專利名稱：硫代磷酸寡核苷酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硫代磷酸寡核苷酸的合成方法。
過去大約15年來，寡聚脫氧核糖核苷酸(DNA序列)、寡聚核糖核苷酸(RNA序列)及其類似物的合成方面已有很大進展(′Methods inMolecular Biology，Vol.20，Protocol for Oligonucleotides andAnalogs′，Agrawal，S.Ed.，Humana Press，Totowa，1993)。大量工作已在微摩爾或更低水平實現(xiàn)，包括單體亞磷酰胺模塊的自動化固相合成(Beaucage，S.L.；Caruthers，M.H.Tetrahedron Lett.，1981，22，1859-1862)已被證明是最方便的方法。實際上，現(xiàn)在用商業(yè)合成儀已可常規(guī)制備高分子量DNA和相對高分子量RNA序列。這些合成寡核苷酸已滿足生物學(xué)和生物技術(shù)方面的許多基本需要。
毫克量一般已滿足分子生物學(xué)目的，而臨床試驗需要克級到大于100克的量。作為潛在的反義藥物，幾種寡核苷酸類似物現(xiàn)已進入高級臨床試驗，看起來可能在很近的將來，如果這些序列中的一個被批準，也即，用于治療AIDS或某種癌癥，將需要千克、幾千克、或更大量的特定序列。
當前制藥業(yè)關(guān)心的很多寡核苷酸是天然寡核苷酸的類似物，其中含有核苷間硫代磷酸連接。存在硫代磷酸連接時，特別是大部分連接是這種連接，尤其是100％的核苷間連接都是這種連接時，將最終產(chǎn)物中的雜質(zhì)濃度、非硫代磷酸連接保持在藥物允許水平是非常需要的。
大量寡核苷酸合成方法用乙腈作為所用試劑的溶劑。用乙腈作溶劑很吸引人，因為它對試劑和寡核苷酸呈惰性，具有良好的溶解性能，且是環(huán)境允許的。一般對于大規(guī)模合成來說，在從固相支持物上切除寡核苷酸產(chǎn)物的階段存在高濃度乙腈。迄今為止，因為乙腈已知的惰性，這已被大規(guī)模合成接受。然而，在導(dǎo)致本發(fā)明的研究期間，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，通過降低切除步驟中的乙腈濃度可以獲得更高純度的寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種大規(guī)模合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括a) 在乙腈存在下組裝結(jié)合到固相支持物上的寡核苷酸；和
b) 從固相支持物上切除寡核苷酸；其特征在于在從固相支持物上切除寡核苷酸之前，將乙腈濃度降低到寡核苷酸加固相支持物重量的10％以下。
可通過已知的固相合成方法組裝硫代磷酸寡核苷酸，例如用H-膦酸酯或特別是亞磷酰胺化學(xué)體。對于亞磷酰胺方法，一般使用的順序是將結(jié)合到固相支持物上的核苷脫保護，優(yōu)選在5’-位置；優(yōu)選在3’-，偶聯(lián)亞磷酰胺核苷形成結(jié)合于支持物上的寡核苷酸；通過與硫化劑反應(yīng)硫化支持物上的寡核苷酸，生成支持物上的硫代磷酸寡核苷酸；用封閉劑將支持物上的未反應(yīng)核苷封閉。然后重復(fù)該循環(huán)，這對于組裝期望的寡核苷酸序列經(jīng)常是必要的。當希望得到混合的磷酸/硫代磷酸產(chǎn)物時，可以用氧化步驟代替硫化步驟以在預(yù)定位置生成磷酸鍵連接。組裝完成時，從支持物上切除之前，經(jīng)常用乙腈洗滌支持物上的寡核苷酸以去除痕量的未反應(yīng)試劑。
可通過干燥支持物上的寡核苷酸除去乙腈，這可以在負壓下進行。通常在室溫脫乙腈，例如15到30℃，盡管也可以提高溫度，如從30到80℃，例如從40到60℃。
根據(jù)本發(fā)明第一個方面的方法適用于大規(guī)模寡核苷酸合成。大規(guī)模寡核苷酸合成經(jīng)常被認為是每批量10mmol寡核苷酸或更多，通常是15mmol或更多，經(jīng)常是25mmol或更多，例如大于50mmol，尤其是大于75mmol的寡核苷酸。在很多實施方案中，本發(fā)明的方法適用于寡核苷酸合成的規(guī)模范圍在100-500mmol。
組裝完預(yù)期產(chǎn)物后，可以從固相支持物上將該產(chǎn)物切除。給定固相支持物的切除方法本領(lǐng)域公知。如果產(chǎn)物通過可切除的連接結(jié)合到固相支持物上，也可使用適于該連接的切除方法，例如，與甲胺、甲胺水溶液、液氨、氨氣接觸，尤其是與濃氨水溶液接觸。切除之后，可用本領(lǐng)域已知的方法純化產(chǎn)物，如離子交換色譜、反相色譜和從適當溶劑中沉淀的一種或多種。也可用例如超濾對產(chǎn)物進一步處理。
根據(jù)本發(fā)明方法中使用的固相支持物在所用溶劑中基本上不溶，它們包括在寡核苷酸固相合成領(lǐng)域中熟知的支持物。實例包括硅膠、控制孔徑玻璃，聚苯乙烯、含聚苯乙烯的共聚物如聚苯乙烯-聚乙二醇共聚物和聚合物如聚乙酸乙烯酯。另外，微孔或軟凝膠支持物，特別是聚丙烯酰胺支持物，如更常用于固相肽合成的類型，需要時也可使用。優(yōu)選的聚丙烯酰胺支持物是胺基官能化的支持物，特別是由丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和雙-丙烯酰乙二胺共聚制備的支持物衍生的類型，如以目錄名PL-DMA銷售的商品支持物(PolymerLaboratories)。這些支持物的制備方法見Atherton，E.；Sheppard，R.C.；in Solid Phase SynthesisA Practical Approach，Publ.，IRL Press at Oxford University Press(1984)。這些支持物上的官能團是甲基酯，首先通過與烷基二胺如乙二胺反應(yīng)轉(zhuǎn)變成伯胺基官能團。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種硫代磷酸寡核苷酸的合成方法，其中包括a) 在乙腈存在下組裝結(jié)合到固相支持物上的寡核苷酸；b) 在從固相支持物上切除寡核苷酸之前，用使用一或多步溶劑洗滌的洗滌操作洗滌結(jié)合到固相支持物上的寡核苷酸；和c) 從固相支持物上切除寡核苷酸。
其特征在于所用洗滌操作的最后洗滌步驟使用除乙腈或二噁烷以外的溶劑。
洗滌操作包括一或多步溶劑洗滌。如果洗滌操作含有單步洗滌，所用溶劑不含乙腈和二噁烷。如果包括一步以上溶劑洗滌，可以在最后洗滌步驟以外的洗滌階段使用乙腈和二噁烷。然而，優(yōu)選在洗滌操作的任何步驟中不使用乙腈和二噁烷。
優(yōu)選使用在溶劑使用條件下不降解寡核苷酸的惰性溶劑。可用的惰性溶劑的實例包括惰性有機溶劑和惰性水性溶劑。
優(yōu)選地，溶劑洗滌要達到使乙腈濃度降低到寡核苷酸加固相支持物重量的10％以下。
可使用的有機溶劑包括芳香烴，例如甲苯；脂肪烴，例如環(huán)己烷；鹵代烷，特別是二氯甲烷；酯，特別是烷基酯如乙酸乙酯和丙酸甲酯或乙酯；醇，特別是脂肪醇如C1-4烷基醇，例如甲醇、乙醇或異丙醇；酰胺，如二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮；堿，親核溶劑如吡啶或烷基胺，尤其是三(烷基)胺，如三(C1-4烷基)胺；極性醚如四氫呋喃；和亞砜，例如二甲基亞砜。
可使用的水性溶劑包括水、水性緩沖液、水和水互溶性惰性有機溶劑的混合物，尤其是與上述溶劑的混合物。
可使用的固相支持物在有關(guān)本發(fā)明第一方面內(nèi)容中已有描述。在許多實施方案中，如果支持物是疏水的如聚苯乙烯時，優(yōu)選使用有機溶劑。在另外一些實施方案中，如果支持物是親水的，如控制孔徑玻璃或硅膠，優(yōu)選使用水性溶劑。在進一步的實施方案中，如果支持物是微孔性的，優(yōu)選使用可溶脹支持物的溶劑。
在某些優(yōu)選實施方案中，所用溶劑用于從寡核苷酸上去除保護基，特別是從核苷酸間連接上去除β-氰乙基保護基，和核堿基(nucleobase)保護基。優(yōu)選溶劑是烷基胺，尤其是三(烷基)胺，如三(C1-4烷基)胺，最優(yōu)選三乙胺。
根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法可同時用于小(即＜25mmol規(guī)模)和大規(guī)模寡核苷酸合成，如上面本發(fā)明第一方面所述。
通過上述與本發(fā)明第一方面有關(guān)的方法，可組裝寡核苷酸，然后經(jīng)洗滌后從固相支持物上切除。
在本發(fā)明第一和第二方面，乙腈濃度優(yōu)選降低到小于寡核苷酸加固相支持物重量的5％，經(jīng)常小于3％，特別是小于約2％，尤其是小于約1％。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案含有在乙腈存在下組裝結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸，空氣干燥結(jié)合于支持物上的寡核苷酸，將干燥的結(jié)合于支持物上的寡核苷酸與三烷基胺，優(yōu)選三乙胺接觸足夠時間，使寡核苷酸去保護，隨后從固相支持物上切除寡核苷酸。
在本發(fā)明的相關(guān)實施方案中，提供一種硫代磷酸寡核苷酸的合成方法，其中包括a)在乙腈存在下組裝結(jié)合到固相支持物上的寡核苷酸；b)在從固相支持物上切除寡核苷酸之前，用使用一或多步溶劑洗滌的洗滌操作洗滌結(jié)合到固相支持物上的寡核苷酸；和c)從固相支持物上切除寡核苷酸。
其特征在于所用洗滌操作的最后洗滌步驟使用溶液進行溶劑洗滌，其中含有烷基胺，優(yōu)選三(C1-4)烷基胺如三乙胺，其中基本上不含乙腈。可用一或多個溶劑洗滌操作。優(yōu)選在任何溶劑洗滌操作中不使用乙腈。
用亞磷酰胺化學(xué)體的寡核苷酸合成被認為是新方法，其中寡核苷酸在微孔支持物的支持下合成。因此，本發(fā)明的第三個方面提供一種寡核苷酸制備方法，其中包括將核苷或寡核苷酸亞磷酰胺與固相支持物支持的含有游離羥基的核苷或寡核苷酸偶聯(lián)，形成寡核苷酸亞磷酸三酯，其特征在于固相支持物是微孔支持物。
微孔支持物優(yōu)選是聚丙烯酰胺支持物，如更常用于固相肽合成的類型，需要時可以使用。優(yōu)選的聚丙烯酰胺支持物是胺基官能化的支持物，尤其是由丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和雙-丙烯酰乙二胺共聚制備的支持物衍生的類型，如以目錄名PL-DMA銷售的商品(Polymer Laboratories)支持物。這些支持物的制備方法見Atherton，E.；Sheppard，R.C.；in Solid Phase SynthesisAPractical Approach，Publ.，IRL Press at Oxford UniversityPress(1984)，其中的微孔支持物在此引作參考。這些胺基官能化支持物上的官能團是甲基酯，首先通過與烷基二胺如乙二胺反應(yīng)轉(zhuǎn)變成伯胺基官能團。微孔支持物優(yōu)選使用聚合物球形式。
根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法優(yōu)選在溶脹微孔支持物的溶劑存在下實施。這種溶劑的實例包括鹵代烷，特別是二氯甲烷；酯，特別是烷基酯如乙酸乙酯和丙酸甲酯或乙酯；醚如四氫呋喃；和優(yōu)選酰胺，如二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮。最優(yōu)選的溶劑是二甲基甲酰胺。
所用核苷或寡核苷酸亞磷酰胺可含3’-或5’-亞磷酰胺基團，最優(yōu)選3’-亞磷酰胺基。通常亞磷酰胺是β-氰乙氧基亞磷酰胺。在不是亞磷酰胺基團的3’-或5’-位置，核苷或寡核苷酸亞磷酰胺通常含有受保護的羥基，優(yōu)選在5’-位置是受保護的羥基。優(yōu)選的保護基是pixyl和三苯甲基，尤其是二甲氧基三苯甲基。
所用含游離羥基的核苷或寡核苷酸可含3’-或5’-羥基，且通常通過不是游離羥基的3’-或5’-位置結(jié)合到固相支持物上。最優(yōu)選地，含游離羥基的核苷或寡核苷酸通過3’-位置結(jié)合到固相支持物上，并含有游離5’-羥基。
含游離羥基的核苷或寡核苷酸通常通過可切除性連接結(jié)合到固相支持物上。
核苷或寡核苷酸亞磷酰胺與含游離羥基的核苷或寡核苷酸偶聯(lián)在適當活化劑存在下進行。這些活化劑的實例是常規(guī)亞磷酰胺寡核苷酸合成領(lǐng)域已知的類型，它們包括四唑、硫代乙基四唑、硝基苯四唑和二氰基咪唑。通常，核苷或寡核苷酸亞磷酰胺以在用于溶脹微孔支持物的溶劑中的溶液使用。在添加溶于用來溶脹微孔支持物的溶劑中的活化劑溶液之前，亞磷酰胺溶液優(yōu)選與含游離羥基的溶脹支持物混合。
通常將在本發(fā)明第三方面方法中產(chǎn)生的寡核苷酸亞磷酸三酯氧化或硫化，形成寡核苷酸磷酸酯或硫代磷酸酯。所用氧化劑在常規(guī)亞磷酰胺寡核苷酸合成領(lǐng)域已知，它們包括碘和叔丁基氫過氧化物。所用硫化劑在常規(guī)亞磷酰胺寡核苷酸合成領(lǐng)域已知，它們包括蒼耳烷氫化物、二硫化苯基乙酰和Beaucage試劑。氧化劑或硫化劑通常以溶液形式使用，其中的溶劑是用于溶脹微孔支持物的。
可用本領(lǐng)域已知的封閉劑進行封閉處理，例如使用吡啶和乙酸酐混合物和吡啶和N-甲基咪唑的混合物。使用封閉劑時優(yōu)選存在溶脹微孔支持物的溶劑。
結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸磷酸酯或硫代磷酸酯上有pixyl或三苯甲基保護基，通常在5’-位置，可以用常規(guī)脫三苯甲基方法去除，例如用二氯乙酸溶液處理。二氯乙酸優(yōu)選以溶液形式使用，其中溶劑是溶脹微孔支持物的溶劑，例如二氯甲烷或優(yōu)選地和酰胺，特別是二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮。去除pixyl或三苯甲基保護基產(chǎn)生游離羥基，然后它可用于進一步偶聯(lián)。為組裝預(yù)期序列可進行進一步偶聯(lián)。預(yù)期序列組裝完成后，可用所用連接適用的方法從固相支持物上切除產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的方法可用于合成硫代磷酸脫氧核糖核酸和核糖核酸。核苷酸可含有堿基、保護基和核苷酸領(lǐng)域已知的其它修飾。例如，堿基可以是嘌呤和嘧啶，通常是A、G、T、C和U。可以使用的其它堿基包括次黃嘌呤、肌苷和2，6-二氨基嘌呤。可能的保護基包括堿基保護基，如苯甲基、乙?；?、苯氧乙?；彤惗□；?，和羥基保護基，如pixyl和三苯甲基，尤其是二甲氧基三苯甲基。核糖核苷酸可用烷氧基或烷氧烷基取代基在2’-位修飾，如甲氧基或甲氧乙氧基取代基，或可在2’-位由羥基保護基保護，如叔丁基二甲基甲硅烷基，1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或1-(2-氯苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Cpmp)。也可存在其它修飾，包括反向核苷、脫堿基核苷和L-核苷。脫氧核糖核苷酸可在2’-位被2’-C-烷基修飾?？梢灾苽淝逗闲秃塑账幔ɑ旌厦撗鹾颂呛塑账岷秃颂呛塑账?，和/或混合磷酸/硫代磷酸核苷酸。
在很多實施方案中本發(fā)明的方法用于制備1到100個核苷間連接的寡核苷酸，經(jīng)常是5到75，優(yōu)選8到50，特別優(yōu)選10到30個核苷間連接。通常本發(fā)明方法用于制備這些化合物，其中至少50％的核苷間連接是硫代磷酸，優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選90到100％的硫代磷酸。
本發(fā)明方法中使用的可切除連接體的實例包括固相寡核苷酸合成領(lǐng)域熟知的類型，如氨基甲酸酯，乙二酰基，琥珀酰基和氨基衍生的連接體。優(yōu)選琥珀?；B接體。
將通過以下實施例說明本發(fā)明，這不是對本發(fā)明的限制。
實施例1-3和比較例A含17個硫代磷酸基的全硫代磷酸化的脫氧核糖核苷酸樣品用標準亞磷酰胺化學(xué)法制備。在聚苯乙烯支持物上生成帶三苯甲基的產(chǎn)物。組裝和硫化完成后，用乙腈洗滌支持物上的核苷酸。
按以下方法處理三個結(jié)合在支持物上的寡核苷酸樣品。對于實施例1，結(jié)合于支持物上的寡核苷酸在過濾漏斗中空氣干燥。對于實施例2，用三乙胺洗滌樣品。對于實施例3，用2.5M乙酸鈉水溶液洗滌樣品。在實施例2和3的任一個中，洗滌在輕微負壓下在過濾漏斗中進行，但操作時注意使乙腈蒸發(fā)最低。用GC測量樣品中乙腈含量(％，w/w)。用標準氨解條件用濃氨水切除實施例1-3的產(chǎn)物得到寡核苷酸產(chǎn)物。對于比較例A，結(jié)合于支持物上的另一個寡核苷酸樣品在相同條件下切除，但不經(jīng)干燥或洗滌處理。對于每個實例用離子交換色譜確定樣品中P＝O雜質(zhì)的重量百分比。結(jié)果見下表1。
表1
表1中結(jié)果表明，與切除前不降低乙腈濃度的比較方法相比，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的寡核苷酸(實施例1到3)得到顯著更純的寡核苷酸產(chǎn)物。
實施例4-用微孔支持物合成寡核苷酸以下反應(yīng)在氮氣氛中進行。
肽合成中通常使用的40ml固相燒結(jié)玻璃/鼓泡反應(yīng)器中含1g胺基官能化的聚丙烯酰胺樹脂(載量1mmol/g)，樹脂由PolymerLaboratories獲得，商品名PL-DMA，向反應(yīng)器中加入3當量的5’-DMT-T-3’-琥珀酸酯。加入足量N-甲基吡咯烷酮(NMP)使樹脂在氮氣攪動中剛好可移動，隨后加入4當量二異丙基碳二亞胺和3當量二異丙基乙胺。用氮氣攪動混合物直至由Kaiser試驗表明樹脂已完全負載。用NMP(5X床體積)和二氯甲烷(DCM，5X床體積)洗滌樹脂。加10當量吡咯到DCM潤濕的樹脂中，然后加入15％v/v二氯乙酸(DCA)的DCM溶液(2X床體積)。用氮氣攪動混合物1小時，然后用DCM(5X床體積)和NMP(5X床體積)洗滌，形成5’-脫保護的3’-與支持物結(jié)合的T。
向上述制備的結(jié)合于支持物上的T中加入3當量5’-DMT-T-3’-(β-氰基乙氧基二異丙基氨基)亞磷酰胺。加入足量NMP使樹脂在氮氣攪動下剛好可移動，隨后再加3.3當量S-乙基四唑。氮氣攪動混合物30分鐘，然后用NMP(10X床體積)洗滌。存在足量NMP使樹脂在氮氣攪動下剛好可移動的條件下，用Beaucage試劑(5當量)硫化60分鐘。用NMP(5X床體積)和DCM(5X床體積)洗滌樹脂，形成5’-DMT保護的結(jié)合于支持物上的二聚體硫代磷酸酯。再重復(fù)兩次脫三苯甲基、偶聯(lián)和硫化循環(huán)，形成5’-DMT結(jié)合于支持物上的四聚體硫代磷酸酯。用上面給出的條件脫三苯甲基，從固相支持物上切除，然后用濃氨水溶液室溫處理48小時去除β-氰乙基。
權(quán)利要求
1.一種大規(guī)模合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括a)在乙腈存在下組裝結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸；和b)從固相支持物上切除寡核苷酸；其特征在于，在從固相支持物上切除寡核苷酸之前，乙腈濃度降低到寡核苷酸加固相支持物重量的10％以下。
2.一種合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括a)在乙腈存在下組裝結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸；b)從固相支持物上切除寡核苷酸之前，用使用一或多步溶劑洗滌的洗滌操作洗滌結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸；和c)從固相支持物上切除寡核苷酸其特征在于，洗滌操作的最后洗滌步驟使用除乙腈或二噁烷以外的溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中溶劑選自下組芳香烴，脂肪烴，鹵代烷，酯，醇，酰胺，堿，親核溶劑，極性醚，亞砜，水，水性緩沖液和水與水互溶性有機溶劑的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中溶劑選自下組甲苯，環(huán)己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酸甲酯或乙酯，C1-4烷基醇，二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮，吡啶，三(C1-4-烷基)胺，四氫呋喃，二甲基亞砜和乙酸鈉水溶液。
5.一種合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括a)在乙腈存在下組裝結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸；b)從固相支持物上切除寡核苷酸之前，用使用一或多步溶劑洗滌的洗滌操作洗滌結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸；和c)從固相支持物上切除寡核苷酸其特征在于，洗滌操作的最后洗滌步驟使用含三烷基胺的溶液進行溶劑洗滌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中溶劑是三乙胺。
7.一種合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括在乙腈存在下組裝結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸；空氣干燥支持寡核苷酸；將干燥的支持寡核苷酸與三烷基胺，優(yōu)選三乙胺接觸足夠時間，使寡核苷酸去保護，隨后從固相支持物上切除寡核苷酸。
8.根據(jù)前面任意一項權(quán)利要求的方法，其中乙腈濃度降低到寡核苷酸加固相支持物重量的5％以下，尤其是約1％以下。
9.根據(jù)前面任意一項權(quán)利要求的方法，其中每批寡核苷酸操作量為10mmol或更多。
10.一種制備寡核苷酸的方法，其中包括將核苷或寡核苷酸亞磷酰胺與支持于固相支持物上的含游離羥基的核苷或寡核苷酸偶聯(lián)，形成寡核苷酸亞磷酸三酯，其特征在于固相支持物是微孔支持物。
11.根據(jù)前面任意一項權(quán)利要求的方法，其中固相支持物是胺基官能化的支持物，它由丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和雙-丙烯酰乙二胺共聚制備的支持物衍生。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中胺基官能化的支持物含有伯胺官能團，它衍生于甲基酯基團與烷基二胺，優(yōu)選乙二胺的反應(yīng)。
13.根據(jù)前面任意一項權(quán)利要求的方法，其中寡核苷酸通過可切除連接體結(jié)合到固相支持物上，該連接體選自氨基甲酸酯，乙二?；牾；桶被苌B接體。
14.根據(jù)前面任意一項權(quán)利要求的方法，其中通過與切除劑接觸從固相支持物上切除寡核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中切除劑包括甲胺，甲胺水溶液，液氨，氨氣或濃氨水溶液。
16.根據(jù)前面任意一項權(quán)利要求的方法，用于制備含1到100個核苷間連接的寡核苷酸。
17.根據(jù)前面任意一項權(quán)利要求的方法，用于制備這些化合物，其中至少50％的核苷間連接是硫代磷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中90到100％的核苷間連接是硫代磷酸。
全文摘要
提供一種合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括在乙腈存在下組裝結(jié)合于固相支持物上的寡核苷酸；從固相支持物上切除寡核苷酸之前除去乙腈；以及從固相支持物上切除寡核苷酸。該方法特別適于大規(guī)模核苷酸合成?？赏ㄟ^一或兩步干燥和通過溶劑洗滌除去固相支持物中的乙腈。優(yōu)選的洗滌溶劑含三烷基胺。
文檔編號C07H21/00GK1479745SQ0182010
公開日2004年3月3日 申請日期2001年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月5日
發(fā)明者M·E·杜格拉斯, B·J·梅洛, D·A·維林斯, M E 杜格拉斯, 梅洛, 維林斯 申請人:艾夫西亞有限公司