區(qū)域。該克隆對其中兩個片斷的識別(通過γ干擾素釋放所測定的)說明，該表位包含在Her-2/neu序列第975位開始的235個氨基酸的片斷中。從此片斷中選擇預測與B44結(jié)合的9肽和11肽，并進行合成。合成的13個肽中，一個被該克隆識別，被確定為該表位。這已通過γ干擾素釋放和TNF-α釋放試驗得到證實。此天然加工的Her-2/neu表位的序列是EEYLVPQQGF(SEQ ID NO3)，位于Her-2/neu蛋白質(zhì)序列的第1021-1030位。
實施例3接種Her-2/neu DNA和多肽可抑制表達Her-2/neu的腫瘤的生長材料和方法動物8-12周齡雌性C57B1/6小鼠，獲自Charles RiverLaboratories(Wilmington，MA)，飼喂在Corixa公司的動物房中。
抗體和試劑從ATCC獲得大鼠抗鼠CD4(GK1.5)和大鼠抗鼠CD8(2.43)雜交瘤細胞系。從腹水中純化出抗體?？谷薍er-2/neu ECD特異性抗體Ab-5購自O(shè)ncogene Research Products(Cambrige，MA)。Montanide 720購自Seppic公司(Fairfield，NJ)。
腫瘤細胞系從ATCC獲得最初來源于C57BL小鼠的小鼠胸腺瘤EL4。用全長人Her-2/neu，使用標準電穿孔操作轉(zhuǎn)染EL4細胞。體外使用新霉素進行藥物篩選后，獲得穩(wěn)定地表達Her-2/neu的EL4細胞。通過流式細胞術(shù)分析驗證Her-2/neu的表達。
Her-2/neu疫苗Her-2/neu質(zhì)粒DNA疫苗(pVR1012-Her-2/neu)由插入VR102(Vical，San Diego，CA)中的全長人Her-2/neu cDNA組成。ECD質(zhì)粒DNA疫苗(pVR1012-ICD)由編碼Her-2/neu氨基酸第1-695位的DNA組成，而ICD質(zhì)粒DNA疫苗(pVR1012-ECD)由VR1012中的編碼氨基酸第692-1256位的DNA組成。使用Qiagen公司(Valencia，CA)試劑盒的試劑和標準技術(shù)制備大量無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。通過肌內(nèi)途徑在第0天(d0)和第21天(d21)遞送質(zhì)粒DNA疫苗(100μg)。ICD(氨基酸第676-1256位)和ECD(氨基酸第22-653位)重組亞單位蛋白由Corxia公司生產(chǎn)。簡而言之，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染L細胞并聯(lián)合使用DEAE、反向HPLC和Mono S柱色譜進行純化，產(chǎn)生ECD蛋白質(zhì)。ICD蛋白質(zhì)在大腸桿菌中產(chǎn)生并通過High Q陰離子交換層析及隨后的鎳樹脂親和層析從溶解的包含體中純化出來。將重組蛋白質(zhì)疫苗和Montandie 720以7∶2(Montanide 720∶蛋白質(zhì))比例混合后進行皮下遞送。
體內(nèi)腫瘤模型為了確保用于腫瘤保護實驗的EL4-Her-2/neu細胞的一致來源，通過體內(nèi)傳代(腹膜內(nèi))擴增細胞并等分冷凍以便在各個實驗中使用。使用200,000個EL4-Her-2/neu細胞皮下注射在脅腹處，以建立腫瘤。典型地，在注射的第8-10天內(nèi)形成可觸知的腫瘤。腫瘤大小以千分尺測量的腫瘤面積(長度×寬度)表示為mm2。
體內(nèi)耗竭效應(yīng)T細胞用質(zhì)粒DNA或蛋白質(zhì)在第0和21天免疫小鼠以產(chǎn)生效應(yīng)T細胞。通過在實驗開始后第35、38和42天腹膜內(nèi)施用100μg/天的純化抗CD4或抗CD8抗體，耗竭CD4和CD8細胞。對耗竭的脾細胞的流式細胞術(shù)分析說明，耗竭了98％以上的靶群體。
過繼轉(zhuǎn)移免疫血清從Her-2/neu質(zhì)粒DNA或ICD蛋白質(zhì)免疫的小鼠采血，獲得免疫血清。匯合每一組的12只不同小鼠的血清，將其轉(zhuǎn)移(靜脈內(nèi))給6只受體幼稚小鼠。血清轉(zhuǎn)移前通過ELISA評價了免疫血清的抗Her-2/neu抗體效價。
體外細胞因子分析用100μg pVR1012或pVR1012-Her-2/neu(肌內(nèi)，i.m.)或Montanide中的50μg ICD蛋白質(zhì)(s.q.)或單純的Montanide在d0和d21天免疫小鼠(4只/組)。第二次免疫后2周，收獲2.5×105個脾細胞并體外用單純的培養(yǎng)基、ICD或ECD蛋白質(zhì)(10μg/ml)進行刺激。通過ELISA分析體外刺激后48小時分泌至上清液中的IFNγ。數(shù)值為4只小鼠三次重復實驗孔的平均值。
結(jié)果Her-2/neu蛋白質(zhì)亞單位和質(zhì)粒DNA疫苗介導腫瘤保護評價由全長或截短形式的Her-2/neu構(gòu)成的Her-2/neu疫苗引起抵抗表達Her-2/neu的同基因腫瘤細胞系的保護性免疫應(yīng)答的能力。用編碼全長人Her-2/neu、Her-2/neu的ICD或ECD部分的質(zhì)粒DNA免疫C57B1/6小鼠。兩次DNA免疫后，用轉(zhuǎn)染了全長人Her-2/neu的EL4細胞(EL4-Her-2/neu)皮下攻擊小鼠，并監(jiān)測腫瘤的生長。在幼稚( )小鼠中，EL4-Her-2/neu細胞在皮下施用的14至20天內(nèi)形成巨大的實體瘤。用Her-2/neu質(zhì)粒DNA(全長、ICD或ECD亞單位)接種基本上抑制了腫瘤細胞的生長(圖3)。大多數(shù)小鼠完全避免了腫瘤的產(chǎn)生，而小部分動物表現(xiàn)出腫瘤攻擊后多達3周的腫瘤發(fā)生延遲。有趣的是我們注意到，用截短和全長Her-2/neu構(gòu)建體得到相似水平的腫瘤保護。
為了確定蛋白質(zhì)亞單位疫苗是否也可有效地引起腫瘤保護，用ICD或ECD蛋白質(zhì)加上佐劑免疫小鼠，用EL4-Her-2/neu攻擊，然后監(jiān)測腫瘤生長。結(jié)果顯示在圖4中，這些結(jié)果說明用ICD蛋白質(zhì)接種可引起部分保護性免疫應(yīng)答，其中小鼠產(chǎn)生腫瘤的頻率和攜帶腫瘤的小鼠的腫瘤平均大小均降低。在這個典型實驗中，ICD接種導致一只動物得到完全的保護，而且出現(xiàn)腫瘤的小鼠的腫瘤平均大小降低(在d23天為162mm2)。這是與幼稚組的4/4小鼠(腫瘤平均大小527mm2)和接種ECD的組的4/4小鼠(腫瘤平均大小462mm2)的腫瘤生長比較而言的。
出乎意料的是，與接種Her-2/neu DNA相比，接種蛋白質(zhì)明顯沒有接種DNA有效。
為了確定在此模型中觀察到的保護作用是否是Her-2/neu特異的，用全長Her-2/neu或載體對照質(zhì)粒DNA接種小鼠，隨后用親本EL4或EL4-Her-2/neu細胞進行攻擊。在接下來的10至25天監(jiān)測腫瘤的生長。這些結(jié)果表明，僅在用Her-2/neu質(zhì)粒DNA免疫的小鼠中腫瘤生長被抑制，這提示，引起了針對Her-2/neu的免疫而且該免疫是保護作用所必需的。以下觀察提供了有關(guān)腫瘤保護是Her-2/neu特異性的進一步的證據(jù)，即用Her-2/neu質(zhì)粒DNA接種不能阻止親代EL4細胞的生長。在使用ICD蛋白質(zhì)作為疫苗時也觀察到了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。綜合起來，這些結(jié)果說明，Her-2/neu疫苗介導的腫瘤保護是Her-2/neu特異的。
Her-2/neu蛋白亞單位或質(zhì)粒DNA疫苗介導的腫瘤保護的機制為了確定接種Her-2/neu質(zhì)粒DNA或蛋白質(zhì)時負責介導腫瘤保護的免疫應(yīng)答的性質(zhì)，我們接下來進行了一系列體內(nèi)耗竭和過繼轉(zhuǎn)移實驗。最初的實驗設(shè)計用于評價CD4和CD8效應(yīng)T細胞的各自作用。用全長Her-2/neu或?qū)φ召|(zhì)粒DNA免疫小鼠兩次。第二次免疫后2周，用抗CD4或抗CD8抗體體內(nèi)處理小鼠以耗竭效應(yīng)T細胞。經(jīng)過7天內(nèi)3次施用抗體后達到98％以上的CD4或CD8脾T細胞耗竭。3天后，用EL4-Her-2/neu攻擊小鼠，并監(jiān)測腫瘤的生長。與圖1所示前面實驗一致，在用Her-2/neu質(zhì)粒DNA(未處理組)接種的小鼠中觀察到完全的腫瘤保護。相反，體內(nèi)耗竭CD4但不耗竭CD8效應(yīng)T細胞的情況下，Her-2/neu DNA疫苗接種介導的腫瘤保護作用完全喪失。在過繼轉(zhuǎn)移實驗中得到了相似的結(jié)果，該實驗中觀察到過繼轉(zhuǎn)移CD8而非CD4耗竭的效應(yīng)T細胞賦予了對腫瘤攻擊的保護作用(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊?，這些結(jié)果提示，該系統(tǒng)中接種質(zhì)粒DNA所介導的保護作用依賴于CD4而非CD8效應(yīng)T細胞的存在。
我們在使用ICD蛋白質(zhì)接種后進行了相似的實驗，以確定CD4和CD8 T細胞在該疫苗引起的免疫應(yīng)答中的作用。再次，用佐劑中的ICD蛋白質(zhì)免疫并加強免疫小鼠，通過體內(nèi)抗體處理耗竭CD4和CD8效應(yīng)T細胞，并隨后用EL4-Her-2/neu進行攻擊。結(jié)果揭示，CD4或CD8 T細胞的耗竭均會造成用ICD接種獲得的保護作用部分喪失，這提示CD4和CD8效應(yīng)T細胞均在ICD蛋白質(zhì)介導的腫瘤保護作用中起作用。過繼轉(zhuǎn)移實驗的結(jié)果也指出，CD4和CD8效應(yīng)T細胞在ICD蛋白質(zhì)接種引起的免疫應(yīng)答中均是重要的(數(shù)據(jù)未顯示)。
由于已知抗Her-2/neu抗體可以表現(xiàn)出對腫瘤細胞的抗增殖作用，我們研究了質(zhì)粒DNA或蛋白質(zhì)接種引起的抗體是否對所觀察到的保護作用有貢獻。為了回答此問題，用全長Her-2/neu DNA或ICD蛋白質(zhì)免疫和加強免疫小鼠。收集Her-2/neu免疫小鼠的血清或未免疫小鼠的對照血清，然后將其轉(zhuǎn)移至幼稚小鼠中，之后用EL4-Her-2/neu攻擊幼稚小鼠。從Her-2/neu DNA免疫血清得到的結(jié)果指出，抗體的轉(zhuǎn)移并沒有賦予保護作用。在用質(zhì)粒DNA接種獲得的抗Her-2/neu抗體水平十分低的情況下(數(shù)據(jù)未顯示)，這些結(jié)果在某種程度上是可預見的。類似地，盡管在含有抗ICD抗體的血清中存在相當大效價(10,000-100,000)的抗ICD抗體，轉(zhuǎn)移該血清也不具有保護性。綜合起來，這些結(jié)果提示，在使用EL4-Her-2/neu腫瘤細胞的此模型中所觀察到的保護作用并非是由抗體介導的。
這些體內(nèi)耗竭和過繼轉(zhuǎn)移實驗的結(jié)果說明，在此模型中CD4+T細胞在引起保護性抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著主要作用。為了更全面的闡明CD4+T細胞介導保護作用的機制，我們檢測了用Her-2/neu DNA或ICD蛋白接種后T細胞的細胞因子分泌譜。結(jié)果總結(jié)在下表中，這些結(jié)果表明了用重組ICD或ECD蛋白質(zhì)體外重復刺激時，來自Her-2/neu質(zhì)粒DNA接種的小鼠的脾細胞與未刺激細胞相比分泌相當高水平的IFNγ。來自接種ICD蛋白質(zhì)的小鼠的脾細胞也響應(yīng)體外ICD刺激但不響應(yīng)ECD蛋白質(zhì)刺激產(chǎn)生IFNγ。這些相同培養(yǎng)物中的IL-4和IL-5水平在檢測水平之下，這與Th1型免疫應(yīng)答相符。綜合起來，這些結(jié)果提示，在該模型中IFNγ可能在Her-2/neu疫苗介導的保護作用中起作用。
表4接種Her-2/neu DNA或蛋白質(zhì)后IFNγ的產(chǎn)生

a用Montanide中的100μg pVR1012或VR1012-Her-2/neu(肌內(nèi))或50μg ICD蛋白質(zhì)(s.q.)或單純的Montanide在d0和d21免疫小鼠(4只/組)。
b第二次免疫后兩周，收獲脾細胞并體外用單純培養(yǎng)基、ICD或ECD蛋白質(zhì)(10μg/ml)刺激。
c體外刺激后48小時通過ELISA測定IFNγ分泌。數(shù)值是4只小鼠的三次重復實驗孔的平均值。
實施例4Her-2/neu特異性的T細胞克隆可識別人腫瘤細胞按實施例1所述，通過用感染了Her-2/neu ICD的腺病毒重組體的自體樹突細胞體外致敏，得到對Her-2/neu具有特異性的T細胞克隆。為確定該T細胞克隆識別內(nèi)源性表達Her-2/neu的人腫瘤的能力，進行了以下實驗。
人腫瘤細胞系SKBR3(胸腺癌)和SKOV3(卵巢癌)均過量表達Her-2/neu。人腫瘤細胞系HCT-116(結(jié)腸癌)和MCF-7(胸腺癌)表達非常低的Her-2/neu蛋白質(zhì)或不表達該蛋白質(zhì)。HLA分型指出，這些腫瘤中僅MCF-7天然表達HLA-B4402(該克隆的限制性等位基因)。使用HLA-B4402的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導SKOV3、SKBR3和HCT-116腫瘤細胞系。用流式細胞術(shù)分析測定親本和轉(zhuǎn)導的腫瘤細胞系及對照成纖維細胞系上I類HLA、HLA-B44和Her-2/neu的表達。用如下FITC標記的單克隆抗體染色腫瘤細胞系或成纖維細胞系IgG(BectonDickinson，陰性對照)；抗I類HLA抗體(Sigma)；與HLA-B分子(包括HLA-B44)亞類結(jié)合的抗Bw4抗體(One Lambda)；抗Her-2/neu抗體CN2(來自O(shè)ncogene Sciences的Ab2)。固定樣品并通過流式細胞術(shù)進行分析。
結(jié)果說明，如預期的，所有測試的細胞系均在細胞表面表達I類HLA。自體成纖維細胞和MCF-7腫瘤細胞表達HLA-B44，而親代腫瘤細胞系SKBR3、SKOV3或HCT-116不表達HLA-B44。用HLA-B44逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導后，所有的腫瘤細胞系均表達HLA-B44。正如預期的，SKBR3和SKOV3腫瘤細胞系均在細胞表面上表達Her-2/neu，而且水平與通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導了Her-2/neu的自體成纖維細胞表達的Her-2/neu量相當。相反，MCF-7、HCT-116和未轉(zhuǎn)導的成纖維細胞在細胞表面上表達非常少的Her-2/neu或不表達Her-2/neu。用Her-2/neu的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導的MCF-7細胞表達Her-2/neu，其水平與SKBR3和SKOV3表達的水平相當。
在IFNγ ELISA和TNFα生物測定試驗中我們測試了Her-2/neu特異性CTL克隆(克隆17D5)識別上述細胞系的能力。表5顯示了IFNγELISA的結(jié)果?？寺?7D5特異地響應(yīng)轉(zhuǎn)導表達Her-2/neu的自體HLA-B4402陽性成纖維細胞而分泌IFNγ。重要的是，克隆17D5特異地響應(yīng)轉(zhuǎn)導了HLA-B4402的SKBR3和SKOV3腫瘤細胞，但不響應(yīng)HLA-B4402陰性的親代腫瘤細胞系或?qū)φ辙D(zhuǎn)導的腫瘤細胞系分泌IFNγ?？寺?7d5不識別HLA-B4402轉(zhuǎn)導的HCT-116腫瘤細胞系。此結(jié)果正如預期的一樣，因為HCT-116腫瘤細胞系僅表達非常低水平的Her-2/neu?？寺?7D5也不識別乳腺腫瘤細胞系MCF-7或Her-2/neu轉(zhuǎn)導的MCF-7。對這些結(jié)果的最有可能的解釋是MCF-7表達的HLA-B4402水平不夠，因為Her-2/neu逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的MCF-7上的Her-2/neu水平與相應(yīng)轉(zhuǎn)導的成纖維細胞上的Her-2/neu水平相似。(這可以通過使用Her-2/neu重組腺病毒感染MCF-7細胞使其表達非常高水平的Her-2/neu來克服)。
表5IFNγ ELISA證明ICD特異性T細胞克隆17D5對腫瘤的識別1

1使用從與所示刺激物或單純培養(yǎng)基孵育的克隆17D5 T細胞獲得的24小時上清液進行標準IFNγELISA。在該測定中17D5 T細胞和刺激物均以10,000個細胞/孔的量使用。在96孔板上一式三份地進行測定。從無T細胞孵育的刺激物獲得的上清液作為對照，其值均不超過本底(數(shù)據(jù)未顯示)。ELISA顯色后，在450nm讀取O.D.，使用570nm作為參照。
2顯示的數(shù)據(jù)為三次重復實驗孔的O.D.讀數(shù)的平均值。
TNFα生物測定試驗的結(jié)果與此IFN-γ結(jié)果相符。
ELISA克隆17D5特異地響應(yīng)轉(zhuǎn)導了表達HLA-B4402的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的SKBR3和SKOV3而分泌TNFα(表6)。
表6TNFα生物測定試驗證明T細胞克隆17D5對腫瘤的識別1

196孔板中一式三份地將克隆17D5 T細胞(10,000個細胞/孔)與所示APC(10,000個細胞/孔)一起或在單純培養(yǎng)基中孵育。收獲4小時上清液并將其加入TNFα敏感細胞系WEHI(以30,000個細胞/孔接種在96孔板中)。將WEHI細胞和上清液一起孵育過夜，并每孔加入1/10終體積的alomarblue。加入Alomar blue后7小時和24小時，讀取O.D.570nm-630nm。所示結(jié)果為24小時時間點上的結(jié)果。
2O.D.數(shù)據(jù)為三次重復實驗孔的平均值，指示了TNFα敏感WEHI細胞的相對存活力，較低的值指示細胞死亡增加，也即TNFα的分泌增加。
由于以上結(jié)果證明了使用ICD重組腺病毒體外致敏的CD8+T細胞能夠識別過表達Her-2/neu的人腫瘤細胞，故該結(jié)果是有意義的。20％至40％的人乳腺癌以及一定比例的卵巢、肺和結(jié)腸癌過表達Her-2/neu。這些數(shù)據(jù)支持了ICD作為Her-2/neu陽性腫瘤疫苗的用途。
實施例5在大腸桿菌中表達人Her-2/neu HICD本實施例描述了構(gòu)建用于表達重組人Her-2/neu ICD(HICD)蛋白質(zhì)的構(gòu)建體。
PCR擴增人ICD的開放閱讀框，并將其亞克隆至修飾的pET28載體中用于在大腸桿菌中表達重組蛋白質(zhì)。制備具有N端組氨酸標簽的兩個構(gòu)建體，其中一個具有蛋白酶切割位點，而另一個沒有此位點。制備一個帶有C端組氨酸標簽的構(gòu)建體，和一個不帶組氨酸標簽的構(gòu)建體。
HICD_plus_8_HIS(SEQ ID NOs5和11)的構(gòu)建首先從pGS10 ATG質(zhì)粒使用如下引物PCR擴增ICD編碼區(qū)PDM-44(SEQ ID NO16)5′atctctggcgcgctggatgacgatgacaagaaacgacggcagcagaagPDM-45(SEQ ID NO17)5′cagggcgcgccactcgagtcattacactggcacgtccagacccagPCR條件如下10μl 10×Pfu緩沖液(Stratagene，La Jolla，CA)，1.25μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，3μl 10μM PDM-44寡聚物，3μl 10μM PDM-45寡聚物，80μl無菌水，2μl Pfu DNA聚合酶，約5ng pGS10Δ ATG DNA。熱循環(huán)條件如下96℃ 2分鐘的單個變性步驟；之后40個循環(huán)96℃ 30秒，68℃ 15秒和72℃ 6分鐘45秒；最后72℃延伸10分鐘。樣品在進一步分析之前保存在4℃。將該PCR產(chǎn)物克隆在修飾的pT7blue質(zhì)粒中，該質(zhì)粒含有與在PDM-44引物中包括的BssHII位點符合閱讀框的8His標簽編碼區(qū)。用BssHII和AscI消化載體和PCR產(chǎn)物。篩選方向正確的構(gòu)建體，然后測序。之后將該構(gòu)建體克隆至pET14b(Novagen，Madison，WI)的NcoI和AscI位點處。然后將該構(gòu)建體克隆至pET28b(Novagen，Madison，WI)載體的NcoI和HindIII位點處。最終的構(gòu)建體含有8組氨酸標簽以及腸激酶切割位點。
構(gòu)建HICD_in_pPDM_coding_sequence(SEQ ID NOs7和10)使用如下引物從cDNA模板PCR擴增ICD編碼區(qū)PDM-591(SEQ ID NO18)5′cacaaacgacggcagcagaagatccggaag 3’PDM-592(SEQ ID NO19)5′gcgccactcgagtcattacactggcacgtc 3’PCR條件如下10μl 10×Pfu緩沖液(Stratagene，La Jolla，CA)，1μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，10μM PDM-591和-592寡聚物各2μl，83μl無菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，1μl cDNA。熱循環(huán)條件如下首先96℃變性2分鐘；之后40個循環(huán)96℃ 30秒，66℃ 15秒和72℃ 5分鐘；之后72℃最終延伸6分鐘。用XhoI消化PCR產(chǎn)物，并將其克隆在經(jīng)Eco 72I和XhoI消化的pPDM His(一種具有符合閱讀框的His標簽的修飾pET28構(gòu)建體)中。通過序列分析驗證正確的構(gòu)建體，然后用其轉(zhuǎn)化BLR pLys S細胞以便進行表達。
構(gòu)建HICD_CT_His_coding_region(SEQ ID NOs4和8)使用如下引物從cDNA模板PCR擴增ICD編碼區(qū)PDM-72(SEQ ID NO20)5′cgacttcatatgaaacgacggcagcagaagatc 3’PDM-61(SEQ ID NO21)5′ccacgtctagagaaggcgcgccatctggatcattaatgatgatgatgatgatgcactggcacgtccagacccaggta 3’PCR條件如下10μl 10×Pfu緩沖液(Stratagene，La Jolla，CA)，1μl 10mM dNTP(Sigma，St.Louis，MO)，2μl 10μM PDM-72寡聚物，2μl 10μM PDM-61寡聚物，83μl無菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，1μlcDNA。熱循環(huán)條件如下首先96℃變性2分鐘；之后40個循環(huán)96℃ 30秒，66℃ 15秒和72℃ 5分鐘；之后72℃最后延伸6分鐘。用NdeI和NotI消化PCR產(chǎn)物，并將其克隆在經(jīng)NdeI和NotI消化的pPDMHis(一種具有符合閱讀框的His標簽的修飾pET28構(gòu)建體)中。通過序列分析驗證正確的構(gòu)建體，然后用其轉(zhuǎn)化BLR pLys S細胞以便進行表達。
構(gòu)建HICD_native_coding_region(SEQ ID NOs6和9)用KpnI和AscI消化VR102人Her-2/neu，分離出人Her-2/neu的ICD區(qū)域的C端部分。將此704bp插入片斷亞克隆至同樣用KpnI和AscI消化(該消化從此構(gòu)建體中除去了C端His標簽，之后替換為所述704bp插入片斷)的具有C端His標簽的pET28HICD中。通過序列分析驗證正確的構(gòu)建體。
實施例6克隆并測序來源于her-2/neu特異性CD8 T細胞的TCRα和β鏈本實施例描述了實施例4所述Her-2/neu特異性CD8 T細胞克隆的T細胞受體(TCR)α和β鏈的克隆和測序。序列分析證明，該TCR的α鏈屬于Vα16家族而β鏈屬于Vβ14家族。此外，鑒定到獨特的多樣性和連接區(qū)段(負責應(yīng)答的特異性)。
使用Trizol試劑從CTL克隆17D5的2×106個細胞中分離出總mRNA，并用Ready-to-go試劑盒(Pharmacia)合成cDNA。為了確定該克隆的Vα和Vβ序列，合成了一組Vα和Vβ亞型特異性引物(基于Clontech，Palo Alto，CA產(chǎn)生的引物序列)并將其和從各個克隆制備的cDNA用于RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)說明，所有的克隆均表達相應(yīng)于Vβ14亞家族的共同Vβ序列。而且，使用從該克隆產(chǎn)生的cDNA，我們確定了表達的Vα序列是Vα16。為了從克隆17D5克隆全長TCRα和β鏈，設(shè)計了橫跨TCR起始密碼子和終止密碼子的編碼核苷酸的引物。引物如下TCRVα-16 5’(有義)(BamHI位點---Kozak--TCRα序列)(SEQ IDNO22)GGATCC---GCCGCCACC--ATGGCCTCTGCACCCATCTCGATCRα3’(反義)(SalI位點---TCRα恒定序列)(SEQ ID NO23)GTCGAC---TCAGCTGGACCACAGCCGCAGTCRVβ-14. 5’(有義)(BamHI位點---Kozak--TCRα序列)(SEQ IDNO24)GGATCC---GCCGCCACC--ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATCRβ3’(反義)(SalI位點---TCRβ恒定序列)(SEQ ID NO25)GTCGAC---TCAGAAATCCTTTCTCTTGAC.
使用從CTL克隆合成的cDNA及上述引物，并使用校正熱穩(wěn)定聚合酶PWO(Roche，Basel，瑞士)進行標準的35循環(huán)RT-PCR反應(yīng)。將所獲特異條帶(對于α鏈為約850bp而對于β鏈為約950bp)連接在PCR平端載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。鑒定含有全長α和β鏈的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，大規(guī)模制備相應(yīng)質(zhì)粒。對含有全長TCRα和β鏈的質(zhì)粒進行測序。測序反應(yīng)驗證了全長TCRα和β鏈的克隆。α和β鏈的cDNA序列分別公開在SEQ ID NOs13和12中，而氨基酸序列分別公開在SEQ ID NOs15和14中。BLAST檢索證實，該Vα屬于Vα16家族而該Vβ屬于Vβ14家族。負責該TCR特異性的多樣性-連接(DJ)區(qū)是獨特的。
從上文所述，應(yīng)當理解，盡管為了舉例說明的目的這里描述了本發(fā)明的具體實施方案，但可以進行多種修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。
序列表<110>Corixa CorporationHand-Zimmerman，SusanCheever，Martin A.
Foy，Teresa M.
Lodes，Michael J.
Kalos，Michael D.
McNeill，Patricia D.
Vedvick，Thomas S.
<120>治療和診斷Her-2/neu相關(guān)惡性腫瘤的組合物和方法<130>210121.544PC<140>PCT<141>2001-08-14<160>25<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>3768<212>DNA<213>人(Homo sapien)<220>
<221>CDS<222>(1)...(3765)<400>1atg gag ctg gcg gcc ttg tgc cgc tgg ggg ctc ctc ctc gcc ctc ttg 48Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15ccc ccc gga gcc gcg agc acc caa gtg tgc acc ggc aca gac atg aag 96Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys20 25 30ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag acc cac ctg gac atg ctc cgc cac 144Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His35 40 45ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac ctg gaa ctc acc tac 192Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr50 55 60ctg ccc acc aat gcc agc ctg tcc ttc ctg cag gat atc cag gag gtg 240Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val65 70 75 80cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag gtc cca ctg 288Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu85 90 95cag agg ctg cgg att gtg cga ggc acc cag ctc ttt gag gac aac tat 336Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga gac ccg ctg aac aat acc acc cct 384Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc ctg cgg gag ctg cag ctt cga agc 432Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg gtc ttg atc cag cgg aac ccc cag 480Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160ctc tgc tac cag gac acg att ttg tgg aag gac atc ttc cac aag aac 528Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175aac cag ctg gct ctc aca ctg ata gac acc aac cgc tct cgg gcc tgc 576Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag ggc tcc cgc tgc tgg gga gag agt 624His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205tct gag gat tgt cag agc ctg acg cgc act gtc tgt gcc ggt ggc tgt 672Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220gcc cgc tgc aag ggg cca ctg ccc act gac tgc tgc cat gag cag tgt 720Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag cac tct gac tgc ctg gcc tgc ctc 768Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255cac ttc aac cac agt ggc atc tgt gag ctg cac tgc cca gcc ctg gtc 816His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270acc tac aac aca gac acg ttt gag tcc atg ccc aat ccc gag ggc cgg 864Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg act gcc tgt ccc tac aac tac ctt 912Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300tct acg gac gtg gga tcc tgc acc ctc gtc tgc ccc ctg cac asc caa 960Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys pro Leu His Asn Gln305 310 315 320gag gtg aca gca gag gat gga aca cag cgg tgt gag aag tgc agc aag 1008Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt ctg ggc atg gag cac ttg cga gag 1056Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350
gtg agg gca gtt acc agt gcc aat atc cag gag ttt gct ggc tgc aag1104Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt ctg ccg gag agc ttt gat ggg gac1152Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc cag cca gag cag ctc caa gtg ttt1200Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400gag act ctg gaa gag atc aca ggt tac cta tac atc tca gca tgg ccg1248Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415gac agc ctg cct gac ctc agc gtc ttc cag aac ctg caa gta atc cgg1296Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430gga cga att ctg cac aat ggc gcc tac tcg ctg acc ctg caa ggg ctg1344Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc tca ctg agg gaa ctg ggc agt gga1392Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460ctg gcc ctc atc cac cat aac acc cac ctc tgc ttc gtg cac acg gtg1440Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac ccg cac caa gct ctg ctc cac act1488Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495gcc aac cgg cca gag gac gag tgt gtg ggc gag ggc ctg gcc tgc cac1536Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc tgg ggt cca ggg ccc acc cag tgt1584Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg ggc cag gag tgc gtg gag gaa tgc1632Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg gag tat gtg aat gcc agg cac tgt1680Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag ccc cag aat ggc tca gtg acc tgt1728Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575ttt gga ccg gag gct gac cag tgt gtg gcc tgt gcc cac tat aag gac1776Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590cct ccc ttc tgc gtg gcc cgc tgc ccc agc ggt gtg aaa cct gac ctc1824Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605tcc tac atg ccc atc tgg aag ttt cca gat gag gag ggc gca tgc cag1872Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln610 615 620cct tgc ccc atc aac tgc acc cac tcc tgt gtg gac ctg gat gac aag1920Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys625 630 635 640ggc tgc ccc gcc gag cag aga gcc agc cct ctg acg tcc atc atc tct1968Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser645 650 655gcg gtg gtt ggc att ctg ctg gtc gtg gtc ttg ggg gtg gtc ttt ggg2016Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly660 665 670atc ctc atc aag cga cgg cag cag aag atc cgg aag tac acg atg cgg2064Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg675 680 685aga ctg ctg cag gaa acg gag ctg gtg gag ccg ctg aca cct agc gga2112Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly690 695 700gcg atg ccc aac cag gcg cag atg cgg atc ctg aaa gag acg gag ctg2160Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu705 710 715 720agg aag gtg aag gtg ctt gga tct ggc gct ttt ggc aca gtc tac aag2208Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys725 730 735ggc atc tgg atc cct gat ggg gag aat gtg aaa att cca gtg gcc atc2256Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile740 745 750aaa gtg ttg agg gaa aac aca tcc ccc aaa gcc aac aaa gaa atc tta2304Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu755 760 765gac gaa gca tac gtg atg gct ggt gtg ggc tcc cca tat gtc tcc cgc2352Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg770 775 780ctt ctg ggc atc tgc ctg aca tcc acg gtg cag ctg gtg aca cag ctt2400Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu785 790 795 800atg ccc tat ggc tgc ctc tta gac cat gtc cgg gaa aac cgc gga cgc2448Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg805810 815ctg ggc tcc cag gac ctg ctg aac tgg tgt atg cag att gcc aag ggg2496Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly820 825 830atg agc tac ctg gag gat gtg cgg ctc gta cac agg gac ttg gcc gct2544Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala835 840 845
cgg aac gtg ctg gtc aag agt ccc aac cat gtc aaa att aca gac ttc2592Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe850 855 860ggg ctg gct cgg ctg ctg gac att gac gag aca gag tac cat gca gat2640Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp865 870 875 880ggg ggc aag gtg ccc atc aag tgg atg gcg ctg gag tcc att ctc cgc2688Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg885 890 895cgg cgg ttc acc cac cag agt gat gtg tgg agt tat ggt gtg act gtg2736Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val900 905 910tgg gag ctg atg act ttt ggg gcc aaa cct tac gat ggg atc cca gcc2784Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala915 920 925cgg gag atc cct gac ctg ctg gaa aag ggg gag cgg ctg ccc cag ccc2832Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro930 935 940ccc atc tgc acc att gat gtc tac atg atc atg gtc aaa tgt tgg atg2880Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met945 950 955 960att gac tct gaa tgt cgg cca aga ttc cgg gag ttg gtg tct gaa ttc2928Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe965 970 975tcc cgc atg gcc agg gac ccc cag cgc ttt gtg gtc atc cag aat gag2976Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu980 985 990gac ttg ggc cca gcc agt ccc ttg gac agc acc ttc tac cgc tca ctg3024Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu995 10001005ctg gag gac gat gac atg ggg gac ctg gtg gat gct gag gag tat ctg3072Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu101010151020gta ccc cag cag ggc ttc ttc tgt cca gac cct gcc ccg ggc gct ggg3120Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly102510301035 1040ggc atg gtc cac cac agg cac cgc agc tca tct acc agg agt ggc ggt3168Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly104510501055ggg gac ctg aca cta ggg ctg gag ccc tct gaa gag gag gcc ccc agg3216Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg106010651070tct cca ctg gca ccc tcc gaa ggg gct ggc tcc gat gta ttt gat ggt3264Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly107510801085gac ctg gga atg ggg gca gcc aag ggg ctg caa agc ctc ccc aca cat3312Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His
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100 105 110Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro115 120 125Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser130 135 140Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln145 150 155 160Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn165 170 175Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys180 185 190His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser195 200 205Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys210 215 220Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys225 230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu245 250 255His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val260 265 270Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg275 280 285Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu290 295 300Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln305 310 315 320Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys325 330 335Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu340 345 350Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys355 360 365Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp370 375 380Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe385 390 395 400Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro405 410 415Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg420 425 430Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu435 440 445Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly450 455 460Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val465 470 475 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr485 490 495Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His500 505 510Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys515 520 525Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys530 535 540Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys545 550 555 560Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys565 570 575Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp580 585 590Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
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<223>引物PDM-61<400>21ccacgtctag agaaggcgcg ccatctggat cattaatgat gatgatgatg atgcactggc 60acgtccagac ccaggta77<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR Valpha-16 5′<400>22ggatccgccg ccaccatggc ctctgcaccc atctcga 37<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR alpha 3′<400>23gtcgactcag ctggaccaca gccgcag 27<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物TCR Vbeta-14.5′<400>24ggatccgccg ccaccatggg cccccagctc cttggcta 38<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物TCR beta 3′<400>25gtcgactcag aaatcctttc tcttgac 2權(quán)利要求
1.有效地在患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的分離的多核苷酸組合物，所述多核苷酸編碼包含基本上由SEQ ID NO3組成的氨基酸序列的多肽。
2.有效引起免疫應(yīng)答的分離的多肽組合物，所述多肽包含基本上由SEQ ID NO3組成的氨基酸序列。
3.包含權(quán)利要求1的多核苷酸或權(quán)利要求2的多肽以及藥學可接受載體的藥物組合物。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，還包含免疫刺激劑。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述免疫刺激劑包含佐劑。
6.在患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用有效量的權(quán)利要求1的多核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述患者是HLA-B44陽性的。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
9.在患者體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的方法，包括給患者施用有效量的具有SEQ ID NO1大約第2026-3765位核苷酸的序列的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
11.分離的多核苷酸組合物，其包含SEQ ID NO13所示的TCR-α序列。
12.分離的多核苷酸組合物，其包含SEQ ID NO12所示的TCR-β序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療和診斷癌癥，尤其是Her－2/neu相關(guān)癌癥的組合物和方法。示例性組合物含有一種或多種Her－2/Neu多肽、其免疫原性片斷，編碼這些多肽的多核苷酸，表達這些多肽的抗原呈遞細胞，和對表達這些多肽的細胞具有特異性的T細胞。這些公開的組合物可用于例如診斷、預防和/或治療Her－2/neu相關(guān)惡性腫瘤。
文檔編號C07K14/71GK1537164SQ01816447
公開日2004年10月13日 申請日期2001年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月14日
發(fā)明者S·漢德－齊姆默爾曼, M·A·齊弗, T·M·福伊, M·J·洛德斯, M·D·卡洛斯, P·D·麥克尼爾, T·S·維德威克, S 漢德-齊姆默爾曼, 卡洛斯, 洛德斯, 福伊, 維德威克, 麥克尼爾, 齊弗 申請人:科里克薩有限公司