專(zhuān)利名稱(chēng)：抗ctla－4抗體的應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及包含抗CTLA-4抗體的組合物和抗CTLA-4抗體應(yīng)用，該抗體具有來(lái)自人基因的氨基酸序列。
CTLA-4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4)是免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白的一個(gè)成員，它能下調(diào)T細(xì)胞活化并維持免疫學(xué)穩(wěn)態(tài)。特別是，據(jù)認(rèn)為CD28和CTLA-4傳遞相反的信號(hào)，該信號(hào)由決定對(duì)抗原反應(yīng)的T細(xì)胞整合?？乖碳細(xì)胞受體的結(jié)果受CD28協(xié)同刺激信號(hào)的調(diào)節(jié)，也受來(lái)自CTLA-4的抑制性信號(hào)的調(diào)節(jié)。此結(jié)果也由T細(xì)胞上的CD28或CTLA-4與在抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)的B7分子之間的相互作用來(lái)決定。
Kwon等。PNAS USA 948099-103(1997)證明體內(nèi)對(duì)CTLA-4的抗體介導(dǎo)阻斷能增強(qiáng)抗前列腺癌的免疫反應(yīng)。Yang等。Cancer Res574036-41(1997)，基于體外和體內(nèi)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤攜帶動(dòng)物中，CTLA-4阻斷能增強(qiáng)其產(chǎn)生抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的能力；在此動(dòng)物模型中，增強(qiáng)效果限于腫瘤生長(zhǎng)的早期階段。Hurwitz等。Proc Natl Acad Sci USA9510067-71(1998)聯(lián)合使用CTLA-4阻斷和一種疫苗(由表達(dá)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的SM1細(xì)胞組成)來(lái)促使親代SM1腫瘤退化，盡管單獨(dú)使用二者之一治療都無(wú)效。
Allison等的美國(guó)專(zhuān)利5,811,097涉及給予CTLA-4阻斷劑降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。WO 00/37504(2000年6月29日公開(kāi))涉及人抗CTLA-4抗體及這些抗體在治療腫瘤中的應(yīng)用。WO 01/14424(2001年3月1日公開(kāi))涉及另外的人抗CTLA-4抗體以及這種抗體在治療腫瘤中的應(yīng)用。WO93/00431(1993年1月7日公開(kāi))涉及細(xì)胞與一種單克隆抗體相互作用的調(diào)節(jié)，該單克隆抗體能與CTLA4Ig融合蛋白發(fā)生反應(yīng)。WO 00/32231(2000年6月8日公開(kāi))涉及一種CTLA-4阻斷劑與一種腫瘤疫苗聯(lián)合使用來(lái)刺激T細(xì)胞。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物施用一定量的人抗CTLA-4抗體，該量能有效治療所述癌癥，其中所述癌選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門(mén)區(qū)癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、兒童實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤(spinal axistumor)、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤、環(huán)境誘導(dǎo)的癌包括那些由石棉誘導(dǎo)的癌，以及所述癌癥的組合。在一個(gè)方案中，本方法也包括將所述抗體與選自試劑組的藥劑聯(lián)合給予所述動(dòng)物，該試劑組由化學(xué)治療劑、癌疫苗、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗血管劑(anti-vascular agent)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、抗增生劑、調(diào)亡誘導(dǎo)物和存活途徑抑制劑組成。
當(dāng)抗體與化學(xué)治療劑聯(lián)合給藥時(shí)，該藥劑可選自有絲分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝物、嵌入抗生素(intercalating antibiotic)、生長(zhǎng)因子抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物、抗激素、血管生成抑制劑和抗雄激素。
當(dāng)抗體與一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑聯(lián)合給藥時(shí)，該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可選自EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)抑制劑、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)抑制劑和erbB2受體抑制劑。
然而在另一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)施該方法時(shí)，將一定量的所述抗體與放療聯(lián)合處理哺乳動(dòng)物，其中聯(lián)合放療的抗體的量能有效抑制哺乳動(dòng)物的異常細(xì)胞生長(zhǎng)或治療過(guò)度增生性疾病。該方法也能這樣實(shí)施，使癌癥對(duì)放射治療敏感化，這是通過(guò)給哺乳動(dòng)物施用能有效使所述癌癥對(duì)放射治療敏感的量的抗體實(shí)現(xiàn)的。本方法優(yōu)選進(jìn)一步包括用放射治療癌癥。應(yīng)該理解的是，通過(guò)給予射線(xiàn)，本方法也能夠使癌癥對(duì)抗體治療敏感。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人。
在一個(gè)實(shí)施方案中，與CTLA-4結(jié)合的抗體有下列特性與CTLA-4的結(jié)合親和力為大約10-9或更高；抑制CTLA-4和B7-1之間結(jié)合的IC50為大約100nM或更低；抑制CTLA-4和B7-2之間結(jié)合的IC50為大約100nM或更低；在人T細(xì)胞試驗(yàn)中增加IL-2產(chǎn)生500pg/ml或更多；并含有包含人FR1、FR2和FR3氨基酸序列的重鏈氨基酸序列，該人FR1、FR2和FR3氨基酸序列對(duì)應(yīng)于VH3-33基因的那些，或其中發(fā)生保守替代或體細(xì)胞突變，其中FR序列與CDR1、CDR2和CDR3序列相連。該抗體的輕鏈中也可包含來(lái)自A27或O12基因的CDR區(qū)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，該抗體抑制CTLA-4和B7-1之間結(jié)合的IC50為大約10nM或更低，更優(yōu)選約5nM或更低，最優(yōu)選約1nM。
可供替代地，該抗體與具有選自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。例如，該抗體能夠與具有選自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗體之結(jié)合表位相結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的抗體包含了含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重鏈，和含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的輕鏈，或由所述CDR序列發(fā)生了序列改變，這種改變選自保守性改變，其中所述保守性改變選自非極性殘基被其它非極性殘基置換、極性不帶電荷殘基被其它極性不帶電荷殘基置換、極性帶電荷殘基被其它極性帶電荷殘基置換、和結(jié)構(gòu)相似殘基的置換；非保守性替代，其中所述非保守性替代選自極性帶電荷殘基替代極性不帶電荷殘基和非極性殘基替代極性殘基；添加；和缺失。在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，抗體在構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)中與種系(germline)序列相比含有少于10、7、5或3個(gè)氨基酸的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體在構(gòu)架區(qū)中含有少于5個(gè)氨基酸的改變，在CDR區(qū)含有少于10個(gè)氨基酸的改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體在構(gòu)架區(qū)含有少于3個(gè)氨基酸的改變，在CDR區(qū)中含有少于7個(gè)氨基酸改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)架區(qū)中的改變是保守性改變，CDR區(qū)中的改變是體細(xì)胞突變。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體包含了含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重鏈，和含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體與選自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、和12.9.1.1的抗體具有相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體含有人3-33基因的重鏈氨基酸序列和人A27或O12基因的輕鏈序列。
本發(fā)明也涉及一種治療哺乳動(dòng)物癌癥的藥物組合物，其包含有效治療所述癌癥量的人抗CTLA-4抗體和藥學(xué)上可接受載體，其中所述癌選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門(mén)區(qū)癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、兒童實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤、環(huán)境誘導(dǎo)的癌癥包括那些由石棉誘導(dǎo)的癌癥，以及所述癌的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法涉及聯(lián)合藥物組合物，其還包含與所述抗體聯(lián)合能有效治療癌癥量的化學(xué)治療劑、癌疫苗、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗血管劑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、抗增生劑、調(diào)亡誘導(dǎo)物和存活途徑抑制劑。
本發(fā)明還涉及有效治療哺乳動(dòng)物癌癥量的人抗CTLA-4抗體在制備用于治療哺乳動(dòng)物癌癥的組合物中的應(yīng)用，其中所述癌選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門(mén)區(qū)癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、兒童實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤、環(huán)境誘導(dǎo)的癌癥包括那些由石棉誘導(dǎo)的癌癥，以及所述癌的組合。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示抗CTLA-4抗體4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的全長(zhǎng)核苷酸和氨基酸序列。
圖2顯示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的預(yù)測(cè)的重鏈與種系DP-50(3-33)氨基酸序列之間的氨基酸序列比對(duì)。由種系發(fā)生的改變用粗體表示。
圖3顯示克隆2.1.3的預(yù)測(cè)的重鏈序列與種系DP-65(4-31)氨基酸序列之間的氨基酸序列比對(duì)。由種系發(fā)生的改變用粗體表示，CDRs用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖4顯示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、4.10.2和4.13.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)27氨基酸序列之間的氨基酸序列比對(duì)。由種系發(fā)生的改變用粗體表示，CDRs用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖5顯示克隆3.1.1、11.2.1、11.6.1和11.7.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系O12氨基酸序列之間的氨基酸序列比對(duì)。由種系發(fā)生的改變用粗體表示，CDRs用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖6顯示克隆2.1.3的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)10/A26氨基酸序列之間的氨基酸序列比對(duì)。由種系發(fā)生的改變用粗體表示，CDRs用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖7顯示克隆12.3.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)17氨基酸序列之間的氨基酸序列比對(duì)。由種系發(fā)生的改變用粗體表示，CDRs用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖8顯示克隆12.9.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)3/A19氨基酸序列之間的氨基酸序列比對(duì)。由種系發(fā)生的改變用粗體表示，CDRs用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
發(fā)明詳述這里引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、出版物和其它參考文獻(xiàn)以其完整形式引入作為參考。
抗血管生成劑，例如MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)抑制劑、MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)抑制劑和COX-II(環(huán)加氧酶II)抑制劑，可以與抗體聯(lián)合用于本發(fā)明的方法中。有用的COX-II抑制劑的例子包括CELEBREXTM(celecoxib)、valdecoxib、rofecoxib。有用的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的例子在WO96/33172(1996年10月24日公開(kāi))、WO96/27583(1996年3月7日公開(kāi))、歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)97304971.1(1997年7月8日申請(qǐng))、歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)99308617.2(1999年10月29日申請(qǐng))、WO98/07697(1998年2月26日公開(kāi))、WO98/03516(1998年1月29日公開(kāi))、WO98/34918(1998年8月13日公開(kāi))、WO98/34915(1998年8月13日公開(kāi))、WO98/33768(1998年8月6日公開(kāi))、WO98/30566(1998年7月16日公開(kāi))、歐洲專(zhuān)利出版物606046(1994年7月13日公開(kāi))、歐洲專(zhuān)利出版物931788(1999年7月28日公開(kāi))、WO90/05719(1990年5月31日公開(kāi))、WO99/52910(1999年10月21日公開(kāi))、WO99/52889(1999年10月21日公開(kāi))、WO99/29667(1999年6月17日公開(kāi))、PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB98/01113(1998年7月21日申請(qǐng))、歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)99302232.1(1999年3月25日申請(qǐng))、英國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)9912961.1(1999年6月3日申請(qǐng))、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/148,464(1999年8月12日申請(qǐng))、美國(guó)專(zhuān)利5,863,949(1999年1月26日出版)、美國(guó)專(zhuān)利5,861,510(1999年1月19日出版)和歐洲專(zhuān)利出版物780386(1997年6月25日公開(kāi))中有描述。優(yōu)選的MMP-2和MMP-9抑制劑是抑制MMP-1的活性很低或不抑制其活性的那些。更優(yōu)選的是相對(duì)于其它基質(zhì)金屬蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)來(lái)說(shuō)，選擇性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
一些本發(fā)明中有用的具體MMP抑制劑例子是AG-3340、RO 32-3555、RS13-0830和下列化合物3-[[4-(4-氟苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羥氨基甲?；?環(huán)戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨]-8-氧雜-二環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基胺；(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-芐氧基)-苯磺?；鵠-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羥基胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫吡喃-4-羧酸羥基胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(1-羥氨基甲?；?環(huán)丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫吡喃-4-羧酸羥基胺；(R)3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫吡喃-3-羧酸羥基胺；(2R，3R)1-[4-(4-氟-2-甲基-芐氧基)-苯磺?；鵠-3-羥基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羥基胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羥氨基甲?；?1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺?；鵠-(4-羥氨基甲?；?四氫吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧雜-二環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基胺；3-內(nèi)-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧雜-二環(huán)[3.2.1]辛烷-3-羧酸羥基胺；和(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氫呋喃-3-羧酸羥基胺；和所述化合物的藥學(xué)上可接受鹽和溶劑合物。
其它抗血管生成劑，包括其它COX-II抑制劑和其它MMP抑制劑，也能用于本發(fā)明。
抗體也可以與以下物質(zhì)共同給藥有絲分裂抑制劑，如長(zhǎng)春堿；烷化劑，如順鉑，卡鉑和環(huán)磷酰胺；抗代謝物，如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷和羥基脲，或，如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)239362中公開(kāi)的優(yōu)選抗代謝物之一，如N-(5-[N-3，4-二氫-2-甲基-4-氧代喹唑啉-6-基甲基)-N-甲基氨基]-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸；生長(zhǎng)因子抑制劑；細(xì)胞周期抑制劑；嵌入抗生素，如多柔比星和博來(lái)霉素；酶，如干擾素；和抗激素，如抗雌激素，比如NolvadexTM(他莫昔芬)或，如抗雄激素，比如CasodexTM(4’-氰基-3-(4-氟苯磺酰)-2-羥基-2-甲基-3’-(三氟甲基)N-丙酰苯胺)。
這里描述的結(jié)合(聯(lián)合)治療可以通過(guò)將各治療成分同時(shí)、順序或間隔給藥的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。
抗體也可以與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑共同使用，例如能抑制EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)反應(yīng)的試劑，如EGFR抗體、EGF抗體和屬于EGFR抑制劑的分子；VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)抑制劑，如VEGF受體和能抑制VEGF的分子；和erbB2受體抑制劑，如與erbB2受體結(jié)合的有機(jī)分子或抗體，例如Herceptin(加利福尼亞South San Fransisco的Genentech公司)。
EGFR抑制劑在如WO95/19970(1995年7月27日公開(kāi))、WO98/14451(1998年4月9日公開(kāi))、WO98/02434(1998年1月22日公開(kāi))和美國(guó)專(zhuān)利5,747,498(1998年5月5日頒發(fā))中有描述，這里所描述的這類(lèi)物質(zhì)可用于本發(fā)明。EGFR抑制劑包括但不限于，單克隆抗體C225、抗EGFR 22Mab(紐約Imclone Systems公司，紐約)，和ABX-EGF(Abgenix Inc.Of Fremont，加利福尼亞)，化合物ZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、MDX-447(Medarex Inc.OfAnnandale，新澤西州)和OLX-103(Merck & Co.Of Whitehouse Station，新澤西州)、VRCTC-310(Ventech Research)和EGF融合毒素(SeragenInc.Of Hopkinton，Massachusettes)。這些以及其它EGFR抑制劑可用于本發(fā)明。
VEGF抑制劑，如SU-5416和SU-6668(Sugen公司，South SanFrancisco，加利福尼亞)，也可以與抗體聯(lián)合使用。VEGF抑制劑在如WO99/24440(1999年5月20日公開(kāi))、PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB99/00797(1999年5月3日申請(qǐng))、WO95/21613(1995年8月17日公開(kāi))、WO96/61422(1999年12月2日公開(kāi))、美國(guó)專(zhuān)利5,834,504(1998年11月10頒發(fā))、WO98/50356(1998年11月12日公開(kāi))、美國(guó)專(zhuān)利5,883,113(1999年3月16日頒發(fā))、美國(guó)專(zhuān)利5,886,020(1999年3月23日頒發(fā))、美國(guó)專(zhuān)利5,792,783(1998年8月11日頒發(fā))、WO99/10349(1999年3月4日公開(kāi))、WO97/32856(1997年9月12日公開(kāi))、WO97/22596(1997年6月26日公開(kāi))、WO98/54093(1998年12月3日公開(kāi))、WO98/02438(1998年1月22日公開(kāi))、WO99/16755(1999年4月8日公開(kāi))和WO98/02437(1998年1月22日公開(kāi))中有描述。其它一些具體的可用于本發(fā)明的VEGF抑制劑的例子是IM862(Cytran Inc.Of Kirkland，華盛頓)；IMC-1C11 Imclone抗體、加利福尼亞州South San Francisco的Genentech公司的抗VEGF單克隆抗體和angiozyme-一種由核酶(Boulder，科羅拉多州)和Chiron(Emeryville，加利福尼亞)合成的核酶。
ErbB2受體抑制劑，如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)和單克隆抗體AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.of The Woodlands，得克薩斯)和2B-1(chiron)，可以進(jìn)一步與抗體聯(lián)合，例如在WO98/02434(1998年1月22日公開(kāi))、WO99/35146(1999年7月15日公開(kāi))、WO99/35132(1999年7月15日公開(kāi))、WO98/02437(1998年1月22日公開(kāi))、WO97/13760(1997年4月17日公開(kāi))、WO95/19970(1995年7月27日公開(kāi))、美國(guó)專(zhuān)利5,587,458(1996年12月24日出版)和美國(guó)專(zhuān)利5,877,305(1999年3月2日出版)中指出的。本發(fā)明中有用的ErbB2受體抑制劑在EP1029853(2000年8月23日公開(kāi))和WO00/44728(2000年8月3日公開(kāi))中也有描述。在前述PCT申請(qǐng)、美國(guó)專(zhuān)利和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)中描述的ErbB2受體抑制劑化合物和物質(zhì)，以及其它抑制ErbB2受體的化合物和物質(zhì)可以與根據(jù)本發(fā)明的抗體合用。
抗體也可以與治療異常細(xì)胞生長(zhǎng)或癌癥有效的其它試劑合用，這些試劑包括但不限于其它能夠增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的試劑，如另外的、不同的、CTLA4抗體和也能夠阻斷CTLA4的其它試劑；以及抗增生劑如法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑和αvβ3抑制劑，如αvβ3抗體Vitaxin，αvβ5抑制劑、p53抑制劑等。
當(dāng)抗體聯(lián)合另一種免疫調(diào)節(jié)劑給藥時(shí)，免疫調(diào)節(jié)劑可以選自例如樹(shù)突細(xì)胞活化劑如CD40配體和抗CD40激動(dòng)劑抗體，以及抗原呈遞增強(qiáng)劑、T細(xì)胞趨化增強(qiáng)劑、腫瘤相關(guān)免疫抑制因子抑制劑，如TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)，和IL-10。
抗體也可以和其它通過(guò)結(jié)合IGF-1R(胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體)抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗體或配體聯(lián)合給藥。可用于本發(fā)明的具體的抗IGF-1R抗體包括在2001年12月20日申請(qǐng)的PCT申請(qǐng)PCT/US01/51113中描述的那些抗體。
抗體也可與細(xì)胞因子聯(lián)合給藥，如IL-2、IFN-g、GM-CSF、IL-12、IL-18和FLT-3L。
除了含有癌癥相關(guān)抗原的癌疫苗外，可有效聯(lián)合抗體的疫苗包括但不限于GM-CSF DNA和細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗、樹(shù)突細(xì)胞疫苗、重組病毒(例如痘苗病毒)疫苗和熱休克蛋白(HSP)疫苗。有效的疫苗還包括腫瘤疫苗，如黑素瘤細(xì)胞制成的疫苗，而且可以是自身的或同種異體的。該疫苗可以是如基于肽、DNA或細(xì)胞的疫苗。
抗體可以與抗激素治療劑共同給予，如抗雌激素或抗雄激素治療劑，或選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體可以給免疫抑制的患者施用，如化療、透析、外科手術(shù)，或由年齡相關(guān)的免疫病變?cè)斐傻拿庖咭种?。抗體可用于協(xié)助免疫受抑群體對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)。
抗體也可用于協(xié)助治療或預(yù)防傳染性疾病，包括細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或病毒性疾病。如果需要，抗體可聯(lián)合抗感染疫苗共同給予。
本發(fā)明的方法可以是新輔助治療/輔助治療，用于緩解這里提及的疾病有關(guān)的癥狀和異常細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的癥狀。此類(lèi)治療可以是單獨(dú)治療或聯(lián)合化療和/或免疫療法和/或疫苗治療。
給予低劑量或高劑量放射治療的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，這些技術(shù)可用于這里所述的聯(lián)合治療。
用抗體治療能夠使異常細(xì)胞對(duì)放射治療更敏感，達(dá)到殺死和/或抑制這種細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種使哺乳動(dòng)物異常細(xì)胞對(duì)射線(xiàn)敏感的方法，包括給哺乳動(dòng)物施予有效使異常細(xì)胞對(duì)放射治療敏感的量的抗CTLA4抗體。
抗體可用來(lái)治療或預(yù)防初發(fā)疾病，或治療或預(yù)防復(fù)發(fā)。它可用來(lái)治療早期或晚期疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，用該抗體預(yù)防遺傳性腫瘤。它也可用于預(yù)防由于感染HVP(人乳頭狀瘤病毒)、EBV(EB病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒)、丙型肝炎的高危人群發(fā)生腫瘤，或治療與這些感染有關(guān)的腫瘤。該抗體也可用于降低術(shù)后腫瘤生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)，或與接觸毒素有關(guān)的腫瘤生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“治療(treating)”，除非另外說(shuō)明，是指逆轉(zhuǎn)、緩解、抑制進(jìn)展，或預(yù)防該術(shù)語(yǔ)應(yīng)用的障礙或疾病，或這種障礙或疾病的一種或多種癥狀。這里所用的術(shù)語(yǔ)“治療(treatment)”，除非另外說(shuō)明，涉及上面定義的“治療”的治療行為。
術(shù)語(yǔ)“表位”包括任何能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異結(jié)合的蛋白決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)組成，如氨基酸或糖基側(cè)鏈，并且通常具有特定三維結(jié)構(gòu)特征，和特定電荷特性。當(dāng)解離常數(shù)小于等于1μM時(shí)，優(yōu)選小于等于100nM，最優(yōu)選小于等于10nM時(shí)，稱(chēng)抗體與抗原特異性結(jié)合。
本發(fā)明可使用的抗體的制備方法在PCT公開(kāi)申請(qǐng)WO00/37504(2000年6月29日公開(kāi))中有描述。
術(shù)語(yǔ)“人抗體”是指一種抗體，它具有來(lái)自人基因的氨基酸序列，人基因包括轉(zhuǎn)基因小鼠或別處中的人基因，并包括由人基因產(chǎn)生抗體序列時(shí)發(fā)生的體細(xì)胞突變或其它改變得到的序列。本發(fā)明包括下述氨基酸序列的改變類(lèi)型。
因而，由這里舉例的具體抗體發(fā)生氨基酸序列改變而來(lái)的抗體也可用于本發(fā)明的方法。例如，序列具有“實(shí)質(zhì)等同性”是指在最佳比對(duì)時(shí)，比如執(zhí)行采用缺省空位加重的GAP程序或BESTFIT，原始序列和改變后序列在完整抗體、可變區(qū)、構(gòu)架區(qū)或CDR區(qū)中具有至少80％的序列等同性，優(yōu)選至少90％的序列等同性，更優(yōu)選至少95％的序列等同性，最優(yōu)選至少99％的序列等同性。優(yōu)選不同的殘基位點(diǎn)的差異是由保守氨基酸替代而造成的。保守氨基酸替代是指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含氨基側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸；以及一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴(lài)氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，合理的期望是用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)置換亮氨酸，用谷氨酸置換天冬氨酸，用絲氨酸置換蘇氨酸，或類(lèi)似的用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸進(jìn)行替代，替代后對(duì)所得分子的結(jié)合或特性不產(chǎn)生大的影響，特別是當(dāng)不對(duì)構(gòu)架區(qū)位點(diǎn)中的氨基酸進(jìn)行置換時(shí)。氨基酸改變是否產(chǎn)生功能肽可以很容易地通過(guò)估計(jì)多肽衍生物的比活性來(lái)確定。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類(lèi)似物。優(yōu)選在功能區(qū)的邊界附近產(chǎn)生片段或類(lèi)似物的氨基或羧基末端。通過(guò)將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公眾或私有序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較來(lái)鑒別結(jié)構(gòu)和功能區(qū)。優(yōu)選地，用計(jì)算機(jī)化的比較方法鑒別結(jié)構(gòu)和/或功能已知的其它蛋白質(zhì)存在的序列基序或預(yù)測(cè)的蛋白構(gòu)象域。鑒別折疊為已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等，Science253164(1991)。因此，前述例子證明根據(jù)本發(fā)明本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠識(shí)別可以用于確定結(jié)構(gòu)和功能區(qū)的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
優(yōu)選的氨基酸替代是(1)降低對(duì)蛋白水解的易感性，(2)降低氧化易感性，(3)改變形成蛋白復(fù)合體的結(jié)合親和力，(4)改變結(jié)合親和力，和(5)賦予或修飾這些類(lèi)似物的其它物理化學(xué)特性或功能特性的那些替代。類(lèi)似物可以包括有天然存在的肽序列以外序列的多種突變蛋白質(zhì)。例如，單個(gè)或多個(gè)氨基酸替代(優(yōu)選保守氨基酸替代)可以在天然發(fā)生的序列(優(yōu)選在形成分子間聯(lián)系的區(qū)域之外的多肽部分)中制得。一個(gè)保守的氨基酸替代不應(yīng)該從本質(zhì)上改變親本序列的結(jié)構(gòu)特性(如，一個(gè)替代氨基酸不應(yīng)趨于破壞親本序列中的螺旋，或打破標(biāo)志親本序列特征二級(jí)結(jié)構(gòu)其它類(lèi)型)。本領(lǐng)域已知的多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的例子在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creithton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984)；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze編，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991)；和Thornton等，Nature354105(1991)中有描述。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”涉及完整的抗體，或其結(jié)合片段，該片段能與該完整抗體特異性結(jié)合發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。結(jié)合片段由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，或用酶或化學(xué)切割完整抗體產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和單鏈抗體。一種抗體，除了“雙特異性”或“雙功能”抗體外，應(yīng)理解為其結(jié)合位點(diǎn)相同。當(dāng)過(guò)量抗體降低結(jié)合反受體的受體量達(dá)到至少約20％、40％、60％或80％，甚至常常更大于約85％(用體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定)時(shí)，該抗體實(shí)質(zhì)上抑制受體與反受體的粘附。
本發(fā)明使用的抗體能被加入到適合給被試者施用的藥物組合物中。典型地，該藥物組合物包括抗體和藥學(xué)上可接受的載體。這里使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗菌和抗真菌試劑、等滲和吸收延遲劑等。藥學(xué)上可接受載體的例子包括一種或多種水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其聯(lián)合物。在許多情況下，優(yōu)選組合物中包括等滲劑，如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。藥學(xué)上可接受物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或少量的輔助物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或乳化劑，防腐劑或緩沖液，它們能夠延長(zhǎng)該抗體或抗體部分的保存期限或有效性。
該抗體可以以多種形式存在。這些形式包括，例如，液體、半固體和固體制劑形式，如液體溶液(如可注射和灌注溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式依賴(lài)于預(yù)期給藥方式和治療應(yīng)用。典型的優(yōu)選組合物是可注射或灌注溶液形式，如與其它抗體給人被動(dòng)免疫時(shí)使用的組合物相似的組合物。優(yōu)選的給藥方式是非腸胃途徑(如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體通過(guò)靜脈內(nèi)灌注或注射給予。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體通過(guò)肌內(nèi)或皮下注射給予。
藥物組合物典型地應(yīng)該是無(wú)菌的，并且在制備和貯存條件下保持穩(wěn)定。該組合物能被配制為溶液、微乳、分散體、脂質(zhì)體或其它適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。無(wú)菌注射溶液可通過(guò)將需要量的該抗體加入到一種適當(dāng)溶劑中來(lái)制備，其中含有上述列舉成分之一或其組合(如果需要)，之后進(jìn)行過(guò)濾滅菌。一般來(lái)說(shuō)，分散體可通過(guò)將活性化合物加入到一種無(wú)菌載體中來(lái)制備，該載體中含有一種基本分散介質(zhì)以及上述列舉的其它所需成分。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，由其前述的無(wú)菌過(guò)濾溶液產(chǎn)生一種粉末，其中含有活性成分加任何另外的期望成分。溶液的適當(dāng)流動(dòng)性能夠這樣保持，例如，通過(guò)使用包衣劑如卵磷脂，對(duì)于分散體，通過(guò)維持所需微粒大小，和通過(guò)使用表面活性劑。在組合物中加入延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，能延長(zhǎng)注射組合物的吸收。
該抗體能以多種本領(lǐng)域已知的方法給予，包括但不限于，口服、非腸胃、粘膜、吸入、局部、口腔、經(jīng)鼻和直腸。對(duì)于許多治療應(yīng)用，優(yōu)選的給藥途徑/方式是皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或灌注。如果希望，可采用無(wú)針注射。如熟練技術(shù)人員期望的，給藥途徑/方式會(huì)隨著期望的結(jié)果而改變。
在某些實(shí)施方案中，該抗體可以和保護(hù)該化合物不被快速釋放的載體一起制備，如控釋制劑，包括植入物、經(jīng)皮膜片和微囊化傳遞系統(tǒng)。可以使用可生物降解的生物相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。很多制備這種制劑的方法已經(jīng)被授權(quán)或是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常都知道的。見(jiàn)，如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在一些實(shí)施方案中，該抗體可以口服給予，如在一種惰性稀釋液中或一種可同化食用載體中。該抗體(如果需要，連同其它成分)也可以裝入硬或軟明膠膠囊中，壓制成片劑或直接加入到患者的飲食中。對(duì)于口服治療給藥，該抗體可被加入賦形劑并用于制成吞服片、口含片、糖錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等。不同于非腸道途徑的抗體給予方法，可能需要用一種防止其失活的材料包衣，或?qū)⒃摶衔锱c這種材料共同給予。
可以調(diào)整劑量方案，提供期望的最佳反應(yīng)(如治療或預(yù)防反應(yīng))。例如，可以給予單一大丸劑(bolus)，隨時(shí)間推移給予幾個(gè)分離的劑量，或劑量也可以根據(jù)治療情況緊急性成比例地減量或加量。配制劑量單位形式的非腸道組合物特別有好處，易于給藥和統(tǒng)一劑量。這里使用的劑量單位形式是指物理上離散的單位，適宜于作為單一劑量給予待治療的哺乳動(dòng)物被試者；每一單位含有在聯(lián)合需要的藥學(xué)載體時(shí)，產(chǎn)生期望的治療效果而計(jì)算的預(yù)定量活性化合物。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格通過(guò)(a)抗體的獨(dú)特特性和要達(dá)到的具體的治療或預(yù)防效果，和(b)組合這種活性化合物用于治療個(gè)體敏感性的領(lǐng)域固有的限制來(lái)確定，并且直接依賴(lài)于它。
一個(gè)根據(jù)本發(fā)明給予的治療或預(yù)防的抗體有效量的示例但無(wú)限制性的范圍是0.1-100mg/kg，更優(yōu)選0.5-50mg/kg，再優(yōu)選1-20mg/kg，甚至更優(yōu)選1-10mg/kg。應(yīng)該注意的是劑量值可以隨待緩解病情的類(lèi)型和嚴(yán)重性而改變。應(yīng)進(jìn)一步理解的是，對(duì)于任何特定的被試者，應(yīng)根據(jù)個(gè)體需要和給予或監(jiān)測(cè)給予此組合物的人的專(zhuān)業(yè)判斷，隨時(shí)調(diào)整特定的劑量方案，而且這里列出的劑量范圍只是實(shí)例，并不企圖限制權(quán)利要求的組合物的范圍或?qū)嵤?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，以靜脈內(nèi)配制品給予該抗體，它是含5或10mg/ml抗體的無(wú)菌水溶液，還有20mM醋酸鈉、0.2mg/ml聚山梨醇酯80和140mM的氯化鈉，pH 5.5。
在一個(gè)實(shí)施方案中，部分劑量通過(guò)靜脈內(nèi)大丸劑給予，剩余的通過(guò)灌注抗體配制品給予。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，0.01mg/kg抗體靜脈內(nèi)大丸劑注射，接著在3-5分鐘內(nèi)0.1mg/kg靜脈內(nèi)注射，然后灌注含1到3mg/kg的100ml鹽水，100ml/小時(shí)，再灌注含4到10mg/kg的250ml鹽水，100ml/小時(shí)，灌注含12.5到21mg/kg的500ml鹽水，100ml/小時(shí)，灌注含28mg/kg的600ml鹽水(500+100袋子)，120ml/小時(shí)。
本發(fā)明方法中使用的抗體可以被標(biāo)記。這可以通過(guò)摻入一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)完成，如摻入放射性標(biāo)記的氨基酸或給多肽連上可被標(biāo)記的抗生物素蛋白(如帶有熒光標(biāo)記或酶活性的鏈霉抗生物素，可被光學(xué)或比色方法檢測(cè)到)檢測(cè)到的生物素化部分。在特定情況下，該標(biāo)簽或標(biāo)記也可以是治療性的。本領(lǐng)域已知并可以使用多種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法。標(biāo)記多肽的例子包括但不限于下列放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、熒光標(biāo)記(如FITC、羅丹明、鑭系無(wú)機(jī)發(fā)光材料)、酶學(xué)標(biāo)記(如辣根過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光劑、生物素化基團(tuán)、第二報(bào)告分子識(shí)別的預(yù)定多肽表位(如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、二抗結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合區(qū)、表位標(biāo)記)。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記連上各種長(zhǎng)度的間隔臂，以降低潛在的空間位阻。
已知抗體基本結(jié)構(gòu)單位包含四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)等同多肽鏈組成，每對(duì)具有一個(gè)“輕”鏈(約25kDa)和一個(gè)“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括一個(gè)約100到110或更多氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每條鏈羧基末端部分限定一個(gè)恒定區(qū)，主要起效應(yīng)子功能。人輕鏈分為κ和λ輕鏈。重鏈分為μ、δ、γ、α或ε，并限定抗體的同種型，分別是IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)由一個(gè)約12或更多氨基酸的“J”區(qū)連接，重鏈也包括一個(gè)約10或更多個(gè)氨基酸的“D”區(qū)。一般可見(jiàn)于Fundamental ImmunologyCh 7(Paul，W.，ed.，2nded.Raven Press，N.Y.(1989))。每對(duì)輕/重鏈的可變區(qū)構(gòu)成抗體結(jié)合位點(diǎn)。
因而，一個(gè)完整的IgG抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了雙功能或雙特異性的抗體，這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。這些鏈均呈現(xiàn)相同的相對(duì)保守的構(gòu)架區(qū)(FR)的一般結(jié)構(gòu)，該構(gòu)架區(qū)由三個(gè)高變區(qū)，也叫互補(bǔ)決定區(qū)或CDRs，連接而成。來(lái)自每對(duì)兩條鏈的CDRs經(jīng)構(gòu)架區(qū)連成一行，使得能夠結(jié)合特異表位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDE3和FR4區(qū)。每個(gè)區(qū)的氨基酸指定均依照Kabat的Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991)，或Chothia &Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等.Nature342878-883(1989)的定義。
本發(fā)明中使用的抗體優(yōu)選來(lái)自表達(dá)人免疫球蛋白基因的細(xì)胞。本領(lǐng)域已知使用轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)產(chǎn)生這種“人”抗體。這種方法之一在Mendez等.Nature Geneties 15146-156(1997)，Green and Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列08/759,620(1996年12月3日申請(qǐng))有描述。使用這種小鼠獲得人抗體也在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)07/466,008(1990年1月12日申請(qǐng))、07/610,515(1990年11月8日申請(qǐng))、07/919,297(1992年7月24日申請(qǐng))、07/922,649(1992年7月30日申請(qǐng))、08/031,801(1993年3月15日申請(qǐng))、08/112,848(1993年8月27日申請(qǐng))、08/234,145(1994年4月28日申請(qǐng))、08/376,279(1995年1月20日申請(qǐng))、08/430,938(1995年4月27日申請(qǐng))、08/464,584(1995年6月5日申請(qǐng))、08/464,582(1995年6月5日申請(qǐng))、08/463,191(1995年6月5日申請(qǐng))、08/462,837(1995年6月5日申請(qǐng))、08/486,853(1995年6月5日中請(qǐng))、08/486,857(1995年6月5日申請(qǐng))、08/486,859(1995年6月5日申請(qǐng))、08/462,513(1995年6月5日申請(qǐng))、08/724,752(1996年10月2日申請(qǐng))和08/759,620(19965年12月3日申請(qǐng))中有描述。也可見(jiàn)Mendez等.Nature Genetics 15146-156(1997)和Greenand Jakobobits J.Exp.Med.188483-495(1998)。也見(jiàn)歐洲專(zhuān)利EP0463151(批準(zhǔn)
公開(kāi)日1996年6月12日)、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO94/02602(1994年2月3日公開(kāi))、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO96/34096(1996年10月31日公開(kāi))和WO98/24893(1998年6月11日公開(kāi))。
一種制備產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的可替代方法是“小座位”(minilocus)方法，其中通過(guò)包含Ig的片段(單個(gè)基因)來(lái)模擬外源Ig座位。一個(gè)或多個(gè)VH基因、一個(gè)或多個(gè)DH基因、一個(gè)或多個(gè)JH基因、mu恒定區(qū)和第二恒定區(qū)(優(yōu)選γ恒定區(qū))形成一個(gè)導(dǎo)入動(dòng)物的構(gòu)建體。見(jiàn)Surani等的美國(guó)專(zhuān)利5,545,807，以及Lonberg和Kay的美國(guó)專(zhuān)利5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650和5,814,318，Krimepenfort和Berns的美國(guó)專(zhuān)利5,591,669，Berns等的美國(guó)專(zhuān)利5,612,205、5,721,367、5,789,215，以及Choi和Dunn的美國(guó)專(zhuān)利5,643,763，和GenPharm International的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)07/574,748(1990年8月29日申請(qǐng))，07/575,962(1990年8月31日申請(qǐng))，07/810,279(1991年12月17日申請(qǐng))，07/853,408(1992年3月18日申請(qǐng))，07/904,068(1992年6月23日申請(qǐng))，07/990,860(1992年12月16日申請(qǐng))，08/053,131(1993年4月26日申請(qǐng))，08/096,762(1993年7月22日申請(qǐng))，08/155,301(1993年11月18日申請(qǐng))，08/161,739(1993年12月3日申請(qǐng))，08/165,699(1993年12月10日申請(qǐng))，08/209,741(1994年3月9日申請(qǐng))。也見(jiàn)歐洲專(zhuān)利546073B1，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO92/03918、WO92/222645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852和WO98/24884。
在另一個(gè)方案中，本發(fā)明方法中使用的抗體不完全是人的，而是“人源化的”。尤其是，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可將鼠抗體或其它物種抗體人源化或靈長(zhǎng)類(lèi)源化。見(jiàn)如Winter和Harris Immunol Today1443-46(1993)和Wright等Crit.Reviews In Immunol.12125-168(1992)。用重組DNA技術(shù)改造抗體，用相應(yīng)的人序列置換CH1、CH2、CH3、鉸鏈區(qū)和/或構(gòu)架區(qū)(見(jiàn)WO92/02190和美國(guó)專(zhuān)利5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350和5,777,085)。此外，使用Ig cDNA構(gòu)建嵌合免疫球蛋白基因是本領(lǐng)域已知的(Liu等.P.M.A.S.843439(1987)和J.Immunol.1393521(1987))。從雜交瘤或其它產(chǎn)生抗體的細(xì)胞分離mRNA并用于產(chǎn)生cDNA?？梢圆捎锰禺愋砸锢镁酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增感興趣的cDNA(美國(guó)專(zhuān)利4,683,195和4,683,202)?？商鎿Q地，構(gòu)建文庫(kù)并篩選分離感興趣的基因。接著將編碼抗體可變區(qū)的DNA序列與人恒定區(qū)序列融合。人恒定區(qū)基因序列可在kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，N.I.H.publication NO.91-3242中找到。人C區(qū)基因很容易由已知克隆得到。同型選擇將由期望的效應(yīng)子功能來(lái)指導(dǎo)，如補(bǔ)體固定或抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性活性。優(yōu)選的同型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。特別優(yōu)選本發(fā)明抗體的同型是IgG2和IgG4?？梢允褂没颚驶颚说娜溯p鏈恒定區(qū)。接著常規(guī)方法表達(dá)嵌合的人源化的抗體。
正如上指出的，本發(fā)明包括抗體片段(包括在這里定義的“抗體”中)的應(yīng)用。抗體片段，如Fv、F(ab’)2和Fab可將完整蛋白切割而制備，如用蛋白酶或化學(xué)切割?？商鎿Q地，設(shè)計(jì)截短基因。例如，編碼一部分F(ab’)2片段的嵌合基因?qū)ň幋aCH1區(qū)和H鏈鉸鏈區(qū)，及其后的翻譯終止密碼子的DNA序列以產(chǎn)生截短分子。
在一個(gè)方法中，使用編碼重鏈和輕鏈J區(qū)的共有序列設(shè)計(jì)寡核苷酸用作引物，將有用的限制性酶切位點(diǎn)引入J區(qū)，用于隨后將V區(qū)片段連接到人C區(qū)片段?？赏ㄟ^(guò)定點(diǎn)誘變修飾C區(qū)cDNA，將限制性酶切位點(diǎn)放在人序列的類(lèi)似位置。
本發(fā)明所用的獲得抗體時(shí)使用的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒載體、YACs、來(lái)自EBV的附加體等。一種方便的載體通常是編碼一個(gè)功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，并帶有改造的合適的限制性酶切位點(diǎn)，以使任何VH或VL序列都可以容易地被插入和表達(dá)的載體。在這種載體中，剪接通常發(fā)生在被插入的J區(qū)中的剪接供體位點(diǎn)和人C區(qū)之前的剪接受體位點(diǎn)之間，并且也可發(fā)生在人CH外顯子內(nèi)發(fā)生的剪接區(qū)。聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在編碼區(qū)下游的天然染色體位點(diǎn)。所得嵌合抗體可與任何強(qiáng)啟動(dòng)子連接，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs，如SV-40早期啟動(dòng)子，(Okayama等Mol.Cell.Bio.3280(1983))，勞斯肉瘤病毒LTR(Gorman等.P.N.A.S.796777(1982))和莫洛尼鼠類(lèi)白血病毒LTR(Grosschedl等.Cell 41885(1985))；天然Ig啟動(dòng)子等。
對(duì)實(shí)施本發(fā)明有用的人抗體或來(lái)自其它物種的抗體也可通過(guò)展示型技術(shù)產(chǎn)生，包括但不限于，噬菌體展示、逆轉(zhuǎn)錄病毒展示、核糖體展示和其它本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)?？蓪?duì)所得分子進(jìn)行另外的成熟，如親和成熟，如本領(lǐng)域熟知的這種技術(shù)。Wright和Harris，Immunol Today1443-46(1993)，Hanes和Plucthau，PNAS USA 944937-4942(1997)(核糖體展示)，Parmley和Smith，Gene 73305-318(1988)(噬菌體展示)，Scott TIBS 17241-245(1992)，Cwirla等.PNAS USA 876378-6382(1990)，Russel等.Nucl.Acids Research 211081-1085(1993)，Hoganboom等.Immunol.Reviews 13043-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH 1080-84(1992)和美國(guó)專(zhuān)利5,733,743。如果用展示技術(shù)產(chǎn)生非人類(lèi)的抗體，這種抗體可如上所述進(jìn)行人源化。
利用這些技術(shù)，抗體可由CTLA-4表達(dá)細(xì)胞、CTLA-4本身、CTLA-4的各種形式、其表位或肽，以及其表達(dá)文庫(kù)(如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,703,057)而產(chǎn)生，該文庫(kù)其后可用來(lái)篩選上述活性。
產(chǎn)生的用于本發(fā)明的抗體起始不需要有特定的期望同型。相反，產(chǎn)生的抗體可具有任何同型并可隨后利用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行同型轉(zhuǎn)換。這些包括定向重組技術(shù)(如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,816,397)和細(xì)胞融合技術(shù)(如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/730,639(1996年10月11日申請(qǐng)))。
如上指出，為了多種治療應(yīng)用，本發(fā)明抗體的效應(yīng)子功能可以通過(guò)同型轉(zhuǎn)換為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM而發(fā)生改變。而且，可通過(guò)使用雙特異性物質(zhì)、免疫毒素或放射性標(biāo)記等來(lái)避免依賴(lài)于補(bǔ)體殺滅細(xì)胞。
能夠產(chǎn)生雙特異性抗體，其包含(i)兩個(gè)抗體一個(gè)的特異性針對(duì)CTLA-4，另一個(gè)的特異性針對(duì)第二分子，(ii)單個(gè)抗體，其一條鏈特異性針對(duì)CTLA-4，第二條鏈特異性針對(duì)第二分子，或(iii)特異性針對(duì)CTLA-4和第二種分子的單鏈抗體?？梢允褂檬熘夹g(shù)產(chǎn)生這種雙特異性抗體，如Fanger等.Immunol Methods 472-81(1994)，Wright andHarris，如上所述，和Traunecker等.Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992)。
用于本發(fā)明的抗體也包括可以制備的“kappabodies”(III等.“Design and construction of a hybrid Immunoglobulin domain withproperties of both heavy and light chain variable regions”P(pán)roteinEng 10949-57(1997))，“minibodies”(Martin等.“Theaffinity-selection of a minibody polypeptide Inhibitor of humanInterleukin-6”EMBO J135303-9(1994))，“diabodies”(Holliger等.“Diabodiessmall bivalent and bispecific antibody fragments”P(pán)NAS USA 906444-6448(1993))，和“janusins”(Traunecker等.“Bispecific single chain molecules(janusins)target cytotoxiclymphocytes on HIV Infected cells”EMBO J 103655-3659(1991)和Traunecker等.“Janusinnew molecular design for bispecificreagents”Int J Cancer Suppl 751-52(1992))。
可以用常規(guī)技術(shù)對(duì)使用的抗體進(jìn)行修飾用作免疫毒素。如見(jiàn)VitettaImmunol Today 14252(1993)。也可見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,194,594。放射性標(biāo)記抗體也能用熟知技術(shù)來(lái)制備。如見(jiàn)Junghans等.Cancer Chemotherapyand Biotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo編，LippincottRaven(1996))。也見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE35,500)、5,684,471和5,697,902。
用于實(shí)施本發(fā)明的具體抗體包括在WO 00/37504中描述和指明為3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體。盡管這里提供了這些序列的信息，在WO 00/37504中可得到更進(jìn)一步的信息。這些抗體是完全人的IgG2或帶有人κ輕鏈的IgG4重鏈。本發(fā)明特別涉及具有這些抗體的氨基酸序列的抗體的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及具有這些抗體的重鏈和輕鏈CDRs的氨基酸序列的抗體，以及如上所述的在CDR區(qū)發(fā)生改變的抗體。
本發(fā)明中使用的抗體優(yōu)選具有很高親和力，當(dāng)用固相法或溶液法測(cè)定時(shí)，典型的Kds從大約10-9到大約10-11M。
用于本發(fā)明的抗體可在雜交瘤細(xì)胞系以外的細(xì)胞系中表達(dá)。編碼特定抗體的cDNA或基因組克隆的序列能用于轉(zhuǎn)化合適的哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可采用任何已知的將多核苷酸導(dǎo)入一種宿主細(xì)胞的方法，例如將多核苷酸包裝到病毒(或包裝到病毒載體)中，并用該病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或用本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染步驟，如美國(guó)專(zhuān)利4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455中舉例說(shuō)明的。將異種多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中熟知的，包括但不限于，葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體融合、電穿孔、微粒轟擊、多核苷酸包裝到脂質(zhì)體、肽接合物、dendrimers、和將DNA直接顯微注射到核中。
可用作表達(dá)用宿主細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域熟知的，包括許多從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無(wú)限增殖細(xì)胞系，包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NSO0、HeLa細(xì)胞、倉(cāng)鼠胎腎(BHK)細(xì)胞、猴腎(COS)細(xì)胞和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)。也可使用非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和植物細(xì)胞。為了防止由于非人糖基化造成的免疫原性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)和/或效應(yīng)子功能的改變，優(yōu)選定點(diǎn)誘變抗體CH2區(qū)除去糖基化。谷氨酰胺合成酶的表達(dá)在歐洲專(zhuān)利216846、256055和323997以及歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)89303964.4中有完整或部分討論。
用在本發(fā)明中的抗體也可以通過(guò)制得目的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物或植物，并從中得到可回收形式的抗體，由轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生。轉(zhuǎn)基因抗體可以從山羊、牛或其它哺乳動(dòng)物的乳汁中產(chǎn)生并回收。如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
圖1顯示了下列抗CTLA-4抗體的全長(zhǎng)核苷酸和氨基酸序列4.1.1全長(zhǎng)4.1.1重鏈(cDNA 22(a)，基因組22(b)，和氨基酸22(c))；全長(zhǎng)去糖基化(aglycosylated)4.1.1重鏈(cDNA 22(d)和氨基酸22(e))；4.1.1輕鏈(cDNA 22(f)和氨基酸22(g))；4.8.1全長(zhǎng)4.8.1重鏈(cDNA 22(h)和氨基酸22(i))；4.8.1輕鏈(cDNA 22(j)和氨基酸22(k))；6.1.1全長(zhǎng)6.1.1重鏈(cDNA 22(l)和氨基酸22(m))；6.1.1輕鏈(cDNA 22(n)和氨基酸22(o))；11.2.1全長(zhǎng)11.2.1重鏈(cDNA 22(p)和氨基酸22(q))；和11.2.1輕鏈(cDNA 22(r)和氨基酸22(s))。
信號(hào)肽序列以粗體和大號(hào)字顯示。全長(zhǎng)4.1.1基因組DNA序列中的開(kāi)放閱讀框架(圖1(b))被加有下劃線(xiàn)。導(dǎo)入突變使4.1.1重鏈去糖基化以及發(fā)生的改變(N29Q)以雙下劃線(xiàn)和粗體字文本顯示(cDNA圖1(b)和氨基酸圖1(c))。
圖2顯示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列與種系DP-50(3-33)氨基酸序列之間的序列比對(duì)。種系DP-50序列與這些克隆的序列之間的差異用粗體表示。該圖也顯示了抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置。CDR1和CDR2序列的位置在所示表的邊緣用箭頭標(biāo)出。CDR3的氨基末端也在邊緣示出，但是羧基末端是可變的，在序列N末端附近的氨基酸結(jié)束。
圖3顯示克隆2.1.3的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列與種系DP-65(4-31)氨基酸序列之間的序列比較。種系DP-65種系序列與該克隆的序列之間的差異用粗體表示。該圖也顯示了該抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖4顯示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、4.10.2和4.13.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)27氨基酸序列之間的序列比較。種系A(chǔ)27序列與這些克隆的序列之間的差異用粗體表示。該圖也顯示了該抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下劃線(xiàn)標(biāo)出。在克隆4.8.1、4.14.3和6.1.1的CDR1s的明顯缺失用“Os”表示。
圖5顯示克隆3.1.1、11.2.1、11.6.1和11.7.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系O12氨基酸序列之間的序列比較。種系O12序列與這些克隆的序列之間的差異用粗體表示。該圖也顯示了抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖6顯示克隆2.1.3的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)10/A26氨基酸序列之間的序列比較。種系A(chǔ)10/A26序列與這些克隆的序列之間的差異用粗體表示。該圖也顯示了抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖7顯示克隆12.3.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)17氨基酸序列之間的序列比較。種系A(chǔ)17序列與這些克隆的序列之間的差異用粗體表示。該圖也顯示了抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
圖8顯示克隆12.9.1的預(yù)測(cè)的κ輕鏈氨基酸序列與種系A(chǔ)3/A19氨基酸序列之間的氨基酸序列比較。種系A(chǔ)3/A19序列與該克隆的序列之間的差異用粗體表示。該圖也顯示了抗體的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下劃線(xiàn)標(biāo)出。
下表顯示了本發(fā)明抗體的H和L鏈FR和CDR區(qū)從種系發(fā)生氨基酸改變的個(gè)數(shù)
序列表序列表<110>PFIZER PRODUCTS INC.<120>抗CTLA-4抗體的應(yīng)用<130>PC23019A<140><141><150>60/293042<151>2001-05-23<160>39<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>1392<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc 960gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380ccgggtaaat ga 1392<210>2<211>1999<212>DNA<213>人<400>2atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 420aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttggtga gaggccagct 720cagggaggga gggtgtctgc tggaagccag gctcagccct cctgcctgga cgcaccccgg 780ctgtgcagcc ccagcccagg gcagcaaggc aggccccatc tgtctcctca cccggaggcc 840tctgcccgcc ccactcatgc tcagggagag ggtcttctgg ctttttccac caggctccag 900gcaggcacag gctgggtgcc cctaccccag gcccttcaca cacaggggca ggtgcttggc 960tcagacctgc caaaagccat atccgggagg accctgcccc tgacctaagc cgaccccaaa 1020ggccaaactg tccactccct cagctcggac accttctctc ctcccagatc cgagtaactc 1080ccaatcttct ctctgcagag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc 1140cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1200agggacaggc cccagctggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcaccacct 1260gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1320cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag 1380ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc acgggaggag 1440cagttcaaca gcacgttccg tgtggtcagc gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg 1500aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa 1560accatctcca aaaccaaagg tgggacccgc ggggtatgag ggccacatgg acagaggccg 1620gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca 1740ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacacct cccatgctgg actccgacgg 1860ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 1920cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc 1980cctgtctccg ggtaaatga 1999<210>3<211>463<212>PRT<213>人<400>3Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly1 5 10 15Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Phe Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly115 120 125Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser130 135 140Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala145 150 155 160Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val165 170 175Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala180 185 190Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val195 200 205Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His210 215 220Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys225 230 235 240Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
245 250 255Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr260 265 270Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu275 280 285Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys290 295 300Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser305 310 315 320Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys325 330 335Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile340 345 350Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro355 360 365Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu370 375 380Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn385 390 395 400Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser405 410 415Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg420 425 430Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu435 440 445His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455 460<210>4<211>1392<212>DNA<213>人<400>4atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg caaatgttgt 720gtcgagtgcc caccgtgccc agcaccacct gtggcaggac cgtcagtctt cctcttcccc 780ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 840gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900cataatgcca agacaaagcc acgggaggag cagttccaaa gcacgttccg tgtggtcagc 960gtcctcaccg ttgtgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020aacaaaggcc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg gcagccccga 1080gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200gggcagccgg agaacaacta caagaccaca cctcccatgc tggactccga cggctccttc 1260ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380ccgggtaaat ga 1392<210>5<211>463<212>PRT<213>人<400>5Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly1 5 10 15Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
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權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物施用能有效治療所述癌癥量的人抗CTLA-4抗體，其中所述癌選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門(mén)區(qū)癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、兒童實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤和所述癌的組合。
2.權(quán)利要求1的方法，包括將所述抗體與選自下組的藥劑聯(lián)合施用給所述哺乳動(dòng)物化學(xué)治療劑、癌疫苗、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗血管劑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、抗增生劑、調(diào)亡誘導(dǎo)物和存活途徑抑制劑。
3.權(quán)利要求1的方法，包括將所述抗體與抗血管生成劑聯(lián)合施用，其中所述的抗血管生成劑選自MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)抑制劑、MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)抑制劑和COX-II(環(huán)加氧酶II)抑制劑。
4.權(quán)利要求1的方法，包括將所述抗體與化學(xué)治療劑聯(lián)合施用，其中所述的化學(xué)治療劑選自有絲分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長(zhǎng)因子抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物、抗激素、血管生成抑制劑和抗雄激素。
5.權(quán)利要求1的方法，包括將所述抗體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑聯(lián)合施用，其中所述的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑選自EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)抑制劑、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)抑制劑和erbB2受體抑制劑。
6.權(quán)利要求1的方法，包括將一定量的所述抗體與放射療法聯(lián)合處理哺乳動(dòng)物，其中聯(lián)合放射療法的抗體的量能有效抑制哺乳動(dòng)物的異常細(xì)胞生長(zhǎng)或治療過(guò)度增生性疾病。
7.權(quán)利要求1的方法，其中與CTLA-4結(jié)合的抗體具有下列特性與CTLA-4的結(jié)合親和力為大約10-9或更高；抑制CTLA-4和B7-1之間結(jié)合的IC50為大約100nM或更低；和抑制CTLA-4和B7-2之間結(jié)合的IC50為大約100nM或更低；并含有包含了人FR1、FR2和FR3氨基酸序列的重鏈氨基酸序列，該人FR1、FR2和FR3氨基酸序列對(duì)應(yīng)于VH3-33基因的那些，或其中發(fā)生了保守替代或體細(xì)胞突變，其中FR序列與CDR1、CDR2和CDR3序列相連，且其中所述抗體在輕鏈中也包含來(lái)自A27或O12基因的CDR區(qū)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的FR1、FR2或FR3序列由VH3-33基因發(fā)生體細(xì)胞突變產(chǎn)生。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體與具有選自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的抗體的重鏈和輕鏈氨基酸序列的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CTLA-4。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的抗體包含了含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.l3.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重鏈，和含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的輕鏈，或由所述CDR序列發(fā)生了序列改變，這種改變選自保守性改變，其中所述保守性改變選自非極性殘基被其它非極性殘基置換、極性不帶電荷殘基被其它極性不帶電荷殘基置換、極性帶電荷殘基被其它極性帶電荷殘基置換、和結(jié)構(gòu)相似殘基的置換；非保守性替代，其中所述非保守性替代選自極性帶電荷殘基替代極性不帶電荷殘基和非極性殘基替代極性殘基；添加；和缺失。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體包含了含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重鏈，和含有選自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗體的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的輕鏈。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體選自含有人3-33基因的重鏈氨基酸序列和人A27或O12基因的輕鏈氨基酸序列的抗體。
13.一種用于治療哺乳動(dòng)物癌癥的藥物組合物，其包含能有效治療所述癌癥量的人抗CTLA-4抗體和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述癌選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門(mén)區(qū)癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、兒童實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤，以及所述癌的組合。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，進(jìn)一步包含與所述抗體聯(lián)合能有效治療所述癌癥量的化學(xué)治療劑、癌疫苗、免疫調(diào)節(jié)劑、抗血管生成劑、抗血管劑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、抗增生劑、調(diào)亡誘導(dǎo)物和存活途徑抑制劑。
15.能有效治療哺乳動(dòng)物癌癥量的人抗CTLA-4抗體在制備治療所述癌癥的組合物中的應(yīng)用，其中所述癌選自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門(mén)區(qū)癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、兒童實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、T細(xì)胞淋巴瘤，以及所述癌的組合。
全文摘要
抗CTLA－4抗體，尤其是人抗CTLA－4抗體，如具有抗體3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的氨基酸序列的那些，用于治療某些癌癥。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1404876SQ02120349
公開(kāi)日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2002年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月23日
發(fā)明者D·C·漢森, E·E·米勒 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司