專利名稱：鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域。具體涉及一種鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體及制備方法。
人內(nèi)皮抑素作為一種抗癌新藥，它的應用途徑是多樣的，在新藥開發(fā)中，對于質(zhì)量控制、臨床觀察等方面的監(jiān)控方法用單克隆抗體來鑒別，其方法簡便、靈敏度高、特異性強，具有其很大的實用價值。據(jù)專利檢索，迄今為止在國內(nèi)外未有該抗體的專利或專利申請。
自1975年B淋巴細胞雜交瘤細胞融合技術問世以來，單克隆抗體作為臨床診斷、臨床治療和預防的新型產(chǎn)物，其運用價值和開發(fā)前景已獲得了普遍的肯定。
本發(fā)明提供了一種鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體；該抗體為一種鼠源性的雜交瘤細胞，且能穩(wěn)定分泌抗人內(nèi)皮抑素的抗體，并能與人內(nèi)皮抑素起免疫反應，屬鼠Ig-G型。
本發(fā)明利用B淋巴細胞雜交瘤細胞融合技術，獲得了鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體。并建立了能穩(wěn)定分泌該抗體的細胞株。
本發(fā)明的另一所要解決的技術問題是提供了上述一種鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體的制備方法，該方法包括下列步驟(1)動物免疫用大腸桿菌表達的人內(nèi)皮抑素作為抗原，加入佛氏佐劑，免疫BALB/c小鼠。經(jīng)三針的免疫后，用免疫雙擴散法，測得小鼠血清中有1∶4以上的免疫應答，將抗原(人內(nèi)皮抑素)通過SDS凝膠電泳和免疫印記法，確定其血清中與人內(nèi)皮抑素20kb左右有免疫應答；(2)細胞融合選用SP2/0細胞株，作為融合細胞，用1640培養(yǎng)液內(nèi)含15％新生小牛血清使SP2/0細胞增殖至2×107，與三天前加強免疫后的BALB/c小鼠的脾細胞108混合，在聚乙二醇(PEG1000)作用下，用1640培養(yǎng)液內(nèi)含12％胎牛血清及1％HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)懸浮融合細胞。分散于96孔細胞培養(yǎng)基中，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日觀察細胞生長情況，并換培養(yǎng)液，促其生長，待見融合細胞生長至1000個以上，取其培養(yǎng)上清液進行檢測；(3)篩選斑點免疫法的建立將抗原直接點在硝酸纖維膜上，每點1-2ul，用2％奶粉pH7.4PBS封閉，置37℃水浴2小時后，置于4℃可保存數(shù)月，將點樣膜背面做好標記，用同酶標板孔徑相同的打孔器，逐一將點樣膜置于酶標板內(nèi)。將培養(yǎng)上清(待檢樣品)，免疫小鼠血清(陽性對照)，正常鼠血清、培養(yǎng)液(陰性對照)，PBS(空白對照)，分別加入酶標板孔內(nèi)，100ul/孔，37℃水浴1小時。用2％奶粉pH7.4PBS洗滌三次。拋干后加入羊抗鼠IgG-HRP，80ul/孔，37℃水浴1小時，用2％奶粉pH7.4PBS洗滌三次后，再用0.05MpH7.4Tris-HCl洗滌一次。加0.06％DAB顯色。用此方法可以清楚的看到陽性對照樣品中有棕色的點樣大小斑點，而陰性對照及空白對照均無色。挑選出斑點深的陽性孔細胞，用有限稀釋法進行稀釋，將細胞進行克隆化培養(yǎng)。經(jīng)過4次百分之百的陽性克隆化培養(yǎng)，細胞轉到100ml方瓶培養(yǎng)，將其分裝若干支，凍存于-196℃液氮罐中；(4)制備抗體選用BALB/c小鼠所繁殖的子一代，F(xiàn)-1小鼠，20克左右，先期2周注射液體石蠟油，0.5ml/只，將建株細胞擴大培養(yǎng)后收集細胞，用無菌生理鹽水洗滌一次后，配成1×106/ml懸液，每只小鼠注射0.5ml細胞懸液，待10日左右，小鼠腹部隆起脹大，行動遲緩時，拉頸致死，破腹吸取腹水，離心后取上清部分，平均每鼠可產(chǎn)腹水2-5ml，置-20℃以下保存。
用本發(fā)明方法制得得鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體進行了特異性、靈敏度、效價和穩(wěn)定性測定，結果如下特異性將抗原進行SDS凝膠電泳和免疫印跡，用單克隆抗體腹水或培養(yǎng)上清作為第一抗體與膜反應，置37℃水浴1小時，用2％奶粉PH7.4PBS洗滌后，再經(jīng)羊抗鼠IgG-HRP作為第二抗體與膜反應，置37℃水浴1小時，用2％奶粉PH7.4PBS洗滌后，通過DAB顯色，均在20kb左右有一帶棕色顯色帶。證明該抗體有良好的特異性。
靈敏度將人內(nèi)皮抑素0.3mg/ml，進行系列稀釋1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320，分別點于硝酸纖維膜上，1.5ul/孔，用1∶50、1∶500、1∶1000，單克隆抗體腹水進行斑點免疫試驗。人內(nèi)皮抑素在1∶320倍時均可見有顯色反應。說明該抗體具有較高的靈敏度。
效價將人內(nèi)皮抑素0.3mg/ml直接點于硝酸纖維膜上，2ul/孔，單克隆抗體腹水作1∶1000、1∶5000、1∶20000、1∶100000進行斑點免疫試驗，在1∶20000處可見較深的顯色反應。說明該抗體有很高的效價。
穩(wěn)定性建株細胞在體外連續(xù)培養(yǎng)3個月，其培養(yǎng)上清仍可在斑點免疫試驗中檢測到陽性顯色。而腹水抗體在4℃中存放3個月以上，未見明顯的抗體效價下降。
本發(fā)明所要解決的再一技術問題是公開鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體對人內(nèi)皮抑素的定性、定量或純化。使用本發(fā)明的鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體可以對人內(nèi)皮抑素的定性或定量進行檢測，還可以用來制備親和層析柱純化內(nèi)皮抑素，或者標記熒光素或酶，制備熒光抗體和酶標抗體，用于免疫組化分析。
本抗體對內(nèi)皮抑素作為抗癌藥物的開發(fā)，可以提供有效的質(zhì)量控制手段；同時還能對病人的藥效進行監(jiān)控；還可以做成試劑，供科研、教學、臨床使用。社會效益和經(jīng)濟效益隨著內(nèi)皮抑素新藥的研發(fā)進展而逐顯價值。
圖3效價將人內(nèi)皮抑素0.3mg/ml直接點于硝酸纖維膜上，2ul/孔，單克隆抗體腹水A、腹水B作1∶1000、1∶5000、1∶20000、1∶100000、1∶500000進行斑點免疫試驗，在1∶20000處可見較深的顯色反應。說明該抗體有很高的效價。
效價將人內(nèi)皮抑素0.3mg/ml直接點于硝酸纖維膜上，2ul/孔，單克隆抗體腹水A、腹水B作1∶1000、1∶5000、1∶20000、1∶100000、1∶500000進行斑點免疫試驗，在1∶20000處可見較深的顯色反應。說明該抗體有很高的效價。
權利要求
1.一種鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體，其特征在于該抗體為一種鼠源性的雜交瘤細胞；能穩(wěn)定分泌人內(nèi)皮抑素；能與人內(nèi)皮抑素起免疫反應；并屬于鼠Ig-G型。
2.一種如權利要求1所述的一種鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)動物免疫用大腸桿菌表達的人內(nèi)皮抑素作為抗原，加入佛氏佐劑，免疫BALB/c小鼠。經(jīng)三針的免疫后，用免疫雙擴散法，測得小鼠血清中有1∶4以上的免疫應答，將抗原(人內(nèi)皮抑素)通過SDS凝膠電泳和免疫印記法，確定其血清中與人內(nèi)皮抑素20kb左右有免疫應答；(2)細胞融合選用SP2/0細胞株，作為融合細胞，用1640培養(yǎng)液內(nèi)含15％新生小牛血清使SP2/0細胞增殖至2×107，與三天前加強免疫后的BALB/c小鼠的脾細胞108混合，在聚乙二醇(PEG1000)作用下，用1640培養(yǎng)液內(nèi)含12％胎牛血清及1％HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)懸浮融合細胞。分散于96孔細胞培養(yǎng)基中，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日觀察細胞生長情況，并換培養(yǎng)液，促其生長，待見融合細胞生長至1000個以上，取其培養(yǎng)上清液進行檢測；(3)篩選斑點免疫法的建立將抗原直接點在硝酸纖維膜上，每點1-2ul，用2％奶粉pH7.4PBS封閉，置37℃水浴2小時后，置于4℃可保存數(shù)月，將點樣膜背面做好標記，用同酶標板孔徑相同的打孔器，逐一將點樣膜置于酶標板內(nèi)。將培養(yǎng)上清(待檢樣品)，免疫小鼠血清(陽性對照)，正常鼠血清、培養(yǎng)液(陰性對照)，PBS(空白對照)，分別加入酶標板孔內(nèi)，100ul/孔，37℃水浴1小時。用2％奶粉pH7.4PBS洗滌三次。拋干后加入羊抗鼠IgG-HRP，80ul/孔，37℃水浴1小時，用2％奶粉pH7.4PBS洗滌三次后，再用0.05MpH7.4Tris-HCl洗滌一次。加0.06％DAB顯色。用此方法可以清楚的看到陽性對照樣品中有棕色的點樣大小斑點，而陰性對照及空白對照均無色。挑選出斑點深的陽性孔細胞，用有限稀釋法進行稀釋，將細胞進行克隆化培養(yǎng)。經(jīng)過4次百分之百的陽性克隆化培養(yǎng)，細胞轉到100ml方瓶培養(yǎng)，將其分裝若干支，凍存于-196℃液氮罐中；(4)制備抗體選用BALB/c小鼠所繁殖的子一代，F(xiàn)-1小鼠，20克左右，先期2周注射液體石蠟油，0.5ml/只，將建株細胞擴大培養(yǎng)后收集細胞，用無菌生理鹽水洗滌一次后，配成1×106/ml懸液，每只小鼠注射0.5ml細胞懸液，待10日左右，小鼠腹部隆起脹大，行動遲緩時，拉頸致死，破腹吸取腹水，離心后取上清部分，平均每鼠可產(chǎn)腹水2-5ml，置-20℃以下保存。
3.一種如權利要1所述的一種鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體在對人內(nèi)皮抑素的定性、定量或純化中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域。本發(fā)明公開了一種鼠抗人內(nèi)皮抑素單克隆抗體，該抗體能與人內(nèi)皮抑素起免疫反應，具有良好的特異性、較高的靈敏度和穩(wěn)定性。本發(fā)明的抗體對內(nèi)皮抑素作為抗癌藥物的開發(fā)，可以提供質(zhì)控，并能做成有效的試劑，有較廣的應用價值。本發(fā)明提供了制備方法。
文檔編號C07K16/18GK1465595SQ0211210
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月18日 優(yōu)先權日2002年6月18日
發(fā)明者胡林達, 王嬿, 朱曦, 高之楨, 劉大濤, 姚義強 申請人:上海信誼藥業(yè)有限公司