專利名稱：成纖維細胞生長因子13的抗體、拮抗劑及激動劑的制作方法
本申請是申請日為1995年6月5日、申請?zhí)枮?5197868.3、發(fā)明名稱為“成纖維細胞生長因子13”的中國專利申請的分案申請。
每種成員都具有與其它成員重疊的功能，也具有獨特的功能范圍。除了刺激血管內(nèi)皮細胞增殖外，F(xiàn)GF-1和2兩者都是內(nèi)皮細胞趨化性的，并且FGF-2已顯示出能夠使內(nèi)皮細胞穿透基底膜。FGF-1和2兩者都具有刺激血管形成的能力。這些生長因子的另一個重要特征是它們促進傷口愈合的能力。FGF家族的許多其它成員都具有與FGF-1和2類似的活性，例如促進血管形成和傷口愈合。FGF家族的幾個成員已顯示出誘導中胚層形成和調(diào)節(jié)神經(jīng)元細胞、脂肪細胞和骨骼肌細胞的分化。
除了在正常組織中的這些生物學活性外，已暗示FGF蛋白質通過促進腫瘤血管形成促進癌和肉瘤發(fā)生，當它們的表達失控時，其作為轉化蛋白質。
FGF家族目前由8個結構相關的多肽組成堿性FGF、酸性FGF、int2、hstl/k-FGF、FGF-5、FGF-6、角質形成細胞生長因子、AIGF(FGF-8)，神經(jīng)膠質激活因子最近被查明為新的肝素結合生長因子，其是從人類神經(jīng)膠質瘤細胞系培養(yǎng)物上清液純化的(Miyamoto，M.等，分子和細胞生物學，13(7)4251-4259(1993))。各種多肽的基因已被克隆和測序。兩個成員FGF-1和FGF-2被用許多名稱表征，但最常見的是分別被稱為酸性和堿性成纖維細胞生長因子。正?；虍a(chǎn)物影響大多數(shù)中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細胞的一般的增殖能力。它們能夠體內(nèi)誘導血管形成，并可能在早期發(fā)育中起重要作用(Burgess，W.H.和Maciag，T.，生物化學年評，58575-606，(1989))。
FGF家族的許多以上鑒定的成員也結合到相同的受體上，并通過結合這些受體引發(fā)第二信使(message)。
編碼分泌形式的FGF-1的真核表達系統(tǒng)已通過基因轉移引入到豬動脈中。這種模型確定了在動脈壁中的基因的功能。在基因轉移21天后，F(xiàn)GF-1的表達誘導豬動脈內(nèi)膜變厚(Nabel，E.G.，等，自然，362844-6(1993))。已進一步地闡明，堿性成纖維細胞生長因子可以調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質瘤生長，并且不依賴于其在腫瘤血管形成中的作用進行，也闡明堿性成纖維細胞生長因子釋放或分泌對這些作用可能是需要的(Morrison，R.S.，等，神經(jīng)科學研究雜志，34502-9(1993))。
還有暗示成纖維細胞生長因子(如堿性FGF)在體外卡波濟氏肉瘤細胞的生長中起作用(Huang，Y.Q.，等，J.Clin.Invest.，911191-7(1993))。編碼人類堿性成纖維細胞生長因子的cDNA序列已被克隆到由噬菌體T7RNA聚合酶識別的轉錄啟動子下游。如此獲得的堿性成纖維細胞生長因子在致有絲分裂性(mitogenicity)、血纖蛋白溶酶原激活劑合成和血管形成測定中被查明具有與人類胎盤成纖維細胞生長因子無法區(qū)別的生物學活性(Squires，C.H.，等，生物化學雜志，26316297-302(1988))。
美國專利5,155,214公開了實質上純化的哺乳動物堿性成纖維細胞生長因子和其生產(chǎn)方法，公開了牛和人類堿性成纖維細胞生長因子的氨基酸序列，以及編碼牛物種多肽的DNA序列。
新發(fā)現(xiàn)的FGF-9具有與FGF家族其他成員約30％的序列相似性。在FGF-9序列中，兩個半胱氨酸殘基和該家族成員的其它共有序列得到保留。已發(fā)現(xiàn)FGF-9不具備酸性和堿性FGF中的那些N-末端典型的信號序列。然而，發(fā)現(xiàn)盡管其缺乏典型的信號序列FGF，但FGF-9在合成后從細胞分泌(Miyamoto，M.等，分子和細胞生物學，13(7)4251-4259(1993)。此外，發(fā)現(xiàn)FGF-9刺激少突神經(jīng)膠質細胞2型星形細胞祖細胞、BALB/c3T3和PC-12細胞的細胞增殖，但不刺激人類臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞增殖(Naruo，K.，等，生物化學雜志，2682857-2864(1993)。
堿性FGF和酸性FGF是細胞增殖、細胞移動、分化和存活的有力的調(diào)節(jié)物，并作用于來源于外胚層，中胚層和內(nèi)胚層的細胞類型上。這兩種FGF以及KGF和AIGF經(jīng)蛋白質純化鑒別。然而，其他四個成員作為癌基因分離，其表達限于胚胎發(fā)生和某些類型癌癥中。已查明FGF-9是針對神經(jīng)膠質細胞的促細胞分裂劑。已報道FGF家族的成員具有瘤形成潛力。當轉化進BALB/c3T3細胞中時，F(xiàn)GF-9已顯示出轉化潛力(Miyamoto，M.，等，分子和細胞生物學，13(7)4251-4259(1993)。
通過用睪酮刺激已從小鼠乳房癌細胞(SC-3)的條件培養(yǎng)基純化出也被稱作FGF-8的雄性激素誘導的生長因子(AIGF)。AIGF是明顯的類FGF-生長因子，具有推定的信號肽序列，并具有與FGF家族已知成員30-40％的同源性。用AIGF轉化的哺乳動物細胞顯示出在不存在雄性激素時對SC-3細胞明顯的刺激作用。因此，AIGF介導SC-3細胞(可能還有其他細胞)的雄性激素誘導性生長，因為其被腫瘤細胞自身分泌。
按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了新的成熟多肽以及其生物活性的并且在診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的多肽是人源的。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其反義類似物和其生物學活性的并且在診斷上或治療上有用的片段和衍生物。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)重組技術生產(chǎn)這種多肽的方法，在所說的重組技術中采用了重組載體(例如，在重組生產(chǎn)本發(fā)明的多肽中作為反應劑有用的克隆和表達質粒)以及含有編碼本發(fā)明多肽之核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸用于篩選激動劑和拮抗劑以及用于治療的方法，所述治療方法例如，促進傷口(如燒傷和潰瘍形成的)愈合、預防與中風相關的神經(jīng)元損傷和由于神經(jīng)元紊亂引起的神經(jīng)元損傷、促進神經(jīng)元生長、防止皮膚老化和頭發(fā)脫落、刺激血管形成、刺激早期胚中的中胚層誘導和肢體再生。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了這些多肽的抗體。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了所說的多肽的拮抗劑和將其用于抑制這些多肽的作用的方法，例如，治療細胞轉化(如，腫瘤)，降低瘢痕形成和治療血管過多(hyper-vascular)病。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了核酸探針，這種核酸探針包含長度足以特異性地與編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸雜交的核酸分子。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了檢測與本發(fā)明的核酸序列中的突變相關的疾病或對疾病的易感性以及檢測由所述序列編碼的多肽的過量表達之診斷測定方法。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了將這些多肽，或編碼這些多肽的多核苷酸體外用于與科學研究、DNA合成及DNA載體的制備有關之目的的方法。
從本文的教導中，本領域技術人員會清楚本發(fā)明的這些和其它方面。


下列附圖僅僅用來說明本發(fā)明的實施方案，而無意于用來限制本發(fā)明權利要求所包括的范圍。
圖1描述了FGF-13的cDNA序列及相應的推導的氨基酸序列，頭21個氨基酸殘基代表推定的前導序列。
編碼本發(fā)明的FGF-13多肽的多核苷酸首先在來源于人卵巢癌組織的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。FGF-13多肽在結構上和成纖維細胞家族所有成員相關，其包含一個編碼212個氨基酸的多肽的開放讀框，其中頭21個氨基酸代表一推定的前導序列，因此成熟多肽有191個氨基酸。最匹配的情況是1)與小鼠AIGF在一段185個氨基酸序列上有69％的相同性和81％的相似性；2)與雞FGF-4在一段82個氨基酸序列上具有30％的相同性和56％的相似性；3)與人KGF在一段78個氨基酸的序列上有41％相同性和64％相似性。
在本發(fā)明的多肽中，F(xiàn)GF/HBGF家族的標記GXLX(S，T，A，G)X6(D，E)CXFXE(X指任何氨基酸，(D，E)指D或E殘基，X6指任何6個氨基酸殘基)是保守的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1所示的編碼序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的編碼序列相同；由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其能和圖1的DNA(SEQ ID NO1)或所說保藏物的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽(SEQ ID NO2)或編碼由所述所說保藏物的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如前導或分泌序列或蛋白原(proprotein)序列；編碼成熟多肽的編碼序列(和可有可無的附加的編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列。
這樣，“編碼多肽的多核苷酸”這一術語包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖1的推導的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產(chǎn)生的多核苷酸等位變體或是非天然產(chǎn)生的多核苷酸變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼如圖1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、衍生物和類似物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一種編碼序列，該序列是圖1中所示的編碼序列(SEQ ID NO1)或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體。本領域已知等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加，而實質上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明也包括這樣的多核苷酸，其中所說的成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框架中與幫助宿主細胞中表達和分泌多肽的多核苷酸序列融合，所述的多核苷酸序列如作為分泌序列在控制多肽從細胞轉運中起作用的前導序列。具有前導序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且可以具有由宿主細胞切割形成成熟形式的多肽的前導序列。這種多核苷酸也編碼蛋白原(proprotein)，這種蛋白原是添加有附加的5’氨基酸殘基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一種無活性的蛋白形式。一旦切除原序列，留下的是有活性的成熟蛋白。
這樣，例如本發(fā)明的多核苷酸可以編碼一種成熟蛋白或編碼具有原序列的蛋白質或編碼既有原序列又有前序列(presequence)(前導序列)的蛋白質。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標記序列融合的編碼序列，所述的標記序列使得可以純化本發(fā)明的多核苷酸。在細菌宿主的情況下，所述的標記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標記，其用來純化融合有標記的成熟多肽，或者例如當使用哺乳動物細胞(如COS-7細胞)時，標記序列可以是血細胞凝集素(HA)標記。所說的HA標記相應于來源于流感血細胞凝集素蛋白質的一種表位(Wilson，I.，等，細胞，37767(1984))。
術語“基因”是指和產(chǎn)生多肽鏈有關的DNA區(qū)段；其包括編碼區(qū)前面的區(qū)域和隨后的區(qū)域(前導區(qū)和尾隨序列)以及在各個編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
全長FGF-13基因的片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，用來分離全長基因和與此基因有高度的序列類似性或類似生物活性的其它基因。這種類型的探針優(yōu)選地是具有至少30個堿基，并且可以含有，例如50個或更多的堿基。所說的探針也可以用于鑒別相應于全長轉錄物的cDNA克隆和含有包含調(diào)節(jié)和啟動子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子的完整FGF-13基因的基因組克隆。篩選的實例包括通過利用已知DNA序列合成寡核苷酸探針來分離FGF-13基因的編碼區(qū)。具有互補于本發(fā)明的基因序列之序列的標記寡核苷酸可以用來篩選人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，以確定探針和哪些文庫成員雜交。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(條件是兩個序列之間具有至少70％，優(yōu)選地具有至少90％，更優(yōu)選地具有至少95％的相同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術語“嚴格條件”指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選地具有至少97％的相同性時雜交才可以發(fā)生。在一個優(yōu)選的實施方案中，與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實質上保持與由圖1的cDNA(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA(s)編碼的成熟多肽相同的生物學功能或活性。
此外，所述多核苷酸可以具有至少20個堿基，優(yōu)選地是至少30個堿基，更優(yōu)選地是至少50個堿基，其與本發(fā)明的多核苷酸雜交，并且具有如上文所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，這種多核苷酸可以用作SEQ ID NO1多核苷酸的探針，例如用于回收多核苷酸或者作為診斷探針或作為PCR引物。
這樣，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID NO2多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，優(yōu)選地至少90％相同性并且更優(yōu)選地至少95％相同性的多核苷酸及其片段(這種片段具有至少30個堿基，優(yōu)選地至少50個堿基)和這些多核苷酸編碼的多肽。
本文所提及的保藏物將按照用于專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定保持。這些保持物僅僅是為了給本領域技術人員提供方便，并不是35U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾。對保藏材料的任何制造、使用或者銷售需要經(jīng)過許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1的推導的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的FGF多肽或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽，以及這種多肽的片段、類似物和衍生物。
術語“片段”、“衍生物”和“類似物”，當有關圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽時，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。這樣，類似物包括蛋白原，這種類似物可以由蛋白原部分切除進而產(chǎn)生活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
所說的圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代(優(yōu)選地是保守氨基酸殘基取代)并且取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的氨基酸殘基，或者(ii)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基，或者(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)這樣一種，其中附加氨基酸與成熟多肽融合，例如前導或分泌序列或用來純化成熟多肽的序列或原序列。通過本文的闡述，可以認為這樣的片段、衍生物以及類似物在本領域技術人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明優(yōu)選地是提供分離形式的多肽和多核苷酸，并且優(yōu)選地是將所述多肽和多核苷酸純化成同質性的。
術語“分離的”意指所述的物質脫離了其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然產(chǎn)生的)。例如，一種存在于活的動物中的天然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因為這種載體或者組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽(特別是成熟多肽)以及和SEQ ID NO2的多肽具有至少70％的相似性(最好是70％的相同性)，更優(yōu)選地是90％的相似性(最好是90％的相同性)，最優(yōu)選地是95％的相似性(最好是95％相同性)的多肽，也包括這些多肽的部分，這種多肽的部分通常包含至少30個氨基酸，并且優(yōu)選地是至少50個氨基酸。
如本領域所熟知的，兩個多肽之間的“相似性”是通過比較一個多肽和另一個多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代來確定的。
本發(fā)明多肽的片段或部分通過肽合成可以用于產(chǎn)生相應的全長多肽；因此，此片段可以用作產(chǎn)生全長多肽的中間體。本發(fā)明多核苷酸的片段或部分可以用于合成本發(fā)明的全長多核苷酸。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程操作(轉導、轉化或轉染)產(chǎn)生的，所說的載體可以是克隆載體或表達載體。該載體可以是例如，質粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程化宿主細胞可以在改良的適于激活啟動子、選擇轉化體或擴增FGF基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，例如溫度和pH值等，是以前用于表達選擇的宿主細胞的那些，對普通技術人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來經(jīng)重組技術生產(chǎn)多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用于表達多肽的表達載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV 40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；酵母質粒；質粒和噬菌體DNA組合衍生的載體、病毒DNA(如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和假狂犬病病毒)。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可復制和穩(wěn)定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領域已知的方法將DNA序列插入到適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點。這樣的方法和其它方法被認為在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。
在表達載體中的所說的DNA序列是可操作地連接到適當?shù)闹笇RNA合成的表達控制序列(啟動子)上的。這樣的啟動子的代表性例子可以提到的是LTR或SV 40啟動子，大腸桿菌的lac或trp、噬菌體λPL啟動子，和已知在原核或真核細胞或它們的病毒中控制基因表達的其它啟動子。所說的表達載體也包含用于翻譯起始和轉錄終止的核糖體結合位點。該載體也可以包含供擴增表達的合適的序列。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型特征，例如真核細胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
包含以上所述的適當?shù)腄NA序列以及適當?shù)膯佑杌蛘呖刂菩蛄械妮d體可以用于轉化適當?shù)乃拗?，以使其能夠表達蛋白質。作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細菌細胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞如果蠅S2和Spodoptera Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細胞等。通過本文的闡述，對適當?shù)乃拗鞯倪x擇在本領域技術人員的知識范圍之內(nèi)。
更具體地說，本發(fā)明也包括重組構建體，該構建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構建體包含載體，如質?；虿《镜妮d體，該載體已正向或反向插入了本發(fā)明的序列。在這一實施方案的更為理想的情況下，構建體還包含可操作連接到所述序列上的調(diào)節(jié)序列，包括，例如，啟動子。大量適合的載體和啟動子是本領域技術人員已知的，并且是通過商業(yè)途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體細菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)、pTRC99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質?；蜉d體都可以使用，只要它們在宿主中可復制和穩(wěn)定。
可以用CAT(氯霉素轉移酶)載體或其它帶有選擇性標記的載體從任何所需的基因選擇啟動子區(qū)。兩種合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對適當?shù)妮d體與啟動子的選擇在本領域普通技術人員的水平之內(nèi)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含以上所述構建體的宿主細胞。所說的宿主細胞可以是高等真核細胞(如哺乳動物細胞)，或低等真核細胞(如酵母細胞)，或者宿主細胞可以是原核細胞(如細菌細胞)?？梢杂闪姿徕}轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染，或電穿孔有效地將構建體引入到宿主細胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學中的基本方法，(1986))。
宿主細胞中的構建體可以用來以常規(guī)方式生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的多肽可以由常規(guī)肽合成器合成產(chǎn)生。
成熟蛋白質可以在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中在適當?shù)膯幼涌刂葡卤磉_。采用來源于本發(fā)明的DNA構建體的RNA，無細胞翻譯系統(tǒng)也可以用來生產(chǎn)這種蛋白質。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文-并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達載體。
編碼本發(fā)明的多肽的DNA在高等真核生物的轉錄被插入到載體中的增強子序列增強。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動子上增加其轉錄。例子包括復制起點晚期側100至270bp上的SV40增強子、細胞肥大病毒早期啟動子增強子、復制起點晚期側上的多形瘤增強子以及腺病毒增強子。
一般來說，重組表達載體包括復制起點和允許宿主細胞轉化的選擇性標記(例如，大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源于高表達基因的指導下游結構序列轉錄的啟動子。這樣的啟動子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質等的操縱子。異源結構序列以合適的方式(phase)與翻譯起始和終止序列裝配，優(yōu)選地，與能夠指導翻譯的蛋白質分泌進周質空間或細胞外培養(yǎng)基的前導序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，這種蛋白質包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性或簡化純化步驟。
通過將編碼所需蛋白質的結構DNA序列及合適的翻譯起始和終止信號以可操作閱讀方式(reading phase)與具有功能性啟動子一起插入來構建用于細菌的有用的表達載體。所說載體包含一個或多個表型選擇性標記和復制起點，以在宿主來保證保持載體和需要時提供擴增。適合轉化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種，當然其它的菌也可以選擇來使用。
作為代表性的但不是限制性的例子，用于細菌的有用的表達載體可以包含源于市售質粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件)的選擇性標記和細菌復制起點。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322“骨架”片段與適當?shù)膯幼雍痛磉_的結構序列組合。
在合適的宿主菌株轉化和宿主菌株生長至適當?shù)募毎芏戎?，用合適的方法(例如溫度變換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞培養(yǎng)另外一段時間。
典型地經(jīng)離心收獲細胞，經(jīng)物理或化學方法破碎細胞，保持所形成的粗產(chǎn)物用于進一步的純化。
可以經(jīng)任何常規(guī)的方法破碎用于表達蛋白質的微生物細胞，所述方法包括凍融循環(huán)、超聲處理、機械破碎或使用細胞裂解劑。
各種哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達重組蛋白質。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括由Gluzman(細胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細胞COS-7細胞系和其它能夠表達相容載體的細胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包含復制起點、適合的啟動子和增強子，也可以包含任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列和5’側翼非轉錄序列。得自SV40病毒基因組的DNA序列如SV40起點、早期啟動子、增強子、剪接體和聚腺苷酸化位點的可以用來提供所需的非轉錄遺傳元件。
本發(fā)明的多肽可以用多種方法從重組細胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時在完成成熟蛋白質的構型中可以使用蛋白質再折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學合成方法的產(chǎn)物，或經(jīng)重組技術從原核或真核宿主(例如細菌、酵母、高等植物、培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動物細胞)生產(chǎn)的。依據(jù)重組生產(chǎn)方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸殘基。
由于具有刺激血管內(nèi)皮細胞生長的能力，本發(fā)明的多肽可以用于刺激由各種疾病(如血栓形成，動脈硬化和其它心血管疾病)引起的局部缺血組織的血管再形成(revascularization)的治療。這些多肽也可以用于刺激血管形成和肢體再生。
所述多肽也可以用于治療損傷傷口、燒傷、手術后組織修復和潰瘍，因為它們對不同來源的各種細胞(如成纖維細胞和骨骼肌細胞)是促有絲分裂的。并且因此促進損傷或患病組織的修復或替代。
所述多肽也可以用于刺激神經(jīng)元生長，用于治療和預防與中風相關的神經(jīng)元損傷和在某些神經(jīng)元紊亂或神經(jīng)衰弱病(阿耳茨海默氏病、帕金森氏病和AIDS-相關綜合癥)中出現(xiàn)的神經(jīng)元損傷。FGF-13具有刺激軟骨細胞生長的能力，因此，它們可以用于增強骨和牙周再生以及幫助組織移植和骨移植。
本發(fā)明的多肽也可以通過刺激角質形成細胞的生長預防由曬傷引起的皮膚老化。
FGF-13多肽也可以用于預防脫發(fā)，因為FGF家族成員激活毛發(fā)生成細胞，并促進黑素細胞生長。同時，本發(fā)明的多肽在與其它細胞因子組合使用時，也可以用于刺激生血細胞和骨髓細胞的生長和分化。
FGF-13多肽也可以用于在移植之前保持器官或者支持初生組織的細胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明的多肽也可以用于在早期胚中誘導中胚層來源的細胞分化。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了為了科研、DNA合成，DNA載體制備相關的體外目的和提供人類疾病之診斷劑和治療劑相關的目的利用這種多肽或編碼這些多肽的多核苷酸的方法。
本發(fā)明提供了鑒別本發(fā)明的多肽之受體的方法?？梢杂迷S多本領域技術人員已知的方法鑒別編碼所說受體的基因，所述方法如配體淘選和FACS分選(Coligan等，免疫學當代方案，1(2)，第5章，(1991))。優(yōu)選地，使用表達克隆，其中從對所述多肽反應性的細胞(例如，已知含有FGF家族蛋白質的若干受體的NIH3T3細胞和SC-3細胞)制備多聚腺苷酸RNA，將從這一RNA產(chǎn)生的cDNA文庫分成多個集合體，用于轉染COS細胞或對所述多肽非反應性的其它細胞。使生長在載玻片上的轉染細胞與標記的本發(fā)明的多肽接觸，所述多肽可以由多種方法(包括碘化或引入位點特異性蛋白質激酶識別位點)標記。
在固定和溫育后，將載玻片進行放射自顯影分析。鑒別陽性集合體，通過重復亞集合和再篩選方法制備和再轉染亞集合體，最終產(chǎn)生編碼推定的受體的單克隆。
受體鑒別的另一種方法是可以將標記的多肽與表達受體分子的細胞膜和抽提物光親和連接，經(jīng)PAGE分離交聯(lián)材料，并對X-光膠片曝光?？梢郧邢掳龆嚯氖荏w的標記復合物，分離成肽片段進行蛋白質微測序。從微測序獲得的氨基酸序列用于設計一套篩選cDNA文庫的簡并寡核苷酸探針，以鑒別編碼推定的受體的基因。
本發(fā)明提供了篩選化合物以鑒別調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽的作用的化合物的方法。這種檢測的一個例子包括在成纖維細胞正常增殖的條件下將哺乳動物成纖維細胞、本發(fā)明的多肽，待篩選的化合物和3[H]胸苷混合?？梢栽诓淮嬖诖Y選化合物下進行對照測定，并將其與存在所述化合物時的成纖維細胞增殖的量比較，從而通過測定每種情況下3[H]胸苷的攝入確定所述化合物是否刺激增殖。通過測定3[H]胸苷摻入的液體閃爍計數(shù)測定成纖維細胞增殖的量。激動劑和拮抗劑化合物兩者均可以通過這一方法鑒別。
在另一種方法中，將哺乳動物細胞或者表達本發(fā)明的多肽之受體的膜制劑在所述化合物存在下與本發(fā)明的標記的多肽一起培養(yǎng)。然后測定所述化合物增強或阻斷這一相互作用的能力?；蛘撸瑴y定在待篩選的化合物與FGF-13受體相互作用后的已知第二信使系統(tǒng)的反應，并測定所述化合物結合受體和引發(fā)第二信使反應的能力，以確定所述化合物是否是潛在的激動劑或拮抗劑。這種第二信使系統(tǒng)包括但不限于cAMP鳥苷酸環(huán)化酶、酪氨酸磷酸化作用、離子通道或者磷酸肌醇水解作用。
拮抗劑化合物的例子包括抗體，或者在某些情況下包括寡核苷酸，其結合本發(fā)明的多肽的受體，但不引發(fā)第二信使反應或者它們結合FGF-13多肽本身。此外，潛在的拮抗劑可以是所述多肽的突變形式，其結合所述受體但不引發(fā)第二信使反應，因此，所述多肽的作用被有效地阻斷。
另一個FGF-13基因和基因產(chǎn)物的拮抗劑化合物是采用反義技術制備的反義構建體。反義技術可以通過三螺旋形成或反義DNA或者RNA來控制基因的表達，這兩種方法都基于多核苷酸和DNA或者RNA的結合。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用來設計長度約10至40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設計成與轉錄所涉及的基因區(qū)互補(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學，241456，(1988)；和Dervan等，科學，2511360(1991))，進而阻止本發(fā)明多肽的轉錄和產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)和mRNA雜交，并阻斷mRNA分子翻譯成為本發(fā)明的多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑(CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細胞中，以便可以體內(nèi)表達反義RNA和DNA，抑制本發(fā)明多肽的產(chǎn)生。
潛在的拮抗劑化合物也包括小分子，這些小分子結合到受體的結合位點上并占據(jù)該位點，使得受體不能接近其多肽，由此阻止正常的生物學活性。小分子的例子包括但不限于小肽或類肽分子。
拮抗劑化合物也可以用于在腫瘤細胞和組織上抑制本發(fā)明多肽的細胞生長和增殖作用(即腫瘤血管發(fā)生的刺激作用)，并且因此在例如腫瘤形成和生長中延遲或阻止異常細胞生長和增殖。
所述拮抗劑也可以用于預防血管過多病和在囊外白內(nèi)障手術后預防上皮晶狀體細胞增殖。在例如氣囊血管成形術后的再狹窄的情況下，阻斷本發(fā)明的多肽的致有絲分裂活性也可能是所需的。
所述拮抗劑也可以用于在傷口愈合期間阻止瘢痕組織生長。
所述拮抗劑可以與如下所述的藥學上可接受的載體一起用于組合物中。
本發(fā)明的多肽、激動劑和拮抗劑可以與合適的藥物載體組合使用，以構成供腸胃外施用的藥物組合物，這樣的組合物包含治療有效量的所說多肽和藥學上可接受的載體或者賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它們的組合物。其配方應該適宜于施用的方式。
本發(fā)明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個或多個填裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。這種容器中可以附有管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機構規(guī)定形式的告示，這一告示反映了制造、使用或銷售人類使用品得到政府機構的同意。此外，本發(fā)明的多肽、激動劑和拮抗劑可以與其它治療化合物結合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數(shù)情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數(shù)情況之下，考慮用藥途徑和病癥等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。在局部施用的特定情況下，優(yōu)選地以從約0.1μg到9mg/cm2的劑量施用。
本發(fā)明的多肽和多肽形式的激動劑和拮抗劑，可以依據(jù)本發(fā)明通過體內(nèi)表達這樣的多肽來利用，這常被稱作“基因治療”。
這樣，例如，可以體外對細胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)進行基因工程操作，用工程細胞向被治療的患者提供所說的多肽。這樣的方法是本領域眾所周知的，并且由本文的描述也顯而易見。例如，可以用本領域公知的方法用包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒對細胞進行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領域已知的方法體內(nèi)對細胞進行基因工程操作，以便體內(nèi)表達多肽。如本領域已知的，產(chǎn)生包含編碼本發(fā)明的多肽之RNA的逆轉錄病毒顆粒的生產(chǎn)細胞可以施用到患者以便體內(nèi)經(jīng)基因工程操作細胞并體內(nèi)表達所說的多肽。經(jīng)本發(fā)明的描述，通過這種方式施用本發(fā)明多肽的這些或其它方法對本領域技術人員是清楚的。例如，經(jīng)基因工程操作細胞的載體可以不是逆轉錄病毒顆粒，而是如腺病毒，其可以在與合適的運送載體組合后用于體內(nèi)經(jīng)基因工程操作細胞。
可以衍生上文描述的反轉錄病毒質粒載體的反轉錄病毒包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類自血病病毒、長臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳房腫瘤病毒。在一個實施方案中，反轉錄病毒質粒載體來自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個或多個啟動子?？梢允褂玫暮线m的啟動子包括但不限于反轉錄病毒LTR；SV 40啟動子；和人類巨細胞病毒(CMV)啟動子(Miller，等，生物技術，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或者其它任何啟動子(例如真核細胞啟動子，如包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。使用的其它病毒啟動子包括但不限于腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。通過本文的描述，合適的啟動子的選擇在本領域技術人員的知識范圍內(nèi)。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在合適的啟動子控制下。可以使用的合適的啟動子包括，但不限于腺病毒啟動子(如腺病毒主要晚期啟動子)；或者異源啟動子(如巨細胞病毒(CMV)啟動子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子；可誘導的啟動子(如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子)；熱休克啟動子；清蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子(如單純皰疹胸苷激酶啟動子)；反轉錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人類生長激素啟動子。所說的啟動子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動子。
使用反轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系以便形成生產(chǎn)細胞系?？梢员晦D染的包裝細胞的例子包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PAl2、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAml2和DAN細胞系(Miller，人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部內(nèi)容本文一并參考)?？梢酝ㄟ^本領域任何已知的方法用所述載體轉導包裝細胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質體和CaPO4沉淀。另外，反轉錄病毒質粒載體可以包在脂質體中，或者和脂類偶聯(lián)，然后施用到宿主中。
生產(chǎn)細胞系產(chǎn)生感染性的反轉錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然后可以使用這些反轉錄病毒載體顆粒體內(nèi)或者體外轉導真核細胞。轉導的真核細胞將表達編碼所述多肽的核酸序列?？杀晦D導的真核細胞包括但不限于胚干細胞、胚癌細胞、以及造血干細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質化細胞、內(nèi)皮細胞和支氣管上皮細胞。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的基因作為診斷測定的一部分的用途，用以檢測與編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列中的突變相關的疾病或疾病易感性。
可以用各種技術在DNA水平上檢測具有本發(fā)明的基因突變的個體?？梢詮幕颊叩募毎?如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸?；蚪MDNA可以直接用于檢測，或者在分析前用PCR酶促擴增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。作為一個例子，可以用與編碼本發(fā)明多肽的核酸互補的PCR引物鑒別和分析其突變。例如，可以通過與正常遺傳型比較的擴增產(chǎn)物大小上的改變來檢測缺失或者插入。點突變可以經(jīng)擴增的DNA與放射性標記的RNA或者放射性標記的反義DNA序列雜交鑒別。經(jīng)核糖核酸酶A消化，或者從熔點溫度的不同辨別完全配對的序列和錯配雙鏈體。
基于DNA序列差異的遺傳試驗可以通過檢測在有或沒有變性劑時凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上區(qū)別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的熔點或部分融化溫度而停滯在凝膠的不同位置(參見，例如，Myers等，科學，2301242(1985))。
也可以由核酸酶保護測定法揭示特定位置上的序列變化，所述測定法如核糖核酸酶保護和S1保護以及化學裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測特定DNA序列，所述方法例如雜交、核糖核酸酶保護、化學裂解、直接DNA測序、或使用限制酶(例如，限制片段長度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法。
除很多常規(guī)凝膠電泳和DNA測序法之外，也可用原位分析檢測突變。
因為相對于正常組織樣品所說的多肽的過量表達可以檢測異常細胞增殖(例如，腫瘤)的存在，所以，本發(fā)明也涉及用于檢測各種組織中FGF-13蛋白質之改變的水平的診斷分析方法。用于檢測得自宿主的樣品中該蛋白質水平的分析方法對本領域的技術人員是公知的，所說的方法包括放射免疫測定、競爭結合測定、Western印跡分析，ELISA測定和“夾心”分析。ELISA測定(Coligan，et al.，免疫學常用方法，1(2)，第6章，(1991))最初包括制備本發(fā)明多肽之抗原的特異性抗體，優(yōu)選地是單克隆抗體。此外，制備單克隆抗體的報道抗體。將可檢測的試劑和報道抗體結合，所說的試劑如放射性、熒光或者在這一實例中是辣根過氧化物酶。由宿主獲得樣品，并將其在與樣品中蛋白質結合的固體支持物(如聚苯乙烯皿)中溫育。通過和非特異性蛋白質(如牛血清清蛋白)一起溫育，將覆蓋皿中任何自由的蛋白質結合位點。接下來將單克隆抗體在皿中溫育，在此期間單克隆抗體和結合到聚苯乙烯皿上的任何本發(fā)明多肽結合。用緩沖液將所有未結合的單克隆抗體洗掉。此時，將和辣根過氧化物酶連接的報道抗體放入皿中，結果導致報道抗體和任何結合到感興趣蛋白上的單克隆抗體結合。
然后將未結合的單克隆抗體洗掉。接著向皿中加入過氧化物酶底物，和標準曲線比較，在給定時間內(nèi)產(chǎn)生的顏色的量即是給定體積的患者樣品中存在的蛋白質的量。
也可以使用競爭測定，其中將對本發(fā)明的多肽特異性的抗體連接到固體支持物上，使標記的FGF-13和來源于宿主的樣品通過固體支持物，經(jīng)例如液體閃爍計數(shù)檢測的標記的量可以與樣品中本發(fā)明的多肽的量相關聯(lián)。
“夾心”分析與ELISA測定類似，在“夾心”分析中，將本發(fā)明的多肽通過一固體支持物并與固體支持物上附著的抗體結合，然后將第二抗體與感興趣的多肽結合，之后將標記的并特異于第二抗體的第三抗體通過固體支持物并與第二抗體結合，接著定量。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列特異地靶向位于單個的人染色體上的特定位置并能與之雜交。此外，現(xiàn)在需要鑒定染色體上的特定位點。目前，僅有少數(shù)幾種以實際的序列數(shù)據(jù)(重復多態(tài)性)為基礎的染色體標記試劑可以用于標記染色體的位置。本發(fā)明的DNA染色體作圖是將這些序列和疾病相關基因相關聯(lián)的重要的第一步。
簡而言之，通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)便可以把序列定位到染色體上。采用3’未翻譯區(qū)域的計算機分析可以快速地選擇引物，其中引物不應跨越超過基因組DNA上的一個外顯子，否則使得擴增方法復雜化。然后采用這些引物用于PCR篩選含有單個的人染色體的體細胞雜交體。只有那些含有與該引物對應的人基因的雜交體才會生產(chǎn)擴增片段。
體細胞雜交體的PCR作圖是將一個特定的DNA定位于特定的染色體上的快速程序。根據(jù)本發(fā)明采用同樣的寡核苷酸引物，用來自于特定染色體或者大基因組克隆集合體的一組片段、按照類似方式可以實現(xiàn)亞定位(sublocalization)?？梢灶愃频赜糜趯θ旧w作圖的其它的作圖策略包括原位雜交，用標記的經(jīng)流式分選的染色體進行預篩選以及通過雜交進行預選，從而構建出染色體特異性的cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來實現(xiàn)一步法準確染色體定位。該技術可以采用50或60個堿基長短的cDNA。關于該技術的綜述參閱Verma等，人類染色體基本技術手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列已定位到一個準確的染色體位置，則染色體上該序列的物理位置可與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關聯(lián)。這些數(shù)據(jù)例如可在V.McKusick，人類的孟德爾遺傳中找到(可以通過Johns Hopkins大學Welch醫(yī)學文庫聯(lián)機得到)。然后通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)來鑒定基因與已定位到相同染色體區(qū)域上的疾病之間的關系。
接下來需要測定在受影響的和未受影響的個體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果突變是在一些或所有的受影響個體中觀察到的、但是又沒有在任何一個正常個體中被觀察到的話，那么該突變可能是疾病的病因。
根據(jù)物理作圖和遺傳作圖技術目前的分辨率，一個被準確定位到與疾病有關的染色體區(qū)域的cDNA可以是50-500個潛在的致病(causative)基因中的一種(其中假定有1兆堿基的作圖分辨率且每20kb為一個基因)。
所述的多肽、其片段或衍生物或類似物、或者表達上述物質的細胞可以用作生產(chǎn)其抗體的免疫原。這些抗體可以是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合，單鏈和人源化的抗體，以及Fab片段或Fab表達文庫的產(chǎn)物。本領域已知的多種方法可以用于生產(chǎn)這些抗體和片段。
針對相應于本發(fā)明的序列的多肽而產(chǎn)生的抗體可以通過將該多肽直接注射入動物體內(nèi)或者通過將該多肽向動物給藥來得到，其中的動物優(yōu)選非人類。然后，如此得到的抗體會結合到該多肽上。通過這種方式，即使是僅僅編碼該多肽的一個片段的序列也可用于產(chǎn)生能結合整個天然多肽的抗體。然后，該抗體可以用于從表達該多肽的組織中分離這種多肽。
為了制備單克隆抗體，可以采用任何一種通過連續(xù)的細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)抗體的技術。例子包括雜交瘤技術(Kohler與Milstein，1975，自然，256495-497)，三體雜交瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983，今日免疫學，472)以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole，等，1985，單克隆抗體與癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以將用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)進行修改從而生產(chǎn)針對本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。也可以使用轉基因小鼠來表達針對本發(fā)明免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
本發(fā)明將參照下面的實施例進一步加以說明；但是，應當了解本發(fā)明并不局限于這些實施例。除非另作聲明的以外，所有的份或量均為重量。
為了利于理解以下的實施例，現(xiàn)敘述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術語。
“質粒”通過一個在前的小寫p和/或跟隨幾個大寫字母和/或數(shù)字加以命名。本文中的起始質粒或者可以通過商業(yè)途徑得到或在不受限制的基礎上公眾可得到，或者可以根據(jù)已公開的方法從可得到的質粒中構建出來。此外，對于與那些所述等價的質粒是本領域已知的并且對本領域普通技術人員是顯而易見的。
DNA的“消化”是指用一種僅對DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多種限制性酶可以通過商業(yè)途徑得到，并且其反應條件、輔因子和其它使用要求對本領域普通技術人員是已知的。為了分析目的，通常把1μg的質粒或DNA片段與溶于約20μl緩沖溶液的約2單位的酶一起使用。為了分離用于質粒構建的DNA片段，通常在一個更大的體積內(nèi)用20至250單位的酶消化5至50μg的DNA。針對具體的限制性酶而言，合適的緩沖溶液和底物的量是由生產(chǎn)者規(guī)定的。通常采用在37℃下約1小時的溫育時間，但是該時間可以根據(jù)產(chǎn)品供應者的指示而變化。在消化后，反應混合物直接在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳以分離出所需的片段。采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝膠進行裂解片段的大小分離。
“寡核苷酸”或指一種單鏈多脫氧核苷酸，或指可以通過化學合成的兩條互補的多脫氧核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一種激酶存在下以ATP添加一個磷酸時，該寡核苷酸將不會連接到另一個寡核苷酸上。合成的寡核苷酸將連接到未被去磷酸化的片段上。
“連接”是指在兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，出處同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的緩沖液和條件、每0.5μg約等摩爾量的待連接DNA片段10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)來實現(xiàn)連接。
除非另有說明，按Graham，F(xiàn).和Van der Eb，A.，病毒學，52456-457(1973)所述的方法進行轉化。
所說的限制性內(nèi)切酶位點相應于細菌表達載體pQE-60(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)的限制性內(nèi)切酶位點。pQE-60編碼抗生素抗性(Ampr)、細菌復制起點(ori)、IPTG可調(diào)節(jié)啟動子操縱子(P/O)、核糖體結合位點(RBS)、6-組氨酸標記和限制性內(nèi)切酶位點。然后用NcoI和BglII消化pQE-60。將擴增的序列連接到pQE-60中并將其插入到帶有組氨酸標記編碼序列和核糖體結合位點(RBS)的讀框中。然后通過Sambrook等(分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989))描述的方法，用連接混合物轉化大腸桿菌菌株M15/rep4(Qiagen，公司)。M15/rep4包含質粒pREP4的多拷貝，這種質粒表達lacI阻遏物同時賦予卡那霉素抗性(Kanr)。通過轉化體在LB平板上的生長能力鑒定轉化體，并選擇出氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。通過限制分析分離并確認質粒DNA。將含有所需構建體的克隆在補充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜(O/N)培養(yǎng)。將O/N培養(yǎng)物以1∶100至1∶250的比率用于接種大體積培養(yǎng)物。細胞生長至0.4和0.6之間的光密度600(O.D.600)時，加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至最終濃度為1mM。IPTG通過失活lacI阻遏物，清除P/O，引起基因表達的增加。將細胞再培養(yǎng)3至4小時。通過離心收獲細胞。將細胞沉淀溶解在6M鹽酸胍離液劑中。澄清后，在允許含有6-組氨酸標記的蛋白質緊密結合的條件下，在鎳-螯合物柱中通過層析從溶液中純化溶解的FGF-13(Hochuli，E.等，色譜學雜志411177-184(1984))。將FGF-13蛋白質(85％純度)以6M鹽酸胍(pH值5.0)從柱中洗脫下來，為了復性，調(diào)至3M鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10mM谷胱甘肽(還原型的)、2mM谷胱甘肽(氧化型的)。在這一溶液溫育12小時后，將蛋白質對10mM磷酸鈉透析。
用市售試劑盒(“Geneclean”’BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴增的序列。然后將所說的片段用相應的核酸內(nèi)切酶消化，并在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段指定為F2。
載體pA2gp(由pVL941載體修飾而成，見下文討論)用于表達蛋白質，這種表達使用桿狀病毒表達系統(tǒng)(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細胞培養(yǎng)方法手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)的試驗站公報1555)。這種表達載體包含苜蓿銀紋夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV)強多角體蛋白啟動子，其后面是限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和XbaI的識別位點。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動子同樣的方向插入，其后是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列的兩側是用于細胞介導的共轉染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列?？梢杂煤芏嗥渌臈U狀病毒載體代替pA2，所說的載體如pRG1、pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學，17031-39)。
用限制酶消化所說的質粒，并用本領域已知的方法利用小牛腸磷酸酶使質粒去磷酸化。然后用市售試劑盒(“Geneclean”，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA指定為V2。
用T4DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質粒V2。然后轉化大腸桿菌DH5α細胞(Stratagene克隆系統(tǒng)，11011 North TorreyPines Road La Jolla，Ca.92037)并利用相應的限制酶鑒別含有所說質粒(pBacFGF-13)的細菌。通過DNA測序確認所克隆的片段的序列。
用脂轉染法(Felgner等，美國科學院學報，847413-7417(1987))將5μg質粒pBacFGF-13與1.0μg市售的線性桿狀病毒(“BaculoGoldTM桿狀病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉染。
在各種情況下，將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg所述質粒在含有50微升無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。在添加10微升脂轉染試劑和90微升Grace’s的培養(yǎng)基后，混合并于室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后將轉染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL1711)中，所說細胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板上。來回搖動平板以混合新添加的溶液。然后將平板在27℃下培養(yǎng)5小時。5小時后，從平板除去轉染溶液，添加1微升補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進行噬斑測定。一點改變是使用具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分離染藍的噬斑(“噬斑測定”的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發(fā)布的昆蟲細胞培養(yǎng)和桿狀病毒學用戶指南9-10頁中找到)。
四天后，將系列稀釋的病毒添加到細胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍的噬斑。然后將包含重組病毒的瓊脂懸浮于包含200微升Grace’s培養(yǎng)基的Eppendcrf管中。經(jīng)簡短離心除去瓊脂，將包含重組桿狀病毒的上清液用于感染接種到35毫米培養(yǎng)皿中的Sf9細胞。4天后，收獲這些培養(yǎng)皿中的上清液，于4℃貯存。
使Sf9細胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace’培養(yǎng)基中生長。在感染復數(shù)(MOI)2下用重組桿狀病毒V-FGF-13感染細胞。6小時后，除去培養(yǎng)基，用SF900II培養(yǎng)基(減去甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經(jīng)離心收獲之前，將細胞進一步培養(yǎng)16小時，標記蛋白質經(jīng)SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
用相應的限制性內(nèi)切酶消化PCR擴增的DNA片段和載體pcDNA3/Amp并連接。將連接混合物轉化到大腸桿菌菌株SURE中(可從Stratagene克隆系統(tǒng)，La Jolla，CA 92037得到)，將轉化的培養(yǎng)物接種在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上，并篩選抗性克隆。從轉化體中分離質粒DNA，并用限制分析檢測是否存在正確的片段。為了表達重組FGF-13，通過DEAE-DEXTRAN方法用表達載體轉染COS細胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版，(1989))。通過放射標記和免疫沉淀法檢測FGF-13-HA蛋白質的表達(E.Harlow，D.Lane，抗體實驗手冊，冷泉港實驗室出版，(1988))。將細胞在轉染后的兩天用15S-半胱氨酸標記8小時，然后收集培養(yǎng)物并用去垢劑裂解細胞(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％ NP-40，0.1％ SDS，1％ NP-40，0.5％ DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson，I.等，Id.37767(1984))。用HA特異性單克隆抗體沉淀細胞裂解物和培養(yǎng)基兩者。在15％ SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質沉淀。
用EcoRI和Hind III消化旁側有Moloney鼠肉瘤病毒長末端重復的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下來用小牛腸磷酸酶進行處理。線性載體在瓊脂糖凝膠上分級分離并使用玻璃珠加以純化。
采用分別與5’和3’末端序列對應的PCR引物擴增編碼本發(fā)明多肽的cDNA。5’引物包含一個EcoRI位點，3’引物含有一個HindIII位點。在T4 DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒的線性化骨架與擴增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在適于兩個片段連接的條件下保持所得到的混合物。將該連接混合物用于轉化細菌HB101，然后為了證實該載體具有插入正確的感興趣基因而將細菌涂布在含有卡那霉素的瓊脂平板上。
將兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包裝細胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)的組織培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)，直至達到鋪滿密度。然后將含有所述基因的載體加入培養(yǎng)基中并用該載體轉導包裝細胞。包裝細胞隨即生產(chǎn)含有該基因的具有感染性的病毒顆粒(現(xiàn)在包裝細胞被稱作生產(chǎn)細胞)。
向轉導的生產(chǎn)細胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，接下來從一個鋪滿生產(chǎn)細胞的10cm平板中收集培養(yǎng)基。含有感染性病毒顆粒的培養(yǎng)基經(jīng)微孔過濾器過濾以除去脫附(detached)的生產(chǎn)細胞，然后利用該培養(yǎng)基去感染成纖維細胞。從成纖維細胞的亞鋪滿平板中除去培養(yǎng)基并迅速地代之以來自于生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)基。除去該培養(yǎng)基并代之以新鮮的培養(yǎng)基。如果病毒的滴度很高，那么實質上所有的成纖維細胞均被感染并且無需選擇。如果滴度非常低，那么就需要采用具有如neo或his這樣的可選擇性標記的逆轉錄病毒。
然后將工程化的成纖維細胞注射入宿主，它或單獨注射或在一個cytodex 3微載體珠上已生長至鋪滿之后再注射。此時成纖維細胞產(chǎn)生蛋白質產(chǎn)物。
根據(jù)以上的教導，本發(fā)明的許多改進和變化都是可能的，因此在附加的權利要求的范圍內(nèi)可以另外的方式實施本發(fā)明。
序列表(1)一般信息(i)申請人HU等(ii)發(fā)明名稱成纖維細胞生長因子-13(iii)序列數(shù)8(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)郵碼07068(v)計算機可讀形式(A)介質類型3.5英寸磁盤(B)計算機IBM PS/2(c)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/207,412(B)申請日1994年3月8日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36,134(c)案號/文檔號325800-364(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度641個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCGCCTGCT GCCCAACCTC ACTCTGTGCT TACAGCTGCT GATTCTCTGC TGTCAAACTC 60AGGGGGAGAA TCACCCGTCT CCTAATTTTA ACCAGTACGT GAGGGACCAG GGCGCCATGA 120CCGACCAGCT GAGCAGGCGG CAGATCCGCG AGTACCAACT CTACAGCAGG ACCAGTGGCA 180AGCACGTGCA GGTCCCCGGG CGTCGCATCT CCGCCACCGC CGAGGACGGC AACAAGTTTG 240CCAAGCTCAT AGTGGAGACG GACACGTTTG GCAGCCGGGT TCGCATCAAA GGGGCTGAGA 300GTGAGAAGTA CATCTGTATG AACAAGAGGG GCAAGCTCAT CGGGAAGCCC AGCGGGAAGA 360GCAAAGACTG CGTGTTCACG GAGATCGTGC TGGAGAACAA CTATACGGCC TTCCAGAACG 420CCCGGCACGA GGGCTGGTTC ATGGTCTTCA CGCGGCAGGG GCGGCCCCGC CAGGCTTCCC 480GCAGCCGCCA GAACCAGCGC GAGGCCCACT TCATCAAGCG CCTCTACCAA GGCCAGCTGC 540CCTTCCCCAA CCACGCCGAG AAGCAGAAGC AGTTCGAGTT TGTGGGCTCC GCCCCCACCC 600GTCGGACCAA GCGCACACGG CGGCCCCAGC CCCTCACGTA G 641(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度212個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Arg Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Cys Leu Gln Leu Leu Ile Leu-20 -15 -10Cys Cys Gln Thr Gln Gly Glu Asn His Pro Ser Pro Asn Phe Asn-51 5Gln Tyr Val Arg Asp Gln Gly Ala Met Thr Asp Gln Leu Ser Arg10 15 20Arg Gln Ile Arg Glu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys25 30 35His Val Gln Val Pro Gly Arg Arg Ile Ser Ala Thr Ala Glu Asp40 45 50Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly55 60 65Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala Glu Ser Glu Lys Tyr Ile Cys70 75 80Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly Lys Pro Ser Gly Lys Ser85 90 95Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr100 105 110Ala Phe Gln Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe Met Val Phe Thr115 120 125Arg Gln Gly Arg Phe Arg Gln Ala Ser Arg Ser Arg Gln Asn Gln130 135 140Arg Glu Ala His Phe Ile Lys Arg Leu Tyr Gln Gly Gln Leu Pro145 150 155Phe Pro Asn His Ala Glu Lys Gln Lys Gln Phe Glu Phe Val Gly160 165 170Ser Ala Pro Thr Arg Arg Thr Lys Arg Thr Arg Arg Pro Gln Pro175 180 185Leu Thr190(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCAGACCAT GGAGAATCAC CCGTCTCCTA AT 32(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸
(xi)序列描述SEQ ID NO4GATTTAAGAT CTCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CTAGTGGATC CCGAGAATCA CCCGTCTCCT 30(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CGACTTCTAG AACCTCGGGG ATCTGGCTCC 30(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GATTTACTCG AGCGTGAGGG GCTGGGGCCG 30
權利要求
1.一種多肽的抗體，這種多肽包括選自如下一組的成員(i)一種具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；以及(ii)一種由ATCC 97148號保藏物的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
2.一種抑制一種多肽的化合物，這種多肽包括選自如下一組的成員(i)一種具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；以及(ii)一種由ATCC 97148號保藏物的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
3.一種激活一種多肽的受體的化合物，這種多肽包括選自如下一組的成員(i)一種具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；以及(ii)一種由ATCC 97148號保藏物的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
4.一種鑒定作為一種多肽的激動劑有活性的化合物的方法，該方法包括(a)使待篩選的化合物和包含細胞的反應混合物在所說細胞受所說多肽正常刺激的條件下混合，所說混合物含有在細胞增殖時摻入到細胞中的標記；和(b)測定所說細胞的增殖程度，以便鑒定此化合物是否是有效的激動劑，其中這種多肽包括選自如下一組的成員(i)一種具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；以及(ii)一種由ATCC 97148號保藏物的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
5.一種鑒定作為一種的多肽的拮抗劑有活性的化合物的方法，該方法包括(a)使待篩選的化合物、所說多肽和包含細胞的反應混合物在所說細胞受所說多肽正常刺激的條件下混合，所說混合物含有在細胞增殖時摻入到細胞中的標記；和(b)測定所說細胞的增殖程度，以便鑒定此化合物是否是有效的拮抗劑，其中這種多肽包括選自如下一組的成員(i)一種具有SEQ ID NO2的推導的氨基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；以及(ii)一種由ATCC 97148號保藏物的cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
6.一種包含治療有效量的權利要求2的化合物的治療組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類成纖維細胞生長因子－13多肽和編碼這種多肽的DNA(RNA)。本發(fā)明也公開了通過重組技術生產(chǎn)這種多肽的方法。本文也公開了利用這種多肽促進傷口(如燒傷和潰瘍形成的傷口)愈合、預防與中風相關的神經(jīng)元損傷和由于神經(jīng)元紊亂引起的神經(jīng)元損傷、促進神經(jīng)元生長、防止皮膚老化和頭發(fā)脫落、刺激血管形成、刺激早期胚胎中的中胚層誘導和肢體再生的方法。本文還公開了這樣的多肽的拮抗劑和它們作為預防異常細胞增殖、血管過多病和上皮晶狀體細胞增殖之治療劑的用途，本文還公開了用于檢測得自宿主的樣品中的編碼序列中的突變和多肽濃度的改變的診斷方法。
文檔編號C07K16/18GK1414021SQ0212641
公開日2003年4月30日 申請日期2002年7月12日 優(yōu)先權日2002年7月12日
發(fā)明者約翰·M·格林, 約阿希姆·R·格呂貝爾, 克雷格·A·羅森 申請人:人體基因組科學有限公司