專利名稱：識(shí)別β淀粉樣肽的人源化抗體的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求以名稱為“識(shí)別β-淀粉樣肽的人源化抗體”的在先臨時(shí)申請(qǐng)U.S.60/251,892(2000年12月6日提交)為優(yōu)先權(quán)。上述申請(qǐng)?jiān)谶@里全文引用作為參考。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)是一種導(dǎo)致老年性癡呆的漸進(jìn)性疾病。通常參見Selkoe，TINS 16403(1993)；Hardy等，WO92/13069；Selkoe，J.Neuropattiol.Exp.Neurol.53438(1994)；Duff等，Nature，373476(1995)；Games等，Nature，373523(1995)。廣義上講，該疾病分為兩類發(fā)生在晚年(65歲以上)的晚期發(fā)作，和老年期之前例如35-60歲之間形成的早期發(fā)作。在該病的兩種類型中，病理學(xué)是相同的，但是如果在早年開始，異?？赡芨訃?yán)重且分布更廣泛。該疾病特征在于至少兩種類型的大腦損傷、神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑。神經(jīng)纖維纏結(jié)是由兩根互相纏繞在一起的細(xì)絲組成的微管相關(guān)的τ蛋白質(zhì)的胞內(nèi)沉積物。老年斑(即淀粉樣斑)是直徑達(dá)150μm通過(guò)腦組織切片的顯微分析觀察到的中心穿插有胞外淀粉樣沉積物的紊亂的神經(jīng)纖維網(wǎng)區(qū)域。淀粉樣斑在大腦中的積累也與唐氏綜合征和其它的認(rèn)知紊亂有關(guān)。
老年斑的主要成分是被稱為Aβ或β-淀粉樣肽的肽。Aβ肽是4-kDa的稱作淀粉樣前體蛋白(APP)的較大跨膜糖蛋白的39-43個(gè)氨基酸的中間片段。通過(guò)不同分泌型酶蛋白水解APP，結(jié)果人們發(fā)現(xiàn)Aβ主要為40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的短型和42-43個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)型兩種。APP的部分疏水跨膜區(qū)域被發(fā)現(xiàn)在Aβ的羧基末端，且其可說(shuō)明Aβ聚集成斑的能力，特別是長(zhǎng)型的情況。淀粉樣斑在大腦中的積累最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死。與這種類型的神經(jīng)系統(tǒng)壞死相關(guān)聯(lián)的生理癥狀被描繪為阿耳茨海默氏病的特征。
APP蛋白的若干突變與阿耳茨海默氏病有關(guān)系。參見，例如，Goate等，Nature 349704(1991)(纈氨酸717突變?yōu)楫惲涟彼?；Chartier Harlan等，Nature 353844(1991))(纈氨酸717突變?yōu)楦拾彼?；Murrell等，Science25497(1991)(纈氨酸717突變?yōu)楸奖彼?；Mullan等，Nature Genet.1345(1992)(雙突變，賴氨酸595-甲硫氨酸596突變?yōu)樘於０?95-亮氨酸596)。這種突變被認(rèn)為是通過(guò)增加或改變APP到Aβ的加工，特別是APP增量加工成為長(zhǎng)型Aβ(即Aβ1-42和Aβ1-43)，導(dǎo)致阿耳茨海默氏病。其它基因例如早衰素(presenilin)基因PS1和PS2中的突變被認(rèn)為是間接影響APP加工來(lái)產(chǎn)生增量的長(zhǎng)型Aβ(參見Hardy，TINS20154(1997))。
小鼠模型已被成功的用于檢測(cè)淀粉樣斑在阿耳茨海默氏病中的意義(Games等，同上，Johnson-Wood等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA941550(1997))。特別地，當(dāng)PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠(其表達(dá)人APP的突變體形式且在年青階段發(fā)展阿耳茨海默氏病)被注射長(zhǎng)型的Aβ時(shí)，它們顯示出阿耳茨海默氏病狀態(tài)的衰退和對(duì)Aβ肽的抗體效價(jià)的增加(Schenk等，Nature 400，173(1999))。上述論述表明Aβ，特別是它的長(zhǎng)型，是引起阿耳茨海默氏病的病因。
McMichael在EP526511中提出了對(duì)預(yù)先確定為AD的患者采用順勢(shì)療法的劑量給藥Aβ(小于或等于10-2mg/天)。對(duì)于帶有約5升血漿的一般人，甚至該劑量的上限預(yù)計(jì)產(chǎn)生不超過(guò)2pg/ml濃度。在人血漿中Aβ的正常濃度一般地在50-200pg/ml范圍內(nèi)(Seubert等，Nature359325(1992)。由于在EP 526,511中建議的劑量只是改變內(nèi)源性循環(huán)Aβ的水平，且在EP 526511中沒(méi)有建議使用佐劑作為免疫刺激劑，因此產(chǎn)生的任何治療性結(jié)果似乎都是難以置信的。
因此，存在著用于阿耳茨海默氏病的新的療法和藥劑的需求，特別是能夠在生理學(xué)(例如，無(wú)毒的)劑量上產(chǎn)生有益治療效果的治療方法和藥劑。
發(fā)明的概述本發(fā)明提供新的免疫藥物，特別是用于致淀粉樣的(amyloidogenic)疾病(例如，阿耳茨海默氏病)的預(yù)防和治療的治療抗體藥物。本發(fā)明是基于，至少部分基于，兩種特異性結(jié)合于Aβ肽并有效減少斑沉積和/或減少與致淀粉樣紊亂有關(guān)的神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)障礙的單克隆抗體的鑒定和表征。這些抗體的結(jié)構(gòu)和功能分析導(dǎo)致了用于預(yù)防和/或治療的各種人源化抗體的設(shè)計(jì)。特別地，本發(fā)明突出了這些抗體的不同區(qū)域的人源化，并因此提供了人源化的免疫球蛋白或抗體鏈，完全人源化的免疫球蛋白或抗體以及功能性免疫球蛋白或抗體片段，尤其是特征抗體的抗原結(jié)合片段。
含有所述特征單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)的多肽和多核苷酸藥物以及適用于編碼所述多肽的載體和宿主也被本發(fā)明公開。
淀粉樣遺傳疾病(例如，阿耳茨海默氏病)的治療方法以及在此方法中使用的藥物組合物和試劑盒也被公開。
本發(fā)明還提供鑒定在所述特征單克隆抗體中對(duì)于特有免疫功能重要的殘基的方法以及鑒定能夠在當(dāng)用于治療藥物時(shí)提高了結(jié)合親合力和/或減少了免疫原性的人源化抗體的設(shè)計(jì)中負(fù)責(zé)取代的殘基的方法。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1描述了小鼠3D6、人源化3D6、Kabat ID 109230和種系A(chǔ)19抗體輕鏈的氨基酸序列的比對(duì)。CDR區(qū)域用箭頭顯示。粗斜體顯示鼠稀有殘基。粗體表示包裝(VH+VL)殘基。實(shí)體表示規(guī)范/CDR相互作用殘基。星號(hào)表示人源化3D6改型1回復(fù)突變所選擇的殘基。
圖2描述小鼠3D6、人源化3D6、Kabat ID 045919和種系VH3-23抗體的重鏈的氨基酸序列的比對(duì)。注解同圖1。
圖3圖示了3D6、嵌合3D6和10D5的Aβ結(jié)合特性。圖3A圖解了Aβ結(jié)合于嵌合的3D6(PK1614)以及與結(jié)合于鼠3D6的比較。圖3B圖示了生物素?；?D6對(duì)未標(biāo)記的3D6、PK1614和10D5競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aβ。
圖4描述了3D6 VH和VL的同源性模型，顯示了α-碳主鏈跡線。VH被顯示為點(diǎn)線，且VL被顯示為實(shí)線。CDR區(qū)域被顯示為條帶的形式。
圖5圖示了嵌合3D6和人源化3D6的Aβ結(jié)合特性。圖5A描述了人源化3D6v1和嵌合3D6結(jié)合于聚集Aβ的測(cè)定的ELISA結(jié)果。圖5B描述了人源化3D6v1和人源化3D6v2結(jié)合于聚集Aβ的測(cè)定的ELISA結(jié)果。
圖6是定量測(cè)定人源化3D6和嵌合3D6與來(lái)自PDAPP小鼠腦切片的Aβ斑結(jié)合的圖表。
圖7顯示人源化3D6改型1和2、嵌合3D6、鼠3D6和10D5與鼠3D6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aβ的能力的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果。
圖8圖示了測(cè)定人源化3D6v2、嵌合3D6和人IgG通過(guò)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)Aβ攝取能力的離體吞噬作用測(cè)定試驗(yàn)。
圖9描述了10D5 VL和3D6 VL氨基酸序列的比對(duì)。黑體表示與10D5精確匹配的殘基。
圖10描述了10D5 VH和3D6 VH氨基酸序列的比對(duì)。黑體表示與10D5精確匹配的殘基。
發(fā)明的具體描述本發(fā)明提供了一種新的用于預(yù)防或治療阿耳茨海默氏病或其它致淀粉樣疾病的免疫藥物和方法。本發(fā)明是基于，至少部分基于，在結(jié)合β淀粉樣蛋白(Aβ)(例如，結(jié)合可溶性和/或聚集性Aβ)、介導(dǎo)吞噬作用(例如，聚集性Aβ的吞噬)、減少斑沉積和/或減少神經(jīng)性營(yíng)養(yǎng)障礙(例如在患者中)方面有效的兩種單克隆免疫球蛋白3D6和10D5的表征。本發(fā)明進(jìn)一步基于這些免疫球蛋白的可變輕鏈和重鏈的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的確定和結(jié)構(gòu)表征以及對(duì)于活性和免疫原性是重要的殘基的鑒定。
本發(fā)明提供免疫球蛋白，其包括此處所述的優(yōu)選的單克隆免疫球蛋白的可變輕鏈和/或重鏈。還提供優(yōu)選的免疫球蛋白，例如治療性免疫球蛋白，其包括人源化的可變輕鏈和/或人源化的可變重鏈。優(yōu)選的可變輕鏈和/或重鏈包括來(lái)自單克隆免疫球蛋白(例如，供體免疫球蛋白)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和基本上來(lái)自人受體免疫球蛋白的可變構(gòu)架區(qū)。短語(yǔ)“基本上來(lái)自人受體免疫球蛋白”是指大多數(shù)或關(guān)鍵的構(gòu)架殘基是來(lái)自人受體序列，然而允許用選擇來(lái)提高人源化免疫球蛋白活性(例如，改變活性使得其更接近模擬供體免疫球蛋白的活性)或降低人源化免疫球蛋白的免疫原性的殘基在特定的位置進(jìn)行殘基取代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈，其包含3D6可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(即包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自輕鏈可變區(qū)序列如SEQ ID NO2所闡述的CDR或包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自重鏈可變區(qū)序列如SEQ ID NO4所闡述的CDR)，并包括一個(gè)基本上來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基被回復(fù)突變?yōu)橄鄳?yīng)的鼠殘基，其中所述的回復(fù)突變基本上不影響鏈和Aβ直接結(jié)合的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈，其包含3D6可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(例如包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自輕鏈可變區(qū)序列如SEQ ID NO2所闡述的CDR和/或包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自重鏈可變區(qū)序列如SEQ ID NO4所闡述的CDR)，并包括一個(gè)基本上來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6輕鏈或重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)氨基酸殘基取代，其中構(gòu)架殘基選自(a)非共價(jià)直接結(jié)合抗原的殘基；(b)與CDR相鄰的殘基；(c)CDR-相互作用的殘基(例如，通過(guò)在同源的已知免疫球蛋白鏈的解開結(jié)構(gòu)上模擬輕鏈或重鏈來(lái)確定)；以及(d)在VL-VH界面上共同參與的殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈，其包含3D6可變區(qū)CDR和來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6輕鏈或重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)氨基酸殘基取代，其中通過(guò)可變區(qū)的三維模型分析，構(gòu)架殘基是一種能夠影響輕鏈可變區(qū)構(gòu)型或功能的殘基，例如能夠與抗原相互作用的殘基、近接于抗原結(jié)合位點(diǎn)的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、與CDR相鄰的殘基、在離CDR殘基6內(nèi)的殘基、規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、鏈間包裝殘基、稀有殘基或在結(jié)構(gòu)模型表面上的糖基化位點(diǎn)殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白輕鏈，其包括3D6可變區(qū)CDR(例如，來(lái)自3D6輕鏈可變區(qū)序列，如SEQID NO2所闡述)，并包括人受體免疫球蛋白可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)選自L1、L2、L36和L46(Kabat編號(hào)規(guī)則)的構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6輕鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)氨基酸殘基取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白重鏈，其包括3D6可變區(qū)CDR(例如，來(lái)自3D6重鏈可變區(qū)序列如SEQ ID NO4所闡述)，并包括人受體免疫球蛋白可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)選自H49、H93和H94(Kabat編號(hào)規(guī)則)的構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)氨基酸殘基取代。
優(yōu)選的輕鏈包括亞型κII的κII構(gòu)架區(qū)(Kabat規(guī)則)，例如，來(lái)自受體免疫球蛋白Kabat ID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、Kabat ID 005059、Kabat ID U21040和Kabat IDU41645的構(gòu)架區(qū)。優(yōu)選的重鏈包括亞型III的構(gòu)架區(qū)(Kabat規(guī)則)，例如，來(lái)自受體免疫球蛋白Kabat ID 045919、Kabat ID 000459、Kabat ID000553、Kabat ID 000386和Kabat ID M23691的構(gòu)架區(qū)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈，其包括10D5可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(例如包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自如SEQ ID NO14所述的輕鏈可變區(qū)序列的CDR或包括包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自如SEQ ID NO16所述的重鏈可變區(qū)序列的CDR)，且包括一個(gè)基本上來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基被回復(fù)突變?yōu)橄鄳?yīng)的鼠殘基，其中所述的回復(fù)突變基本上不影響鏈和Aβ直接結(jié)合的能力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白的輕鏈或重鏈，其包含10D5可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(例如包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自如SEQ ID NO14所述的輕鏈可變區(qū)序列的CDR和/或包括一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)來(lái)自如SEQ ID NO16所述的重鏈可變區(qū)序列的CDR)，并包括一個(gè)基本上來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6輕鏈或重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中構(gòu)架殘基選自(a)非共價(jià)直接結(jié)合抗原的殘基；(b)與CDR相鄰的殘基；(c)與CDR-相互作用的殘基(例如，通過(guò)在同源的已知免疫球蛋白鏈的解開結(jié)構(gòu)上模擬輕鏈或重鏈來(lái)確定)；以及(d)在VL-VH界面上共同參與的殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種人源化免疫球蛋白輕鏈或重鏈，其包含10D5可變區(qū)CDR和自人受體免疫球蛋白輕鏈或重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠10D5輕鏈或重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中通過(guò)可變區(qū)的三維模型分析，構(gòu)架殘基是一種能夠影響輕鏈可變區(qū)構(gòu)型或功能的殘基、例如能夠與抗原相互作用的殘基、近接于抗原結(jié)合位點(diǎn)的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、與CDR相鄰的殘基、在離CDR殘基6內(nèi)的殘基、規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、鏈間包裝殘基、稀有殘基或在結(jié)構(gòu)模型表面上的糖基化位點(diǎn)殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了除上述取代之外的至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基的取代。例如，稀有殘基可用在此位置上的人可變鏈序列的普通氨基酸殘基取代。或者，稀有殘基可用來(lái)自同源的種系可變鏈序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代(例如，稀有的輕鏈構(gòu)架殘基可用來(lái)自A1、A17、A18、A2或A19種系免疫球蛋白序列的相應(yīng)種系殘基取代或稀有的重鏈構(gòu)架殘基可用來(lái)自VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21或VH3-11種系免疫球蛋白序列的相應(yīng)種系殘基取代。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含上述輕鏈和重鏈的人源化免疫球蛋白，或所述免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，人源化免疫球蛋白結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)β淀粉樣肽(Aβ)，結(jié)合親合力至少為107M-1、108M-1或109M-1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段包括具有同種型γ1的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)可溶性β淀粉樣肽(Aβ)和聚集性Aβ。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段介導(dǎo)β淀粉樣肽(Aβ)的吞噬作用(例如，誘導(dǎo)吞噬作用)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段越過(guò)受試者的血腦屏障。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段減少受試者的β淀粉樣肽(Aβ)沉積和神經(jīng)炎性營(yíng)養(yǎng)障礙。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含3D6可變區(qū)的嵌合免疫球蛋白(例如，如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所述的可變區(qū)序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其包括SEQ ID NO8所示的可變重鏈區(qū)以及SEQ ID NO5所示的可變輕鏈區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其包括SEQ ID NO12所示的可變重鏈區(qū)以及SEQ ID NO11所示的可變輕鏈區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含10D5可變區(qū)的嵌合免疫球蛋白(例如，SEQ ID NO14或SEQ ID NO16所示的可變區(qū)序列)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步含有來(lái)自IgG1的恒定區(qū)。
本文所述的免疫球蛋白特別適用于以預(yù)防或治療致淀粉樣疾病為目的治療方法中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療致淀粉樣疾病(例如，阿耳茨海默氏病)的方法，其包括給藥患者有效量的此處所述的人源化免疫球蛋白。另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有本文所述人源化免疫球蛋白和藥用載體的藥物組合物。也提供了用于制備本文所述免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或鏈的分離的核酸分子、載體和宿主細(xì)胞，以及用于制備所述免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白鏈的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種當(dāng)制備人源化3D6或10D5免疫球蛋白時(shí)用于分別確定負(fù)責(zé)取代的人源化3D6或10D5殘基的方法。例如，確定負(fù)責(zé)取代的可變構(gòu)架區(qū)殘基的方法包括建立在解開同源免疫球蛋白結(jié)構(gòu)上制作3D6或10D5可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型并對(duì)能夠影響3D6或10D5免疫球蛋白可變區(qū)構(gòu)型或功能的殘基分析所述模型，因而負(fù)責(zé)取代的殘基得到確定。本發(fā)明進(jìn)一步提供了SEQ ID NO2或SEQID NO4所示的可變區(qū)序列或其任意部分在產(chǎn)生3D6免疫球蛋白、3D6免疫球蛋白鏈或其結(jié)構(gòu)域的三維圖像中的應(yīng)用。本發(fā)明也提供了SEQID NO14或SEQ ID NO16所示的可變區(qū)序列或其任意部分在產(chǎn)生10D5免疫球蛋白、10D5免疫球蛋白鏈或其結(jié)構(gòu)域的三維圖像中的應(yīng)用。
在描述本發(fā)明之前，下面所用特定術(shù)語(yǔ)的定義將對(duì)理解是有幫助的。
術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”或“抗體”(在這里交換使用)是指具有由兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈組成的四條多肽鏈基本結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合蛋白，所述鏈的穩(wěn)定化，例如通過(guò)鏈間二硫鍵進(jìn)行，其具有特異性結(jié)合抗原的能力。重鏈和輕鏈折疊到結(jié)構(gòu)域中。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”是指含有肽環(huán)(如含有3到4個(gè)肽環(huán))的重鏈或輕鏈多肽的球形區(qū)域，所述肽環(huán)例如通過(guò)β-折疊和/或鏈內(nèi)二硫鍵而穩(wěn)定化。結(jié)構(gòu)域本文進(jìn)一步指“恒定的”或“可變的”，基于在為“恒定”域的情況下，不同類別的域中相對(duì)缺乏序列變化，或在為“可變”域的情況下，不同類別的域中有顯著的序列變化?！昂愣ǖ摹庇蛟谳p鏈上可被交換稱為“輕鏈恒定區(qū)”、“輕鏈恒定域”、“CL”區(qū)或“CL”域?！昂愣ǖ摹庇蛟谥劓溕峡杀唤粨Q稱為“重鏈恒定區(qū)”、“重鏈恒定域”、“CH”區(qū)或“CH”域?！翱勺兊摹庇蛟谳p鏈上可被交換稱為“輕鏈可變區(qū)”、“輕鏈可變域”、“VL”區(qū)或“VL”域?！翱勺兊摹庇蛟谥劓溕峡杀唤粨Q稱為“重鏈可變區(qū)”、“重鏈可變域”、“CH”區(qū)或“CH”域。
術(shù)語(yǔ)“區(qū)”是指抗體鏈的局部或一部分且其包括此處所定義的恒定或可變的域，以及所述域的更多不連續(xù)的局部或部分。例如，輕鏈可變域或區(qū)包括分散在此處所定義的“構(gòu)架區(qū)”或“FR”中的“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”。
免疫球蛋白或抗體可以為單體或多聚體的形式存在。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”是指一個(gè)與抗原結(jié)合或與抗原結(jié)合(即特異性結(jié)合)的完整抗體(即與它們所衍生的完整抗體)競(jìng)爭(zhēng)的免疫球蛋白或抗體的多肽片段。術(shù)語(yǔ)“構(gòu)型”是指蛋白或多肽(例如，抗體、抗體鏈、結(jié)構(gòu)域或其區(qū)域)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，短語(yǔ)“輕(或重)鏈構(gòu)型”是指輕(或重)鏈可變區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，短語(yǔ)“抗體構(gòu)型”或“抗體片段構(gòu)型”是指抗體或其片段的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
抗體的“特異性結(jié)合”是指抗體對(duì)抗原或優(yōu)選的表位顯示出可感知的親合力并且優(yōu)選不顯示顯著的交叉反應(yīng)?！翱筛兄被騼?yōu)選的結(jié)合包括具有至少106、107、108、109M-1或1010M-1的親合力的結(jié)合。親合力大于107M-1，優(yōu)選大于108M-1是更優(yōu)選的。本文所述這些值的中間的數(shù)值也確定在本發(fā)明的范圍中且優(yōu)選的結(jié)合親合力可顯示為親合力的范圍，例如106到1010M-1，優(yōu)選107到1010M-1，更優(yōu)選108到1010M-1。“不顯示顯著的交叉反應(yīng)”的抗體是一種不會(huì)可感知地結(jié)合于不期望的物質(zhì)(例如，不期望的蛋白質(zhì)物質(zhì))的抗體。例如，特異性結(jié)合于Aβ的抗體將可感知地結(jié)合Aβ但不會(huì)顯著地與非-Aβ蛋白或肽(例如，包含在淀粉樣斑中的非-Aβ蛋白質(zhì)或肽)反應(yīng)。對(duì)優(yōu)選表位特異的抗體將，例如，與相同蛋白或肽上的較遠(yuǎn)的表位不產(chǎn)生顯著的交叉反應(yīng)。特異性結(jié)合可通過(guò)任意的用于檢測(cè)此結(jié)合的本領(lǐng)域已知手段來(lái)測(cè)定。優(yōu)選地，特異性結(jié)合是通過(guò)Scatchard分析和/或競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)來(lái)測(cè)定的。
結(jié)合片段通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)產(chǎn)生，或通過(guò)完整免疫球蛋白的酶解或化學(xué)裂解來(lái)產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、單鏈、以及單鏈抗體。不同于“雙特異的”或“雙功能的”免疫球蛋白或抗體、免疫球蛋白或抗體被認(rèn)為具有各個(gè)同一的結(jié)合位點(diǎn)。“雙特異的”或“雙功能的抗體”是人工雜交的抗體，其具有兩個(gè)不同的重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)。雙特異抗體可通過(guò)不同的方法包括雜交瘤融合或Fab′片段的連接來(lái)制備。參見，例如，Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
術(shù)語(yǔ)“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗體”是指免疫球蛋白或抗體，其包括至少一種人源化免疫球蛋白或抗體鏈(即至少一種人源化輕或重鏈)。術(shù)語(yǔ)“人源化免疫球蛋白鏈”或“人源化抗體鏈”(即“人源化免疫球蛋白輕鏈”或“人源化免疫球蛋白重鏈”)是指一種免疫球蛋白或抗體鏈(即分別為輕鏈或重鏈)具有包括基本上來(lái)自人免疫球蛋白或抗體的構(gòu)架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(例如，至少一個(gè)CDR、優(yōu)選兩個(gè)CDR、更優(yōu)選三個(gè)CDR)的可變區(qū)并進(jìn)一步含有恒定區(qū)(例如，在輕鏈的情況下，至少一個(gè)恒定區(qū)或其部分，且在重鏈的情況下優(yōu)選三個(gè)恒定區(qū))的恒定區(qū)，術(shù)語(yǔ)“人源化可變區(qū)”(例如，“人源化輕鏈可變區(qū)”或“人源化重鏈可變區(qū)”)是指包括基本上來(lái)自人免疫球蛋白或抗體的構(gòu)架區(qū)和基本上來(lái)自非人免疫球蛋白或抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的可變區(qū)。
短語(yǔ)“基本上來(lái)自人免疫球蛋白或抗體”或“基本上人”是指為比較目的比對(duì)人免疫球蛋白或抗體氨基酸序列時(shí)，區(qū)域與人的構(gòu)架或恒定區(qū)序列具有至少80-90％，優(yōu)選90-95％，更優(yōu)選95-99％的同一性(即局部序列同一性)，例如允許保守性取代、共有序列取代、種系取代、回復(fù)突變等。保守性取代、共有序列取代、種系取代、回復(fù)突變等的導(dǎo)入，通常被稱為人源化抗體或鏈的“優(yōu)化”。短語(yǔ)“基本上來(lái)自非人免疫球蛋白或抗體”或“基本上非人”是指與非人的生物，例如非人的哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白或抗體序列具有至少80-95％，優(yōu)選90-95％，更優(yōu)選96％、97％、98％或99％的同一性。
相應(yīng)地，所有的人源化免疫球蛋白或抗體或人源化免疫球蛋白或抗體鏈的區(qū)域或殘基，除了可能的CDR外，基本上與相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)天然人免疫球蛋白序列的區(qū)域或殘基相同。術(shù)語(yǔ)“相應(yīng)的區(qū)域”或“相應(yīng)的殘基”是指當(dāng)?shù)谝缓偷诙蛄袨楸容^目的進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，在第二個(gè)氨基酸或核苷酸序列上的區(qū)域或殘基與在第一個(gè)氨基酸或核苷酸序列上的區(qū)域或殘基占有相同的(即同等的)位置。
術(shù)語(yǔ)“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗體”不想包括嵌合的免疫球蛋白或抗體，如下面所定義的。盡管人源化免疫球蛋白或抗體在其構(gòu)建中是嵌合的(即包含來(lái)自不止一種蛋白質(zhì)的區(qū)域)，其包括在此處所定義的嵌合免疫球蛋白或抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的其他特征(即含有供體CDR殘基和受體構(gòu)架殘基的可變區(qū))。
術(shù)語(yǔ)“顯著的同一性”是指兩個(gè)多肽序列，當(dāng)進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，例如通過(guò)GAP或BESTFIT程序采用默認(rèn)間隙權(quán)重，具有至少50-60％序列同一性，優(yōu)選60-70％序列同一性，更優(yōu)選70-80％序列同一性，更優(yōu)選至少80-90％同一性，更優(yōu)選至少90-95％同一性，以及甚至更優(yōu)選至少95％序列同一性或更多(例如，99％的序列同一性或更多)。術(shù)語(yǔ)“基本上同一性”是指兩個(gè)多肽序列，當(dāng)進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，例如通過(guò)GAP或BESTFIT程序采用默認(rèn)間隙權(quán)重，具有至少80-90％序列同一性，優(yōu)選90-95％序列同一性，以及更優(yōu)選至少95％序列同一性或更多(例如，99％序列同一性或更多)。對(duì)于序列比較來(lái)說(shuō)，通常，一個(gè)序列充當(dāng)被比較的測(cè)試序列的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，測(cè)試序列和參考序列被輸入到計(jì)算機(jī)中，如果需要，指定序列座標(biāo)，以及指定序列算法程序參數(shù)。序列比較算法然后基于所設(shè)定的程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列同一性百分比。術(shù)語(yǔ)“序列同一性”和“序列同一性”在此處可以互用。
序列比較的最佳比對(duì)可以通過(guò)，例如，Smith & Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2482(1981)，通過(guò)Needleman & Wunsch的同源性排列算法，J.Mol.Biol.48443(1970)，通過(guò)Pearson & Lipman的相似性檢索法，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)，通過(guò)計(jì)算機(jī)實(shí)施的這些算法(威斯康星遺傳學(xué)軟件包中GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過(guò)目測(cè)(通常參見Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology)來(lái)進(jìn)行。一個(gè)適于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的實(shí)例是BLAST算法，其被描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215403(1990)中。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公開獲得(公眾可通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生研究所NCBI因特網(wǎng)服務(wù)器來(lái)獲得)。通常，可以利用默認(rèn)的程序參數(shù)進(jìn)行序列比對(duì)，盡管也可以使用用戶參數(shù)。對(duì)于氨基酸序列來(lái)說(shuō)，BLASTP程序默認(rèn)碼長(zhǎng)(W)為3，期望值(E)為10，BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))。
優(yōu)選地，不相同的殘基位置通過(guò)保守性氨基酸取代區(qū)分。為了將氨基酸取代分為保守性取代或非保守性取代，氨基酸分組如下組I(疏水側(cè)鏈)亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；組II(中性親水側(cè)鍵)半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；組III(酸性側(cè)鏈)天冬氨酸、谷氨酸；組IV(堿性側(cè)鏈)天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；組V(影響鏈方向的殘基)甘氨酸、脯氨酸；和組VI(芳香族側(cè)鏈)色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守替代涉及同類氨基酸之間的替代。非保守替代由一組中的一個(gè)成員變?yōu)榱硪唤M中的一個(gè)成員。
優(yōu)選地，人源化免疫球蛋白或抗體結(jié)合抗原的親合力是相應(yīng)的非人抗體的3、4或5倍。例如，如果非人抗體具有109M-1的親合力，人源化抗體則會(huì)具有至少3×109M-1、4×109M-1或109M-1的結(jié)合親合力。當(dāng)描述免疫球蛋白或抗體鏈的結(jié)合特性時(shí)，鏈可被描述基于其“抗原(例如，Aβ)直接結(jié)合”的能力。當(dāng)一條鏈針對(duì)完整的免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)賦予特異性結(jié)合特性或結(jié)合親合力時(shí)，其被稱為“抗原直接結(jié)合”。突變(例如，回復(fù)突變)被稱為基本上影響重或輕鏈抗原直接結(jié)合的能力，如果其影響(例如，減小)與含有缺少所述突變的等同鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)比較時(shí)含有至少一個(gè)數(shù)量級(jí)別的含有所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)的結(jié)合親合力。突變“基本上不影響(例如，減小)鏈直接結(jié)合抗原的能力”，如果其影響(例如，減小)含有所述鏈的完整免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)的結(jié)合親合力僅僅是含有缺少所述突變的等同鏈的抗體(或其抗原結(jié)合片段)的2、3或4倍。
術(shù)語(yǔ)“嵌合免疫球蛋白”或抗體是指免疫球蛋白或抗體其輕鏈和重鏈來(lái)自不同的種。嵌合免疫球蛋白或抗體可例如通過(guò)基因工程構(gòu)建自屬于不同種的免疫球蛋白基因區(qū)段。
“抗原”是一種與抗體特異性結(jié)合的物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)物質(zhì)或肽)。
術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”是指免疫球蛋白或抗體(或其抗原結(jié)合片段)特異性結(jié)合的抗原上的位點(diǎn)。表位可以自連續(xù)的氨基酸或非連續(xù)的氨基酸通過(guò)蛋白的三級(jí)折疊來(lái)形成。從連續(xù)的氨基酸形成的表位一般在接觸變性溶劑后仍保留活性而通過(guò)三級(jí)折疊形成的表位則在變性溶劑中失活。表位通常在單一的空間構(gòu)型上包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸。檢測(cè)表位空間構(gòu)型的方法包括，例如，x-射線晶體照相術(shù)以及2-維的核磁共振。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris編(1996)。
識(shí)別相同表位的抗體可通過(guò)顯示一個(gè)抗體阻礙另一個(gè)抗體與靶抗原結(jié)合能力的簡(jiǎn)單的免疫測(cè)定，即競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合通過(guò)在測(cè)免疫球蛋白抑制參照抗體特異性結(jié)合共同抗原例如Aβ的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。已知的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)有很多種，例如固相直接或間接放射免疫測(cè)定(RIA)、固相直接或間接的酶免疫測(cè)定(EIA)、夾心競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)(參見Stahli等，Methods in Enzymology 9242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA法(參見Kirkland等，J.Immunol.1373614(1986))；固相直接標(biāo)記測(cè)定法、固相直接標(biāo)記夾心測(cè)定法(參見Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press(1988))；采用I-125標(biāo)記的固相直接標(biāo)記RIA法(參見Morel等，Mol.Immunol.25(1)7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA法(Cheung等，Virology 176546(1990))；以及直接標(biāo)記RIA法(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.3277(1990))。通常，這種測(cè)定包括使用純化抗原結(jié)合到攜帶未標(biāo)記的測(cè)試免疫球蛋白和標(biāo)記的參照免疫球蛋白之一的固體表面或細(xì)胞。競(jìng)爭(zhēng)性抑制通過(guò)在測(cè)試免疫球蛋白的存在下測(cè)定結(jié)合到固體表面或細(xì)胞的標(biāo)記量而測(cè)定。通常，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性抗體過(guò)量存在時(shí)，其將抑制參照抗體與共同抗原特異性結(jié)合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。
表位也被免疫學(xué)細(xì)胞例如B細(xì)胞和/或T細(xì)胞所識(shí)別。表位的細(xì)胞識(shí)別可以通過(guò)測(cè)定抗原依賴性增殖的體外試驗(yàn)而檢測(cè)，如通過(guò)摻入3H-胸苷，通過(guò)細(xì)胞因子分泌，通過(guò)抗體分泌，或通過(guò)抗原-依賴性殺傷(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞試驗(yàn))進(jìn)行測(cè)定。
示例性表位或抗原決定簇可在人淀粉狀前體蛋白(APP)中發(fā)現(xiàn)，但優(yōu)選在APP的Aβ肽中發(fā)現(xiàn)。APP存在多重同工型，例如APP695APP751和APP770。APP中的氨基酸依據(jù)APP770同工型的序列被編號(hào)(參見，例如，GenBank登錄號(hào)No.P05067，也如SEQ ID NO38所述)。Aβ(在這里也稱為β淀粉樣肽和A-β)肽是APP的39-43個(gè)氨基酸的～4-kDa的內(nèi)部片段(Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43)。Aβ40，例如，由APP的第672-711位殘基組成且Aβ42由APP的第673-713位殘基組成。通過(guò)不同分泌型酶體內(nèi)或原位水解處理APP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ有“短型”，40個(gè)氨基酸長(zhǎng)，以及“長(zhǎng)型”，42-43個(gè)氨基酸長(zhǎng)。優(yōu)選的表位或抗原決定簇，如這里所描述，位于Aβ肽的N-末端且包括Aβ的第1-10位氨基酸的殘基，優(yōu)選來(lái)自Aβ42第1-3位、第1-4位、第1-5位、第1-6位、第1-7位或第3-7位的殘基。其它優(yōu)選的表位或抗原決定簇包括Aβ第2-4位、第5、6、7或8位的殘基，Aβ第3-5位、第6、7、8或9位的殘基，或Aβ42第4-7位、第8、9或10位的殘基。
術(shù)語(yǔ)“致淀粉樣疾病”包括任意與不溶解的淀粉樣纖維的形成或沉積相關(guān)(或引起)的疾病。示例的致淀粉樣疾病包括但不限于全身性淀粉樣變性、阿耳茨海默氏病、成年糖尿病、帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病、額-暫時(shí)性癡呆以及朊病毒-相關(guān)的傳染性海綿狀腦病(分別在人中為kuru和Creutzfeldt-Jacob疾病，在羊和牛中為瘙癢病和BSE)。不同的致淀粉樣疾病由沉積的原纖維的多肽組分的特性所定義和表征。例如，患有阿耳茨海默氏病、β-淀粉樣蛋白(例如，野生型、變體或平截的β-淀粉樣蛋白)的受試者或患者具有淀粉樣沉積物的多肽組分的特征。因此，例如在受試者或患者的腦中，阿耳茨海默氏病是一個(gè)“通過(guò)Aβ沉積物表征的疾病”或“與Aβ沉積物相關(guān)的疾病”的例子。術(shù)語(yǔ)“β-淀粉狀蛋白”、“β-淀粉樣肽”、“β-淀粉樣”、“Aβ”和“Aβ肽”在這里可以互用。
術(shù)語(yǔ)“有效量”或“有效劑量”定義為足以獲得或至少部分獲得所期望的效果的量。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”定義為足以治愈或至少部分抑制疾病和已由該病引起的并發(fā)癥的量。有效作用的量依據(jù)感染的程度以及患者本身免疫系統(tǒng)的基本狀態(tài)。
術(shù)語(yǔ)“患者”包括接受預(yù)防性或治療性治療的人或其它哺乳動(dòng)物對(duì)象。
“可溶解的”或“分離的”Aβ是指非-聚集性或解聚的Aβ多肽?！安蝗芙獾摹盇β是指聚集的Aβ多肽，例如，通過(guò)非共價(jià)鍵連在一起的Aβ。Aβ(例如，Aβ42)被認(rèn)為是聚集性的，至少部分是由于肽的C末端的疏水殘基的存在(APP的部分跨膜結(jié)構(gòu)域)。制備可溶性Aβ的一種方法是用超聲波在純的DMSO中溶解冷凍干燥的肽。產(chǎn)生的溶液被離心以去除任意不溶解的微粒。
I.免疫和治療劑本發(fā)明的免疫和治療劑含有或由這里所定義的免疫原或抗體，或功能性的或其抗原結(jié)合片段所組成。已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單位包括亞單位的四聚體。每個(gè)四聚體包含兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)，每對(duì)含有一個(gè)“輕”鏈(約25kD)的和一個(gè)“重”鏈(約50-70kD)。每個(gè)鏈的氨基末端包括一個(gè)約100-110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每個(gè)鏈的羧基末端限定一個(gè)主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。
輕鏈分為κ或λ且大約230個(gè)殘基的長(zhǎng)度。重鏈分為gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)，大約450-600個(gè)殘基的長(zhǎng)度，分別把抗體的同種型定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重鏈和輕鏈折疊成結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”是指蛋白例如免疫球蛋白或抗體的球形區(qū)域。免疫球蛋白或抗體的結(jié)構(gòu)域包括，例如，通過(guò)β折疊和鏈內(nèi)二硫鍵形成的3或4肽環(huán)。完整的輕鏈具有，例如，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(VL和CL)而完整的重鏈具有，例如4或5個(gè)結(jié)構(gòu)域(VH、CH1、CH2、和CH3)。
輕鏈和重鏈中約12或更多個(gè)氨基酸形成的“J”區(qū)連接可變區(qū)與恒定區(qū)，重鏈還包括約10或更多個(gè)氨基酸形成的“D”區(qū)(通常參見，F(xiàn)undamental Immunology(Paul，W編，第二版，Raven Press，N.Y.(1989)，第7章，為了各種目的在此全文引入作為參考)。
每對(duì)輕鏈/重鏈的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，完整的抗體有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了雙功能或雙特異性抗體，這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。所有的鏈都顯示同樣的基本結(jié)構(gòu)，由三個(gè)高度可變區(qū)也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR所連接的相對(duì)保守的構(gòu)架區(qū)。天然產(chǎn)生的鏈或重組產(chǎn)生的鏈的表達(dá)可帶有在細(xì)胞加工過(guò)程中被去除而產(chǎn)生成熟鏈的前導(dǎo)序列。成熟的鏈也重組產(chǎn)生，具有非天然產(chǎn)生的前導(dǎo)序列，例如為增強(qiáng)分泌或改變特定目的鏈的加工。
每對(duì)兩個(gè)成熟鏈的CDR通過(guò)構(gòu)架區(qū)排列，使其能夠與特異性表位結(jié)合。從N末端到C末端，輕鏈和重鏈包括區(qū)FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4?！癋R4”在本領(lǐng)域中也稱作可變重鏈的D/J區(qū)和可變輕鏈的J區(qū)。每區(qū)氨基酸的排列按照Kabat定義，免疫學(xué)目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)。另一結(jié)構(gòu)定義已由Chothia等提出，J.Mol.Biol.196901(1987)；Nature 342878(1989)；以及J.Mol.Biol.186651(1989)(此后共同簡(jiǎn)稱為“Chothia等”，為了各種目的在此全文引入作為參考)。
A.Aβ抗體本發(fā)明的治療劑包括與Aβ或淀粉斑的其它組分特異性結(jié)合的抗體。此種抗體可以是單克隆或多克隆的。其中有些抗體特異性結(jié)合Aβ的聚集形式而不結(jié)合可溶形式。一些特異性結(jié)合可溶形式而不結(jié)合聚集形式。還有一些與聚集和可溶形式均結(jié)合。一些這樣的抗體結(jié)合Aβ天然產(chǎn)生的短型(即Aβ39、40或41)而不結(jié)合Aβ天然產(chǎn)生的長(zhǎng)型(即Aβ42和Aβ43)。一些抗體體結(jié)合Aβ長(zhǎng)型而不結(jié)合短型。一些抗體結(jié)合Aβ而不結(jié)合全長(zhǎng)的淀粉樣前體蛋白。在治療方法中使用的抗體優(yōu)選具有一個(gè)完整的恒定區(qū)或至少足以與Fc受體相互作用的恒定區(qū)。人同種型IgG1是優(yōu)選的，因?yàn)槠鋵?duì)吞噬細(xì)胞上的FcRI受體具有最高親合力的人同種型。雙特異性Fab片段也可以采用，其中抗體的一個(gè)臂對(duì)Aβ具有特異性，另一個(gè)臂對(duì)Fc受體具有特異性。優(yōu)選的抗體結(jié)合Aβ的結(jié)合親合力大于(或等于)大約106、107、108、109或1010M-1(包括這些值的中間的數(shù)值)。
多克隆血清通常含有沿著Aβ長(zhǎng)度與若干表位結(jié)合的抗體的混合群。然而，多克隆血清可特異于Aβ的特殊區(qū)段，例如Aβ1-10。單克隆抗體與Aβ內(nèi)的特異表位結(jié)合，其可以是構(gòu)象或非構(gòu)象的表位?？贵w的預(yù)防和治療效用可通過(guò)實(shí)施例中所描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型法來(lái)測(cè)定。優(yōu)選的單克隆抗體結(jié)合于Aβ第1-10位殘基中的表位(天然Aβ的第一個(gè)N末端殘基編號(hào)為1)。一些優(yōu)選的單克隆抗體結(jié)合于第1-5位氨基酸的表位，而一些結(jié)合于第5-10位氨基酸的表位。一些優(yōu)選的抗體結(jié)合于第1-3位、第1-4位、第1-5位、第1-6位、第1-7位或第3-7位氨基酸的表位。一些優(yōu)選的抗體結(jié)合于從Aβ第1-3位殘基開始至第7-11位殘基終止的表位。較不優(yōu)選的抗體包括那些結(jié)合于Aβ第10-15位、第15-20位、第25-30位、第10-20位、第20、30位或第10-25位殘基的表位的抗體。建議這種抗體在使用前利用實(shí)施例中所描述的小鼠模型篩選其活性。例如人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特定結(jié)合第10-18位、第16-24位、第18-21位和第33-42位殘基的表位的抗體缺少活性(例如，缺少減少斑沉積和/或消除與阿耳茨海默氏病相關(guān)的神經(jīng)炎性病癥的能力)。在一些方法中，采用具有結(jié)合不同表位的特異性的多單克隆抗體。此種抗體可按序或同時(shí)給藥。對(duì)除Aβ外的其它淀粉樣組分的抗體也可采用(例如，給藥或輔助給藥)。例如，抗體可針對(duì)淀粉樣相關(guān)的蛋白共核蛋白(Synuclein)。
當(dāng)一種抗體據(jù)說(shuō)結(jié)合于指定殘基中的表位，例如Aβ1-5時(shí)，意指其特異性結(jié)合含有指定殘基的多肽(即本實(shí)施例中的Aβ1-5)。此種抗體不必要接觸Aβ1-5中的所有殘基。也并非Aβ1-5中的每一個(gè)氨基酸取代或缺失都必然顯著影響結(jié)合親合力。抗體的表位特異性可被檢測(cè)，例如通過(guò)形成噬菌體展示文庫(kù)，其中不同的成員顯示不同的Aβ的亞序列。然后在噬菌體展示文庫(kù)篩選其特異性結(jié)合在測(cè)抗體的成員。分離序列家族。通常，此族包括一個(gè)共有的核心序列，以及在不同成員中側(cè)接序列的長(zhǎng)度發(fā)生變化。顯示與抗體特異性結(jié)合的最短的核心序列限定了通過(guò)抗體結(jié)合的表位?？贵w也可用來(lái)與其表位特異性已被測(cè)定的抗體一起在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中測(cè)定其表位特異性。例如，與3D6抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Aβ的抗體結(jié)合到與3D6相同或相似的表位即Aβ1-5的殘基中。同樣，與10D5抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體結(jié)合到相同或相似的表位即Aβ3-7的殘基中。篩選表位特異性的抗體對(duì)治療效力的預(yù)知是有用的。例如，一個(gè)確定結(jié)合到Aβ第1-7位殘基的表位的抗體可能在本發(fā)明預(yù)防和治療阿耳茨海默氏病的方法中是有效的。
特異性的結(jié)合于優(yōu)選的Aβ區(qū)段而不結(jié)合Aβ的其它區(qū)域的單克隆或多克隆抗體相對(duì)于結(jié)合其它區(qū)域的單克隆抗體或結(jié)合完整Aβ的多克隆血清具有大量的優(yōu)點(diǎn)。首先，對(duì)于相等的重量劑量來(lái)說(shuō)，特異性結(jié)合優(yōu)選區(qū)段的抗體的劑量含有在清除淀粉樣斑中有效的抗體的較高克分子劑量。第二，特異性結(jié)合優(yōu)選區(qū)段的抗體可誘導(dǎo)抗淀粉樣沉積物的清除反應(yīng)而不誘導(dǎo)抗完整APP多肽的清除反應(yīng)，從而減少可能的副作用。
1.非人抗體的制備本發(fā)明提供了非人抗體，例如，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選的Aβ表位具有特異性的抗體。此種抗體可被用于配制本發(fā)明的各種治療組合物，或優(yōu)選地，提供用于人源化或嵌合抗體生產(chǎn)的互補(bǔ)決定區(qū)(具體描述在下文)。非人單克隆抗體，例如鼠科動(dòng)物、豚鼠、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、兔或大鼠可以通過(guò)例如用Aβ免疫動(dòng)物來(lái)制備。也可以使用含有Aβ、Aβ的免疫原性片段或Aβ抗體的抗-獨(dú)特型抗體的更長(zhǎng)多肽鏈。參見Harlow &Lane，同上(為各種目的全文引入作為參考)。這樣一種免疫原可以從天然來(lái)源獲得、通過(guò)肽合成或者通過(guò)重組表達(dá)獲得?？蛇x擇地，如以下所述，免疫原可以融合載體蛋白或與其復(fù)合給藥?？蛇x擇地，免疫原可以結(jié)合佐劑給藥。術(shù)語(yǔ)″佐劑″是指一種化合物當(dāng)與抗原聯(lián)合給藥時(shí)增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，但當(dāng)單獨(dú)給藥時(shí)不產(chǎn)生對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。佐劑可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，其機(jī)制包括淋巴細(xì)胞募集、刺激B和/或T細(xì)胞以及刺激巨噬細(xì)胞。如下文所述，可以使用若干佐劑。完全弗氏佐劑和不完全佐劑的依次使用對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫是優(yōu)選的。
兔或豚鼠通常用于制備多克隆抗體。制備多克隆抗體的示例，例如，用于被動(dòng)保護(hù)，可如下所述來(lái)進(jìn)行。125個(gè)非-轉(zhuǎn)基因小鼠用100μg的Aβ1-42加上CFA/IFA佐劑致免疫，并在4-5月時(shí)安樂(lè)死。從免疫的小鼠中收集血液。IgG分離自其它的血液組分。對(duì)免疫原特異的抗體可通過(guò)親和層析部分純化。每個(gè)小鼠獲得平均約0.5-1mg免疫原特異的抗體，總共獲得60-120mg。
小鼠通常用于制備單克隆抗體?？蛊蔚膯慰寺〉闹苽浞椒ㄊ亲⑸溟L(zhǎng)型的Aβ或其片段到小鼠中，制備雜交瘤和篩選特異性結(jié)合Aβ的抗體的雜交瘤?？蛇x擇地，篩選結(jié)合Aβ的特異區(qū)域或所需片段而不結(jié)合Aβ的其它非重疊片段的抗體。通過(guò)確定抗體與Aβ肽的缺失突變體的集合，并測(cè)定哪些缺失突變體與抗體結(jié)合，從而完成后者的篩選。可以通過(guò)如Western印跡和ELISA的方法評(píng)估結(jié)合作用。顯示特異性結(jié)合抗體的最小片段限定了該抗體的表位?？蛇x擇地，表位的特異性可以通過(guò)其中測(cè)試和參照抗體對(duì)Aβ的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行確定。如果測(cè)試抗體與參照抗體競(jìng)爭(zhēng)，則它們結(jié)合相同表位或足夠接近的表位，以至一個(gè)抗體的結(jié)合干擾了另一個(gè)抗體的結(jié)合。這些抗體的優(yōu)選同種型是小鼠同種型IgG2a或其它物種中的等同的同種型。小鼠同種型IgG2a與人同種型IgG1等同。
2.嵌合和人源化抗體本發(fā)明也提供了對(duì)β淀粉樣肽特異的嵌合和/或人源化抗體(即嵌合和/或人源化免疫球蛋白)。嵌合和/或人源化抗體具有與提供構(gòu)建該嵌合或人源化抗體的初始材料的小鼠或其它非人抗體有相同或相似的結(jié)合特異性和親合力。
A.嵌合抗體的制備術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指其輕鏈和重鏈基因通常通過(guò)基因工程從屬于不同物種的免疫球蛋白基因區(qū)段已被構(gòu)建的抗體。例如，小鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)(V)區(qū)段可能結(jié)合人恒定(C)區(qū)段如IgG1和IgG4。優(yōu)選人同種型IgG1。因此，典型的嵌合抗體是由小鼠抗體V或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人抗體的C或效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的雜種蛋白。
B.人源化抗體的制備術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指一種抗體其包括至少一個(gè)含有基本上來(lái)自人抗體鏈(稱為受體免疫球蛋白或抗體)的可變區(qū)構(gòu)架殘基的鏈以及至少一個(gè)基本上來(lái)自小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(稱為供體免疫球蛋白或抗體)。參見，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033(1989)、US5,530,101、US5,585,089、US5,693,761、US5,693,762、Selick等，WO 90/07861，以及Winter，US5,225,539(全文引入作為參考)。恒定區(qū)，如果存在，也基本上或整個(gè)來(lái)自人免疫球蛋白。
小鼠CDR在人可變區(qū)構(gòu)架中的取代最可能導(dǎo)致保留其正確的空間取向，如果人可變區(qū)構(gòu)架與其CDR源自的小鼠可變構(gòu)架采用相同或相似的構(gòu)象。此可以通過(guò)從構(gòu)架序列顯示與其CDR來(lái)源的鼠科動(dòng)物可變構(gòu)架區(qū)有高度的序列同一性的人抗體中獲得人可變區(qū)來(lái)完成。輕鏈和重鏈可變構(gòu)架區(qū)可衍生自相同的或不同的人抗體序列。人抗體序列可以是天然產(chǎn)生的人抗體序列或可以是幾種人抗體的共有序列。參見Kettleborough等，Protein Engineering 4773(1991)；Kolbinger等，Protein Engineering 6971(1993)以及Carter等，WO 92/22653。
在鑒定鼠供體免疫球蛋白和適當(dāng)?shù)娜耸荏w免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)后，接下來(lái)是確定，如果有，是哪些來(lái)自組分的殘基應(yīng)被取代以優(yōu)化產(chǎn)生的人源化抗體的特性。通常，用鼠氨基酸取代人氨基酸殘基應(yīng)最小化，因?yàn)槭髿埢膶?dǎo)入增加了抗體激發(fā)人體的人-抗-小鼠-抗體(HAMA)反應(yīng)的危險(xiǎn)。本領(lǐng)公認(rèn)的檢測(cè)免疫應(yīng)答的方法可用來(lái)控制特定患者或在臨床試驗(yàn)中的HAMA反應(yīng)。給藥人源化抗體的患者在進(jìn)行所述治療的開始和自始至終進(jìn)行免疫原性評(píng)估。利用本領(lǐng)域公知的方法，包括表面胞質(zhì)共振技術(shù)(BIACORE)和/或固相ELISA分析，例如通過(guò)測(cè)定在患者血清樣品中對(duì)人源化治療劑的抗體，來(lái)測(cè)定HAMA反應(yīng)。
來(lái)自人可變區(qū)構(gòu)架殘基的特定氨基酸基于其對(duì)CDR構(gòu)象和/或結(jié)合抗原的可能影響進(jìn)行篩選取代。鼠CDR區(qū)與人可變構(gòu)架區(qū)的非天然并列可產(chǎn)生非天然的構(gòu)象抑制，除非通過(guò)特定氨基酸殘基的取代來(lái)修正，否則會(huì)導(dǎo)致結(jié)合親合力的喪失。
篩選用于取代的氨基酸殘基部分是通過(guò)計(jì)算機(jī)模型來(lái)測(cè)定。計(jì)算機(jī)硬件和軟件在此描述用于產(chǎn)生免疫球蛋白分子的三維圖像。通常，分子模型產(chǎn)生自免疫球蛋白鏈或其結(jié)構(gòu)域的解開結(jié)構(gòu)。將待建模型的鏈與解開三維結(jié)構(gòu)的鏈或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸序列相似性比較，且顯示出最大序列相似性的鏈或結(jié)構(gòu)域被選為分子模型構(gòu)建的起始點(diǎn)。顯示至少50％序列同一性的鏈或結(jié)構(gòu)域被選擇用于分子模型的構(gòu)建，且優(yōu)選至少60％、70％、80％、90％或更多的序列同一性的那些鏈或結(jié)構(gòu)域被選擇用于建模。解開的起始結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾允許正在建模的免疫球蛋白鏈或結(jié)構(gòu)域的實(shí)際氨基酸和起始結(jié)構(gòu)間的差別。然后把修飾的結(jié)構(gòu)裝配到合成的免疫球蛋白中。最后，通過(guò)能量最小化以及通過(guò)核實(shí)所有的原子相互之間都在適當(dāng)?shù)木嚯x內(nèi)以及鍵長(zhǎng)和角度在化學(xué)上可接受的限度內(nèi)，使模型改進(jìn)。
用于取代的氨基酸殘基的選擇也可部分通過(guò)測(cè)定在特定位置的氨基酸的特性，或跟據(jù)經(jīng)驗(yàn)觀察特定氨基酸取代或誘變的效果來(lái)確定。例如，當(dāng)鼠可變區(qū)構(gòu)架殘基和所選擇的人可變區(qū)構(gòu)架殘基之間不同時(shí)，人構(gòu)架氨基酸通常應(yīng)被來(lái)自小鼠抗體中等同的構(gòu)架氨基酸取代，當(dāng)合理地預(yù)期該氨基酸(1)直接非共價(jià)結(jié)合抗原，
(2)與CDR區(qū)相鄰，(3)或者與CDR區(qū)相互作用(例如，通過(guò)計(jì)算機(jī)模型測(cè)定在CDR區(qū)的約3-6內(nèi))，或(4)參與VL-VH界面。
“直接非共價(jià)結(jié)合抗原”殘基包括在構(gòu)架區(qū)的適當(dāng)位置的氨基酸，通過(guò)建立的化學(xué)力，例如通過(guò)氫鍵、范德華力、疏水作用等，具有與抗原上的氨基酸直接相互作用的較好概率。
CDR和構(gòu)架區(qū)由Kabat等或Chothia等，同上所定義。當(dāng)構(gòu)架殘基，如由Kabat等，同上所定義，構(gòu)成結(jié)構(gòu)環(huán)殘基，如由Chothia等，同上所定義時(shí)，在小鼠抗體中存在的氨基酸可選擇來(lái)取代至人源化抗體中。“與CDR區(qū)相鄰”的殘基包括在緊鄰一個(gè)或多個(gè)人源化免疫球蛋白鏈的一級(jí)序列中的CDR位置上的氨基酸殘基，例如在緊鄰由Kabat所限定的CDR或由Chothia所限定的CDR的位置上的氨基酸殘基(參見，例如，Chothia和Lesk JMB 196901(1987))。這些氨基酸特別可能與CDR中的氨基酸相互作用，并且如果選自于受體，則特別可能使供體CDR變形和降低親合力。此外，相鄰氨基酸可與抗原直接相互作用(Amit等，Science，233747(1986)，在此引入作為參考)且篩選這些來(lái)自供體的氨基酸可能理想地保持所有的抗原接觸，提供在原始抗體中的親合力。
“或者與CDR區(qū)相互作用”的殘基包括那些通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析而測(cè)定在空間方向足以影響CDR區(qū)的殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，“或者與CDR區(qū)相互作用”的殘基通過(guò)分析供體免疫球蛋白的三維模型而測(cè)定(例如，計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的模型)。一種通常是原始供體模型的三維模型顯示CDR外的特定氨基酸臨近于CDR，并具有通過(guò)氫鍵、范德華力、疏水作用等與CDR中的氨基酸相互作用的良好概率。在這些氨基酸位置，選擇供體免疫球蛋白氨基酸而非受體免疫球蛋白氨基酸。與此標(biāo)準(zhǔn)相符的氨基酸通常具有在CDR某個(gè)原子的約3埃單位()內(nèi)的側(cè)鏈原子且必須含有一個(gè)能夠通過(guò)建立的化學(xué)力，例如上述所列舉，與CDR原子相互作用的原子。
在原子可以形成氫鍵的情況下，測(cè)定它們?cè)雍酥g的距離為3，但不形成鍵的原子，3測(cè)定在其范德華表面之間。因此，在后一種情況下，原子核心必須在大約6(3加總范德華半徑)內(nèi)原子才被認(rèn)為是能夠相互作用的。在一些情況下原子核距離4或5到6。在測(cè)定氨基酸能否與CDR相互作用，優(yōu)選不考慮作為CDR部分的重鏈CDR2的最后8個(gè)氨基酸，因?yàn)閺慕Y(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)來(lái)看，這8個(gè)氨基酸更多地充當(dāng)構(gòu)架的一部分。
能夠與CDR中的氨基酸相互作用的氨基酸也可以通過(guò)其它的方式測(cè)定。每一構(gòu)架氨基酸的溶劑可到達(dá)的表面面積以兩種方式計(jì)算(1)在完整抗體中，以及(2)在由去除CDR的抗體組成的假定分子中。在這些大約10平方?；蚋嗟臄?shù)之間的差異顯示構(gòu)架氨基酸接近溶劑至少部分被CDR阻斷，且因此氨基酸與CDR接觸。氨基酸的溶劑可進(jìn)入的表面面積可以基于抗體的三維模型，利用本領(lǐng)域公知的算法計(jì)算(例如，Connolly，J.Appl.Cryst.16548(1983)以及Lee和Richards，J.Mol.Biol.55379(1971)，二者均被引入作為參考)。通過(guò)影響另一個(gè)依次接觸CDRs的構(gòu)架氨基酸的構(gòu)象，構(gòu)架氨基酸偶而也與CDR直接作用。
在構(gòu)架的一些位置的氨基酸已知能夠與很多抗體的CDR相互作用(Chothia和Lesk，同上，Chothia等，同上，以及Tramontano等，J.Mol.Biol.215175(1990)，所有文獻(xiàn)均在此引入作為參考)。顯著的是在輕鏈的位置2、48、64和71和重鏈的位置26-30、71和94(編號(hào)方式符合于Kabat)的氨基酸已知能夠與很多抗體中的CDR相互作用。輕鏈位置35以及重鏈位置93和103的氨基酸也可能與CDR相互作用。在所有的這些編號(hào)位置，在人源化免疫球蛋白中選擇供體氨基酸而非受體氨基酸(當(dāng)不同時(shí))是優(yōu)選的。在其它方面，特定的殘基能夠與CDR區(qū)相互作用，例如輕鏈的頭5個(gè)氨基酸，有時(shí)可選自受體免疫球蛋白而不會(huì)損失人源化免疫球蛋白中的親合力。
“參與VL-VH界面”的殘基或“包裝殘基”包括那些在VL和VH之間界面上的殘基，如被Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824592-66(1985)或Chothia等，同上所定義。通常，如果不常見的包裝殘基是不同于人構(gòu)架中的那些，它們應(yīng)保留在人源化抗體中。
一般而言，符合上述條件的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代。在一些實(shí)施方案中，所有或大部分的符合上述條件的氨基酸被取代。有時(shí)候，一個(gè)特定的氨基酸是否符合上述條件很含糊，且可選擇的變體免疫球蛋白被制備，其中的一個(gè)具有特定的取代，而其它的沒(méi)有。如此產(chǎn)生的可選擇的變體免疫球蛋白采用這里所描述的任何測(cè)定方法對(duì)其期望的活性進(jìn)行檢測(cè)，且挑出優(yōu)選的免疫球蛋白。
通常人源化抗體的CDR區(qū)基本上是相同的，且更通常，與供體抗體的相應(yīng)CDR區(qū)相同。盡管不是通常所期望的，有時(shí)候可能進(jìn)行CDR殘基的保守氨基酸取代而不明顯影響產(chǎn)生的人源化免疫球蛋白的結(jié)合親合力。保守性氨基酸取代是指組合例如甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
其它的候選取代為受體人構(gòu)架氨基酸，其對(duì)于人免疫球蛋白的該位置來(lái)講是不尋常或“稀有”的。這些氨基酸可用來(lái)自小鼠供體抗體的等同位置的或來(lái)自更通常人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸取代。例如，當(dāng)在受體免疫球蛋白的人構(gòu)架區(qū)的氨基酸對(duì)于該位置是稀少的并且相應(yīng)的在供體免疫球蛋白的氨基酸對(duì)于人免疫球蛋白序列的該位置是普通的情況時(shí)，或當(dāng)受體免疫球蛋白的氨基酸對(duì)該位置是稀少的并且相應(yīng)的供體免疫球蛋白的氨基酸相對(duì)于其它的人序列也是稀少的時(shí)候，取代應(yīng)是可期望的。這些標(biāo)準(zhǔn)有助于確保人構(gòu)架中的非典型氨基酸不破壞抗體的結(jié)構(gòu)。此外，通過(guò)用來(lái)自供體抗體的對(duì)人抗體碰巧是常見的氨基酸替換不常見的人受體氨基酸，人源化抗體可以產(chǎn)生較少的免疫原性。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“稀有”是指一個(gè)在該位置處出現(xiàn)的氨基酸在序列的代表性樣本中占少于序列的約20％但通常少于序列的約10％，且此處所用的術(shù)語(yǔ)“普通的”是指在該位置處出現(xiàn)的氨基酸在序列的代表性樣本中占多于序列的約25％但通常超過(guò)序列的約50％。例如，所有的人輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別被歸類到序列″亞組″中，其彼此尤其同源且在特定的關(guān)鍵位置具有相同的氨基酸(Kabat等，同上)。當(dāng)判定人受體序列中的氨基酸在人序列中是“稀有”還是“普通的”時(shí)，通常優(yōu)選僅考慮那些與受體序列在相同亞組中的人序列。
其它的取代候選為受體構(gòu)架氨基酸，其在可選擇的定義下被鑒定為CDR區(qū)的一部分，所述定義由Chothia等提出，同上。其它的取代候選為受體人構(gòu)架氨基酸，其在AbM和/或接觸定義下被鑒定為CDR區(qū)的一部分。尤其是，在可變重鏈中的CDR1被定義包括第26-32位的殘基。
其它的取代候選為對(duì)應(yīng)于稀有或非常見的供體構(gòu)架殘基的受體構(gòu)架殘基。稀有或非常見的供體構(gòu)架殘基是那些對(duì)鼠抗體而言在該位置為稀有的或非常見的。對(duì)于鼠抗體而言，亞組根據(jù)Kabat和經(jīng)鑒定區(qū)別于共有序列的殘基位置來(lái)確定。這些供體特異性差異可指向增強(qiáng)活性的鼠序列中的體細(xì)胞突變。預(yù)計(jì)影響結(jié)合的非常見殘基被保留，而預(yù)計(jì)對(duì)結(jié)合不重要的殘基被取代。
其它的取代候選為在受體構(gòu)架區(qū)中出現(xiàn)的非種系殘基。例如，當(dāng)受體抗體鏈(即人抗體鏈與供體抗體鏈具有顯著的序列同一性)與種系抗體鏈(同樣與抗體鏈具有顯著的序列同一性)比對(duì)時(shí)，在受體鏈構(gòu)架和種系鏈構(gòu)架之間不匹配的殘基可用相應(yīng)的來(lái)自種系序列的殘基取代。
除了上面所討論的特異氨基酸取代之外，人源化免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)通?；旧舷嗤?，且更通常與它們所衍生的人抗體的構(gòu)架區(qū)相同。當(dāng)然，很多構(gòu)架區(qū)中的氨基酸對(duì)抗體的特異性或親合力有較少的或沒(méi)有直接的幫助。因此，許多單獨(dú)的構(gòu)架殘基的保守性取代可以容許而無(wú)需明顯改變產(chǎn)生的人源化免疫球蛋白的特異性或親合力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化免疫球蛋白的可變構(gòu)架區(qū)與人可變構(gòu)架區(qū)序列或此序列的共有序列有至少85％的序列同一性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，人源化免疫球蛋白的可變構(gòu)架區(qū)與人可變構(gòu)架區(qū)序列或此序列的共有序列有至少90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選96％、97％、98％或99％的序列同一性。然而，通常這種取代是未期望的。
人源化抗體優(yōu)選顯示對(duì)抗原有至少107、108、109或1010M-1的特異結(jié)合親合力。通常人源化抗體對(duì)抗原的結(jié)合親合力的上限在供體免疫球蛋白的3、4或5倍之內(nèi)。通常結(jié)合親合力的下限也在供體免疫球蛋白的3、4或5倍之中。可選擇地，結(jié)合親合力可與沒(méi)有取代的人源化抗體的相比較(例如，具有供體CDR和受體FR，但沒(méi)有FR取代的抗體)。在這種情況下，最優(yōu)化的抗體(帶有取代)的結(jié)合是優(yōu)選至少二-到三倍大于，或三-到四-倍大于未取代的抗體的結(jié)合。為了進(jìn)行比較，不同抗體的活性可通過(guò)例如BIACORE(即使用未標(biāo)記的試劑的表面胞質(zhì)團(tuán)共振)或競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定。
C.人源化3D6抗體的制備本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案提供了一種針對(duì)Aβ的N末端的人源化抗體特別用于此處所述的治療和/或診斷的方法中。一個(gè)特定的優(yōu)選的用于人源化抗體生產(chǎn)的起始材料是3D6。3D6對(duì)Aβ的N末端是特異性的且已顯示介導(dǎo)淀粉斑的吞噬作用(例如，誘導(dǎo)吞噬作用)(參見實(shí)施例I-V)。編碼3D6抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA的克隆和測(cè)序描述在實(shí)施例VI中。
合適的人受體抗體序列通過(guò)計(jì)算機(jī)比較小鼠可變區(qū)的氨基酸與已知人抗體的序列得到鑒定。重鏈和輕鏈的比較分別進(jìn)行，但原理是相似的。具體地，來(lái)自其構(gòu)架序列顯示與鼠VL和VH構(gòu)架區(qū)高度序列同一性的人抗體的可變區(qū)的鑒定可通過(guò)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)利用NCBIBLAST(公眾通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生研究所NCBI因特網(wǎng)服務(wù)器來(lái)獲得)與各自的鼠構(gòu)架序列進(jìn)行同一性檢索。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇與鼠供體序列有大于50％序列同一性的受體序列。優(yōu)選地，選擇有60％、70％、80％、90％或更多的序列同一性的受體抗體序列。
3D6計(jì)算機(jī)比較顯示3D6輕鏈與亞型κII的人輕鏈有最大的序列同一性，且3D6重鏈與亞型κIII的人重鏈有最大的序列同一性，如Kabat等所定義的，同上。因此，輕鏈和重鏈人構(gòu)架區(qū)優(yōu)選來(lái)自這些亞型的人抗體，或來(lái)自此亞型的共有序列。與相應(yīng)的來(lái)自3D6的區(qū)域有最大的序列同一性的優(yōu)選的輕鏈人可變區(qū)是來(lái)自具有Kabat IDNO.019230、005131、005058、005057、005059、U21040和U41645的抗體，其中019230是較優(yōu)選的。與相應(yīng)的來(lái)自3D6的區(qū)域有最大序列同一性的優(yōu)選的重鏈人可變區(qū)是來(lái)自Kabat ID NO.045919、000459、000553、000386和M23691的抗體，其中045919是較優(yōu)選的。
接下來(lái)如下篩選殘基用于取代。當(dāng)氨基酸在3D6可變構(gòu)架區(qū)和等同的人可變構(gòu)架區(qū)之間有差別時(shí)，人構(gòu)架氨基酸通常應(yīng)被等同的小鼠氨基酸取代，如果合理地預(yù)期該氨基酸(1)非共價(jià)直接結(jié)合抗原，(2)與一個(gè)CDR區(qū)相鄰，在由Chothia等，同上提出的可選擇的定義下是CDR區(qū)的一部分，或者另與一個(gè)CDR區(qū)相互作用(例如，CDR區(qū)的約3A內(nèi))(例如，在3D6的L2、H49和H94位置上的氨基酸)，或(3)參與VL-VH界面(例如，氨基酸在3D6的L36、L46和H93位置上的氨基酸)。
3D6抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)以及3D6抗體的人源化的計(jì)算機(jī)模擬描述在實(shí)施例VII中。簡(jiǎn)單地說(shuō)，三維模型的生成是基于重鏈和輕鏈的最接近解開的鼠抗體結(jié)構(gòu)。為此目的，命名為1CR9(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)ID1CR9，Kanyo等，J.Mol.Biol.293855(1999))的抗體被選作模擬3D6輕鏈的模板，而命名為1OPG(PDB ID1OPG，Kodandapani等，J.Biol.Chem.2702268(1995))的抗體被選作模擬3D6重鏈的模板。模型通過(guò)一系列的能量最小化步驟來(lái)解除不期望的原子接觸以及優(yōu)化靜電的和范德華相互作用而進(jìn)一步被改進(jìn)。1qkz的解開結(jié)構(gòu)(PDB ID1QKZ，Derrick等，J.Mol.Biol.29381(1999))被選作模擬重鏈如3D6的CDR3的模板，因?yàn)?D6和1OPG在此區(qū)域中當(dāng)用于比較目的進(jìn)行比對(duì)時(shí)不顯示顯著的序列同源性。
此處所述的抗體的三維結(jié)構(gòu)信息是公眾可獲得的，例如從生物結(jié)構(gòu)信息學(xué)研究協(xié)作體的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Research Collaboratory forStructural Bioinformatics’Protein Data Bank)(PDB)。PDB是通過(guò)萬(wàn)維網(wǎng)免費(fèi)進(jìn)入的且由Berman等(2000)Nucleic Acids Research，28235描述。計(jì)算機(jī)模型化允許CDR-相互作用殘基的測(cè)定。3D6結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型可依次作為起始點(diǎn)，用于預(yù)測(cè)含有取代在人構(gòu)架結(jié)構(gòu)中的3D6互補(bǔ)決定區(qū)的抗體的三維結(jié)構(gòu)。其它的模型可被構(gòu)建，表示結(jié)構(gòu)中導(dǎo)入進(jìn)一步的氨基酸取代。
通常，滿足上述條件的一個(gè)、大多數(shù)或所有的氨基酸的取代是所期望的。因此，本發(fā)明的人源化抗體通常會(huì)含有人輕鏈構(gòu)架殘基用相應(yīng)的3D6殘基在下述位置的至少1、2或3以及更通常4個(gè)位置上進(jìn)行取代L1、L2、L36和L46。人源化抗體也通常含有人重鏈構(gòu)架殘基用相應(yīng)的3D6殘基在下述位置的至少1、2以及有時(shí)3個(gè)位置上進(jìn)行取代H49、H93和H94。人源化抗體也可含有人重鏈構(gòu)架殘基用相應(yīng)的種系殘基在下述位置的至少1、2以及有時(shí)3個(gè)位置上進(jìn)行取代H74、H77和H89。
然而有時(shí)候，一個(gè)特定的氨基酸是否符合上述條件很含糊，且產(chǎn)生可選擇的變體免疫球蛋白，其中的一個(gè)具有特定的取代，而其它的沒(méi)有。在其中用鼠殘基的取代將導(dǎo)入在人免疫球蛋白的特定位置是稀有的殘基的情況下，理想的是對(duì)帶有或不帶有取代的抗體的活性進(jìn)行檢測(cè)。如果帶有或不帶有取代的抗體的活性(例如，結(jié)合親合力和/或結(jié)合特異性)大約相同，沒(méi)有取代的抗體則是優(yōu)選的，因?yàn)檫@將預(yù)計(jì)引起HAHA應(yīng)答的減少，如本文所述。
其它的取代候選為受體人構(gòu)架氨基酸，其在人免疫球蛋白的該位置上是非常見的。這些氨基酸可用來(lái)自更平常的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸進(jìn)行取代?？蛇x擇地，當(dāng)此種氨基酸在人免疫球蛋白的位置是特有的時(shí)，來(lái)自小鼠3D6的等同位置的氨基酸可被導(dǎo)入到人構(gòu)架區(qū)。
在其它的實(shí)施方案中，當(dāng)人輕鏈構(gòu)架受體免疫球蛋白為Kabat IDNO 019230時(shí)，輕鏈含有在下列位置的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更通常13個(gè)取代L7、L10、L12、L15、L17、L39、L45、L63、L78、L83、L85、L100或L104。在其它的實(shí)施方案中，當(dāng)人重鏈構(gòu)架受體免疫球蛋白為Kabat ID NO.045919時(shí)，重鏈含有在下列位置的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更通常15個(gè)取代H3、H5、H13、H16、H19、H40、H41、H42、H44、H72、H77、H82A、H83、H84或H108。這些位置用來(lái)自具有更典型氨基酸殘基的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸進(jìn)行取代。適當(dāng)?shù)陌被崛〈膶?shí)例顯示于圖1和2。
其它的取代候選為構(gòu)架區(qū)中的非-種系殘基。3D6與已知的種系序列的計(jì)算機(jī)比較表明顯示最大程度的序列同一性的重鏈序列包括種系可變區(qū)序列VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21和VH3-11，其中VH3-23為較優(yōu)選的。Kabat ID 045919與VH3-23的序列比對(duì)表明殘基H74、H77和/或H89可選擇用相應(yīng)的種系殘基取代(例如，殘基H74、H77和/或H89，當(dāng)比較Kabat ID 045919和VH3-23時(shí))。同樣，與3D6輕鏈有最大程度序列同一性的種系序列包括A1、A17、A18、A2和A19，其中A19是最優(yōu)選的。在所選擇的輕鏈?zhǔn)荏w構(gòu)架和其中一個(gè)種系序列之間沒(méi)有匹配的殘基可選擇用相應(yīng)的種系殘基來(lái)取代。
表1總結(jié)了3D6 VH和VL區(qū)的序列分析。其它的可以用于3D6抗體和其它的人抗體的計(jì)算機(jī)建模的小鼠和人結(jié)構(gòu)與用于篩選氨基酸取代的種系序列一樣被充分闡述。稀有的小鼠殘基也列在表1中。稀有小鼠殘基的鑒定方法是比較供體VL和/或VH序列與其它的供體VL和/或VH序列所屬的亞組的成員的序列并鑒定其不同于共有序列的殘基位置。這些供體的特異差異可指向增強(qiáng)活性的體細(xì)胞突變。接近于結(jié)合位點(diǎn)的不常見或稀有的殘基可能接觸抗原，使其理想地保留小鼠殘基。然而，如果不常見的小鼠殘基對(duì)于結(jié)合是不重要的，相應(yīng)的受體殘基的采用是優(yōu)選的，因?yàn)樾∈髿埢梢栽谌嗽椿贵w中產(chǎn)生免疫原性的新表位。如果在供體序列中的不常見殘基在相應(yīng)的受體序列中實(shí)際上是一個(gè)普通殘基，則優(yōu)選的殘基毫無(wú)疑問(wèn)是受體殘基。
表13D6 V-區(qū)序列的概況
*來(lái)自相同抗體的重鏈和輕鏈(O-81，Hirabayashi等，NAR202601)。
這里所指的Kabat ID序列是公眾可獲得的，例如，獲自西北大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系(Northwestern University Biomedical EngineeringDepartment)的免疫學(xué)目的蛋白序列的Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)。此處所述的抗體的三維結(jié)構(gòu)信息是公眾可獲得的，例如，獲自生物結(jié)構(gòu)信息學(xué)研究協(xié)作體的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)。PDB是通過(guò)萬(wàn)維網(wǎng)免費(fèi)進(jìn)入的且描述在Berman等，(2000)Nucleic Acids Research，第235-242頁(yè)。此處所述的種系基因序列是公眾可獲得的，例如，獲自收集了Igh、Igκ和Igλ種系V基因的序列的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)(作為在國(guó)家衛(wèi)生研究所(NIH)的國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館(NLM)的分支機(jī)構(gòu))。NCBI“Ig種系基因”數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性檢索由IgG BLASTTM所提供。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體含有(i)包括含有鼠3D6 VL CDR和人受體構(gòu)架的可變區(qū)的輕鏈，其中構(gòu)架具有至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)選自L1、L2、L36和L46用相應(yīng)的3D6殘基取代的殘基，以及(ii)含有3D6 VH CDR和人受體構(gòu)架的重鏈，其中構(gòu)架具有至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)選自H49、H93和H94用相應(yīng)的3D6殘基取代的殘基，以及可優(yōu)選地，至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)選自H74、H77和H89用相應(yīng)的人種系殘基取代的殘基。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體含有(i)包括含有鼠3D6 VL CDR和人受體構(gòu)架的可變區(qū)的輕鏈，其中構(gòu)架具有用酪氨酸(Y)取代的殘基1，用纈氨酸(V)取代的殘基2，用亮氨酸(L)取代的殘基36和/或用精氨酸(R)取代的殘基46，和(ii)包括3D6 VH CDR和人受體構(gòu)架的重鏈，其中構(gòu)架具有用丙氨酸(A)取代的殘基49，用纈氨酸(V)取代的殘基93和/或用精氨酸(R)取代的殘基94，以及可優(yōu)選地，具有用絲氨酸(S)取代的殘基74，用蘇氨酸(T)取代的殘基77和/或用纈氨酸(V)取代的殘基89。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體具有此處所描述的結(jié)構(gòu)特征，且進(jìn)一步具有至少一個(gè)(優(yōu)選兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或全部)下述的活性(1)結(jié)合聚集的Aβ1-42(例如，通過(guò)ELISA測(cè)定)；(2)結(jié)合斑中的Aβ(例如，AD和/或PDAPP斑的染色)；(3)結(jié)合與嵌合3D6相比較具有兩倍到三倍的結(jié)合親合力的Aβ(例如，具有鼠CDR和人受體FR的3D6)；(4)介導(dǎo)Aβ的吞噬作用(例如，在離體吞噬作用測(cè)定中，如這里所述)；以及(5)通過(guò)血腦屏障(例如，證明短期的腦定位作用，例如在PDAPP動(dòng)物模型中，如這里所述)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體具有此處所述的結(jié)構(gòu)特征，以一種方式或足以激發(fā)至少一種下述體內(nèi)影響的親合力結(jié)合Aβ(1)減少Aβ斑沉積；(2)預(yù)防班形成；(3)降低可溶性Aβ的水平；(4)減少與致淀粉樣疾病相關(guān)的神經(jīng)炎性病癥；(5)減少或改善至少一種與致淀粉樣疾病相關(guān)的生理癥狀；和/或(6)提高認(rèn)知功能。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明人源化抗體具有此處所述的結(jié)構(gòu)特征，并且特異性結(jié)合于含有Aβ第1-5位或第3-7位殘基的抗原決定簇。
3.人抗體抗Aβ人抗體通過(guò)以下所述的多種技術(shù)提供。一些人抗體通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)選擇，或相反具有與特定的小鼠抗體相同的表位特異性，例如在這里所述的小鼠單克隆抗體之一。人抗體也可以通過(guò)僅用Aβ的片段作為免疫原，和/或通過(guò)篩選抗Aβ缺失突變體集合的抗體，對(duì)特定表位特異性進(jìn)行篩選。人抗體優(yōu)選具有人IgG1同種型特異性。
a.三雜交瘤(trioma)法Oestberg等，Hybridoma 2361(1983)，美國(guó)專利No.4,634,664；以及Engleman等，美國(guó)專利4,634,666(為所有目的分別在此引入作為參考)描述了基本方法和該方法中作為范例的細(xì)胞融合組分SPAZ-4。由于抗體產(chǎn)生細(xì)胞系來(lái)自三個(gè)細(xì)胞兩個(gè)人細(xì)胞和一個(gè)小鼠細(xì)胞，這種獲得抗體產(chǎn)生細(xì)胞系的方法稱為三雜交瘤法。首先，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞系與人B淋巴細(xì)胞融合，得到非抗體產(chǎn)生的異種雜交細(xì)胞，如Oestberg同上所述的SPAZ-4細(xì)胞系。接著使該異種細(xì)胞與免疫化的人B淋巴細(xì)胞融合，獲得抗體產(chǎn)生的三雜交瘤細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)三雜交瘤比來(lái)自人細(xì)胞的普通雜交瘤細(xì)胞有更穩(wěn)定的抗體生產(chǎn)。
免疫化的B淋巴細(xì)胞從人供體的血液、脾臟、淋巴結(jié)或骨髓中獲得。如果期望抗體抗特異抗原或表位，優(yōu)選使用該抗原或其表位免疫。免疫可以是體外或體內(nèi)。對(duì)于體內(nèi)免疫，B細(xì)胞通常從用Aβ、其片段，帶有Aβ或其片段的更大的多肽或Aβ抗體的抗-獨(dú)特型抗體免疫的人中獲得。在一些方法中，B細(xì)胞來(lái)自最終被給藥抗體治療的同一患者。對(duì)于體外免疫，通常使B淋巴細(xì)胞在添加有10％人血漿的培養(yǎng)基如RPM-1640中(參見Engleman，同上)接觸抗原7-14天的時(shí)間。
通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，免疫化的B淋巴細(xì)胞與異種雜交細(xì)胞如SPAZ-4融合。例如，細(xì)胞用分子量為1000-4000的40-50％聚乙二醇在37℃處理約5-10分鐘。從融合混合物中分離細(xì)胞并在選擇性培養(yǎng)基中擴(kuò)增所需的雜交細(xì)胞(如HAT或AH)。通過(guò)分析三雜交瘤培養(yǎng)基中結(jié)合Aβ或其片段的能力，可以鑒定分泌具有所需的結(jié)合特異性抗體的克隆。生產(chǎn)具有所期望特異性的人抗體的三雜交瘤細(xì)胞用限制稀釋技術(shù)亞克隆，并在培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)。然后，測(cè)定獲得的三雜交瘤細(xì)胞系結(jié)合Aβ或其片段的能力。
盡管三雜交瘤細(xì)胞遺傳上穩(wěn)定，但并不高水平產(chǎn)生抗體?？梢詫?lái)自三雜交瘤細(xì)胞的抗體基因克隆到一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體中，并把載體轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)的哺乳動(dòng)物、細(xì)菌或酵母細(xì)胞系，以增加表達(dá)水平。
b.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物抗Aβ人抗體也可以由轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物生產(chǎn)，其具有至少編碼人免疫球蛋白基因座區(qū)段的轉(zhuǎn)基因。通常，這種轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的內(nèi)源免疫球蛋白基因座在功能上是無(wú)活性的。優(yōu)選地，人免疫球蛋白基因座區(qū)段包括重鏈和輕鏈成分的未經(jīng)重排的序列。內(nèi)源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的導(dǎo)入都可以通過(guò)定向同源重組，或YAC染色體的導(dǎo)入實(shí)現(xiàn)。由此過(guò)程獲得的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物能夠功能性重排免疫球蛋白成分序列，大量表達(dá)由人免疫球蛋白基因編碼的各種同種型抗體，且不表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白基因。具有這些特性的哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)與特性詳細(xì)描述于例如，Lonberg等，WO93/12227(1993)；US5,877,397，US5,874,299，US5,814,318，US5,789,650，US5,770,429，US5,661,016，US5,633,425，US5,625,126，US5,569,825，US5,545,806，Nature 1481547(1994)，NatureBiotechnology 14826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991)(為各種目的分別引入本文作為參考)。轉(zhuǎn)基因小鼠是特別合適的。用Aβ或其片段免疫轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物可以獲得抗-Aβ抗體，如Lonberg或Kucheriapati，同上所述。利用常規(guī)的Kohler-Milstein技術(shù)，通過(guò)例如將來(lái)自這些哺乳動(dòng)物的B細(xì)胞和合適雜交瘤細(xì)胞系融合可以用來(lái)制備單克隆抗體。還可以從用免疫原性藥劑免疫的人血清中提供人多克隆抗體?；蛘撸摱嗫寺】贵w可以利用Aβ或其它淀粉樣肽作為親合試劑，通過(guò)親和純化來(lái)濃縮。
c.噬菌體展示法另外獲得人抗-Aβ抗體的方法是篩選人B細(xì)胞的DNA文庫(kù)，一般方案概述見Huse等，Sciences 2461275-1281(1989)。如在三雜交瘤法中所描述，B細(xì)胞可以從用Aβ、其片段，帶有Aβ或片段的更大的多肽或抗-獨(dú)特型抗體免疫的人中獲得?；蛘撸珺細(xì)胞可以從最終接受抗體治療的患者中獲得。選擇結(jié)合Aβ或其片段的抗體。然后克隆并擴(kuò)增編碼這些抗體(或結(jié)合片段)的序列。Huse所述方案和噬菌體展示法一同使用將會(huì)更加有效。參見例如，Dower等，WO 91/17271，McCafferty等，WO 92/01047，Herzig等，US5,877,218，Winter等，US5,871,907，Winter等，US5,858,657，Holliger等，US5,837,242，Johnson等，US5,733,743和Hoogenboom等，US5,565,332(為各種目的分別引入本文作為參考)。在這些方法中，產(chǎn)生噬菌體文庫(kù)，其中的成員在它們的外表面上展示不同的抗體?？贵w通常展示為Fv或Fab片段。通過(guò)親和富集選擇對(duì)Aβ或其片段具有所期望的特異性的噬菌體展示抗體。
在變化的噬菌體展示方法中，生產(chǎn)具有所選擇的鼠抗體結(jié)合特異性的人抗體。參見Winter WO 92/20791。這種方法中，選擇的鼠抗體的輕鏈或重鏈的可變區(qū)用作起始材料。例如，如果輕鏈的可變區(qū)用作起始材料，構(gòu)建的噬菌體文庫(kù)其成員展示相同的輕鏈可變區(qū)(即鼠起始材料)和不同的重鏈可變區(qū)。重鏈可變區(qū)獲自重排的人重鏈可變區(qū)文庫(kù)。選擇對(duì)Aβ顯示強(qiáng)特異性結(jié)合(例如，至少108，優(yōu)選至少109M-1)的噬菌體。然后來(lái)自該噬菌體的人重鏈可變區(qū)作為構(gòu)建另一個(gè)噬菌體文庫(kù)的起始材料。該文庫(kù)中，每個(gè)噬菌體展示相同的重鏈可變區(qū)(即從第一個(gè)展示文庫(kù)中鑒定的區(qū)域)和不同的輕鏈可變區(qū)。輕鏈可變區(qū)獲自重排的人輕鏈可變區(qū)文庫(kù)。再一次，選擇對(duì)Aβ顯示強(qiáng)特異性結(jié)合的噬菌體。這些噬菌體展示完全的人抗-Aβ抗體的可變區(qū)。這些抗體通常與鼠起始材料具有相同或相似的表位特異性。
4.可變區(qū)的制備在已經(jīng)概念性地選擇人源化免疫球蛋白的CDR和構(gòu)架組分之后，各種各樣的方法可以用來(lái)制備這樣的免疫球蛋白。因?yàn)槊艽a子的簡(jiǎn)并性，各種核酸序列將編碼各自的免疫球蛋白氨基酸序列。所需核酸序列的產(chǎn)生方法是全程固相DNA合成或?qū)^早制備的所需多核苷酸進(jìn)行PCR誘變。寡核苷酸介導(dǎo)的誘變是優(yōu)選的制備靶多肽DNA的取代、缺失和插入的變體的方法。參見Adelman等，DNA2183(1983)。簡(jiǎn)而言之，靶多核苷酸DNA通過(guò)雜交編碼所需突變的寡核苷酸與單鏈DNA模板而改變。在雜交后，DNA聚合酶用于合成模板的整個(gè)第二互補(bǔ)鏈，所述模板摻入寡核苷酸引物且編碼靶多肽DNA中選擇的改變。
5.恒定區(qū)的選擇如上所述制備的抗體的可變片段(例如，嵌合、人源化或人抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū))通常連接于免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的部分。人恒定區(qū)DNA序列可通過(guò)公知的方法分離自各種人細(xì)胞，但優(yōu)選無(wú)限增值化的B細(xì)胞(參見Kabat等，同上，以及Liu等，WO87/02671)(為所有目的分別以全文引入作為參考)。照例，抗體將含有輕鏈和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)通常包括CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區(qū)。這里描述的抗體包括具有所有類型恒定區(qū)的抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及任意的同種型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。恒定區(qū)的選擇部分依賴于期望的是否是抗體依賴性補(bǔ)體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的毒性。例如，同種型IgG1和IgG3有補(bǔ)體活性但同種型IgG2和IgG4沒(méi)有。當(dāng)所期望的抗體(例如，人源化抗體)顯示胞毒活性時(shí)，恒定區(qū)一般是固定恒定區(qū)的補(bǔ)體，通常為IgG1類。當(dāng)此種胞毒不是所期望的時(shí)，恒定區(qū)可以屬于IgG2類。同種型的選擇也影響抗體進(jìn)入腦部的通路。人同種型IgG1是優(yōu)選的。輕鏈恒定區(qū)可以是λ或κ。人源化抗體可含有來(lái)自一個(gè)以上的類型或同種型的序列?？贵w可以表達(dá)為含有兩個(gè)輕鏈和兩個(gè)重鏈的四聚體，可以為單獨(dú)的輕鏈和重鏈，如Fab、Fab′F(ab′)2和Fv，也可以作為其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過(guò)間隔區(qū)連接的單鏈抗體。
6.重組抗體的表達(dá)嵌合、人源化和人抗體通常通過(guò)重組表達(dá)來(lái)制備。將編碼可選擇地連接于恒定區(qū)的人源化輕鏈和重鏈可變區(qū)的核酸插入到表達(dá)載體中。輕鏈和重鏈可被克隆到相同或不同的表達(dá)載體中。使編碼免疫球蛋白鏈的DNA區(qū)段可操作連接到表達(dá)載體中的調(diào)控序列來(lái)確保免疫球蛋白多肽的表達(dá)。表達(dá)調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子(例如，天然相關(guān)的或異源的啟動(dòng)子)、信號(hào)序列、增強(qiáng)子元件以及轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，表達(dá)調(diào)控序列是能轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動(dòng)子系統(tǒng)。一旦該載體進(jìn)入合適的宿主后，使宿主維持在適合該核苷酸序列高水平表達(dá)以及適合交叉反應(yīng)抗體的收集和純化的環(huán)境中。
這些表達(dá)載體通常作為游離基因或作為宿主染色體DNA的整合部分可在宿主生物體中復(fù)制。通常，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記(例如，氨芐青霉素-抗性、潮霉素-抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)以使得這些用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞得以檢測(cè)(參見例如，Itakura等，美國(guó)專利4,704,362)。
大腸桿菌(E.Coli)是對(duì)于本發(fā)明的多核苷酸(例如DNA序列)的克隆特別有用的一種原核宿主。其它適用的微生物宿主包括桿菌，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)，以及其它的腸細(xì)菌，例如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)以及各種假單胞菌(Pseudomonas)種。在這些原核宿主中，其也可以產(chǎn)生表達(dá)載體，通常含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)調(diào)控序列(例如復(fù)制的起點(diǎn))。另外，任意的各種已知的啟動(dòng)子也會(huì)存在，例如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)或來(lái)自噬菌體λ的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子一般將調(diào)控表達(dá)，可選擇地與操縱基因序列一起，且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等，用于啟動(dòng)和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。
其它的微生物，例如酵母，也可用于表達(dá)。糖酵母(Saccharomyces)是優(yōu)選的酵母宿主，帶有具有表達(dá)調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子)、復(fù)制的起點(diǎn)、終止序列等的合適載體是所期望的。典型的啟動(dòng)子包括3-磷酸甘油激酶和其它糖酵解酶?？烧T導(dǎo)的酵母啟動(dòng)子尤其包括來(lái)自乙醇脫氫酶、同型細(xì)胞色素和參與麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子。
除了微生物外，哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可用于表達(dá)和生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(例如編碼免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。參見Winnacker，F(xiàn)rom Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.(1987)。真核細(xì)胞實(shí)際上是優(yōu)選的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域中開發(fā)了許多能夠分泌異源蛋白(如完整的免疫球蛋白)的合適宿主細(xì)胞系，包括CHO細(xì)胞系、各種COS細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞，優(yōu)選骨髓瘤細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞和雜交瘤。優(yōu)選地，細(xì)胞為非人的細(xì)胞。這些細(xì)胞的表達(dá)載體包括表達(dá)調(diào)控序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(Queen等，Immunol.Rev.8949(1986))，以及必須的加工信號(hào)位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選的表達(dá)調(diào)控序列是來(lái)自免疫球蛋白基因、巨細(xì)胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒等的啟動(dòng)子。參見Co等，J.Immunol.1481149(1992)。
或者，抗體編碼序列可摻入到轉(zhuǎn)基因中，用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組并隨后在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中表達(dá)(參見，例如Deboer等，US5,741,957，Rosen，US5,304,489，和Meade等，US5,849,992)。合適的轉(zhuǎn)基因包括與哺乳動(dòng)物乳腺特異基因，例如酪蛋白或β乳球蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子可操作連接的輕鏈和重鏈的編碼序列。
含有目的多核苷酸序列(例如重鏈和輕鏈編碼序列和表達(dá)調(diào)控序列)的載體可依據(jù)細(xì)胞宿主的類型通過(guò)公知的方法被轉(zhuǎn)到宿主中。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理、電傳孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、生物裂解(biolistics)和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染可用于其它細(xì)胞宿主。(通常參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press，第2版，1989)(全文引入作為參考)。轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物的其它方法包括使用聚凝胺(Polybrene)、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電傳孔以及顯微注射(通常參見，Sambrook等，同上)。為了獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因可以置微注射入受精卵細(xì)胞，或可以引入胚胎干細(xì)胞的基因組中，以及將這些細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入去核卵母細(xì)胞中。
當(dāng)重鏈和輕鏈克隆在單獨(dú)的表達(dá)載體上時(shí)，載體被共轉(zhuǎn)染從而獲得完整免疫球蛋白的表達(dá)和裝配。一旦表達(dá)，整個(gè)抗體、其二聚物、獨(dú)立的輕鏈和重鏈或本發(fā)明的其它免疫球蛋白形式可通過(guò)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)純化，包括硫酸銨沉淀、親和柱層析、柱層析法、HPLC純化、凝膠電泳等(通常參見Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。作為藥物用途，至少90到95％同質(zhì)性的基本上純化的免疫球蛋白是優(yōu)選的，98到99％或更高的同質(zhì)性是更優(yōu)選的。
7.抗體片段也在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供非人的片段、嵌合和/或人抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供人源化抗體的片段。通常，這些片段顯示特異性結(jié)合抗原，其具有至少107，且更通常108或109M-1親合力。人源化抗體片段包括單獨(dú)的重鏈，輕鏈Fab、Fab′F(ab′)2、Fabc以及Fv。片段通過(guò)重組DNA技術(shù)，或通過(guò)酶解或化學(xué)分離完整的免疫球蛋白來(lái)產(chǎn)生。
8.抗體在動(dòng)物模型中的治療功效的測(cè)試各組7-9月大的PDAPP小鼠用0.5mg PBS中的多克隆抗-Aβ或特異性抗-Aβ單克隆抗體注射。所有的抗體制劑純化到具有低的內(nèi)毒素水平?？蛊螁慰寺〉闹苽浞椒ㄊ菍β的片段或長(zhǎng)型注射到小鼠中，制備雜交瘤并篩選特異性結(jié)合Aβ的所需片段而不結(jié)合Aβ的其它非重疊片段的抗體的雜交瘤。
如有必要，小鼠腹膜內(nèi)注射4個(gè)月時(shí)期以維持流動(dòng)的抗體濃度，通過(guò)ELISA測(cè)定的效價(jià)大于對(duì)Aβ42或其它的免疫原由ELISA所確定的1/1000。監(jiān)測(cè)效價(jià)且小鼠在6個(gè)月注射的末期實(shí)施安樂(lè)死。死后進(jìn)行組織化學(xué)、Aβ水平以及毒理學(xué)操作。每組使用10個(gè)小鼠。
9.篩選具有清除活性的抗體本發(fā)明也提供在淀粉樣沉積物或任何其它抗原或相關(guān)生物實(shí)體的清除中具有活性的抗體的篩選方法，這種清除活性是所期望的。為了篩選對(duì)淀粉樣沉積物的清除活性，將來(lái)自阿爾茨海默氏病患者的腦部組織樣品或具有阿爾茨海默氏病病理現(xiàn)象之動(dòng)物模型與帶有Fc受體的吞噬細(xì)胞，如小膠質(zhì)細(xì)胞，以及受測(cè)抗體在培養(yǎng)基中體外接觸。吞噬細(xì)胞可以是初級(jí)培養(yǎng)物或如BV-2、C8-B4或THP-1之類的細(xì)胞系。在一些方法中，這些成分被集合于顯微鏡載玻片上以便顯微監(jiān)控。一些方法中，多個(gè)反應(yīng)在微量滴定板的孔中平行進(jìn)行。以這種方式，獨(dú)立的微型顯微鏡載玻片可以放置在獨(dú)立的小孔中，或者在可以使用非顯微檢測(cè)的方式，如Aβ的ELISA檢測(cè)。優(yōu)選地，對(duì)體外反應(yīng)混合物中淀粉樣沉積物的量進(jìn)行一系列測(cè)定，從反應(yīng)前的基線值開始，以及反應(yīng)進(jìn)行中的一個(gè)或多個(gè)測(cè)試值?？乖梢酝ㄟ^(guò)染色檢測(cè)，如熒光標(biāo)記的Aβ抗體或其它淀粉樣斑的成分。用于染色的抗體可以與受測(cè)清除活性的抗體相同，也可以不同。如果在淀粉樣沉積的反應(yīng)中出現(xiàn)相對(duì)于基線的降低，則認(rèn)為受測(cè)抗體具有清除活性。這些抗體可能在用于預(yù)防或治療阿爾茨海默氏病和其它致淀粉樣病中是有用的。
類似的方法可以用于篩選在清除其它類型生物實(shí)體中具有活性的抗體。該分析可以用于對(duì)幾乎任何類型生物實(shí)體檢測(cè)清除活性。通常，生物實(shí)體在人和動(dòng)物的疾病中有某個(gè)作用。生物實(shí)體可以組織樣品或分離的形式提供。如果是組織樣品，優(yōu)選非固定的組織樣品，以使其成分易于接觸，以及避免伴隨著固定對(duì)成分構(gòu)象的干擾。在本分析中可用于測(cè)試的組織樣品的例子包括癌組織、癌變前組織、良性生長(zhǎng)的組織如疣或痣、感染了病原微生物的組織、炎性細(xì)胞所浸潤(rùn)的組織、含有細(xì)胞間病理基質(zhì)(如血纖維蛋白性心包炎)的組織、帶有異?？乖慕M織以及瘢痕組織?？梢允褂玫姆蛛x的生物實(shí)體包括Aβ、病毒抗原或病毒、蛋白聚糖、其它病原微生物的抗原、腫瘤抗原以及粘連分子。這些抗原可以從天然來(lái)源、重組表達(dá)或化學(xué)合成方法或其它方式獲得。使該組織樣品或分離的生物實(shí)體與帶有Fc受體的吞噬細(xì)胞，如小膠質(zhì)細(xì)胞或單核細(xì)胞以及受測(cè)抗體在培養(yǎng)基中接觸。該抗體可針對(duì)受測(cè)生物實(shí)體或與之相關(guān)的抗原。在后一種情況中，目的在于測(cè)試帶有該抗原的生物實(shí)體是否替代性地被吞噬。通常，盡管并不必需，抗體與生物實(shí)體(有時(shí)帶有相關(guān)抗原)相互接觸發(fā)生在吞噬細(xì)胞加入之前。然后監(jiān)測(cè)殘存于培養(yǎng)基中的生物實(shí)體和/或相關(guān)抗原的濃度，如果存在的話。培養(yǎng)基中的生物實(shí)體或相關(guān)抗原濃度或量的減少顯示，在吞噬細(xì)胞參與時(shí)，該抗體對(duì)于該生物實(shí)體和/或相關(guān)抗原具有清除活性(參見例如，實(shí)施例IV)。
B.編碼免疫和治療劑的核酸對(duì)淀粉樣沉積物的免疫應(yīng)答也可以通過(guò)給藥編碼用于被動(dòng)免疫的抗體及其組分鏈的核酸進(jìn)行誘導(dǎo)。所述核酸可以是DNA或RNA。編碼免疫原的核酸區(qū)段通常與調(diào)控元件相連，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，這使DNA區(qū)段得以在患者的預(yù)期靶細(xì)胞中表達(dá)。對(duì)于在血細(xì)胞中的表達(dá)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答理想的是，來(lái)自免疫球蛋白輕鏈或重鏈基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件或者CMV主要中早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子適用于指導(dǎo)表達(dá)。相連的調(diào)控元件和編碼序列經(jīng)常被克隆到載體中。給藥雙鏈抗體時(shí)，其兩條鏈可以克隆于同一個(gè)載體中，也可以分別克隆于不同載體中。
一些可獲得的病毒載體系統(tǒng)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(參見例如，Lawrie和Tumin，Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109(1993))；腺病毒載體(參見例如，Bett等，J.Virol.675911(1993))；腺相關(guān)病毒載體(參見例如，Zhou等，J.Exp.Med.1791867(1994))；來(lái)自痘病毒家族的病毒載體，包括牛痘病毒和禽痘病毒；來(lái)自α病毒屬的病毒載體，例如來(lái)自新培斯病毒和塞姆利基森林病毒的那些載體(參見例如，Dubensky等，J.Virol.70508(1996))；委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(參見Johnston等，US5,643,576)和甲病毒，如水泡性口膜炎病毒(參見，Rose，WO 96/34625)以及乳頭瘤病毒(Ohe等，Human Gene Therapy6325(1995)；Woo等，WO 94/12629和Xiao & Brandsma，Nucleic Acids.Res.24，2630-2622(1996))。
編碼免疫原的DNA或含該DNA的載體可以包裝于脂質(zhì)體中。合適的脂質(zhì)和相關(guān)類似物描述于Eppstein等，US5,208,036，F(xiàn)elgner等，US5,264,618，Rose，US5,279,833以及Epand等，US5,283,185。載體和編碼免疫原的DNA還可以吸附或連接到顆粒性載體上，載體的例子包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚丙交酯類以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，參見例如，McGee等，J.Micro Encap.(1996)。
可以通過(guò)向體內(nèi)傳遞基因治療載體或裸DNA對(duì)個(gè)體患者給藥，一般通過(guò)全身性給藥(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻腔、胃、皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或頭顱內(nèi)灌輸)或者局部給藥(參見例如，Anderson等，US5,399,346)。術(shù)語(yǔ)“裸多核苷酸”是指多核苷酸沒(méi)有與膠體物質(zhì)復(fù)合。裸多核苷酸有時(shí)被克隆到質(zhì)粒載體中。這種載體進(jìn)一步可以包含如丁哌卡因的輔助藥劑(Attardo等，US5,593,970)。還可以利用基因槍給藥DNA。參見Xiao和Brandsma，同上。編碼免疫原的DNA可以沉淀到顯微的金屬珠表面。用沖擊波或擴(kuò)散氦氣加速微粒，使它透過(guò)組織到達(dá)幾個(gè)細(xì)胞層的深度。例如，Agacetus，Inc.Middleton WI生產(chǎn)的AccelTM基因傳送裝置是適用的?；蛘?，僅需用化學(xué)或機(jī)械刺激將裸DNA點(diǎn)在皮膚上即可使DNA穿過(guò)皮膚到達(dá)血流(參見Howell等，WO95/05853)。
在進(jìn)一步變例中，可以將編碼免疫原的載體輸送給離體細(xì)胞，例如來(lái)自個(gè)體患者的移植細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞、骨髓穿刺液、組織活檢)或者一般供體的造血干細(xì)胞，通常對(duì)已插入了載體的細(xì)胞進(jìn)行挑選后，再次將細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。
II.預(yù)防和治療方法本發(fā)明尤其涉及阿耳茨海默氏病和其它的致淀粉樣疾病的治療，通過(guò)給患者施用針對(duì)Aβ特異表位的治療免疫劑(例如，人源化免疫球蛋白)在患者中產(chǎn)生有益治療反應(yīng)的條件下(例如，誘導(dǎo)Aβ吞噬作用，減少斑沉積、抑制斑的形成、減少神經(jīng)炎性營(yíng)養(yǎng)障礙、改進(jìn)認(rèn)知功能和/或回復(fù)、治療或預(yù)防認(rèn)知衰退)，例如，用于預(yù)防和治療致淀粉樣疾病。本發(fā)明也公開了已知的免疫因子(例如，人源化免疫球蛋白)在用于治療和預(yù)防致淀粉樣疾病的藥物的應(yīng)用。
在此所述的術(shù)語(yǔ)“治療”定義為治療劑對(duì)患者應(yīng)用或給藥，或治療劑對(duì)來(lái)自具有疾病、疾病癥狀或發(fā)病傾向的患者的分離的組織或細(xì)胞系應(yīng)用或給藥，其目的在于治愈、痊愈、減輕、緩解、改變、改善、改進(jìn)或影響疾病、疾病癥狀或發(fā)病傾向。
在一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防和治療與患者腦中的Aβ淀粉樣沉積物相關(guān)的疾病的方法。此種疾病包括阿耳茨海默氏病、唐氏綜合癥和認(rèn)知損傷。后者可與有或沒(méi)有致淀粉樣疾病的其它特征一起出現(xiàn)。本發(fā)明的一些方法需要給患者施用有效劑量的特異性結(jié)合淀粉樣沉積物成分的抗體。這些方法特別適用于人類患者阿爾茨海默氏病的預(yù)防與治療。示例的方法需要給藥有效劑量的結(jié)合Aβ的抗體。優(yōu)選的方法需要給藥有效劑量的特異性結(jié)合位于Aβ第1-10位殘基內(nèi)的表位的抗體，例如特異性結(jié)合于Aβ第1-3位殘基的表位的抗體，特異性結(jié)合于Aβ第1-4位殘基的表位的抗體，特異性結(jié)合于Aβ第1-5位殘基的表位的抗體，特異性結(jié)合于Aβ第1-6位殘基的表位的抗體，特異性結(jié)合于Aβ第1-7位殘基的表位的抗體，或特異性結(jié)合于Aβ第3-7位殘基的表位的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了給藥結(jié)合于包含Aβ游離N-末端殘基的表位的抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了給藥結(jié)合于Aβ第1-10位殘基內(nèi)的表位的抗體，其中Aβ的第1位殘基和/或第7位殘基為天冬氨酸。然而在另一方面，本發(fā)明提供了給藥特應(yīng)性結(jié)合于Aβ肽而不結(jié)合全長(zhǎng)淀粉樣前體蛋白(APP)的抗體。在另一個(gè)方面，所述抗體的同種型是IgG1。
在另一方面，本發(fā)明提供了給藥結(jié)合患者的淀粉樣沉積物并誘導(dǎo)對(duì)淀粉樣沉積物的清除反應(yīng)。例如，這種清除反應(yīng)可以通過(guò)Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的治療劑通常是基本上純的，不含不需要的污染物。這是指藥劑通常至少約50％w/w(重量/重量)純度，同時(shí)基本上不含干擾蛋白和污染物。有時(shí)候藥劑至少約80％w/w以及更優(yōu)選至少90或約95％w/w純度。然而，使用常規(guī)蛋白純化技術(shù)，至少99％w/w的均一性蛋白可以獲得。
這些方法可以用于無(wú)癥狀的患者和那些目前出現(xiàn)癥狀的患者。在這些方法中使用的抗體可以是人抗體、人源化的、嵌合的或非人的抗體或其片段(例如抗原結(jié)合片段)且可以是單克隆或多克隆的，如本文所述。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了給藥由用Aβ肽免疫人中制備的抗體，該人可以是將由抗體治療的患者。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了給藥抗體和藥用載體作為藥用組合物。或者，抗體可給藥于患者通過(guò)給藥編碼至少一個(gè)抗體鏈的多核苷酸。多核苷酸在患者體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生抗體連。或者，多核苷酸編碼抗體的重鏈和輕鏈。這種多核苷酸在患者中表達(dá)產(chǎn)生重鏈和輕鏈。在示例的實(shí)施方案中，監(jiān)控患者給藥抗體在血液中的水平。
因此本發(fā)明滿足了預(yù)防或改善神經(jīng)病理的治療方法以及在一些患者中與阿耳茨海默氏病相關(guān)的認(rèn)知損傷的長(zhǎng)期需求。
A.接受治療的患者接受治療的患者包括具有患病危險(xiǎn)但沒(méi)有表現(xiàn)出癥狀的個(gè)體，以及目前表現(xiàn)出癥狀的患者。對(duì)于阿爾茨海默氏病，實(shí)際上任何人，只要他或她活得足夠長(zhǎng)，都存在患阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明方法可以對(duì)普通群體預(yù)防性給藥，而無(wú)需評(píng)估受試患者的危險(xiǎn)。本發(fā)明尤其對(duì)已知具有阿爾茨海默氏病遺傳危險(xiǎn)的個(gè)體有用。所述個(gè)體包括那些有親屬已患該病的個(gè)體，和那些通過(guò)遺傳學(xué)和生化標(biāo)記分析確定存在風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。對(duì)于阿爾茨海默氏病的危險(xiǎn)遺傳學(xué)標(biāo)記包括APP基因的突變，尤其是在第717位、第670和671位的分別被稱為Hardy突變和Swedish突變的突變(參見Hardy，同上)。其它危險(xiǎn)標(biāo)記是早衰素基因PS1和PS2以及ApoE4中的突變、AD家族史、血膽固醇過(guò)多或動(dòng)脈粥樣硬化。目前正患阿爾茨海默氏的個(gè)體可以通過(guò)特征性癡呆以及上述危險(xiǎn)因子的存在來(lái)識(shí)別。另外，大量診斷測(cè)試可用來(lái)鑒定患AD的患者。這些測(cè)試包括測(cè)定CSFτ和Aβ42的水平。τ水平升高和Aβ42水平下降表示患有AD。也可以通過(guò)實(shí)施例部分論述的ADRDA標(biāo)準(zhǔn)來(lái)診斷患阿爾茨海默氏病的個(gè)體。
對(duì)于無(wú)癥狀患者，可以在任何年齡開始治療(例如10、20、30歲)。然而，通常在患者到40、50、60或70歲時(shí)才需要開始治療。治療通常需要在一段時(shí)期內(nèi)進(jìn)行多劑量給藥?？梢酝ㄟ^(guò)隨時(shí)間分析抗體水平來(lái)監(jiān)測(cè)治療。如果應(yīng)答失敗，表明需要升高劑量。對(duì)于潛在的唐氏綜合癥患者，可以在產(chǎn)前對(duì)母親給藥治療劑開始治療，也可以在出生后不久對(duì)患者給藥。
B.治療方案和劑量在預(yù)防應(yīng)用中，對(duì)易患阿爾茨海默氏病或有患阿爾茨海默氏病危險(xiǎn)的患者給藥足以消除或降低危險(xiǎn)、減輕嚴(yán)重性或延緩疾病發(fā)作的劑量的藥物組合物或藥物，包括疾病的生化、組織學(xué)和/或行為癥狀，疾病發(fā)展中呈現(xiàn)的中間病理現(xiàn)象及其并發(fā)癥。在治療應(yīng)用中，對(duì)易患或已經(jīng)患所述疾病的患者給藥足以治愈或至少部分抑制疾病癥狀(生化、組織學(xué)和/或行為癥狀)包括疾病發(fā)展中出現(xiàn)的中間病理現(xiàn)象及其并發(fā)癥的劑量的組合物或藥物。
在一些方法中，藥劑的給藥減少或消除了尚未表現(xiàn)典型阿爾茨海默氏病病理現(xiàn)象的患者的認(rèn)知損傷。足以實(shí)現(xiàn)治療或預(yù)防治療的量稱為治療-或預(yù)防-有效劑量。在預(yù)防和治療方案中，通常藥劑給藥幾個(gè)劑量，直到實(shí)現(xiàn)充分的免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”或“免疫學(xué)應(yīng)答”包括體液(抗體介導(dǎo))和/或細(xì)胞(通過(guò)抗原特異的T細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物介導(dǎo))針對(duì)接受者中的抗原反應(yīng)的發(fā)展。此種反應(yīng)可以是主動(dòng)反應(yīng)，即通過(guò)給藥免疫原誘導(dǎo)，或被動(dòng)反應(yīng)，即通過(guò)給藥免疫球蛋白或抗體或接觸過(guò)抗原的T細(xì)胞誘導(dǎo)。
“免疫原因子”或“免疫原”在給藥哺乳動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)抵抗其本身的免疫應(yīng)答，可選擇地與佐劑結(jié)合。通常免疫應(yīng)答受到監(jiān)控，并且如果免疫應(yīng)答開始減弱則重復(fù)給藥。
本發(fā)明用于治療上述病癥的組合物的有效劑量隨一些不同因素而改變，包括給藥方法、靶部位、患者的生理狀況、患者是人還是動(dòng)物、所給藥的其它藥物以及處理是治療性的還是預(yù)防性的。通常，患者為人，但也可以治療包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在內(nèi)的非人哺乳動(dòng)物。治療劑量需要用滴定法測(cè)量，以優(yōu)化安全性和有效性。
對(duì)于利用抗體的被動(dòng)免疫，劑量范圍為約0.0001到100mg/kg受體體重，更經(jīng)常為0.01到5mg/kg受體體重。例如，劑量可能為1mg/kg受體體重或10mg/kg受體體重或在1-10mg/kg受體體重范圍之內(nèi)，優(yōu)選至少1mg/kg受體體重。受試者可每天、幾天間隔、每周或根據(jù)任何其它的經(jīng)驗(yàn)給藥這些劑量。一種示例的治療需要以多劑量給藥延續(xù)一段時(shí)間，例如至少6個(gè)月。其它的示例的治療方案包括每?jī)芍芤淮位蛞粋€(gè)月一次或每3到6個(gè)月一次給藥。示范性的給藥時(shí)間表包括1-10mg/kg或15mg/kg連續(xù)多天，30mg/kg幾天間隔或每周60mg/kg。在一些方法中，同時(shí)給藥兩種或多種具有不同結(jié)合特異性的抗體，其中所給藥的每種抗體的劑量都落入所述的范圍之中抗體通常多次給藥。每次的間隔可以是以周、月、年計(jì)。間隔也可以是不定期的，如通過(guò)測(cè)試患者中Aβ的抗體血液水平所示。在一些方法中，把劑量調(diào)整到血漿中抗體濃度達(dá)1-1000μg/ml，而在一些方法中為25-300μg/ml?；蛘?，抗體可以持續(xù)釋放劑量給藥，這種情況下，不需要頻繁給藥。根據(jù)患者中抗體的半衰期改變使用的劑量和頻率。通常，人抗體有最長(zhǎng)的半衰期，接下來(lái)依次為人源化抗體、嵌合抗體和非人抗體。
給藥的劑量和頻率可依賴于處理是治療性還是預(yù)防性的。在預(yù)防性應(yīng)用中，將含有本發(fā)明抗體或其合劑的組合物給藥于并非在病態(tài)的患者以增強(qiáng)病人的抗性。該量定義為“預(yù)防有效量”。在此應(yīng)用中，精確量再次取決于患者的健康狀態(tài)和基本的免疫力，但通常在0.1-25mg/劑量的范圍，特別是0.5-2.5mg/劑量的范圍。在一段長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)，以相對(duì)不頻繁的間隔給藥相對(duì)低的劑量。一些患者在余生中繼續(xù)接受治療。
在治療應(yīng)用中，有時(shí)要求以相對(duì)短的間隔給藥相對(duì)高的劑量(例如，從大約1到200mg抗體/劑量，更普遍地使用從5到25mg)直到疾病進(jìn)展得以減輕或終止，更優(yōu)選地直到該患者的疾病癥狀有部分或完全的改善。此后，可以給患者施用一種預(yù)防性的方案。
編碼抗體的核酸的劑量范圍為每位患者約10ng到1g，100ng到100mg，1μg到10mg，或30-300μg DNA。感染性病毒載體的劑量為每劑量10-100個(gè)毒?；蚋喽玖?。
治療劑可以經(jīng)非腸道、局部、靜脈內(nèi)、口腔、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或肌內(nèi)方式給藥，用于預(yù)防和/或治療處理。最典型的免疫原藥劑給藥途徑為皮下給藥，當(dāng)然其它的途徑同樣有效。其次最常用的途徑是肌內(nèi)注射。這種注射類型最通常在胳膊或腿的肌肉內(nèi)注射。在一些方法中，直接將藥劑注射到沉積物已累積的特定組織中，例如顱內(nèi)注射?？贵w給藥優(yōu)選靜脈輸注或肌內(nèi)注射。一些方法中，特殊的治療抗體直接注射于顱內(nèi)。一些方法中，抗體以一種緩釋組合物或裝置如MedipadTM裝置進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的藥劑可選擇性地與其它治療致淀粉樣病至少部分有效的藥劑組合給藥。對(duì)于腦中發(fā)生淀粉樣沉積物的阿爾茨海默氏病和唐氏綜合癥，還可以將本發(fā)明的藥劑與其它促進(jìn)本發(fā)明藥劑穿過(guò)血腦屏障的藥劑一起組合給藥。
C.藥物組合物本發(fā)明的藥劑通常作為包含活性治療因子即很多其它可藥用成分的藥物組合物給藥。參見Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980))。優(yōu)選劑型根據(jù)預(yù)期給藥和治療應(yīng)用方式?jīng)Q定。組合物還可以根據(jù)所需的劑型包括可藥用的、非毒性載體或稀釋劑，它們被認(rèn)為是常規(guī)用于配制給動(dòng)物或人施用的藥物組合物的載體。稀釋劑以不影響組合后的生物活性來(lái)選擇。這類稀釋劑的例子是蒸餾水、生理磷酸鹽緩沖液、林格液、葡萄糖溶液、和Hank氏溶液。另外，藥物組合物或制劑還可以包括其它載體，佐劑或非毒性、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑等。
藥物組合物還可以包括較大的、代謝緩慢的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖如聚氨基葡糖、聚乳酸、聚羥基乙酸和共聚物(例如樹膠官能化的瓊脂糖凝膠TM、瓊脂糖、纖維素等)、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、以及脂類聚集物(例如油滴或脂質(zhì)體)。另外，這些載體具備作為免疫刺激劑的功能(即佐劑)。
對(duì)于非腸道給藥，本發(fā)明的藥劑可以作為物質(zhì)在生理可接受稀釋劑中的溶液或懸浮液與藥物載體的可注射劑型一起給藥，所述藥物載體可以是無(wú)菌液體，例如水油、鹽水、甘油或乙醇。另外，組合物中還可以含有輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等。藥物組合物的其它成分是石油，動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的，例如花生油、大豆油和礦物油。液體載體通常優(yōu)選二醇例如丙二醇或聚乙二醇，尤其是對(duì)可注射溶液?？贵w可以以補(bǔ)給注射(clepotinjection)的形式或移植制劑的形式給藥，其可以以使活性成分持續(xù)釋放的方式進(jìn)行配制。一個(gè)示例的組合物包括5mg/ml的單克隆抗體，配制于由50mM L-組氨酸、150mM NaCl組成、用HCl調(diào)整pH到6.0的水相緩沖液中。
通常，將組合物制備成液體溶液或懸浮液的可注射形式；也可以制備成注射前可適于溶解或懸浮在液體媒介物的固體劑型。如前面所述，還可以將制劑乳化于或包埋于脂質(zhì)體或微顆粒，例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中來(lái)增強(qiáng)佐劑效果(參見Langer，Science 2491527(1990)和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 2897(1997))。本發(fā)明的藥劑可以以儲(chǔ)存注射的形式或移植制劑的形式給藥，其可以以使活性成分持續(xù)或脈動(dòng)釋放的方式來(lái)配制。
適合其它給藥方式的其它劑型包括口服、鼻內(nèi)和肺部施用的制劑、栓劑和經(jīng)皮應(yīng)用制劑。對(duì)于栓劑，粘合劑和載體包括例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯；該種栓劑可以從含活性成分在0.5％到10％，優(yōu)選1％-2％范圍內(nèi)的混合物制各?？诜苿┌ㄙx形劑，例如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂。這些組合物配制成溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、控釋制劑或粉劑的形式，含有10％-95％活性成分，優(yōu)選25％-70％活性成分。
局部應(yīng)用可導(dǎo)致經(jīng)皮或皮內(nèi)送遞。局部給藥可以通過(guò)共同給藥霍亂毒素或其脫毒衍生物或亞基或者其它類似的細(xì)菌毒素促進(jìn)(參見Glenn等，Nature 391，851(1998))。通過(guò)應(yīng)用經(jīng)化學(xué)交聯(lián)得到的作為混合劑或連接分子的成分，或者表達(dá)為融合蛋白，來(lái)實(shí)現(xiàn)共同給藥。
或者，可利用皮膚通道或利用轉(zhuǎn)移體(transferosome)實(shí)現(xiàn)經(jīng)皮送遞(Paul等，Eur.J.Immunol.253521(1995)；Cevc等，Biochem.Biophys.Acta 1368201-15(1998))。
III.治療過(guò)程的監(jiān)測(cè)本發(fā)明提供了監(jiān)測(cè)患有或易患阿爾茨海默氏病的患者的治療的方法，即監(jiān)測(cè)給藥患者的治療的過(guò)程。該方法可用于監(jiān)測(cè)有癥狀患者的治療處理以及無(wú)癥狀患者的預(yù)防處理。尤其地，該方法對(duì)于監(jiān)測(cè)被動(dòng)免疫(例如，檢測(cè)給藥抗體的水平)是有用的。
一些方法需要在確定藥劑的給藥劑量之前測(cè)定患者體內(nèi)例如抗體的免疫應(yīng)答水平基線值，然后將該值與治療后的免疫應(yīng)答值相比較。免疫應(yīng)答水平的顯著增加(即同一樣品重復(fù)測(cè)定中，高于一般的試驗(yàn)誤差幅度，表示為所述測(cè)定平均值的標(biāo)準(zhǔn)差)表明治療結(jié)果為陽(yáng)性(即藥劑的給藥已得到了所需的反應(yīng)。如果免疫應(yīng)答的水平?jīng)]有顯著改變或者有所降低，表明治療結(jié)果為陰性。
在其它方法中，測(cè)定對(duì)照組免疫應(yīng)答的對(duì)照值(即平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)。通常，對(duì)照組中的個(gè)體沒(méi)有接受預(yù)先治療。然后將給藥治療劑后患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答測(cè)量值與對(duì)照值比較。相對(duì)于對(duì)照值的顯著增加(例如高于平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)表明陽(yáng)性或足夠的治療結(jié)果。缺乏明顯的增加或降低則表明陰性或不夠的治療結(jié)果。通常連續(xù)給藥藥劑，免疫應(yīng)答相對(duì)于對(duì)照值不斷增加。和前面一樣，相對(duì)于對(duì)照值出現(xiàn)穩(wěn)定期，表明治療給藥可以間斷或者降低劑量或次數(shù)。
在其它方法中，測(cè)定接受治療藥劑治療并且其免疫應(yīng)答對(duì)治療的響應(yīng)已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定期的個(gè)體對(duì)照組的免疫應(yīng)答對(duì)照值(例如平均值和標(biāo)準(zhǔn)差)。患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的測(cè)定值與對(duì)照值相比較。如果患者的測(cè)定值與對(duì)照值沒(méi)有顯著的不同(例如，高于一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)，則治療可以間斷。如果患者體內(nèi)的水平顯著低于對(duì)照值，則需要保證連續(xù)給藥藥劑。如果患者體內(nèi)的水平持續(xù)低于對(duì)照值，則表明應(yīng)改變治療方案。
在其它方法中，對(duì)目前沒(méi)有接受治療但以前曾接受一個(gè)療程治療的患者監(jiān)測(cè)其抗體的水平或分布，以確定是否需要恢復(fù)治療。在起始一個(gè)療程治療之后，可以將患者體內(nèi)免疫應(yīng)答的測(cè)量值與患者以前獲得的免疫應(yīng)答值比較。相對(duì)于前期測(cè)量顯著降低(即在相同樣品的重復(fù)測(cè)量中，高于一般誤差幅度)表明可以恢復(fù)治療?；蛘撸梢詫⒒颊叩臏y(cè)量值與接受一個(gè)療程治療后的患者組所測(cè)定的對(duì)照值相比較(平均值加標(biāo)準(zhǔn)差)。或者，可以將患者的測(cè)量值與接受預(yù)防處理、保持沒(méi)有疾病綜合癥的患者組或者接受治療處理、表現(xiàn)疾病癥狀改善的患者組體內(nèi)的對(duì)照值相比較。在所有的這些情況下，相對(duì)于對(duì)照水平的顯著降低(即超過(guò)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)表明患者應(yīng)當(dāng)恢復(fù)治療。
用于分析的組織樣品通常是來(lái)自患者的血液、血漿、血清、粘液或腦脊液。分析樣品，例如對(duì)Aβ肽的抗體的水平或分布，例如人源化抗體的水平和分布進(jìn)行分析。在實(shí)施例部分描述了檢測(cè)特異于Aβ的抗體的ELISA法。在一些方法中，給藥抗體的水平和分布通過(guò)清除分析進(jìn)行測(cè)定，例如本文所述的體外吞噬作用測(cè)定。這些方法中，來(lái)自被測(cè)試患者的組織樣品與淀粉樣沉積物(例如，來(lái)自PDAPP小鼠)及帶有Fc受體的吞噬細(xì)胞接觸。接著檢測(cè)隨后的淀粉樣沉積物的清除。清除反應(yīng)的存在和程度顯示了在被測(cè)患者組織樣品中有效清除Aβ的抗體的存在和水平。
被動(dòng)免疫后的抗體圖通常先是抗體濃度迅速上升到峰值，接著指數(shù)式降低。如果沒(méi)有進(jìn)一步給藥，根據(jù)給藥抗體半衰期的不同將在幾天到幾個(gè)月的時(shí)期內(nèi)降低至治療前的水平。例如，一些人抗體半衰期為20天。
在一些方法中，在給藥前對(duì)患者的Aβ抗體進(jìn)行基線測(cè)量，在此不久之后的第二次測(cè)量是為確定抗體的峰值，間隔進(jìn)行一次或更多次的測(cè)量，以監(jiān)測(cè)抗體水平的下降。當(dāng)抗體降低到基線或預(yù)先確定峰值百分?jǐn)?shù)的更低基線(如50％、25％或10％)，給藥另一劑量的抗體。一些方法中，峰值或其后測(cè)定值的更低背景與預(yù)先確定的參照水平比較，以構(gòu)成對(duì)其它患者產(chǎn)生有益的預(yù)防性或治療性處理方案。如果測(cè)得的抗體水平明顯小于參照水平(例如，小于治療受益的患者群中參照值平均數(shù)減去一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)則表明需要施用額外劑量的抗體。
其它的方法包括在治療過(guò)程的自始至終監(jiān)測(cè)本領(lǐng)域識(shí)別的任意生理癥狀(例如，身體或精神癥狀)，這些癥狀通常依賴研究者或醫(yī)師診斷或監(jiān)控致淀粉樣疾病(例如，阿耳茨海默氏病)。例如，可監(jiān)測(cè)認(rèn)知損傷。后者是阿耳茨海默氏病和唐氏綜合癥的癥狀但也可產(chǎn)生沒(méi)有這些疾病的其它癥狀。例如，認(rèn)知損傷可根據(jù)慣例在治療全過(guò)程中通過(guò)檢測(cè)患者在微型精神狀態(tài)測(cè)試(Mini-Mental State Exam)中的得分來(lái)監(jiān)測(cè)。
C.試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步提供了實(shí)施上述監(jiān)測(cè)方法的試劑盒。通常，該試劑盒含有特異性結(jié)合Aβ抗體的試劑。試劑盒還包括一種標(biāo)記物。對(duì)于檢測(cè)Aβ抗體，標(biāo)記物通常是標(biāo)記的抗-獨(dú)特型抗體的形式。對(duì)于檢測(cè)抗體，可以預(yù)先將試劑結(jié)合到固相上使用，例如結(jié)合到微滴定板的孔中。試劑盒一般還含有提供指導(dǎo)試劑盒使用的標(biāo)簽。該標(biāo)簽還可以包括顯示測(cè)定的標(biāo)記水平與Aβ抗體水平之間相關(guān)性的圖或其它相應(yīng)方式。術(shù)語(yǔ)標(biāo)簽是指在試劑盒的生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售或使用過(guò)程的任何時(shí)間，貼附于或附在試劑盒中的任何書面或記錄材料。例如，術(shù)語(yǔ)標(biāo)簽包括廣告宣傳頁(yè)和手冊(cè)、包裝材料、說(shuō)明書、音頻或視聽磁帶、計(jì)算機(jī)磁盤以及直接印刷在試劑盒上的書寫印記。
本發(fā)明還提供了診斷試劑盒，例如，研究、檢測(cè)和/或診斷的試劑盒。該試劑盒通常含有結(jié)合于Aβ表位的抗體，優(yōu)選是與其第1-10位殘基結(jié)合。優(yōu)選地，標(biāo)記是抗體或試劑盒含有二級(jí)標(biāo)記試劑。優(yōu)選地，試劑盒含有用于實(shí)施所需應(yīng)用的說(shuō)明書的標(biāo)簽，例如，用于進(jìn)行體內(nèi)成像分析。示例性的抗體為在這里所述的那些。
D.體內(nèi)成像本發(fā)明提供了對(duì)患者中的淀粉樣沉積物進(jìn)行體內(nèi)成像方法。這種方法可用于診斷或確證阿爾茨海默氏病或?qū)ζ涞膽岩?。例如，該方法可用于出現(xiàn)癡呆癥狀的患者身上。如果患者有異常的淀粉樣沉積物，則該患者可能患有阿爾茨海默氏病。該方法也可用于無(wú)癥狀的患者。異常淀粉樣沉積物的存在表明將來(lái)易發(fā)展成有癥狀疾病。該方法也可用于監(jiān)測(cè)早先被診斷為阿爾茨海默氏病患者的疾病發(fā)展和/或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。
該方法是給藥患者一種藥劑，如結(jié)合Aβ的抗體，并在其結(jié)合后檢測(cè)該藥劑。優(yōu)選的抗體結(jié)合患者的Aβ沉積物，但不結(jié)合全長(zhǎng)的APP多肽。特別優(yōu)選結(jié)合于Aβ第1-10位氨基酸內(nèi)表位的抗體。在一些方法中，抗體結(jié)合于Aβ第7-10位氨基酸內(nèi)的表位。這類抗體通常結(jié)合且不誘導(dǎo)顯著的清除反應(yīng)。在其它方法中，抗體結(jié)合于Aβ第1-7位氨基酸內(nèi)的表位。這類抗體通常結(jié)合并誘導(dǎo)對(duì)Aβ的清除反應(yīng)。然而，利用缺少全長(zhǎng)恒定區(qū)的抗體片段，如Fabs，可以避免這種清除反應(yīng)。在一些方法中，同樣的抗體可以作為治療和診斷試劑。通常，結(jié)合Aβ的C末端到第10位殘基的表位的抗體沒(méi)有顯示與結(jié)合第1-10位殘基內(nèi)表位的抗體一樣強(qiáng)的信號(hào)，可能是因?yàn)榈矸蹣映练e物內(nèi)的C末端表位是難于接觸的。因此，這種抗體較不優(yōu)選。
可以通過(guò)靜脈內(nèi)注射到患者身體，或顱內(nèi)注射或鉆孔穿過(guò)頭骨直接對(duì)大腦給藥診斷試劑。試劑的劑量應(yīng)在與治療方法中相同的劑量范圍內(nèi)。通常，試劑是標(biāo)記的。盡管在一些方法中，對(duì)Aβ有親和性的一級(jí)試劑未標(biāo)記，而二級(jí)標(biāo)記藥劑用于結(jié)合一級(jí)試劑，標(biāo)記的選擇基于檢測(cè)的方式。例如，熒光標(biāo)記適用于光學(xué)檢測(cè)。順磁標(biāo)記適用于無(wú)須手術(shù)參與的X射線斷層檢測(cè)。放射性標(biāo)記也可以用PET或SPECT來(lái)檢測(cè)。
比較標(biāo)記位點(diǎn)與相應(yīng)基線值的數(shù)目、大小和/或強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行診斷。基線值代表未生病群體的平均水平?；€值也代表同一患者先前確定的水平。例如，基線值可以在患者治療開始前確定，而將之后的測(cè)定值與基線值比較。相對(duì)于基線的數(shù)值的下降是對(duì)治療陽(yáng)性反應(yīng)的信號(hào)。
本發(fā)明將通過(guò)下面的非限制性實(shí)施例更充分地描述。
實(shí)施例實(shí)施例I.抗-Aβ抗體mAb 2H3、mAb 10D5、mAb 266、mAb 21F12和pAb Aβ1-42的治療功效本實(shí)施例測(cè)試各種Aβ多克隆和單克隆抗體抑制Aβ在異源轉(zhuǎn)基因小鼠腦中累積的能力。
A.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)60只8.5-10.5月齡的雄性和雌性雜合PADPP轉(zhuǎn)基因小鼠獲自charles River實(shí)驗(yàn)室。小鼠被分成6組，分別用針對(duì)Aβ的各種抗體處理。將動(dòng)物分配以使組內(nèi)的動(dòng)物在性別、月齡、家系和來(lái)源上盡可能近地匹配。表2顯示了試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
表2試驗(yàn)設(shè)計(jì)
a.實(shí)驗(yàn)終止時(shí)組內(nèi)的小鼠數(shù)所有的組以每組10只動(dòng)物開始。
b.NA不適用的c.小鼠多克隆抗-聚集的Aβ42d.mAb單克隆抗體如表2所顯示，抗體包括四種鼠Aβ-特異的單克隆抗體2H3(針對(duì)Aβ第1-12位殘基)、10D5(針對(duì)Aβ第1-16位踐基)、266(針對(duì)Aβ第13-28位殘基結(jié)合于可溶性而非聚集的AN1792)、21F12(針對(duì)Aβ第33-42位殘基)。第五組用Aβ特異的多克隆抗體組分(用聚集的AN1792免疫獲得)處理。陰性對(duì)照組僅接受稀釋劑PBS，沒(méi)有抗體。
B.監(jiān)測(cè)處理過(guò)程單克隆抗體以約10mg/kg(假設(shè)小鼠重50克)的劑量注射?？贵w的效價(jià)在處理的28周期間檢測(cè)。平均每七天進(jìn)行腹膜內(nèi)注射給藥，使抗Aβ效價(jià)維持在1000以上。盡管因mAb 266不與本測(cè)定中用作捕捉抗原的聚集的AN1792良好結(jié)合，從而效價(jià)測(cè)定較低，但對(duì)該組仍然維持同樣的劑量方案。由于抗體在體內(nèi)被快速清除，接受單克隆抗體2H3的組在前三周內(nèi)實(shí)驗(yàn)中斷。
對(duì)于測(cè)定抗體的效價(jià)，僅在腹膜內(nèi)接種之前從每組中隨機(jī)選出三個(gè)小鼠進(jìn)行采血，總共30次取血。Aβ1-42-結(jié)合抗體的抗體效價(jià)采用Aβ1-42包被的塑料多孔板進(jìn)行夾心ELISA來(lái)測(cè)定，具體描述在“基本材料和方法”部分。每一血液的多克隆抗體和單克隆10D5和21F12的平均效價(jià)顯示在表3中。
表3
多克隆抗體在此段時(shí)間的效價(jià)平均值大約1000且其稍高于10D5-和21F12-處理的動(dòng)物的此種水平。
處理持續(xù)超過(guò)六個(gè)月的時(shí)間，總共196天。動(dòng)物在最后一次給藥一周后實(shí)施安樂(lè)死。
C.腦中Aβ和APP水平用各種抗-Aβ抗體制劑處理約6個(gè)月后，移出動(dòng)物腦部，然后鹽水灌注。腦的一個(gè)半球準(zhǔn)備用于免疫組織化學(xué)分析，第二個(gè)半球用于定量測(cè)定Aβ和APP水平。為了測(cè)定各種形式的β淀粉樣沉積物和淀粉樣前體蛋白(APP)的濃度，解剖大腦半球，并在5M胍中制備海馬區(qū)、皮層區(qū)和小腦區(qū)三個(gè)區(qū)的勻漿。進(jìn)行一系列稀釋，通過(guò)與ELISA模式中已知濃度的Aβ肽或APP的一系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)比較，來(lái)量化淀粉樣肽或APP的水平。
通過(guò)ELISA測(cè)定的皮層和海馬勻漿液中總Aβ和Aβ1-42的水平，以及小腦中總Aβ的水平分別顯示在表4、5和6中。接種PBS的對(duì)照組總Aβ濃度的中值在海馬中比皮層中高3.6倍(海馬組織中值63,389ng/g而皮層組織中值17,818ng/g)。對(duì)照組小腦的中值(30.6ng/g組織)比海馬中要低2000倍以上。這些水平與從前報(bào)道的此年齡的雜合PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠水平相似(Johnson-Wood等，同上)。
對(duì)于皮層，一個(gè)處理組具有Aβ中值水平，以Aβ1-42測(cè)定，與對(duì)照組的顯著不同(p＜0.05)，那些動(dòng)物接受了表4所示的多克隆抗-Aβ抗體。與本處理組的對(duì)照組相比，Aβ1-42的中值水平降低了65％。與另外一個(gè)處理組中的對(duì)照相比，Aβ61-42的中值水平也顯著降低了55％，這些動(dòng)物服以單克隆抗體(mAb)10D5(p＝0.0433)。
表4
腳注a.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組動(dòng)物的數(shù)目b.ng/g組織c.Mann Whitney分析d.NA不適用的e.標(biāo)準(zhǔn)偏差在海馬區(qū)中，與多克隆抗-Aβ抗體處理相關(guān)的總Aβ的中值降低的百分率(50％，p＝0.0055)小于皮層中觀察到的(65％)(表5)。但海馬區(qū)中降低的絕對(duì)量幾乎比皮層大3倍，海馬中凈降低為31,683ng/g組織而皮層中為11,685ng/g組織。如不以總Aβ，而以Aβ1-42這種更加致淀粉樣的Aβ形式為測(cè)定基準(zhǔn)，多克隆抗體導(dǎo)致的降低是顯著的(p＝0.0025)。單克隆抗體10D5和266處理組的中值分別降低33％和21％。
表5
a.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組動(dòng)物的數(shù)目b.ng/g組織c.Mann Whitney分析d.NA不適用的e.標(biāo)準(zhǔn)偏差也測(cè)定了小腦中的總Aβ(表6)。在服用多克隆抗-Aβ抗體和266抗體的處理組中，總Aβ水平顯著降低(分別為43％和46％，p＝0.0033和p＝0.0184)，而用10D5處理組有幾乎顯著的降低(29％，p＝0.0675)。
表6
a.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組動(dòng)物的數(shù)目b.ng/g組織c.Mann Whitney分析d.NA不適用的e.標(biāo)準(zhǔn)偏差通過(guò)ELISA測(cè)定了來(lái)自抗原處理、對(duì)照和PBS處理的小鼠皮層和小腦APP濃度。使用兩種不同的APP分析。第一種分析命名為APP-α/FL，識(shí)別APP-α(α，APP的分泌型，已在Aβ序列中切割)和APP的全長(zhǎng)型(FL)。第二種分析只識(shí)別APP-α。與Aβ在處理組亞組中的處理相關(guān)性降低相反，與對(duì)照動(dòng)物相比，在所有處理組中APP水平幾乎不變。這些結(jié)果表明用Aβ抗體免疫消耗Aβ，但不消耗APP。
總之，在抗AN1792的多克隆抗體處理的小鼠中，其皮層、海馬和小腦中Aβ的水平顯著降低。在較小程度上，針對(duì)Aβ1-42的氨基末端區(qū)域特別是第1-16位和第13-28位的氨基酸的單克隆抗體也表現(xiàn)顯著的治療效果。
D.組織化學(xué)分析在用PBS、多克隆Aβ42、21F12、266和10D5處理組的小鼠腦的亞組中，Aβ免疫活性斑的形態(tài)與之前接著使用Aβ42的標(biāo)準(zhǔn)免疫方法的研究中的形態(tài)進(jìn)行定性比較。
淀粉樣斑的程度和外形的最大變化均產(chǎn)生在多克隆Aβ-42抗體免疫的動(dòng)物中。淀粉樣沉積、侵蝕的斑形態(tài)以及細(xì)胞相關(guān)的Aβ免疫活性，這三者的降低非常類似由標(biāo)準(zhǔn)免疫程序所產(chǎn)生的效果。這些觀察支持ELISA的結(jié)果，其中給藥多克隆Aβ42抗體可以導(dǎo)致總Aβ和Aβ42顯著降低。
在類似的定性評(píng)估中，10D5組的淀粉樣斑在數(shù)量和外形上也有所減少，并存在細(xì)胞相關(guān)的Aβ免疫活性。相對(duì)于對(duì)照處理動(dòng)物，抗Aβ的多克隆Ig組分和單克隆抗體之一(10D5)分別降低了93％和81％的斑沉積(p＜0.005)。似乎21F12對(duì)斑沉積有相對(duì)較弱的效果。相對(duì)于對(duì)照處理的動(dòng)物，對(duì)多克隆pabAβ1-42處理后的腦部顯微照相顯示出彌散的沉積物，以及pabAβ1-42處理組中許多更大緊密斑消失。
E.淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)利用最后一次抗體輸注8天后收集的脾細(xì)胞，測(cè)定Aβ-依賴的淋巴細(xì)胞增殖。將新鮮收集的細(xì)胞以每孔105個(gè)，在起刺激作用的濃度為5μM的Aβ1-40存在下培養(yǎng)5天。作為陽(yáng)性對(duì)照，另外的細(xì)胞與T細(xì)胞促細(xì)胞分裂劑PHA共同培養(yǎng)，作為陰性對(duì)照，細(xì)胞的培養(yǎng)無(wú)外加的肽。
用各種抗Aβ抗體被動(dòng)免疫的衰老PDAPP小鼠的脾細(xì)胞在體外經(jīng)AN1792刺激，并測(cè)定增殖和細(xì)胞因子反應(yīng)。這些分析的目的在于確定被動(dòng)免疫是否促使抗原呈遞，并因此引發(fā)對(duì)AN1792特異的T細(xì)胞反應(yīng)。在用抗-Aβ抗體被動(dòng)免疫的小鼠中未觀察到AN1792特異的增殖或細(xì)胞因子反應(yīng)。
實(shí)施例II抗-Aβ抗體mAb 2H3、mAb 10D5、mAb 266、mAb 21F12、mAb 3D6、mAb 16C11和pAb Aβ1-42的治療功效在第二項(xiàng)研究中，重復(fù)10D5的處理并檢測(cè)另外兩種抗Aβ抗體單克隆抗體3D6(Aβ1-5)及16C11(Aβ33-42)。對(duì)照組接受PBS或一種不相關(guān)的同種型-匹配抗體(TM2a)。小鼠較前述研究中大(11.5-12月齡的雜合體)，其它的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都相同。再一次，在處理6個(gè)月后，相對(duì)于PBS或同種型-匹配抗體對(duì)照組，10D5使斑沉積降低了超過(guò)80％(p＝0.003)。另外一個(gè)抗Aβ抗體3D6同樣有效，產(chǎn)生86％的降低(p＝0.003)。相反，第三個(gè)抗該肽的抗體16C11對(duì)斑沉積無(wú)效。Aβ42的ELISA測(cè)定也獲得相似的結(jié)果。
這些結(jié)果表明在缺少T細(xì)胞免疫情況下，抗Aβ肽的抗體反應(yīng)足以降低PDAPP小鼠中的淀粉樣沉積，但并非所有的抗-Aβ抗體都有效。針對(duì)含有Aβ第1-5位或第3-7位氨基酸的表位的抗體特別有效?？傊?，可以表明被動(dòng)給藥抗Aβ抗體(即被動(dòng)免疫)降低了患阿爾茨海默氏病的小鼠模型中的斑沉積的程度。
實(shí)施例IIICNS中抗體結(jié)合的監(jiān)測(cè)此實(shí)施例證明了在較為溫和的血清濃度(25-70μg/ml)時(shí)，獲得的抗體以足以修飾β-淀粉樣斑的水平進(jìn)入CNS。
為了檢測(cè)抗Aβ抗體是否可以在CNS內(nèi)直接作用，取實(shí)施例II結(jié)束時(shí)鹽水灌注的小鼠腦部，檢查外周給藥的抗體是否存在。未固定的恒冷腦切片暴露于抗鼠免疫球蛋白(羊抗小鼠IgG-Cy3)的熒光試劑中。10D5和3D6處理組的腦中的斑被抗體強(qiáng)烈地著色，而16C11組無(wú)染色。為充分展示斑沉著的程度，首先用抗-Aβ抗體與各個(gè)腦組織的系列切片進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后與第二種試劑進(jìn)行免疫反應(yīng)。10D5和3D6在外周給藥后獲得接觸CNS內(nèi)的大多數(shù)淀粉樣斑。與16C11組相比，這些組中的斑沉積極大地降低?？贵w進(jìn)入CNS并非由于血腦屏障的異常泄漏，因?yàn)镋vans Blue檢測(cè)PDAPP小鼠，未發(fā)現(xiàn)血管通透性的增加。此外，衰老PDAPP小鼠腦軟組織中的抗體濃度和非轉(zhuǎn)基因小鼠相同，血清中抗體濃度顯示0.1％(不考慮同種型)。
這些數(shù)據(jù)表明，外周給藥的抗體可以進(jìn)入CNS內(nèi)，并在其中直接引發(fā)淀粉樣沉積物的清除?？赡?6C11也已接觸到淀粉樣斑，但卻不能結(jié)合。
實(shí)施例IV抗淀粉樣沉積物抗體的活性的離體篩選試驗(yàn)為了檢測(cè)抗體對(duì)斑清除的效果，我們建立了一種離體分析，其中將初級(jí)小膠質(zhì)細(xì)胞與來(lái)自PDAPP小鼠或人AD腦的未固定的恒冷切片共同培養(yǎng)。小膠質(zhì)細(xì)胞獲自新生DBA/2N小鼠(1-3天)的腦皮層。在HBSS-(Hank氏平衡鹽溶液，Sigma)和50μg/ml DNA酶I中通過(guò)機(jī)械方法解離皮層。用100μm細(xì)胞濾器(Falcon)過(guò)濾解離的細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘。沉淀重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(高葡萄糖DMEM、10％FBS、25ng/ml rmGM-CSF)，以每個(gè)T-75培養(yǎng)瓶?jī)蓚€(gè)腦組織的密度鋪細(xì)胞。7-9天后，培養(yǎng)瓶在定軌搖床以200rpm的速度37℃培養(yǎng)2小時(shí)。細(xì)胞懸浮物以1000rpm離心，重懸于分析培養(yǎng)基。
PDAPP小鼠或人AD腦(死亡時(shí)間＜3小時(shí))的10-μm恒冷切片融化后，裝到多聚賴氨酸包被的圓形玻璃蓋片上，并放置在24孔組織培養(yǎng)平板的孔中。用分析培養(yǎng)基沖洗蓋玻片二次，分析培養(yǎng)基由含有1％FBS、谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素以及5ng/ml rmGM-CSF(R&D)的H-SFM(無(wú)雜交瘤細(xì)胞血清培養(yǎng)基，Gibco BRL)組成。一小時(shí)內(nèi)加入兩倍濃度的對(duì)照或抗-Aβ抗體(終濃度5ng/ml)。然后以0.8×106細(xì)胞/ml分析培養(yǎng)基的密度接種小膠質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)物在加濕的培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃，5％CO2)孵育24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。孵育結(jié)束后，用4％的低聚甲醛固定培養(yǎng)物并浸透于0.1％的Triton-X100。切片用生物素酰化的3D6染色，接著鏈霉素/Cy3共軛物(Jackson ImmunoResearch)染色。外源的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)核染色(DAPI)可見。用倒置熒光顯微鏡(尼康，TE300)觀察培養(yǎng)物，以SPOT數(shù)碼相機(jī)用SPOT軟件(Diagnostic instruments)進(jìn)行光學(xué)顯微照相。對(duì)于Western印跡分析，培養(yǎng)物用8M尿素抽提，在還原tricine樣品緩沖液中以1∶1稀釋，并上樣于16％tricine凝膠中(Novex)。轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移膜(immobilon)上后，印跡暴露于5μg/ml的pabAβ42，接著與HRP共軛的抗小鼠抗體接觸，并在ECL(Amersham)中顯影。
當(dāng)有16C11(一種抗Aβ抗體，在體內(nèi)無(wú)效)存在下對(duì)PDAPP腦切片進(jìn)行分析時(shí)，β淀粉樣斑保持其完整性，并且末觀察到吞噬作用。相反，當(dāng)鄰近的切片在10D5存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，淀粉樣沉積物大多不存在，并且小膠質(zhì)細(xì)胞顯示許多含有Aβ的吞噬泡。AD腦切片也有同樣的結(jié)果；10D5誘導(dǎo)對(duì)AD斑的吞噬，而16C11無(wú)效。此外，當(dāng)以小鼠或人小膠質(zhì)細(xì)胞和小鼠、兔或靈長(zhǎng)類動(dòng)物抗Aβ抗體進(jìn)行操作時(shí)，該分析提供了可比性結(jié)果。
表7比較幾種不同抗體結(jié)合特異性的Aβ結(jié)合與吞噬作用?？梢?，結(jié)合于第1-7位氨基酸內(nèi)表位的抗體結(jié)合并清除淀粉樣沉積物，而結(jié)合于第4-10位氨基酸內(nèi)表位的抗體結(jié)合但不清除淀粉樣沉積物。結(jié)合于C末端到第10位殘基的表位的抗體既不結(jié)合也不清除淀粉樣沉積物。
Table 7表位特異性分析抗體表位同種型染色吞噬作用N-末端單克隆抗體3D6 1-5 IgG2b + +10D5 3-7 IgG1 + +22C8 3-7 IgG2a + +6E10 5-10 IgG1 + -14A8 4-10 大鼠 + -IgG1第13-28位氨基酸18G1110-18 大鼠 - -IgG1266 16-24 IgG1 - -22D1218-21 IgG2b - -C-末端2G3 -40 IgG1 - -16C11-40/-42 IgG1 - -21F12-42 IgG2a - -免疫血清兔(CFA) 1-6 + +小鼠(CFA)3-7 + +小鼠(QS-21) 3-7 + +猴(QS-21)1-5 + +小鼠(MAP1-7) + +表8顯示的結(jié)果獲自幾種抗Aβ抗體，比較其離體分析中誘導(dǎo)吞噬作用的能力，以及在體內(nèi)被動(dòng)轉(zhuǎn)移研究中減少斑沉積的能力。盡管16C11和21F12可以高親合力結(jié)合于聚集的合成Aβ肽，這些抗體不能與末固定的腦切片中的Aβ淀粉樣斑反應(yīng)，因此不能引發(fā)離體分析中的吞噬作用，并在體內(nèi)沒(méi)有功效。在三種測(cè)定中，10D5、3D6和多克隆抗Aβ抗體都有活性。這些結(jié)果顯示體內(nèi)效果是基于CNS中抗體直接介導(dǎo)的斑清除作用，并且離體分析可以預(yù)示體內(nèi)效果。
表8離體分析預(yù)示體內(nèi)功效抗體同種型 對(duì)聚集的 與β-淀粉斑 離體的 體內(nèi)的Aβ的 的結(jié)合 功效功效親合力(pM)單克隆3D6 IgG2b 470 + + +10D5IgG143+ + +16C11 IgG190- - -21F12 IgG2a 500 - - -TM2aIgG1- - - -多克隆1-42混合600 + + +同樣的分析已用來(lái)檢測(cè)抗一個(gè)稱為NAC的共核蛋白片段的抗體的清除活性。共核蛋白已顯示是一種淀粉樣斑相關(guān)蛋白。NAC的抗體與含有淀粉樣斑的腦組織樣品和小膠質(zhì)細(xì)胞接觸，同前。用兔血清作對(duì)照。隨后的監(jiān)測(cè)表明斑的數(shù)目和大小有顯著的減少，顯示了抗體的清除活性。
共聚焦顯微鏡用來(lái)確認(rèn)在離體分析過(guò)程中Aβ已內(nèi)化。在對(duì)照抗體的存在下，使外源的小膠質(zhì)細(xì)胞維持在組織上方的一個(gè)共聚焦平面，在此區(qū)域沒(méi)有含Aβ的吞噬泡，并且淀粉樣斑在切片內(nèi)是完整的。在10D5存在時(shí)，幾乎所有的淀粉樣斑物質(zhì)都存在于外源小膠質(zhì)細(xì)胞的小泡中。為了確定內(nèi)化肽的最終命運(yùn)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)10D5處理的培養(yǎng)物用8M尿素抽提，并通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)。在第一小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，還未產(chǎn)生吞噬作用，與多克隆抗Aβ抗體的反應(yīng)顯示一個(gè)強(qiáng)的4kD條帶(相應(yīng)于Aβ肽)。Aβ的免疫活性在第一天降低，并第三天消失。因此，抗體介導(dǎo)Aβ的吞噬作用導(dǎo)致了其降解。
為了確定在離體分析中吞噬作用是否由Fc-介導(dǎo)，制備抗Aβ抗體3D6的F(ab’)2片段。盡管F(ab’)2片段保持了其與淀粉樣斑反應(yīng)的全部能力，它們不能引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生吞噬作用。此外，整個(gè)抗體的吞噬可以被抗鼠Fc受體(抗-CD16/32)的試劑阻斷。這些數(shù)據(jù)顯示Aβ的體內(nèi)清除是通過(guò)Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用進(jìn)行的。
實(shí)施例V抗體通過(guò)血腦屏障的途徑本實(shí)施例在靜脈內(nèi)注射抗體到正?；騊DAPP小鼠外周組織后，測(cè)定進(jìn)入腦部的抗體的濃度。處理后，用0.9％NaCl溶液灌注PDAPP或?qū)φ盏恼Ｐ∈?。剖出腦區(qū)(海馬和皮層)并快速冷凍。在0.1％Triton+蛋白酶抑制劑中勻漿腦組織。ELISA檢測(cè)抽提物中的免疫球蛋白。F(ab)’2羊抗小鼠IgG包被到RIA板上作為捕捉劑。將腦抽提物或血清孵育1小時(shí)。用抗小鼠I IgG1-HRP或IgG2a-HRP或IgG2b-HRP(Caltag)檢測(cè)同種型。發(fā)現(xiàn)無(wú)論何種同種型，存在于CNS中的抗體與其在血液中的濃度都為1∶1000。例如，當(dāng)血液中IgG1濃度是血液中IgG2a濃度的三倍時(shí)，在腦部的濃度也是它的三倍，二者的濃度都是血液中濃度水平的0.1％。在轉(zhuǎn)基因或未轉(zhuǎn)基因的小鼠中都觀察到這一結(jié)果，這表明PDAPP沒(méi)有獨(dú)特的血腦屏障泄漏。
實(shí)施例VI.小鼠3D6可變區(qū)的克隆和測(cè)序3D6 VH的克隆和測(cè)序分析。3D6的重鏈可變VH區(qū)利用由兩種獨(dú)立的方法從雜交瘤細(xì)胞制備的mRNA通過(guò)RT-PCR進(jìn)行克隆。首先，共有引物用于包括翻譯起始密碼子的VH區(qū)前導(dǎo)肽作為5’引物(DNA#3818-3829)，以及g2b(DNA#3832)作為恒定區(qū)特異的3’引物。來(lái)自PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物和來(lái)自多種獨(dú)立衍生的克隆的序列彼此完全一致。對(duì)3D6 VH區(qū)的序列進(jìn)一步核查，結(jié)果通過(guò)對(duì)由5’RACE RT-PCR法和3’g2b特異性引物(DNA #3832)獲得的VH片段進(jìn)行測(cè)序而得到確認(rèn)。再一次，該序列獲自PCR產(chǎn)物以及多種獨(dú)立分離的克隆。兩個(gè)序列彼此完全一致，(在來(lái)自5’RACE產(chǎn)物前導(dǎo)區(qū)的V8I取代除外)，表明該序列是來(lái)自編碼3D6的VH區(qū)的mRNA。3D6 VH區(qū)的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸序列SEQ ID NO4)分別顯示在表9A和圖2中。
表9A小鼠3D6 VH核苷酸序列ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGCGTCTCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGAATTCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTTGCATCCATTAGGAGTGGTGGTGGTAGAACCTACTATTCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAGAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGTAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTATTGTGTCAGATATGATCACTATAGTGGTAGCTCCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACT(SEQ ID NO3)*前導(dǎo)肽加下劃線。
小鼠3D6 VL的克隆和測(cè)序分析。將3D6的輕鏈可變VH區(qū)以和VH區(qū)類似的方式克隆。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用于擴(kuò)增鼠VL區(qū)的共有引物設(shè)計(jì)如下5’引物(DNA#3806-3816)設(shè)計(jì)來(lái)雜交于包含翻譯起始密碼子的VL區(qū)，以及3’引物(DNA#3817)特異于V-J結(jié)合區(qū)下游的鼠Ck區(qū)。PCR片段以及使用此共有輕鏈引物對(duì)分離出的獨(dú)立衍生的克隆的DNA序列分析，揭示了獲得的cDNA是來(lái)自非功能性重排信息，因?yàn)樵撔蛄泻性赩-J區(qū)接點(diǎn)之間的移碼突變。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，5’RACE用于克隆編碼cDNA的第二VL。此產(chǎn)物(共有序列11)的DNA序列分析顯示其編碼一個(gè)功能性的mRNA。因此，可以推斷該序列編碼正確的3D6輕鏈mRNA。3D6 VL區(qū)的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)分別顯示在表9B和圖1。
表9B小鼠3D6 VL核苷酸序列ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGGTTATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAATAGAGGCTGAGGATTTGGGACTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQID NO1)*前導(dǎo)肽加下劃線用于3D6 VL cDNA克隆的引物顯示在表10中。
從N末端到C-末端，輕鏈和重鏈含有結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每一結(jié)構(gòu)域氨基酸的分配與Kabat等的編號(hào)規(guī)則一致，同上。
嵌合3D6抗體的表達(dá)可變重鏈和輕鏈區(qū)經(jīng)重新改造來(lái)編碼各自VDJ或VJ接頭下游剪接的供體序列，并被克隆到重鏈的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體PCMV-hγ1和輕鏈的載體PCMV-hκ1中。這些載體編碼人γ1和Ck恒定區(qū)作為插入的可變區(qū)表達(dá)盒下游的外顯子片段。在證實(shí)序列之后，重鏈和輕鏈表達(dá)載體被共同轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中。兩個(gè)不同的重鏈克隆(H2.2 & H3.2)獨(dú)立地與3種不同的嵌合輕鏈克隆(L3、L4、&L10)共轉(zhuǎn)染以確證結(jié)果的再現(xiàn)性。嵌合的21.6抗體轉(zhuǎn)染作為載體的陽(yáng)性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基并通過(guò)western印跡來(lái)分析抗體的產(chǎn)生或通過(guò)ELISA分析其Aβ結(jié)合。
多種轉(zhuǎn)染子全部表達(dá)了重鏈+輕鏈組合，其在western印跡上由羊抗人IgG(H+L)抗體識(shí)別。
3D6和嵌合3D6(PK1614)抗體與Aβ的直接結(jié)合通過(guò)ELISA分析來(lái)進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)嵌合3D6高親和性地結(jié)合Aβ，類似于由3D6所論證的(圖3A)。此外，基于競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)的ELISA表明嵌合3D6和鼠3D6抗體與生物素化-3D6同等地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于Aβ(圖3B)。嵌合抗體顯示與3D6參考樣品不能區(qū)分的結(jié)合特性。
表11.
此外，3D6和PK1614在清除Aβ斑中是有效的。離體分析表明隨著抗體的濃度增加，Aβ量減少的方式類似于鼠和嵌合3D6抗體。因此，可以推斷該序列分別編碼功能性3D6重鏈和輕鏈。
實(shí)施例VII.3D6人源化同源性/分子建立模型。為了鑒定鼠3D6抗體中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)構(gòu)架殘基，三維模型的建立基于最接近的重鏈和輕鏈的鼠抗體。為達(dá)到此目的，一個(gè)稱為1CR9的抗體選擇作為建立3D6輕鏈模型的模板(PDBID1CR9，Kanyo等，同上)，以及命名為1OPG的抗體選擇作為建立3D6重鏈模型的模板(PDB ID1OPG Kodandapani等，同上)(也參見表1)。3D6與這些抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列的比對(duì)揭示，除了重鏈的CDR3以外，1CR9和1OPG抗體與3D6有顯著的序列同源性。此外，所選抗體的CDR環(huán)如同3D6的CDR環(huán)落入到相同的規(guī)范Chothia結(jié)構(gòu)分類中，同樣除了重鏈的CDR3以外。因此，1CR9和1OPG最初選作解開結(jié)構(gòu)的抗體，用于3D6的同源性建模。
基于上述抗體的3D6可變區(qū)的第一同源性模型是利用Look &SegMod Modules GeneMine(v3.5)軟件包來(lái)構(gòu)建的。此軟件可購(gòu)買自Molecular Applications Group(Palo Alto，CA)。此軟件包由Michael Levitt和Chris Lee博士開發(fā)，通過(guò)自動(dòng)運(yùn)行步驟基于序列的同源性在已知結(jié)構(gòu)的模板上建立一級(jí)序列結(jié)構(gòu)模型，促進(jìn)了分子建模的進(jìn)程。其運(yùn)行在Silicon Graphics IRIS工作站的UNIX環(huán)境下，模型的結(jié)構(gòu)通過(guò)一系列能量最小化步驟來(lái)去除不必要的原子接觸并優(yōu)化靜電的和范德華作用而自動(dòng)改進(jìn)。
更精確的模型的建立利用Quanta的建模能力。3D6重鏈的CDR3在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的查詢鑒定了1qkz為最同源的且具有與3D6相同的殘基數(shù)。因此，3D6重鏈的CDR3的建模利用1qkz的晶體結(jié)構(gòu)作為模板。3D6模型的α-碳主鏈跡線顯示于圖4。VH結(jié)構(gòu)域顯示為點(diǎn)畫線，且VL區(qū)域顯示為實(shí)線，以及CDR環(huán)顯示為條帶形式。
人受體抗體序列的篩選。合適的人受體抗體序列通過(guò)計(jì)算機(jī)比較小鼠可變區(qū)的氨基酸序列與已知人抗體的序列來(lái)進(jìn)行鑒定。3D6重鏈和輕鏈的比較分別進(jìn)行。特別地，來(lái)自其構(gòu)架序列顯示與鼠VL和VH構(gòu)架區(qū)高度序列同一性的人抗體的可變區(qū)使用NCBI BLAST(公眾可通過(guò)國(guó)家衛(wèi)生研究所NCBI因特網(wǎng)服務(wù)器獲得)通過(guò)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)查詢各自的鼠構(gòu)架序列來(lái)進(jìn)行鑒定。
兩個(gè)候選的序列選作受體序列基于下述的條件(1)與受試序列同源；(2)與供體序列共有規(guī)范的CDR結(jié)構(gòu)；以及(3)在構(gòu)架區(qū)不含有任何稀有氨基酸殘基。所選VL的受體序列是Kabat IDNO(KABID)019230(Genbank登錄號(hào)No.S40342)，VH的受體序列是KABID 045919(Genbank登錄號(hào)No.AF115110)。人源化3D6抗體的第一個(gè)改型利用了這些所選的受體抗體序列。
氨基酸殘基的取代。如上所述，本發(fā)明的人源化抗體含有基本上來(lái)自人免疫球蛋白的可變構(gòu)架區(qū)(受體免疫球蛋白)以及基本上來(lái)自小鼠免疫球蛋白稱為3D6的互補(bǔ)決定區(qū)(供體免疫球蛋白)。在鑒定了3D6的互補(bǔ)決定區(qū)和適當(dāng)?shù)娜耸荏w免疫球蛋白后，接下來(lái)的步驟是確定來(lái)自這些元件的哪一些殘基，如果有的話，被取代以優(yōu)化產(chǎn)生的人源化抗體的特性。前面所述的標(biāo)準(zhǔn)用于篩選取代的殘基。
圖1和2分別描述了原始鼠3D6 VL和VH與人源化序列的改型1、相應(yīng)的人構(gòu)架受體序列，以及顯示與人構(gòu)架受體序列有最高的同源性的人種系V區(qū)序列的比對(duì)。陰影部分的殘基顯示規(guī)范(實(shí)體)、游尺(點(diǎn)線)、包裝(粗體)以及稀有氨基酸(粗斜體)，并標(biāo)在圖上。星號(hào)表明殘基在人受體構(gòu)架序列中回復(fù)突變?yōu)槭髿埢?，且CDR區(qū)顯示為上劃線的。插入到人源化3D6 VH和VL的變體1中的變化概括在表12中。
表12.人源化3D6.v1中變化的概括
表13和14分別闡述了不同輕鏈和重鏈的Kabat編號(hào)檢索表13輕鏈Kabat編號(hào)檢索小鼠A19-KAB3D6HUMKABI種系##TYPEVL3D6VLD備注0192301 1FR1 Y YD D 稀有的小鼠，可接觸CDR2 2 V VI I 規(guī)范/CDR接觸3 3 V VV V4 4 M MM M5 5 T TT T6 6 Q QQ Q7 7 T SS S8 8 P PP P9 9 L LL L1010T SS S1111L LL L1212S PP P1313V VV V1414T TT T1515I PP P1616G GG G1717Q EE E1818P PP P1919A AA A2020S SS S2121I II I2222S SS S2323C CC C2424 CDR1 K KR R2525S SS S2626S SS S2727Q QQ Q27A 28S SS S27B 29L LL L
27C 30 L L L L27D 31 D D H H27E 32 S S S S28 33 D D N N29 34 G G G G30 35 K K Y Y31 36 T T N N32 37 Y Y Y Y33 38 L L L L34 39 N N D D35 40FR2 W W W W36 41 L L Y Y 包裝殘基37 42 L L L L38 43 Q Q Q Q39 44 R K K K40 45 P P P P41 46 G G G G42 47 Q Q Q Q43 48 S S S S44 49 P P P P45 50 K Q Q Q46 51 R R L L 包裝殘基47 52 L L L L48 53 I I I I49 54 Y Y Y Y50 55CDR2 L L L L51 56 V V G G52 57 S S S S53 58 K K N N54 59 L L R R55 60 D D A A56 61 S S S S57 62FR3 G G G G58 63 V V V V59 64 P P P P60 65 D D D D61 66 R R R R62 67 F F F F
63 68 TSSS64 69 GGGG65 70 SSSS66 71 GGGG67 72 SSSS68 73 GGGG69 74 TTTT70 75 DDDD71 76 FFFF72 77 TTTT73 78 LLLL74 79 KKKK75 80 IIII76 81 SSSS77 82 RRRR78 83 IVVV79 84 EEEE80 85 AAAA81 86 EEEE82 87 DDDD83 88 LVVV84 89 GGGG85 90 LVVV86 91 YYYY87 92 YYYY88 93 CCCC89 94 CDR3 WWMM90 95 QQQQ91 96 GGAA92 97 TTLL93 98 HHQQ94 99 FFTT95 100 PPPP96 101 RRR97 102 TTT98 103 FR4FFF99 104 GGG100 105 GQQ101 106 GGG
102107T T T103108K K K104109L V V105110E E E106111I I I106A 112K K KTable 14.重鏈Kabat編號(hào)檢索小鼠KAB3D6HUMKABIVH3-##TYPEVH3D6D23種注解VH045919系1 1FR1E E E E2 2 V V V V3 3 K Q Q Q4 4 L L L L5 5 V L L L6 6 E E E E7 7 S S S S8 8 G G G G9 9 G G G G1010 G G G G1111 L L L L1212 V V V V1313 K Q Q Q1414 P P P P1515 G G G G1616 A G G G1717 S S S S1818 L L L L1919 K R R R2020 L L L L2121 S S S S2222 C C C C2323 A A A A2424 A A A A2525 S S S S2626 G G G G
2727 F F F F2828 T T T T2929 F F F F3030 S S S S3131 CDR1 N N S S3232 Y Y Y Y3333 G G A A3434 M M V M3535 S S S S3636 FR2W W W W3737 V V V V3838 R R R R3939 Q Q Q Q4040 N A A A 稀有小鼠，替換w/人(Hum)4141 S P P P4242 D G G G 稀有小鼠，替換w/人4343 K K K K4444 R G G G4545 L L L L4646 E E E E4747 W W W W4848 V V V V4949 A A S S CDR接觸/貼面(veneer)5050 CDR2 S S A A5151 I I I I5252 R R S S52A 53 S S G G5354 G G S S5455 G G G G5556 G G G G5657 R R S S5758 T T T T5859 Y Y Y Y5960 Y Y Y Y6061 S S A A6162 D D D D6263 N N S S
6364V V V V6465K K K K6566G G G G6667FR3 R R R R6768F F F F6869T T T T6970I I I I7071S S S S7172R R R R7273E D D D7374N N N N7475A A A S7576K K K K7677N N N N7778T S S T7879L L L L7980Y Y Y Y8081L L L L8182Q Q Q Q8283M M M M82A 84S N N N82B 85S S S S82C 86L L L L8387K R R R8488S A A A8589E E E E8690D D D D8791T T T T8892A A A A8993L L L V9094Y Y Y Y9195Y Y Y Y9296C C C C9397V V A A 包裝殘基，使用小鼠9498R R K K 規(guī)范殘基，使用小鼠9599CDR3Y Y D96100 D D N97101 H H Y98102 Y Y D
99 103 S S F100104 G G W100105 S S SA100B 106 S S G100C 107 - - T100108 - - FD101109 D D D102110 Y Y Y103111 FR4W W W104112 G G G105113 Q Q Q106114 G G G107115 T T T108116 T L L109117 V V V110118 T T T111119 V V V112120 S S S113121 S S S人源化抗體優(yōu)選顯示出特異性結(jié)合Aβ的親合力至少為107、108、109或1010M-1。通常人源化抗體對(duì)Aβ的結(jié)合親合力的上限為3D6的親合力上限的三、四或五倍(即～109M-1)。通常結(jié)合親合力的下限也為3D6的親合力下限的三、四或五倍。
人源化3D6 VH和VL、改型1的組裝和表達(dá)簡(jiǎn)單地說(shuō)，對(duì)于每一個(gè)V區(qū)，把4個(gè)大的單鏈重疊寡核苷酸進(jìn)行合成。此外，將4個(gè)短的PCR引物合成用于每一V區(qū)域以進(jìn)一步促進(jìn)特定V區(qū)的組裝。用于此目的寡核苷酸的DNA序列顯示在表15中。
表15DNA寡核苷酸
人源化輕鏈利用PCR進(jìn)行裝配。至于所預(yù)計(jì)的序列，對(duì)兩打以上的DNA序列進(jìn)行分析表明分散的點(diǎn)突變和貫穿VL區(qū)的缺失。序列的分析顯示克隆2.3負(fù)責(zé)修復(fù)氨基末端區(qū)域的2個(gè)間隔接近的單核苷酸缺失。因此定點(diǎn)誘變?cè)诳寺CRShum3D6v12.3上進(jìn)行，通過(guò)寡核苷酸來(lái)導(dǎo)入2個(gè)缺失的核苷酸，且點(diǎn)突變的修復(fù)通過(guò)DNA序列分析得到確認(rèn)，以及將VL插入片段克隆到輕鏈表達(dá)載體pCMV-cK中。
利用基于PCR的方法裝配人源化VH產(chǎn)生了5’端一半序列全部缺失的克隆。進(jìn)一步地努力優(yōu)化PCR的條件來(lái)滿足部分的成功。通過(guò)優(yōu)化的PCR條件而裝配的克隆在定位到A+B片段重疊的區(qū)域中仍具有10-20核苷酸缺失。所以，可選擇的路線應(yīng)用于VH裝配，通過(guò)利用DNA聚合酶(T4、Klenow和Sequenase)介導(dǎo)的重疊延伸，然后通過(guò)T4 DNA連接酶來(lái)共價(jià)連接重疊末端。利用后一方法對(duì)來(lái)自VH裝配的克隆亞組進(jìn)行DNA序列分析揭示了克隆中的分散的點(diǎn)突變和缺失。對(duì)兩打以上克隆的分析揭示了克隆的如圖所示基本相同的模式。在VH和VL克隆的第一次裝配之后所觀察到的類似結(jié)果表明DNA序列誤差產(chǎn)生在用于裝配的長(zhǎng)DNA的合成過(guò)程中自動(dòng)合成儀的誤差。
人源化VH克隆2.7選擇用于通過(guò)觀察含有的3個(gè)核苷酸缺失的定點(diǎn)誘變介導(dǎo)的修復(fù)。
實(shí)施例XIII人源化3D6v2抗體的特征鑒定人源化3D6的第二改型具有改型1所顯示的所有取代，除了在殘基1處D→Y的取代。在改型1中該殘基的取代是因?yàn)樵摎埢昏b定為一個(gè)CDR作用殘基。但是，取代缺失了一個(gè)在該位點(diǎn)對(duì)與人免疫球蛋白來(lái)說(shuō)稀有的殘基。然而，建立了一個(gè)沒(méi)有該取代的改型。此外，在重鏈構(gòu)架區(qū)的非種系殘基被命名為H74＝S，H77＝T和H89＝V的種系殘基取代。改型2輕鏈和重鏈的Kabat編號(hào)分別與表13和14所述相同，除了改型2輕鏈的殘基1為天冬氨酸(D)，重鏈的殘基74為絲氨酸(S)，重鏈的殘基77為蘇氨酸(T)，重鏈的殘基89為纈氨酸(V)。人源化3D6改型1輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別見序列SEQ ID NO34和36。人源化3D6改型2輕鏈和重鏈的核苷酸序列分別見序列SEQ ID NO35和37。
實(shí)施例IX人源化3D6抗體的功能試驗(yàn)人源化3D6v1結(jié)合聚集態(tài)Aβ.人源化3D6v1的功能性試驗(yàn)通過(guò)來(lái)自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行。該細(xì)胞用嵌合重鏈+人源化輕鏈或嵌合輕鏈+人源化重鏈混合物的全嵌合抗體以及最終用完全人源化抗體轉(zhuǎn)染。條件培養(yǎng)基通過(guò)ELISA試驗(yàn)測(cè)試其對(duì)聚集態(tài)Aβ1-42的結(jié)合。人源化抗體在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)顯示出良好的活性，且顯示出與嵌合3D6參照樣品不能區(qū)分的結(jié)合特性。結(jié)果顯示在表16中。
表16
為了比較人源化3D6v1和3D6v2抗體的結(jié)合親合力，利用聚集態(tài)Aβ作為抗原進(jìn)行ELISA分析。結(jié)果顯示3D6v1(H1L1)和3D6v2(H2L2)具有幾乎完全相同的Aβ結(jié)合特性(附圖5)。
h3D6v2的替代網(wǎng)(rNET)分析.rNET表位圖譜分析提供了關(guān)于在表位中的單個(gè)殘基對(duì)抗體的綜合結(jié)合活性的貢獻(xiàn)的信息。rNET分析利用了合成的系統(tǒng)的單一取代的肽類似物。被測(cè)試抗體的結(jié)合被測(cè)定抗天然肽(天然抗原)和抗19個(gè)可選擇的“單一取代”肽，每一個(gè)肽在第一位置用該位置的19個(gè)非天然氨基酸之一取代。一種分布圖被產(chǎn)生來(lái)反映不同非天然殘基位置取代的影響。在延著抗原肽的連續(xù)位置同樣地產(chǎn)生分布圖。聯(lián)合的分布圖，或表位圖譜，(反映所有19個(gè)非天然殘基的每一位置的取代)可與第二抗體的類似圖譜比較。大體上類似或相同的圖譜表明被比較的抗體具有相同或相似的表位特異性。
此分析被用于3D6和人源化3D6，改型2?？贵w被測(cè)試其對(duì)天然Aβ肽DAEFRHDSGY(SEQ ID N033)的結(jié)合。殘基1-8被系統(tǒng)地用19個(gè)非天然殘基的每一個(gè)在其位置進(jìn)行取代。3D6和h3D6V2的相應(yīng)的圖譜被產(chǎn)生。結(jié)果顯示在表17的表格中。
表17Aβwt3D6和人源化3D6的替換網(wǎng)狀表位(rNET)圖譜
顯著地，當(dāng)注意每一位置的取代時(shí)，3D6和h3D6v2的分布圖實(shí)質(zhì)上是相同的(即，當(dāng)比較欄1(3D6)和欄2(h3D6v2)的數(shù)據(jù)時(shí)，值以相同的方式波動(dòng))。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了h3D6v2的特異性被保留，正如h3D6v2的rNET表位圖譜與m3D6利用Aβ殘基1-4和5-8的實(shí)質(zhì)上相同性。
PDAPP腦切片的免疫組織化學(xué)分析證實(shí)了h3D6v1抗體的特異性。人源化3D6v1抗體識(shí)別來(lái)自PDAPP小鼠的恒冷箱腦切片的Aβ。人源化3D6v1和PK1614以相同的劑量反應(yīng)方式結(jié)合于PDAPP斑，通過(guò)測(cè)定每玻片熒光的量(像素的定量測(cè)定)對(duì)用于染色組織的抗體的量(附圖6)。相同的抗人第二抗體被用于此實(shí)驗(yàn)中。切片、染色和成像的方法如前面所述。在相同的試驗(yàn)中，h3D6v2對(duì)PDAPP和AD腦切片的污染的成像分析表明h3D6v2以與3D6v1類似的方式識(shí)別Aβ斑(例如，高度修飾斑)。
h3D6的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析。h3D6抗體v1和v2與鼠3D6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的能力通過(guò)ELISA利用生物素?；?D6抗體抗體來(lái)測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析表明h3D6v1，h3D6v2，和嵌合PK1614均可與m3D6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aβ(附圖7)。h3D6v1和h3D6v2與3D6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Aβ的能力是相同的。10D5抗體被用作陰性對(duì)照，因?yàn)槠渚哂信c3D6不同的結(jié)合表位。BIAcore分析也顯示了h3D6v1和h3D6v2高度結(jié)合Aβ的親合力(表18)。
表18利用BIAcore技術(shù)測(cè)定Aβ抗體的親合力
與具有0.88nM Kd的3D6相比，h3D6v1和h3D6v2具有大約小2到3倍的結(jié)合親合力，測(cè)定h3D6v1和h3D6v2分別具有2.06nM和2.24nM的Kd。ELISA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)表明h3D6v1和h3D6v2具有大約小6-倍的結(jié)合親合力。典型的，人源化抗體與其鼠的相應(yīng)抗體比較損失大約3-4倍的結(jié)合親合力。因此h3D6v1和h3D6v2的大約3倍(ELISA和BIAcore結(jié)果的平均值)的損失是在可接受的范圍內(nèi)。
h3D6v2抗體的離體試驗(yàn)。h3D6v2刺激小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力通過(guò)離體吞噬作用試驗(yàn)被測(cè)定(附圖8)。h3D6v2與嵌合3D6在誘導(dǎo)來(lái)自PDAPP小鼠腦組織的Aβ的吞噬作用中是同樣有效的。IgG在此實(shí)驗(yàn)中被用作陰性對(duì)照，因?yàn)槠洳荒軌蚪Y(jié)合Aβ且因此不能夠誘導(dǎo)吞噬作用。
h3D6在體內(nèi)腦中的定位。125I標(biāo)記的h3D6v2，m3D6，和抗體DAE13在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中各自被IV-注射到14個(gè)獨(dú)立的PDAPP小鼠中。第7天后處死小鼠并灌注用于進(jìn)一步的分析。其腦區(qū)被切割并測(cè)定在特異性腦區(qū)域的125I活性。腦中的放射性標(biāo)記的活性與血清樣品中的活性比較。血清和腦區(qū)域的結(jié)果分別顯示在表19和20中。
表19
表20
數(shù)據(jù)表明h3D6v2集中到腦中，且特別聚集在已知Aβ集中的海馬區(qū)。m3D6和DAE13的腦部計(jì)數(shù)與h3D6v2可比。通過(guò)體內(nèi)的Aβ斑結(jié)合證實(shí)所有的三種抗體能夠通過(guò)血腦屏障。
實(shí)施例X.小鼠10D5可變區(qū)的克隆和測(cè)序10D5 VH的克隆和序列分析。來(lái)自雜交瘤細(xì)胞的10D5的VH和VL區(qū)通過(guò)RT-PCR利用5’RACE法克隆。得自兩個(gè)獨(dú)立的編碼假定10D5 VL區(qū)的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO13)以及推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO14)，被列在表21和附圖9中。得自兩個(gè)獨(dú)立的編碼假定10D5 VH區(qū)的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO15)以及推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO16)，被列在表22和附圖10中。10D5VL和VH序列滿足功能性V區(qū)的條件就需含有一個(gè)與C區(qū)的啟動(dòng)甲硫氨酸鄰近的ORF，且具有免疫球蛋白V區(qū)基因的保守殘基的特性。
表21小鼠10D5 VL DNA序列ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTACTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAACATTATACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAAGAAAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGGAA(SEQ IDNO13)*前導(dǎo)肽加下劃線表22小鼠10D5 VH DNA序列ATGGACAGGCTTACTTCCTCATTCCTGCTGCTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGGCTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGAGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGAAAGCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGTTCGAAGGCCCATTACTCCGGTACTAGTCGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO15)*前導(dǎo)肽加下劃線。
實(shí)施例XI.人受試者的預(yù)防和治療進(jìn)行單劑量I期試驗(yàn)確定在人體內(nèi)的安全性。以逐步增加的劑量對(duì)不同患者給藥治療藥物，從推測(cè)功效的水平約0.01開始，以3為系數(shù)增長(zhǎng)，直到達(dá)到10倍有效小鼠劑量的水平。
進(jìn)行II期試驗(yàn)確定治療的功效。挑選利用阿爾茨海默氏病和相關(guān)病癥協(xié)會(huì)(ADRD)為可能發(fā)生的AD制定的標(biāo)準(zhǔn)確定的患早期到中度阿爾茨海默氏病的患者。按照做微精神狀況檢查(MiniMental StateExam，MMSE)，合適的患者的得分在12-26范圍內(nèi)。其它選擇標(biāo)準(zhǔn)是，患者在研究期間容易生存，且不會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜問(wèn)題，例如可能帶來(lái)干擾的伴隨藥物的使用。利用典型心理測(cè)量法例如MMSE、ADAS對(duì)患者功能作基線評(píng)價(jià)，這些方法對(duì)于評(píng)價(jià)阿爾茨海默氏病的狀況和功能是一種綜合判斷。這些心理測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)能夠測(cè)量阿爾茨海默氏病的發(fā)展。合適的定性生命標(biāo)準(zhǔn)也可以用來(lái)監(jiān)測(cè)治療。還可以通過(guò)MRI監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展。也可以監(jiān)測(cè)患者的血液狀況，包括分析免疫原特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。
測(cè)定基線后，患者開始接受治療。將其完全打亂，以雙盲方式用治療藥物或安慰劑治療。至少每六個(gè)月監(jiān)測(cè)患者一次。通過(guò)進(jìn)展中治療組相對(duì)于安慰劑組的有效降低來(lái)確定效果。
進(jìn)行第二次II期試驗(yàn)，評(píng)價(jià)患者從非阿爾茨海默氏病的早期記憶丟失，有時(shí)被稱為年齡有關(guān)的記憶損傷(AAMI)或輕度認(rèn)知損傷(MCI)到經(jīng)ADRDA標(biāo)準(zhǔn)確定為可能的阿爾茨海默氏病的轉(zhuǎn)變。通過(guò)篩選參照群體的記憶丟失早期跡象或其它與前阿爾茨海默氏病癥候?qū)W、阿爾茨海默氏病的家族史、遺傳危險(xiǎn)因素、年齡、性別和已發(fā)現(xiàn)的其它預(yù)示阿爾茨海默氏病高危特征有關(guān)的不利特征，從非臨床群體中選擇具有轉(zhuǎn)化成阿爾茨海默氏病高風(fēng)險(xiǎn)的患者。收集基于包括MMSE和ADAS的合適法則和其它設(shè)計(jì)用來(lái)評(píng)價(jià)較為正常群體法則的基線積分。將這些患者群體分成合適的安慰劑對(duì)交替劑量藥物組。以間隔約六個(gè)月，對(duì)這些患者群體進(jìn)行跟蹤，終點(diǎn)是每個(gè)患者到觀察結(jié)束時(shí)他或她是否轉(zhuǎn)化成按照ADRDA標(biāo)準(zhǔn)判斷的可能的阿爾茨海默氏病。
一般材料和方法A.多克隆和單克隆Aβ抗體的制備從兩組動(dòng)物采集的血液中制備抗Aβ多克隆抗體。第一組含有6-8周齡的100只雌性Swiss Webster小鼠。在0、15和29天用100μg與CFA/IFA組合的AN1792免疫。第36天進(jìn)行第四次注射，給藥一半劑量的AN1792。第42天放血法處死動(dòng)物，制備血清，共收集血清64ml。第二組含有24只6-9周齡的雌性小鼠，與PDAPP小鼠等基因，但對(duì)于人APP基因是非轉(zhuǎn)基因的。在0、14、28和56天用100μg與CFA/IFA組合的AN1792免疫。第63天放血法處死動(dòng)物，制備血清，共收集血清14ml?；旌线@兩種血清。使用50％飽和硫酸銨進(jìn)行兩次連續(xù)的沉淀作用，以純化抗體組分。最終的沉淀物在PBS中透析并檢測(cè)內(nèi)毒素。內(nèi)毒素的水平小于1EU/mg。
抗Aβ單克隆抗體制備于腹水液。冰冷的腹水液中加入濃縮的硫酸葡聚糖鈉鹽進(jìn)行脫脂，在冰上攪動(dòng)使終濃度為0.238％。攪動(dòng)加入濃縮的CaCl2，使其終濃度為64mM。10000×g離心該溶液，棄沉淀。在冰上攪動(dòng)逐滴加入等體積的飽和硫酸銨于上清液中。10000×g再次離心該溶液，丟棄上清液。沉淀重懸并透析于20mM Tris-HCl，0.4MNaCl中，pH7.5。此部分上Pharmacia FPLC Sepharose Q柱，并以反向梯度從0.4M到0.275M NaCl(溶于20mM Tris-HCl，pH7.5)洗脫。
抗體的峰值可以通過(guò)280納米的吸收被鑒定，從而收集合適的部分。通過(guò)BCA方式測(cè)定蛋白濃度，以及SDS-PAGE測(cè)定純度，從而對(duì)純化的抗體制備物進(jìn)行定性。也檢測(cè)抗體池的內(nèi)毒素。內(nèi)毒素水平低于1EU/mg。低于100的效價(jià)被任意地給一個(gè)25的效價(jià)值。
B.抗體效價(jià)的測(cè)定在小鼠尾靜脈切開小口取血，采集約200μl血置于微量離心管。豚鼠如下取血，首先剃去后腿背面的毛，然后用18號(hào)針頭劃破跖骨靜脈，采血于微量離心管。室溫下(RT)靜置1小時(shí)使血液凝結(jié)成塊，旋渦振蕩，然后在14000×g離心10分鐘，將血塊從血清中分離出來(lái)。然后將血清轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中，4℃儲(chǔ)存直到測(cè)定效價(jià)。
用ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。在Well包被緩沖液(0.1M磷酸鈉，pH8.5，0.1％疊氮化鈉)中含有10μg/ml Aβ42或SAPP或如各單獨(dú)報(bào)道的其它抗原的100μl溶液包被96孔微滴定板(Costsr EIA平板)，室溫過(guò)夜。吸干各孔，從1/100稀釋度的樣品稀釋液(0.014M磷酸鈉、pH7.4、0.15M NaCl、0.6％牛血清白蛋白、0.05％硫柳汞)開始向孔中加入血清。以三倍的跨度制備七個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品，置于平板中，終稀釋度為1/218700。稀釋液在經(jīng)包被的平板的孔中室溫保溫1小時(shí)。然后用含0.05％吐溫20的PBS沖洗四次。將第二抗體，結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的羊抗小鼠Ig(獲自Boehringer Mannheim)，作為100μl的1/3000稀釋度的樣品稀釋液加到孔中，室溫保溫1小時(shí)。再次用PBS、吐溫20沖洗平板四次。為了形成色原體，將100μl的Slow TMB(3，3’，5，5’-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯，獲自Pierce Chemicals)加入各孔，室溫保溫15分鐘。加入25μl的2M H2SO4終止反應(yīng)。然后在Molecular Devices Vmax裝置上讀取450nm-650nm處的光密度。
效價(jià)被定義為得到最大OD一半時(shí)血清稀釋度的倒數(shù)。最大OD通常取自起始的1/100稀釋液，除非該條件下具有非常高的效價(jià)，在這種情況下，需要建立較高起始稀釋度的最大OD。如果50％的點(diǎn)落在兩個(gè)稀釋液之間，則利用線性外推法計(jì)算最終效價(jià)。為了計(jì)算幾何平均抗體效價(jià)，低于100的效價(jià)被任意地指定效價(jià)值為25。
C.腦組織制備無(wú)痛處死后取腦，一個(gè)腦半球準(zhǔn)備進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，解剖另一個(gè)腦半球的三個(gè)腦區(qū)(海馬、皮層和小腦)用于利用特異性ELISA測(cè)定各種Aβ蛋白質(zhì)和APP型的濃度(Johnson-Wood等，同上)。
將用于ELISA的組織在10體積的冰冷胍緩沖液(5.0M胍-鹽酸，50mM Tris-HCl，pH8.0)中勻漿。勻漿液利用Adams Nutator(Fisher)溫和攪拌，室溫下混合3到4小時(shí)，然后于-20℃儲(chǔ)藏，留待定量Aβ和APP時(shí)使用。前面的試驗(yàn)已經(jīng)表明，在該儲(chǔ)藏條件下，分析物是穩(wěn)定的，當(dāng)合成的Aβ蛋白(Bachem)摻入同窩生小鼠的對(duì)照腦組織勻漿中時(shí)，可以定量提取(Johnson-Wood等，同上)。
D.Aβ水平的測(cè)定用冰冷卻的酪蛋白稀釋液(0.25％酪蛋白、PBS、0.05％疊氮化鈉、20μg/ml抑酶肽、5mM EDTA pH8.0，10μg/ml亮肽素)以1∶10稀釋腦勻漿，然后在4℃，16000×g離心20分鐘。制備合成的Aβ蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(1-42氨基酸)和APP標(biāo)準(zhǔn)品，使終組合物中包括0.5M胍和0.1％牛血清白蛋白(BSA)?！翱偂盇β夾心ELISA利用單克隆抗體266，特異于Aβ第13-28位的氨基酸(Seubert等，同上)作為捕捉抗體，和生物素?；膯慰寺】贵w3D6，特異于Aβ第1-5位的氨基酸(Johnson-Wood等，同上)作為報(bào)道抗體。3D6單克隆抗體不能識(shí)別分泌型APP或全長(zhǎng)APP，僅可檢測(cè)氨基末端為天冬氨酸的Aβ類型。該分析法靈敏度下限約為50ng/ml(11nM)，不與濃度至多1ng/ml內(nèi)源性鼠Aβ蛋白質(zhì)表現(xiàn)交叉反應(yīng)性(Johnson-Wood等，同上)。
Aβ1-42特異性?shī)A心ELISA采用mAβ21F12，特異于Aβ的氨基酸33-42(Johnson-Wood等，同上)作為捕捉抗體。該分析同樣用生物素酰化的mAβ3D6作為報(bào)道抗體，其靈敏度下限約為125μg/ml(28μM，Johnson-Wood等，同上)。當(dāng)進(jìn)行AβELISA時(shí)，用100μl mAβ266(10μg/ml)或mAβ21F12(5μg/ml)包被96孔的免疫測(cè)試平板(Costar)，室溫下保溫過(guò)夜。通過(guò)抽吸除去溶液，向各孔中加入200μl 0.25％的人血清蛋白PBS溶液，于室溫將各孔封閉至少1小時(shí)。除去封閉液，在4℃下儲(chǔ)藏干燥的平板直到使用。在使用前用沖洗緩沖液(Tris-緩沖鹽水(0.15M NaCl，0.01M Tris-HCl，pH7.5)加0.05％吐溫20)使平板再水化。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品以每孔100μl三等份加入，然后于4℃保溫過(guò)夜。分析的每個(gè)步驟之間用沖洗緩沖液至少?zèng)_洗平板三次。加入生物素酚化的mAβ3D6(用酪蛋白分析緩沖液(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％吐溫20，pH7.4)稀釋到0.5μg/ml，室溫下保溫1小時(shí)。將抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物((抗生物素蛋白-HRP得自Vector，Burlingame，CA)用酪蛋白分析緩沖液以1∶4000的比例稀釋)加到孔中，室溫保持1小時(shí)。加入比色物質(zhì)，SlowTMB-ELISA(Pierce)，使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15分鐘，之后，加入25μl 2N H2SO4終止反應(yīng)。利用Molecular Devices Vmax裝置讀取450nm和650nm處的吸收度差值，定量反應(yīng)產(chǎn)物。
E.APP水平的測(cè)定應(yīng)用了兩種不同APP測(cè)定法。其一種分析被命名為APP-α/FL，識(shí)別APP-α和APP的全長(zhǎng)型(FL)。第二種分析特異于APP-α。APP-α/FL分析法識(shí)別包括Aβ的前12個(gè)氨基酸的分泌型APP。因?yàn)閳?bào)道抗體(2H3)對(duì)存在于APP695第612-613位的氨基酸之間(Esch等，Science 2481122-1124(1990))的α-發(fā)夾-位點(diǎn)不具有特異性；因此該分析也可以識(shí)別全長(zhǎng)APP(AP-FL)。利用針對(duì)APP-FL細(xì)胞質(zhì)末端的固定APP抗體消耗腦勻漿APP-FL的初步試驗(yàn)表明，約30-40％的APP-α/FL APP是FL(數(shù)據(jù)未顯示)。APP-α/FL和APP-α分析的捕捉抗體均為mAb 8E5，其針對(duì)APP695型第444到592位的氨基酸(Games等，同上)。用于APP-α/FL分析的報(bào)道m(xù)Ab是mAb 2H3，其特異于APP695第597-608位的氨基酸(Johnso-Wood等，同上)，APP-α分析的報(bào)道抗體是mAb 16H9的生物素?；苌铮溽槍?duì)APP第605-611位的氨基酸。APP-α/FL分析的靈敏度下限約為11ng/ml(150ρM)(Johnson-Wood等)，APP-α特異性分析的靈敏度下限約為22ng/ml(0.3nM)。對(duì)于這兩種APP檢測(cè)，如前面mAb 266所述，將mAb8E5包被到96孔EIA平板上。純化的重組分泌型APP-α用作APP-α分析和APP-α/FL分析的參照標(biāo)準(zhǔn)品(Esch等，同上)。5M胍中的腦勻漿樣品用ELISA樣品稀釋液(0.014M磷酸鹽緩沖液，pH7.4，0.6％牛血清白蛋白，0.05％硫柳汞，0.5M NaCl，0.1％NP40)以1∶10的比例稀釋。然后用含0.5M胍的樣品稀釋液以1∶4的比例稀釋它們。然后在室溫下，16000×g離心稀釋的勻漿15秒。將APP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品平行兩份加入平板，室溫下保溫1.5小時(shí)。將生物素?；膱?bào)道抗體2H3或16H9與樣品一起在室溫下保溫1小時(shí)。鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim)，在樣品稀釋液中稀釋1000倍，加入孔中室溫下保溫1小時(shí)。加入熒光物質(zhì)4-甲基-umbellipheryl-磷酸酯，室溫下保溫30分鐘，在Cytofluor tm 2350熒光計(jì)(Millipore)上在激發(fā)光365nm和發(fā)射光450nm處對(duì)平板讀數(shù)。
F.免疫組織化學(xué)腦在4％多聚甲醛的PBS液中于4℃固定三天，然后在1％多聚甲醛PBS液中于4℃儲(chǔ)存1到7天，直到被切片。在振動(dòng)切片機(jī)上室溫下將其切成40微米厚的冠狀切片，在防凍劑(30％甘油，30％乙二醇，在磷酸緩沖液中)中于-20℃儲(chǔ)存直到進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理。對(duì)于每個(gè)腦，在背側(cè)海馬水平上的六個(gè)切片，連續(xù)間隔240μm彼此分離，與下述之一的抗體中一起溫育過(guò)夜(1)生物素?；目?Aβ(mAb，3D6，特異于人Aβ)在PBS和1％馬血清中稀釋到濃度為2μg/ml；或(2)特異于人APP的生物素?；膍Ab，8E5，在PBS和1.0％馬血清中稀釋到濃度為3μg/ml；或(3)特異于神經(jīng)膠質(zhì)纖絲酸性蛋白質(zhì)的mAb(GFAP；Sigma Chemical Co.)，用含0.25％Triton X-100和1％馬血清的Tris-緩沖鹽水(pH7.4)(TBS)以1∶500的比例稀釋；或(4)特異于CD11b(MAC-1抗原)的mAb(Chemicon International)，用0.25％Triton X-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀釋；或(5)特異于MHC II抗原的mAb(Pharmingen)，用含0.25％TritonX-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀釋；或(6)特異于CD 43的大鼠mAb(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(7)特異于CD 45RA的大鼠mAb(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(8)特異于CD 45RB的大鼠單克隆Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋或(9)特異于CD 45的大鼠單克隆Aβ(Pharminge)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(10)特異于CD3e的生物素?；嗫寺}(cāng)鼠Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀釋；或(11)特異于CD 3的大鼠mAb(Serotec)，用含1％兔血清的PBS液以1∶200的比例稀釋；或(12)含1％正常馬血清的無(wú)一級(jí)抗體的PBS溶液。
與上面所列的1、2和6-12號(hào)抗體溶液反應(yīng)的切片首先用含1.0％Triton X-100，0.4％過(guò)氧化氫的PBS液在室溫下預(yù)處理20分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。接著將它們與一級(jí)抗體在4℃下保溫過(guò)夜。然后使與3D6或8E5或CD3e mAb反應(yīng)的切片在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶-抗生物素蛋白-生物素-復(fù)合物與用PBS稀釋75倍的試劑盒成分“A”和“B”(Vector Elite Standard Kit，Vector Labs，Burlingame，CA)一起反應(yīng)1小時(shí)。與特異于CD 45RA、CD 45RB、CD45、CD3的抗體和無(wú)一級(jí)抗體的PBS溶液反應(yīng)的切片分別與在PBS中稀釋為1∶75的生物素?；目?大鼠IgG(Vector)，或者在PBS中稀釋為1∶75的生物素?；目?小鼠IgG(Vectot)一起在室溫下保溫1小時(shí)。然后將切片與辣根過(guò)氧化物酶-抗生物素蛋白-生物素-復(fù)合物與試劑盒成分“A”和“B”(用PBS稀釋75倍)(Vector Elite Standard Kit，Vector Labs，Burlingame，CA)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。
將切片置于0.01％過(guò)氧化氫、0.05％ 3，3’-二氨基聯(lián)苯(DAB)中室溫下。用于與GFAP-、MAC-1-和MHC II-特異性抗體一起保溫的切片首先用0.6％過(guò)氧化氫在室溫下預(yù)處理，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后與一級(jí)抗體在4℃下保溫過(guò)夜。與GFAP抗體反應(yīng)的切片與在TBS中稀釋成1∶200的生物素?；鸟R抗-小鼠IgG(VectorLaboratories；Vectastain Elite ABC試劑盒)在室溫下保溫1小時(shí)。接著將切片與在TBS中稀釋成1∶1000的抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(Vector Laboratories；Vectastain Elite ABC試劑盒)反應(yīng)1小時(shí)。接著將與MAC-1或MHCII-特異性單克隆抗體作為一級(jí)抗體一同保溫的切片與在TBS中稀釋成1∶200的生物素酰化的兔抗-大鼠IgG在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，隨后與在TBS中稀釋成1∶1000的抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物保溫1小時(shí)。然后將與GFAP-、MAC-1-或MHC II-特異性抗體一同保溫的切片用0.05％DAB、0.01％過(guò)氧化氫、0.04％氯化鎳、TBS液分別在室溫下處理4和11分鐘，使它們顯色。
將免疫標(biāo)記的切片在載玻片(VMR Superfrost玻片)上制作成標(biāo)本，空氣干燥過(guò)夜，在ProPar(Anatech)中浸漬，然后加蓋玻片覆蓋，用Permount(Fisher)作為標(biāo)本介質(zhì)封固。
為了復(fù)染色Aβ斑，將GFAP-陽(yáng)性切片亞組在免疫組織化學(xué)處理后置于Superfrost載玻片上制作成標(biāo)本，在1％硫黃素S(Thioflavin S)(Sigma)水溶液中保持7分鐘。然后使切片脫水，在Propar中使其清晰，然后加蓋玻片覆蓋，用Permount封固。
G.成像分析通過(guò)CCD攝像機(jī)和索尼特麗瓏監(jiān)示器連接于尼康Microphot FX顯微鏡的Videometric 150型圖像分析系統(tǒng)(Oncor，Inc.，Gaithersburg，MD)被用來(lái)定量免疫反應(yīng)切片。切片的圖像儲(chǔ)存于影象緩沖區(qū)中，確定基于顏色和飽和度的閾值以選擇和計(jì)算免疫標(biāo)記結(jié)構(gòu)物所占據(jù)的總像素面積。對(duì)于每個(gè)切片，人工描繪出海馬區(qū)輪廓，計(jì)算海馬區(qū)占據(jù)的總像素面積。如下測(cè)定淀粉樣沉積百分率(含與mAb 3D6具有免疫反應(yīng)性的Aβ沉積物的海馬區(qū)面積的分?jǐn)?shù))×100。同樣，神經(jīng)炎性沉積的百分率如下測(cè)定(含與單克隆抗體8E5具有反應(yīng)性的營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)突的海馬區(qū)面積的分?jǐn)?shù))×100。運(yùn)行Simple 32軟件應(yīng)用程序的C-成像系統(tǒng)(Compix，Inc.，Cranberry Township，PA)通過(guò)Optronics照相機(jī)連接于Nikon Microphot FX顯微鏡，用于定量GFAP-陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和MAC-1和MHC II-陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的夾肌后(retrospenial)皮層的百分率。免疫反應(yīng)切片的圖像儲(chǔ)存于顯影緩沖區(qū)中，確定單色閾值，以選擇和計(jì)算免疫標(biāo)記細(xì)胞占據(jù)的總像素面積。對(duì)于每個(gè)切片，手工繪制除夾肌后皮層(RSC)的輪廓，然后計(jì)算RSC占據(jù)的總像素面積。星形膠質(zhì)細(xì)胞增多(astrocytosis)百分率如下確定(GFAP-反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的RSC的分?jǐn)?shù))×100。同樣，小膠質(zhì)細(xì)胞增多(microgliosis)百分率如下確定(MAC-1或MHC II-反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)的RSC的分?jǐn)?shù))×100。對(duì)于所有的圖像分析，定量每個(gè)動(dòng)物的背側(cè)海馬水平上的六個(gè)切片(彼此連續(xù)以240μm的間隔分隔)。在所有的情況下，動(dòng)物的治療狀況對(duì)于觀察者都是未知的。
盡管為了便于清楚理解，前面已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，但顯然可以在權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行某些改動(dòng)。本文為各種目的引證的所有出版物和專利文獻(xiàn)以及附圖和序列表所示的文本以其全文內(nèi)容引入作為參考。
根據(jù)前文，顯然本發(fā)明提供了多種用途。例如，本發(fā)明提供了以上所述的Aβ抗體在致淀粉樣病的治療、預(yù)防或診斷中的應(yīng)用，或在用于相同疾病的藥物或診斷組合物制備中的應(yīng)用。
序列表<110>神經(jīng)實(shí)驗(yàn)室有限公司(Neuralab Limited)<120>識(shí)別β淀粉樣肽的人源化抗體(Humanized Antibodies that Recognize Beta-Amyloid Peptide)<130>ELN-002PC<150>60/251,892<151>2000-12-06<160>63<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>396<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(1)...(396)<221>信號(hào)肽<222>(1)...(60)<400>1atg atg agt cct gcc cag ttc ctg ttt ctg tta gtg ctc tgg att cgg 48Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg-20 -15 -10 -5gaa acc aac ggt tat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg 96Glu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser1 5 10gtt acc att gga caa cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc 144Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser15 20 25ctc tta gat agt gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg 192Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg30 35 40cca ggc cag tct cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac 240Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp45 50 55 60tct gga gtc cct gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttt 288Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75aca ctg aaa atc agc aga ata gag gct gag gat ttg gga ctt tat tat 336Thr Leu Lys Ile Ser Arg Ile Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr80 85 90
tgc tgg caa ggt aca cat ttt cct cgg acg ttc ggt gga ggc acc aag 384Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys95 100 105ctg gaa atc aaa 396Leu Glu Ile Lys110<210>2<211>132<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>信號(hào)<222>(1)...(20)<400>2Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg-20 -15 -10 -5Glu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser1 5 10Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser15 20 25Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg30 35 40Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp45 50 55 60Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Lys Ile Ser Arg Ile Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr80 85 90Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys95 100 105Leu Glu Ile Lys110<210>3<211>414<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(1)...(414)<221>信號(hào)肽<222>(1)...(57)<400>3atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gtc ctt gtt tta aaa ggt 48Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly-15 -10 -5gtc cag tgt gaa gtg aag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg aag 96Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys1 5 10
cct gga gcg tct ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc 144Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe15 20 25agt aac tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag aat tca gac aag agg ctg 192Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Asn Ser Asp Lys Arg Leu30 35 40 45gag tgg gtt gca tcc att agg agt ggt ggt ggt aga acc tac tat tca 240Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser50 55 60gac aat gta aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gag aat gcc aag aac 288Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn65 70 75acc ctg tac ctg caa atg agt agt ctg aag tct gag gac acg gcc ttg 336Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu80 85 90tat tat tgt gtc aga tat gat cac tat agt ggt agc tcc gac tac tgg 384Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp95 100 105ggc cag ggc acc act gtc aca gtc tcc tca 414Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115<210>4<211>138<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>信號(hào)<222>(1)...(19)<400>4Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly-15 -10 -5Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys1 5 10Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe15 20 25Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Asn Ser Asp Lys Arg Leu30 35 40 45Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser50 55 60Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn65 70 75Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu80 85 90Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp95 100 105Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser110 115
<210>5<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)<222>(1)...(20)<223>人源化3D6輕鏈可變區(qū)<400>5Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg-20 -15 -10 -5Glu Thr Asn Gly Tyr Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser15 20 25Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys30 35 40Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp45 50 55 60Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr80 85 90Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105Val Glu Ile Lys110<210>6<211>125<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>信號(hào)<222>(1)...(19)<400>6Met Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val-15 -10 -5Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala1 5 10Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr15 20 25Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu30 35 40 45Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val65 70 75Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr80 85 90Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105
<210>7<211>100<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>7Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser20 25 30Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95Leu Gln Thr Pro100<210>8<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化3D6重鏈可變區(qū)<221>信號(hào)<222>(1)...(19)<400>8Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly-15 -10 -5Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln1 5 10Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe15 20 25Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu30 35 40 45Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser50 55 60Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn65 70 75Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu80 85 90Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp95 100 105Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115<210>9<211>121<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)<400>9Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Asp Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>10<211>98<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys<210>11<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)<222>(1)...(20)<223>人源化3D6輕鏈可變區(qū)<400>11Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg-20 -15 -10 -5Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro1 5 10
Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser15 20 25Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys30 35 40Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp45 50 55 60Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe65 70 75Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr80 85 90Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys95 100 105Val Glu Ile Lys110<210>12<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化3D6輕鏈可變區(qū)<221>信號(hào)<222>(1)...(19)<400>12Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly-15 -10 -5Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln1 5 10Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe15 20 25Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu30 35 40 45Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser50 55 60Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn65 70 75Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val80 85 90Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp95 100 105Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115<210>13<211>393<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(1)...(393)<221>信號(hào)肽<222>(1)...(57)
<400>13atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gta ctg atg ttc tgg att cct gct 48Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala-15 -10 -5tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val1 5 10agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag aac att 144Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile15 20 25ata cat agt aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca 192Ile His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro30 35 40 45ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser50 55 60ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr65 70 75ctc aag atc aag aaa gtg gag gct gag gat ctg gga att tat tac tgc 336Leu Lys Ile Lys Lys Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys80 85 90ttt caa ggt tca cat gtt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg 384Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu95 100 105gag ctg gaa 393Glu Leu Glu110<210>14<211>131<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>信號(hào)<222>(1)...(19)<400>14Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala-15 -10 -5Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val1 5 10Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile15 20 25Ile His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro30 35 40 45Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser50 55 60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr65 70 75Leu Lys Ile Lys Lys Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys80 85 90Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu95 100 105Glu Leu Glu110<210>15<211>426<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(1)...(426)<221>信號(hào)肽<222>(1)...(57)<400>15atg gac agg ctt act tcc tca ttc ctg ctg ctg att gtc cct gca tat 48Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr-15 -10 -5gtc ctg tcc cag gct act ctg aaa gag tct ggc cct gga ata ttg cag 96Val Leu Ser Gln Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln1 5 10tcc tcc cag acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg 144Ser Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu15 20 25agc act tct ggt atg gga gtg agc tgg att cgt cag cct tca gga aag 192Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys30 35 40 45ggt ctg gag tgg ctg gca cac att tac tgg gat gat gac aag cgc tat 240Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr50 55 60aac cca tcc ctg aag agc cgg ctc aca atc tcc aag gat acc tcc aga 288Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg65 70 75aag cag gta ttc ctc aag atc acc agt gtg gac cct gca gat act gcc 336Lys Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala80 85 90aca tac tac tgt gtt cga agg ccc att act ccg gta cta gtc gat gct 384Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala95 100 105atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 426Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser110 115 120
<210>16<211>142<212>PRT<213>Mus musculus<220>
<221>信號(hào)<222>(1)...(19)<400>16Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr-15 -10 -5Val Leu Ser Gln Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln1 5 10Ser Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu15 20 25Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys30 35 40 45Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr50 55 60Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg65 70 75Lys Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Pro Ala Asp Thr Ala80 85 90Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Pro Ile Thr Pro Val Leu Val Asp Ala95 100 105Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser110 115 120<210>17<211>136<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17tccgcaagct tgccgccacc atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga 60tgctgtgggt gtccggctcc tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc 120ccgtgacccc cggcga 136<210>18<211>131<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18ctggggggac tggccgggct tctgcagcag ccagttcagg taggtcttgc cgtcggagtc 60cagcagggac tgggaggact tgcaggagat ggaggcgggc tcgccggggg tcacgggcag 120ggacaggggg g 131<210>19
<211>146<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19acctgaactg gctgctgcag aagcccggcc agtcccccca gcgcctgatc tacctggtgt 60ccaagctgga ctccggcgtg cccgaccgct tctccggctc cggctccggc accgacttca 120ccctgaagat ctcccgcgtg gaggcc 146<210>20<211>142<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20aattctagga tccactcacg cttgatctcc accttggtgc cctggccgaa ggtgcggggg 60aagtgggtgc cctgccagca gtagtacacg cccacgtcct cggcctccac gcgggagatc 120ttcagggtga agtcggtgcc gg 142<210>21<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21ctggggggac tggccg 16<210>22<211>22<212>DNA<<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22acctgaactg gctgctgcag aa 22<210>23<211>138<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23acagaaagct tgccgccacc atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt 60taaaaggtgt ccagtgtgag gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg 120
gcggctccct gcgcctgt 138<210>24<211>135<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24gccgccggag cggatggagg ccacccactc caggcccttg ccgggggcct ggcgcaccca 60ggacatgccg tagttggaga aggtgaagcc ggaggcggcg caggacaggc gcagggagcc 120gccgggctgc accag 135<210>25<211>142<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>25ctggagtggg tggcctccat ccgctccggc ggcggccgca cctactactc cgacaacgtg 60aagggccgct tcaccatctc ccgcgacaac gccaagaact ccctgtacct gcagatgaac 120tccctgcgcg ccgaggacac cg 142<210>26<211>144<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26ctgcaaggat ccactcaccg gaggacacgg tcaccagggt gccctggccc cagtagtcgg 60aggagccgga gtagtggtcg tagcgcacgc agtagtacag ggcggtgtcc tcggcgcgca 120gggagttcat ctgcaggtac aggg144<210>27<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>27gccgccggag cggatg 16<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>28ctggagtggg tggcctccat 20<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>29tccgcaagct tgccgccac 19<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>30aattctagga tccactcacg cttgatctc 29<210>31<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31acagaaagct tgccgccacc atg 23<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>32ctgcaaggat ccactcaccg ga 22<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>內(nèi)肽(internal peptide)<400>33
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5 10<210>34<211>402<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>h3D6改型1 VL<400>34atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60tccggctacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag402<210>35<211>402<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>h3D6改型2 VL<400>35atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctga tgctgtgggt gtccggctcc 60tccggcgacg tggtgatgac ccagtccccc ctgtccctgc ccgtgacccc cggcgagccc 120gcctccatct cctgcaagtc ctcccagtcc ctgctggact ccgacggcaa gacctacctg 180aactggctgc tgcagaagcc cggccagtcc ccccagcgcc tgatctacct ggtgtccaag 240ctggactccg gcgtgcccga ccgcttctcc ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg 300aagatctccc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgctggca gggcacccac 360ttcccccgca ccttcggcca gggcaccaag gtggagatca ag402<210>36<211>414<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>h3D6改型1 VH<400>36atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaacg ccaagaactc cctgtacctg 300cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccctgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 414<210>37<211>414<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>h3D6改型2 VH<400>37atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 300cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc<210>38<211>770<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>38Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg1 5 10 15Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro20 25 30Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln35 40 45Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp50 55 60Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu65 70 75 80Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn85 90 95Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val100 105 110Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu115 120 125Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys130 135 140Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu145 150 155 160Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile165 170 175Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu180 185 190Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val195 200 205Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys210 215 220Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu225 230 235 240Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu245 250 255Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile260 265 270Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg275 280 285Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile290 295 300
Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe305 310 315 320Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr325 330 335Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr340 345 350Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala355 360 365Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp370 375 380Glu Ash Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala385 390 395 400Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala405 410 415Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile420 425 430Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn435 440 445Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met450 455 460Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu465 470 475 480Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys485 490 495Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe500 505 510Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser515 520 525Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser530 535 540Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp545 550 555 560Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val565 570 575Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala580 585 590Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro595 600 605Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe610 615 620Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val625 630 635 640Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser645 650 655Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp660 665 670Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu675 680 685Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly690 695 700Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu705 710 715 720Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val725 730 735Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met740 745 750Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met755 760 765
Gln Asn770<210>39<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>39acttatatct gtttt 15<210>40<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>40acttatacac tttgt 15<210>41<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>41acttatgttc attst 15<210>42<211>16<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>42acttatgccc attgtt16<210>43<211>15<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>43acttatatat attgt 15
<210>44<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>44acttatgkyy attg 14<210>45<211>15<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>45acttatgtat acayw 15<210>46<211>15<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>46acttatggct ymtct15<210>47<211>13<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>47acttattccc att 13<210>48<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>48acttatatgt tctc 14<210>49<211>14
<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>49acttataccc attt 14<210>50<211>11<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>50ggacggttgg g 11<210>51<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>51acttataggg tttt 14<210>52<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>52acttatgggr tttt 14<210>53<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>53acttatatgt agtt 14<210>54<211>13<212>DNA<213><213>人工序列
<220>
<223>引物<400>54acttatatgt gtt 13<210>55<211>15<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>55acttatacgt atttt 15<210>56<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>56acttatctts tttg14<210>57<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>57acttatrggg tttt14<210>58<211>13<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>58acttatgttt ttg 13<210>59<211>15<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物
<400>59acttatmgtg mtttt 15<210>60<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>60acttatggtc tctt 14<210>61<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>61acttatatgt tttt 14<210>62<211>14<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>62acttattttg ttat 14<210>63<211>11<212>DNA<213><213>人工序列<220>
<223>引物<400>63ggacgggaca g
權(quán)利要求
1.一種人源化免疫球蛋白輕鏈，其含有(i)來(lái)自3D6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO2的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6輕鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基選自(a)直接非共價(jià)結(jié)合抗原的殘基；(b)與CDR區(qū)鄰近的殘基；(c)與CDR相互作用的殘基；和(d)參與VL-VH界面的殘基。
2.一種人源化免疫球蛋白重鏈，其含有(i)來(lái)自3D6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO4的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基選自(a)直接非共價(jià)結(jié)合抗原的殘基；(b)與CDR區(qū)鄰近的殘基；(c)與CDR相互作用的殘基；和(d)參與VL-VH界面的殘基。
3.如權(quán)利要求1中所述的輕鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)建立3D6輕鏈基于1CR9的解開結(jié)構(gòu)的模型來(lái)進(jìn)行確定。
4.如權(quán)利要求1中所述的輕鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)建立3D6輕鏈基于1NLD的解開結(jié)構(gòu)的模型來(lái)進(jìn)行確定。
5.如權(quán)利要求2中所述的重鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)建立3D6重鏈基于1OPG的解開結(jié)構(gòu)的模型來(lái)進(jìn)行確定。
6.一種人源化免疫球蛋白輕鏈，含有(i)來(lái)自3D6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO2的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6輕鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基是一個(gè)如3D6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的三維模型分析所鑒定的能影響輕鏈可變區(qū)構(gòu)象或功能的殘基。
7.一種人源化免疫球蛋白重鏈，含有(i)來(lái)自3D6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO4的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠3D6重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基是一個(gè)如3D6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的三維模型分析所鑒定的能影響重鏈可變區(qū)構(gòu)象或功能的殘基。
8.如權(quán)利要求6中所述的輕鏈，其中所述的構(gòu)架殘基選自能夠與抗原相互作用的殘基、近接于抗原結(jié)合位點(diǎn)的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、與CDR相鄰的殘基、在離CDR殘基6內(nèi)的殘基、規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、鏈間包裝殘基、稀有殘基或在結(jié)構(gòu)模型表面的糖基化位點(diǎn)的殘基。
9.如權(quán)利要求7中所述的重鏈，其中所述的構(gòu)架殘基選自能夠與抗原相互作用的殘基、近接于抗原結(jié)合位點(diǎn)的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、與CDR相鄰的殘基、在離CDR殘基6內(nèi)的殘基、規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、鏈間包裝殘基、不常見的殘基或在結(jié)構(gòu)模型表面的糖基化位點(diǎn)的殘基。
10.如權(quán)利要求6或8中所述的輕鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)建立3D6輕鏈基于1CR9的解開結(jié)構(gòu)的模型來(lái)進(jìn)行確定。
11.如權(quán)利要求6或8中所述的輕鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)建立3D6輕鏈基于1NLD的解開結(jié)構(gòu)的模型來(lái)進(jìn)行確定。
12.如權(quán)利要求7或9中所述的重鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)建立3D6重鏈基于1OPG的解開結(jié)構(gòu)的模型來(lái)進(jìn)行確定。
13.一種人源化免疫球蛋白輕鏈，其含有(i)來(lái)自3D6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO2的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基選自L1、L2、L36和L46(Kabat編號(hào)規(guī)則)用來(lái)自小鼠3D6輕鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)氨基酸取代。
14.一種人源化免疫球蛋白重鏈，其含有(i)來(lái)自3D6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO4的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基選自H49、H93和H94(Kabat編號(hào)規(guī)則)用來(lái)自小鼠3D6重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)氨基酸取代。
15.如權(quán)利要求1、3、4、6、8、10、11和13中任一項(xiàng)所述的輕鏈，其中人受體輕鏈屬于亞型κ II(Kabat規(guī)則)。
16.如權(quán)利要求2、5、7、9、12和14中任一項(xiàng)所述的重鏈，其中人受體重鏈屬于亞型III(Kabat規(guī)則)。
17.如權(quán)利要求15中所述的輕鏈，其中的人受體輕鏈選自KabatID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID 005058、Kabat ID 005057、KabatID 005059、Kabat ID U21040和Kabat ID U41645。
18.如權(quán)利要求15中所述的輕鏈，其中的人受體輕鏈?zhǔn)荎abat ID019230。
19.如權(quán)利要求16中所述的重鏈，其中的人受體重鏈選自KabatID 045919、Kabat ID 000459、Kabat ID 000553、Kabat ID 000386和Kabat ID M23691。
20.如權(quán)利要求16中所述的重鏈，其中的人受體重鏈?zhǔn)荎abat ID045919。
21.如權(quán)利要求1、3、4、6、8、10、11、13、15、17和18中任一項(xiàng)所述的輕鏈，其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用人可變輕鏈序列的普通氨基酸殘基在該位置進(jìn)行取代。
22.如權(quán)利要求1、3、4、6、8、10、11、13、15、17和18中任一項(xiàng)所述的輕鏈，其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用來(lái)自種系可變輕鏈序列的相應(yīng)氨基酸殘基進(jìn)行取代。
23.如權(quán)利要求22中所述的輕鏈，其中的種系可變輕鏈序列選自A1、A17、A18、A2和A19。
24.如權(quán)利要求2、5、7、9、12、14、16、19和20中任一項(xiàng)所述的重鏈、其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用人可變重鏈序列的普通氨基酸殘基在該位置進(jìn)行取代。
25.如權(quán)利要求2、5、7、9、12、14、16、19和20中任一項(xiàng)所述的重鏈、其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用來(lái)自種系可變重鏈序列的相應(yīng)氨基酸殘基進(jìn)行取代。
26.如權(quán)利要求25中所述的重鏈，其中的種系可變重鏈序列選自VH3-48、VH3-23、VH3-7、VH3-21和VH3-11。
27.如權(quán)利要求25中所述的重鏈，其中的種系可變重鏈序列是VH3-23。
28.如權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)所述的輕鏈，其中的稀有構(gòu)架殘基選擇基于輕鏈可變區(qū)亞組中的人輕鏈可變區(qū)在該位置的出現(xiàn)小于10％，而普通殘基選擇基于輕鏈可變區(qū)亞組中的人輕鏈可變區(qū)在該位置的出現(xiàn)超過(guò)50％。
29.如權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)所述的重鏈，其中的稀有構(gòu)架殘基選擇基于重鏈可變區(qū)亞組中的人重鏈可變區(qū)在該位置的出現(xiàn)小于10％，而普通殘基選擇基于重鏈可變區(qū)亞組中的人重鏈可變區(qū)在該位置的出現(xiàn)超過(guò)50％。
30.一種輕鏈，其包含來(lái)自單克隆抗體3D6輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和可變區(qū)構(gòu)架殘基L1、L2、L36和L46(Kabat編號(hào)規(guī)則)，其中輕鏈的其它部分來(lái)自人免疫球蛋白。
31.一種重鏈，其包含來(lái)自單克隆抗體3D6重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和可變構(gòu)架殘基H49、H93和H94(Kabat編號(hào)規(guī)則)，其中重鏈的其它部分來(lái)自人免疫球蛋白。
32.一種包含如權(quán)利要求1、3、4、6、8、10、11、13、15、17和18中任一項(xiàng)所述的輕鏈和如權(quán)利要求2、5、7、9、12、14、16、19和20中任一項(xiàng)所述的重鏈的人源化免疫球蛋白，或所述免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段。
33.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少107M-1的結(jié)合親合力。
34.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少108M-1的結(jié)合親合力。
35.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少109M-1的結(jié)合親合力。
36.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其中的重鏈同種型是γ1。
37.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其結(jié)合于可溶性β淀粉樣肽(Aβ)和聚集的Aβ。
38.如權(quán)利要求37中所述的免疫球蛋白，其中的可溶性β淀粉樣肽(Aβ)是非聚集的Aβ。
39.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其介導(dǎo)β淀粉樣肽(Aβ)的吞噬作用。
40.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其在受試者中越過(guò)血腦屏障。
41.如權(quán)利要求32中所述的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其減少受試者的β淀粉樣肽(Aβ)沉積和神經(jīng)炎性營(yíng)養(yǎng)不良。
42.一種含有人源化重鏈和人源化輕鏈的人源化免疫球蛋白，其中(a)人源化輕鏈包含3個(gè)具有來(lái)自小鼠3D6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO2的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)和1個(gè)來(lái)自人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架，條件是至少一個(gè)選自包括L1、L2、L36和L46(Kabat編號(hào)規(guī)則)的第一組的位置被小鼠3D6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)構(gòu)架的同等位置的相同氨基酸占據(jù)；和(b)人源化重鏈包含3個(gè)具有來(lái)自小鼠3D6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)SEQ ID NO4的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)和1個(gè)來(lái)自人重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架，條件是至少一個(gè)選自包括H49、H93和H94(Kabat編號(hào)規(guī)則)的第二組的位置被小鼠3D6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)構(gòu)架的同等位置的相同氨基酸占據(jù)；其中人源化免疫球蛋白特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少107M-1的結(jié)合親合力，其中3D6免疫球蛋白具有可變區(qū)SEQ ID NO2的輕鏈和可變區(qū)SEQ ID NO4的重鏈。
43.如權(quán)利要求42中所述的人源化免疫球蛋白，其中的人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自κ輕鏈可變區(qū)。
44.如權(quán)利要求42中所述的人源化免疫球蛋白，其中的人重鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自IgG1重鏈可變區(qū)。
45.如權(quán)利要求42中所述的人源化免疫球蛋白，其中的人源化輕鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自選自Kabat ID 019230、Kabat ID 005131、Kabat ID005058、Kabat ID 005057、Kabat ID 005059、Kabat ID U21040和KabatID U41645的輕鏈。
46.如權(quán)利要求42中所述的人源化免疫球蛋白，其中的人源化重鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自選自Kabat ID 045919、Kabat ID 000459、Kabat ID000553、Kabat ID 000386和Kabat ID M23691的重鏈。
47.如權(quán)利要求42中所述的人源化免疫球蛋白，其中的人源化輕鏈可變區(qū)構(gòu)架除來(lái)自第一組的位置之外與Kabat ID 019230輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列相同，以及重鏈可變區(qū)構(gòu)架除來(lái)自第二組的位置之外與Kabat ID 045919重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列相同。
48.如權(quán)利要求42中所述的人源化免疫球蛋白，其中的人源化輕鏈含有與小鼠3D6重鏈的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)相同的互補(bǔ)決定區(qū)，以及人源化重鏈含有與小鼠3D6重鏈的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)相同的互補(bǔ)決定區(qū)。
49.一種含有3D6可變輕鏈區(qū)序列SEQ ID NO2的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)的人源化抗體。
50.一種含有3D6可變輕鏈區(qū)序列SEQ ID NO4的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)的人源化抗體。
51.一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，包括一個(gè)含有對(duì)應(yīng)于小鼠3D6抗體CDR的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的可變區(qū)。
52.一種人源化抗體，其結(jié)合β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少107M-1的親合力，其包括(a)一個(gè)含有鼠3D6互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸殘基和人VL亞組II可變區(qū)構(gòu)架區(qū)(FR)氨基酸殘基的輕鏈可變區(qū)；和(b)一個(gè)含有鼠3D6互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)氨基酸殘基和人VH亞組III可變區(qū)構(gòu)架區(qū)(FR)氨基酸殘基的重鏈可變區(qū)。
53.一種嵌合免疫球蛋白，其含有來(lái)自3D6免疫球蛋白可變區(qū)序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的可變區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和來(lái)自人受體免疫球蛋白的可變構(gòu)架區(qū)。
54.一種免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其含有如SEQ ID NO8所述的可變重鏈區(qū)和如SEQ ID NO5所述的可變輕鏈區(qū)。
55.一種免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其含有如SEQ ID NO12所述的可變重鏈區(qū)和如SEQ ID NO11所述的輕鏈區(qū)。
56.一種免疫球蛋白，其含有如SEQ ID NO8所述的可變重鏈區(qū)、如SEQ ID NO5所述的可變輕鏈區(qū)和來(lái)自IgG1的恒定區(qū)。
57.一種免疫球蛋白，其含有如SEQ ID NO12所述的可變重鏈區(qū)、如SEQ ID NO11所述的輕鏈區(qū)和來(lái)自IgG1的恒定區(qū)。
58.一種預(yù)防和治療患者的致淀粉樣疾病的方法，其包括給藥患者有效量的如權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的人源化免疫球蛋白。
59.一種預(yù)防和治療患者的阿耳茨海默氏病的方法，其包括給藥患者有效量的如權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的人源化免疫球蛋白。
60.如權(quán)利要求59中所述的方法，其中人源化免疫球蛋白的有效量為1mg/kg體重。
61.如權(quán)利要求59中所述的方法，其中人源化免疫球蛋白的有效量為10mg/kg體重。
62.一種含有如權(quán)利要求32-52中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白和藥用載體的藥物組合物。
63.一種分離的多肽，其含有選自SEQ ID NO2的第24-39位氨基酸、SEQ ID NO2的第55-61位氨基酸和SEQ ID NO2的第94-102位氨基酸的SEQ ID NO2的片段。
64.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO2的第24-39位氨基酸、SEQ ID NO2的第55-61位氨基酸和SEQ ID NO2的第94-102位氨基酸。
65.一種分離的多肽，其含有選自SEQ ID NO4的第31-35位氨基酸、SEQ ID NO4的第50-66位氨基酸和SEQ ID NO4的第99-107位氨基酸的SEQ ID NO4的片段。
66.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO4的第31-35位氨基酸、SEQ ID NO4的第50-66位氨基酸和SEQ ID NO4的第99-107位氨基酸。
67.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
68.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO4的氨基酸序列。
69.一種含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽變體，所述的變體包含至少一個(gè)保守的氨基酸取代，其中的變體保留直接特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)的能力，具有至少107M-1的結(jié)合親合力。
70.一種含有SEQ ID NO4的氨基酸序列的多肽變體，所述的變體包含至少一個(gè)保守的氨基酸取代，其中的變體保留特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)的能力，具有至少107M-1的結(jié)合親合力。
71.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO2氨基酸序列的第1-112位殘基或含有SEQ ID NO4氨基酸序列的第1-119位殘基。
72.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求1、3、4、6、8、10、、11、13、15、17和18中任一項(xiàng)所述的輕鏈。
73.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求2、5、7、9、12、14、16、19和20中任一項(xiàng)所述的重鏈。
74.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求64-71中任一項(xiàng)所述的多肽。
75.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求32-57中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白。
76.一種分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO1或3的核苷酸序列。
77.一種載體，其含有如權(quán)利要求72-76中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
78.一種宿主細(xì)胞，其含有如權(quán)利要求72-76中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
79.一種制備抗體或其片段的方法，其包括在使得抗體或片段能夠產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求45中所述的宿主細(xì)胞并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中分離所述的抗體。
80.一種制備抗體或其片段的方法，所述方法包括在使得抗體或片段可產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)表達(dá)編碼所述抗體或片段的核酸分子的宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中分離所述的抗體或片段，其中所述的抗體或片段含有SEQ ID NO2的第24-39位氨基酸、SEQ ID NO2的第55-61位氨基酸和SEQ ID NO2的第94-102位氨基酸。
81.一種制備抗體或其片段的方法，所述方法包括在使得抗體或片段可產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)表達(dá)編碼所述抗體或片段的核酸分子的宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中分離所述的抗體或片段，其中所述的抗體或片段含有SEQ ID NO4的第31-35位氨基酸、SEQ ID NO4的第50-66位氨基酸和SEQ ID NO4的第99-112位氨基酸。
82.一種鑒定人源化3D6免疫球蛋白可變構(gòu)架區(qū)中負(fù)責(zé)取代的殘基的方法，其包括基于解開的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)建立3D6可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)模型并分析所述模型的能夠影響3D6免疫球蛋白可變區(qū)構(gòu)象或功能的殘基，從而負(fù)責(zé)取代的殘基得到鑒定。
83.如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所述的可變區(qū)或其任意部分在產(chǎn)生3D6免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其結(jié)構(gòu)域的三維圖像中的應(yīng)用。
84.一種人源化免疫球蛋白輕鏈，其含有(i)來(lái)自10D5免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO14的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠10D5輕鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基選自(a)直接非共價(jià)結(jié)合抗原的殘基；(b)與CDR區(qū)鄰近的殘基；(c)與CDR相互作用的殘基；和(d)參與VL-VH界面的殘基。
85.一種人源化免疫球蛋白重鏈，其含有(i)來(lái)自10D5免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO16的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠10D5重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基選自(a)直接非共價(jià)結(jié)合抗原的殘基；(b)與CDR區(qū)鄰近的殘基；(c)與CDR相互作用的殘基；和(d)參與VL-VH界面的殘基。
86.如權(quán)利要求84中所述的輕鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)基于與10D5輕鏈具有至少70％的序列同一性的鼠免疫球蛋白輕鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5輕鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
87.如權(quán)利要求84中所述的輕鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)基于與10D5輕鏈具有至少80％的序列同一性的鼠免疫球蛋白輕鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5輕鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
88.如權(quán)利要求84中所述的輕鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)基于與10D5輕鏈具有至少90％的序列同一性的鼠免疫球蛋白輕鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5輕鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
89.如權(quán)利要求85中所述的重鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)基于與10D5重鏈具有至少70％的序列同一性的鼠免疫球蛋白重鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5重鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
90.如權(quán)利要求85中所述的重鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)基于與10D5重鏈具有至少80％的序列同一性的鼠免疫球蛋白重鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5重鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
91.如權(quán)利要求85中所述的重鏈，其中與CDR相互作用的殘基通過(guò)基于與10D5重鏈具有至少90％的序列同一性的鼠免疫球蛋白重鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5重鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
92.一種人源化免疫球蛋白輕鏈，其含有(i)來(lái)自10D5免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO14的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白輕鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠10D5輕鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基是一個(gè)如10D5免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的三維模型分析所鑒定的能影響輕鏈可變區(qū)構(gòu)象或功能的殘基。
93.一種人源化免疫球蛋白重鏈，其含有(i)來(lái)自10D5免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO16的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，和(ii)來(lái)自人受體免疫球蛋白重鏈序列的可變構(gòu)架區(qū)，條件是至少一個(gè)構(gòu)架殘基用來(lái)自小鼠10D5重鏈可變區(qū)序列的相應(yīng)的氨基酸殘基取代，其中的構(gòu)架殘基是一個(gè)如10D5免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的三維模型分析所鑒定的能影響重鏈可變區(qū)構(gòu)象或功能的殘基。
94.如權(quán)利要求92中所述的輕鏈，其中所述的構(gòu)架殘基選自能夠與抗原相互作用的殘基、近接于抗原結(jié)合位點(diǎn)的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、與CDR相鄰的殘基、在離CDR殘基6內(nèi)的殘基、規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、鏈間包裝殘基、稀有殘基或在結(jié)構(gòu)模型表面上的糖基化位點(diǎn)殘基。
95.如權(quán)利要求93中所述的重鏈，其中所述的構(gòu)架殘基選自能夠與抗原相互作用的殘基、近接于抗原結(jié)合位點(diǎn)的殘基、能夠與CDR相互作用的殘基、與CDR相鄰的殘基、在離CDR殘基6內(nèi)的殘基、規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、鏈間包裝殘基、稀有殘基或在結(jié)構(gòu)模型表面上的糖基化位點(diǎn)殘基。
96.如權(quán)利要求92或94中所述的輕鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)基于與10D5輕鏈具有至少70％的序列同一性的鼠免疫球蛋白輕鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5輕鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
97.如權(quán)利要求92或94中所述的輕鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)基于與10D5輕鏈具有至少80％的序列同一性的鼠免疫球蛋白輕鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5輕鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
98.如權(quán)利要求92或94中所述的輕鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)基于與10D5輕鏈具有至少90％的序列同一性的鼠免疫球蛋白輕鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5輕鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
99.如權(quán)利要求93或95中所述的重鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)基于與10D5重鏈具有至少70％的序列同一性的鼠免疫球蛋白重鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5重鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
100.如權(quán)利要求93或95中所述的重鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)基于與10D5重鏈具有至少80％的序列同一性的鼠免疫球蛋白重鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5重鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
101.如權(quán)利要求93或95中所述的重鏈，其中的構(gòu)架殘基通過(guò)基于與10D5重鏈具有至少90％的序列同一性的鼠免疫球蛋白重鏈的解開結(jié)構(gòu)建立10D5重鏈模型來(lái)進(jìn)行鑒定。
102.如權(quán)利要求84、86-88、92、94和96-98中任一項(xiàng)所述的輕鏈，其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用人可變輕鏈序列的普通氨基酸殘基在該位置進(jìn)行取代。
103.如權(quán)利要求84、86-88、92、94和96-98中任一項(xiàng)所述的輕鏈，其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用來(lái)自種系可變輕鏈序列的相應(yīng)氨基酸殘基進(jìn)行取代。
104.如權(quán)利要求103中所述的輕鏈，其中種系可變輕鏈序列是與可變輕鏈序列具有至少70％的序列同一性的免疫球蛋白的可變輕鏈序列。
105.如權(quán)利要求103中所述的輕鏈，其中種系可變輕鏈序列是與可變輕鏈序列具有至少80％的序列同一性的免疫球蛋白的可變輕鏈序列。
106.如權(quán)利要求103中所述的輕鏈，其中種系可變輕鏈序列是與可變輕鏈序列具有至少90％的序列同一性的免疫球蛋白的可變輕鏈序列。
107.如權(quán)利要求85、89-91、93和99-101中任一項(xiàng)所述的重鏈，其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用人可變重鏈序列的普通氨基酸殘基在該位置進(jìn)行取代。
108.如權(quán)利要求85、89-91、93和99-101中任一項(xiàng)所述的重鏈，其中至少一個(gè)稀有人構(gòu)架殘基用來(lái)自種系可變重鏈序列的相應(yīng)氨基酸殘基進(jìn)行取代。
109.如權(quán)利要求108中所述的重鏈，其中種系可變重鏈序列是可變重鏈序列SEQ ID NO16或與可變重鏈序列SED ID NO16具有至少70％的同一性。
110.如權(quán)利要求108中所述的重鏈，其中種系可變重鏈序列是可變重鏈序列SEQ ID NO16或與可變重鏈序列SED ID NO16具有至少80％的同一性。
111.如權(quán)利要求108中所述的重鏈，其中種系可變重鏈序列是可變重鏈序列SEQ ID NO16或與可變重鏈序列SED ID NO16具有至少90％的同一性。
112.如權(quán)利要求102-106中任一項(xiàng)所述的輕鏈，其中稀有構(gòu)架殘基選擇基于輕鏈可變區(qū)亞組中的人輕鏈可變區(qū)序列在該位置的出現(xiàn)小于10％，以及普通殘基選擇基于輕鏈可變區(qū)亞組中的人輕鏈可變區(qū)在該位置的出現(xiàn)超過(guò)50％。
113.如權(quán)利要求107-111中任一項(xiàng)所述的重鏈，其中稀有構(gòu)架殘基選擇基于重鏈可變區(qū)亞組中的人重鏈可變區(qū)序列在該位置的出現(xiàn)小于10％，以及普通殘基選擇基于重鏈可變區(qū)亞組中的人重鏈可變區(qū)在該位置的出現(xiàn)超過(guò)50％。
114.一種包含如權(quán)利要求84、86-88、92、94和96-98中任一項(xiàng)所述的輕鏈和如權(quán)利要求85、89-91、93和99-101中任一項(xiàng)所述的重鏈的人源化免疫球蛋白，或所述免疫球蛋白的抗原結(jié)合片段。
115.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少10-7M的結(jié)合親合力。
116.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少10-8M的結(jié)合親合力。
117.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少10-9M的結(jié)合親合力。
118.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其中重鏈同種型是γ1。
119.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其結(jié)合于聚集的β淀粉樣肽(Aβ)。
120.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其介導(dǎo)β淀粉樣肽(Aβ)的吞噬作用。
121.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其在受試者中越過(guò)血腦屏障。
122.如權(quán)利要求114中所述的人源化免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段，其減少受試者中β淀粉樣肽(Aβ)沉積。
123.一種含有人源化重鏈和人源化輕鏈的人源化免疫球蛋白，其中(a)人源化輕鏈包含3個(gè)具有來(lái)自小鼠10D5免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)SEQ ID NO14的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)和1個(gè)來(lái)自人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架，條件是至少一個(gè)選自規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、包裝殘基、稀有殘基的構(gòu)架殘基被小鼠10D5免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)構(gòu)架的同等位置的相同氨基酸殘基占據(jù)；和(b)人源化重鏈包含3個(gè)具有來(lái)自小鼠10D5免疫球蛋白重鏈可變區(qū)SEQ ID NO16的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)和1個(gè)來(lái)自人重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架，條件是至少一個(gè)選自包括規(guī)范的殘基、游標(biāo)區(qū)殘基、包裝殘基、稀有殘基的第二組的構(gòu)架殘基被小鼠10D5免疫球蛋白重鏈可變區(qū)構(gòu)架的同等位置的相同氨基酸占據(jù)；其中人源化免疫球蛋白特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，具有至少107M-1的結(jié)合親合力，其中10D免疫球蛋白具有可變區(qū)SEQ ID NO14的輕鏈和可變區(qū)SEQ ID NO16的重鏈。
124.如權(quán)利要求123中所述的人源化免疫球蛋白，其中人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自κ輕鏈可變區(qū)。
125.如權(quán)利要求123中所述的人源化免疫球蛋白，其中人重鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自IgG1重鏈可變區(qū)。
126.如權(quán)利要求123中所述的人源化免疫球蛋白，其中輕鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自與10D5免疫球蛋白的輕鏈序列具有至少70％的序列同一性的人免疫球蛋白輕鏈。
127.如權(quán)利要求123中所述的人源化免疫球蛋白，其中重鏈可變區(qū)構(gòu)架來(lái)自與10D5免疫球蛋白的重鏈序列具有至少70％的序列同一性的人免疫球蛋白重鏈。
128.如權(quán)利要求123中所述的人源化免疫球蛋白，其中人源化輕鏈含有與小鼠10D5重鏈的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)相同的互補(bǔ)決定區(qū)，以及人源化重鏈含有與小鼠10D5重鏈的相應(yīng)互補(bǔ)決定區(qū)相同的互補(bǔ)決定區(qū)。
129.一種人源化抗體，其含有10D5可變輕鏈序列SEQ ID NO14的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)。
130.一種人源化抗體，其含有10D5可變重鏈序列SEQ ID NO16的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)。
131.一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合于β淀粉樣肽(Aβ)，包括一個(gè)含有對(duì)應(yīng)于小鼠10D5抗體CDR的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的可變區(qū)。
132.一種嵌合免疫球蛋白，其含有基本上如SEQ ID NO14或SEQID NO16所述的可變區(qū)序列和來(lái)自人免疫球蛋白的恒定區(qū)序列。
133.一種預(yù)防和治療患者的致淀粉樣疾病的方法，其包括給藥患者有效量的如權(quán)利要求114-131中任一項(xiàng)所述的人源化免疫球蛋白。
134.一種預(yù)防和治療患者的阿耳茨海默氏病的方法，其包括給藥患者有效量的如權(quán)利要求114-131中任一項(xiàng)所述的人源化免疫球蛋白。
135.如權(quán)利要求134中所述的方法，其中人源化免疫球蛋白的有效量為1mg/kg體重。
136.如權(quán)利要求134中所述的方法，其中人源化免疫球蛋白的有效量為10mg/kg體重。
137.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求114-131中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白和藥用載體。
138.一種分離的多肽，其含有選自SEQ ID NO2的第24-39位氨基酸、SEQ ID NO2的第55-61位氨基酸和SEQ ID NO2的第94-102位氨基酸的SEQ ID NO2的片段。
139.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO2的第24-39位氨基酸、SEQ ID NO2的第55-61位氨基酸和SEQ ID NO2的第94-102位氨基酸。
140.一種分離的多肽，其含有選自SEQ ID NO4的第31-37位氨基酸、SEQ ID NO4的第52-67位氨基酸和SEQ ID NO4的第100-112位氨基酸的SEQ ID NO4的片段。
141.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO4的第31-37位氨基酸、SEQ ID NO4的第52-67位氨基酸和SEQ ID NO4的第100-112位氨基酸。
142.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO14的氨基酸序列。
143.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO16的氨基酸序列。
144.一種含有氨基酸序列SEQ ID NO14的多肽變體，所述變體包含至少一個(gè)保守的氨基酸取代，其中的變體保留直接特異性結(jié)合β淀粉樣肽(Aβ)的能力，具有至少10-7M的結(jié)合親合力。
145.一種含有氨基酸序列SEQ ID NO16的多肽變體，所述變體包含至少一個(gè)保守的氨基酸取代，其中的變體保留直接特異性結(jié)合β淀粉樣肽(Aβ)的能力，具有至少10-7M的結(jié)合親合力。
146.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NO14氨基酸序列的第1-112位殘基或含有SEQ ID NO16氨基酸序列的第1-123位殘基。
147.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求84、86-88、92、94和96-980中任一項(xiàng)所述的輕鏈。
148.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求85、89-91、93和99-101中任一項(xiàng)所述的重鏈。
149.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求139-146中任一項(xiàng)所述的多肽。
150.一種分離的核酸分子，其編碼如權(quán)利要求114-1327中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白。
151.一種分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO13或15的核苷酸序列。
152.一種載體，其含有如權(quán)利要求147-151中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
153.一種宿主細(xì)胞，其含有如權(quán)利要求147-151中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
154.一種制備抗體或其片段的方法，其包括在使得抗體或片段能夠產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求153中所述的宿主細(xì)胞并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中分離所述的抗體。
155.一種制備抗體或其片段的方法，所述方法包括在使得抗體或片段可產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)表達(dá)編碼所述抗體或片段的核酸分子的宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中分離所述的抗體，其中所述的抗體或片段含有SEQ ID NO2的第24-39位氨基酸、SEQ ID NO2的第55-61位氨基酸和SEQ ID NO2的第94-102位氨基酸。
156.一種制備抗體或其片段的方法，所述方法包括在使得抗體或片段可產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)表達(dá)編碼所述抗體或片段的核酸分子的宿主細(xì)胞，并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物中分離所述的抗體，其中所述的抗體或片段含有SEQ ID NO4的第31-37位氨基酸、SEQ ID NO4的第52-67位氨基酸和SEQ ID NO4的第100-112位氨基酸。
157.一種鑒定在人源化10D5免疫球蛋白可變構(gòu)架區(qū)中負(fù)責(zé)取代的殘基的方法，其包括基于解開的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)建立10D5可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)的模型并分析所述模型的能夠影響10D5免疫球蛋白可變區(qū)構(gòu)象或功能的殘基，從而負(fù)責(zé)取代的殘基得到鑒定。
158.如SEQ ID NO14或SEQ ID NO16所述的可變區(qū)序列或其任意部分在產(chǎn)生10D5免疫球蛋白、10D5免疫球蛋白鏈或其結(jié)構(gòu)域的三維圖像中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了改進(jìn)的藥劑和方法，用于治療與患者腦中的Aβ淀粉樣沉積物相關(guān)的疾病。優(yōu)選的藥劑包括人源化抗體。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1541225SQ01820170
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2001年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月6日
發(fā)明者古里奇·巴錫, 古里奇 巴錫, 喬斯·薩爾達(dá)尼亞, 薩爾達(dá)尼亞, 特德·耶德諾克, 耶德諾克 申請(qǐng)人:神經(jīng)實(shí)驗(yàn)室有限公司, 惠氏公司