專利名稱：抗乙肝病毒等包膜病毒感染的工程多肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工組合的抗病毒工程多肽及其制備方法，通過制備由不同的細菌毒素和可與病毒包膜抗原或受體特異結(jié)合的多肽，比如scFv結(jié)構(gòu)域組合成的工程多肽(Engineered peptide)來達到抗病毒目的。
目前抗病毒治療多從以下幾方面著手1，抑制病毒核酸，2，抑制病毒蛋白酶3，利用免疫因子殺傷，比如干擾素，4，利用病毒疫苗免疫等。
然而，在實際應(yīng)用中，病毒利用其突變特點往往很快就能讓上述治療手段失效。比如數(shù)年前投入使用的抗乙肝病毒藥物Laminvudine，剛開始使用時有效率幾達90％，然而僅僅經(jīng)過數(shù)年的臨床應(yīng)用，由于乙肝病毒的基因迅速發(fā)生突變，有效率從當初的90％左右降至只有10％左右。因此必需尋找其他更為有效的抗病毒途經(jīng)。
基于上述現(xiàn)狀，專利發(fā)明人認為應(yīng)該選擇病毒不易發(fā)生突變的結(jié)構(gòu)作為藥物作用的靶點來殺傷病毒，這樣才能從根本上避開現(xiàn)有抗病毒治療手段容易被病毒突變所破壞的致命弱點。
本發(fā)明針對現(xiàn)有抗病毒治療手段容易被病毒突變所破壞的致命弱點，提供一種特異而有效的抗病毒藥物及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是將可形成離子通道的大腸菌素(colicin El，Ia，Ib，A，B，N)或其通道結(jié)構(gòu)域和可與靶病毒包膜抗原或受體特異結(jié)合的多肽組合成工程多肽。在該工程多肽里，可與靶病毒包膜抗原或受體特異結(jié)合的多肽作為誘導物誘導大腸菌素通道結(jié)構(gòu)域到達靶病毒包膜附近，然后大腸菌素結(jié)構(gòu)域在包膜上形成離子通道，破壞包膜的完整性，病毒核糖核酸外泄或暴露從而殺傷病毒體。
該發(fā)明制備方法的獨創(chuàng)之處在于利用基因工程技術(shù)，將可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽基因插入到裝載在工程質(zhì)粒里的大腸菌素基因選定的位點上來組合該抗病毒工程多肽。另一獨創(chuàng)之處在于利用0.1-0.3M NaCl梯度洗脫自離子交換柱收獲制備的抗病毒工程多肽。制備方法中的其余流程采用專利發(fā)明人已發(fā)展成熟的技術(shù)流程(Qiu et al，Site-specific biotinylation of colicin Ia，a probe for proteinconformation in the membrane.J Biol Chem 2697483-7488(1994)，Qiu et al，Majortransmembrane movement associated with colicin Ia channel gatingJ.Gen.Physiology.107313-328(1996))。因此該制備方法的可行性及可靠性極高。該制備方法中技術(shù)路線的關(guān)鍵在于利用基因工程技術(shù)制備成人工組合抗菌工程多肽的質(zhì)粒，然后將突變好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到不含質(zhì)粒的工程菌里制備多肽和利用0.1-0.3MNaCl梯度洗脫自離子交換柱純化工程多肽。
可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽與大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域的組合方式可以有兩種，將多肽或結(jié)合在大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域的氨基端，或結(jié)合在大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域的羧基端，這樣便可以形成四種工程多肽。此外，可以通過改變工程多肽肽鏈的長度及氨基酸殘基組成來增強其抗病毒活性或減少可能出現(xiàn)的副作用。由于這樣的組成或改變將會增加或減少該工程多肽的氨基酸殘基數(shù)量，因此其分子量將會在5,000-100,000范圍內(nèi)變動。
每一種包膜病毒都有自己獨特的包膜抗原或受體，因此只要采用可與其特異結(jié)合的多肽與可形成離子通道的大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域連接，就可以組合成一種特異的、對抗該病毒的抗病毒工程多肽。也就是說，本發(fā)明的一大優(yōu)點是有可能通過更換多種可與不同病毒包膜抗原或受體結(jié)合的多肽來和大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域組成對抗任何一種包膜病毒的抗病毒藥物。
本發(fā)明的另一大優(yōu)點是制備的抗病毒工程多肽可直接在病毒體包膜上形成離子通道以破壞包膜的完整性，這種殺病毒方式與使用核酸類似物取代病毒DNA前體的核苷類藥物、抑制病毒蛋白酶藥物、干擾素及中藥等抑制病毒藥物、免疫抑制劑及基因工程核酸疫苗等傳統(tǒng)方法相比較，其好處在于它采用的是自然界經(jīng)過億萬年自然選擇優(yōu)選出來的一種最簡單有效殺滅生物體的機制，這種機制具有很高的靶向性，這樣就保證了該抗病毒工程多肽只殺死選定的病毒體而不傷害宿主細胞，從而最大限度的減小了上述傳統(tǒng)抗病毒藥物對宿主的毒副作用。
具體實施例方式
實施例1本實施例是將Gene Bank AF427148登錄的抗HBV PreS1 scFv基因連接到大腸菌素Ia通道結(jié)構(gòu)域的氨基端上，制備成人工組合的抗HBV工程多肽的質(zhì)粒，將突變好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到不含質(zhì)粒的工程菌里，將菌大量繁殖(4L FB培基，225rpm，37℃；6h)，離心沉淀菌體(4℃，6000g，20min)，取4℃、50mM硼酸緩沖液+2mM EDTA+2mM DTT50-80ml懸浮菌體，超聲破碎(4℃，40W，1-2min)，高速離心破碎菌體(4℃，70000g，1.5h)，取上清加入硫酸鏈霉素沉淀DAN，4℃、50mM硼酸緩沖液+2mM EDTA+2mM DTT 2L透析過夜后，上樣于CM離子交換柱，0.1-0.3M NaCl+50mM硼酸緩沖液梯度洗脫后便得到了純化率達90％以上的抗HBV工程多肽，分子量4萬左右，粗制劑蛋白含量約為5-10mg/ml。預(yù)實驗中，該工程多肽對體外培養(yǎng)的人體細胞和實驗動物未表現(xiàn)出毒副作用。在設(shè)定的實驗動物模型中，該工程多肽應(yīng)表現(xiàn)出一定的抗HBV能力。
權(quán)利要求
1.一種人工組合的抗病毒工程多肽，其特征在于該多肽由基因工程技術(shù)將可特異結(jié)合不同種病毒包膜上固有的抗原或受體的多肽或衍生物與可形成離子通道大腸菌素，包括colicin El，Ia，Ib，A，B和N，或其通道結(jié)構(gòu)域，或它們的衍生物人工連接組成，其分子量為5,000-100,000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工組合的抗病毒工程多肽，其特征在于其分子結(jié)構(gòu)為可形成離子通道大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域的羧基端與可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽的氨基端連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工組合的抗病毒工程多肽，其特征在于其分子結(jié)構(gòu)為可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽的羧基端與可形成離子通道的大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域的氨基端連接。
4.一種人工組合的抗病毒工程多肽的制備方法，其特征在于利用基因工程技術(shù)將可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽基因插入到裝載在工程質(zhì)粒里的大腸菌素基因選定的位點上，再將突變好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到不含質(zhì)粒的工程菌里，經(jīng)大量繁殖菌，超聲破碎，高速離心沉淀破碎菌體及沉淀DNA，透析之后由離子交換柱收獲制備的抗病毒工程多肽。
全文摘要
本發(fā)明的抗病毒工程多肽由基因工程技術(shù)將可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽與可形成離子通道大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域組成，它具有兩種分子結(jié)構(gòu)a.大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域的羧基端與可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽的氨基端連，b.大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域的氨基端與可特異結(jié)合病毒包膜抗原或受體的多肽的羧基端連接，分子量為5,000－100,000，利用基因工程技術(shù)將大腸菌素或其通道結(jié)構(gòu)域與能夠特異結(jié)合不同種病毒的包膜抗原或受體的各種多肽分別連接之后，就可以組成對抗不同病毒的多種抗病毒工程多肽。它通過破壞病毒體包膜來殺傷病毒體和預(yù)防病毒感染。它具有高度特異性，屬窄譜抗病毒藥物。由于病毒體包膜的脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)不易突變，因而病毒將難以依靠經(jīng)典的突變來逃避該多肽的殺病毒效應(yīng)。
文檔編號C07K16/08GK1396178SQ0211389
公開日2003年2月12日 申請日期2002年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者丘小慶 申請人:成都陽輝生物科技有限責任公司