專利名稱：一個(gè)玉米bZIP類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，是采用分子生物學(xué)的方法克隆了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子ABP9的基因，ABP9是與植物抗非生物逆境密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，ABP9可以提高植物對(duì)低溫、干旱和鹽漬等多種非生物逆境的抵抗能力。
在非生物逆境條件下，植物體內(nèi)被誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白中有許多是與植物抗逆境密切相關(guān)的基因，其中的一些基因已被克隆(Anil Grover，1998，Current Science.75689-695)。為了提高植物的抗寒、抗旱和抗鹽等非生物逆境的能力，人們也克隆了許多其它不同來(lái)源的抗逆相關(guān)基因，并轉(zhuǎn)化到植物中(Shavindra Bajaj，1999，Molecular Breeding.5493-503)。這些被克隆并進(jìn)行轉(zhuǎn)化基因可分為3類1)合成滲透調(diào)節(jié)因子的酶類如向煙草轉(zhuǎn)入E.coli來(lái)源的mtlD基因，可提高植物的甘露醇含量；向煙草、水稻轉(zhuǎn)入P5CS，可提高植物的脯氨酸含量；向擬南芥、水稻轉(zhuǎn)入codA，提高了植物甜菜堿的含量(Sakamoto A.，1998，PMB.381011-1019)。2)LEA及其相關(guān)蛋白如向擬南芥轉(zhuǎn)入cor15a基因(Steponkus PL，1998，PNAS.9514570-14575)。3)氧化逆境相關(guān)蛋白如向苜蓿中轉(zhuǎn)入Mn-SOD(Mckersic BD，1999，Plant Physiol.1111177-1181)；向煙草中轉(zhuǎn)入GST。這些功能基因轉(zhuǎn)入到植物中后，在實(shí)驗(yàn)室條件下，植株在某一方面的抗逆性有所提高，但所取得的效果并不理想。最近，有人向擬南芥中轉(zhuǎn)入抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CBF1(C-repeatBinding Factor)，CBF1可調(diào)控一系列的抗寒相關(guān)基因的表達(dá)，與上述轉(zhuǎn)單個(gè)的功能基因相比，CBF1明顯提高擬南芥的抗寒性能(Kirsten R.1998，Science.280104-106)。同樣，向擬南芥轉(zhuǎn)入DREB1A因子，它可調(diào)控與抗非生物逆境相關(guān)的多個(gè)基因的表達(dá)，明顯提高了植株的抗鹽、抗寒、抗旱的能力(Mie Kasuga，1999，Nature Biotechnology.17287-291)。
已有的研究表明在干旱、鹽漬和低溫等逆境條件下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，形成氧化逆境(Zhu J.K.，2001，Trends Plant Sci.666-71)。由于活性氧具有非?；顫姷幕瘜W(xué)性質(zhì)，它會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的傷害，如損傷細(xì)胞膜、失活重要的酶類及DNA斷裂等，因此活性氧的及時(shí)清除對(duì)植物抗非生物逆境能力的提高具有重要意義。在活性氧的清除過程中，過氧化氫酶CAT1起作重要作用，但在逆境條件下，植物本身的抗氧化系統(tǒng)受誘導(dǎo)表達(dá)的能力比較弱，不能及時(shí)地清除體內(nèi)的活性氧，影響了植物抗逆性的進(jìn)一步提高，所以克隆調(diào)控Cat1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子不僅有助于我們對(duì)ROS信號(hào)傳導(dǎo)路徑的理解，而且對(duì)培育具有抗旱、抗鹽、抗寒等逆境能力的作物具有重要的指導(dǎo)意義。因?yàn)檫@樣的反式因子它不僅僅是能夠調(diào)控Cat1基因的表達(dá)，還能調(diào)控其它的一系列的抗氧化基因和抗非生物逆境基因的表達(dá)。
ABRE是存在于許多逆境響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)的ABA響應(yīng)元件(ABAResponsive elelment)，其特征序列是(C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C)(Wenqiong Chen 2001，Plant Cell.14559-574)。在Cat1基因的啟動(dòng)子區(qū)含有一個(gè)重要的與逆境相關(guān)的順式調(diào)控元件ABRE1和ABRE2，缺失分析表明ABRE2(5’-GAAGTCCACGTGGAGGTGG)是Cat1基因響應(yīng)ABA調(diào)控所必需的順式元件。在玉米幼胚的發(fā)育過程中，隨著ABA含量的升高，Cat1基因的表達(dá)也隨之增強(qiáng)，事實(shí)上，胚發(fā)育的過程就是有機(jī)物質(zhì)不斷積累，細(xì)胞不斷脫水的過程，也是細(xì)胞抗逆境能力不斷提高的過程。研究表明在玉米幼胚的發(fā)育過程中，細(xì)胞中存在著能夠與ABRE2相互作用的反式因子，可分為兩類一類是依賴于ABA的能夠與Cat1基因ABRE2元件相互作用的反式因子(命名為Cat1 promoter Binding Factor 1，CBF1)，另一類是不依賴于ABA的能夠與Cat1基因ABRE2元件相互作用的反式因子(命名為Cat1 promoter Binding Factor 2，CBF2)(LingqingM.Guan，2000，The PlantJournal.22(2)87-95)。目前還沒有關(guān)于這兩類重要調(diào)控因子的報(bào)道。
本發(fā)明采用酵母單雜交的方法對(duì)所構(gòu)建的玉米授粉后17天(17dpp)幼胚cDNA文庫(kù)進(jìn)行了篩選，得到1個(gè)陽(yáng)性的克隆，命名為ABRE結(jié)合蛋白ABP9(ABRE Binding Protein 9)。把本發(fā)明所克隆的ABP9的蛋白序列輸入到GenBank中BLAST分析，結(jié)果表明ABP9屬于bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，與已報(bào)道的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子相比，ABP9與它們之間的同源性均很低，ABP9與來(lái)源于模式植物擬南芥的ABF3的同源性最高，但也只有18.8％。
本發(fā)明采用5’RACE的方法，獲得了ABP9基因的全長(zhǎng)cDNA序列。ABP9基因的全長(zhǎng)cDNA序列包含1510bp(

圖1)，推測(cè)的讀碼框?yàn)?158bp，編碼385個(gè)氨基酸(圖2)。本發(fā)明還包括該殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的序列衍生的蛋白質(zhì)；以及編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列，且具有與序列1同源性為90％以上的DNA序列。
本發(fā)明把所克隆的ABP9基因分別構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pPC86和原核表達(dá)載體pGEX4T-1上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ABP9基因產(chǎn)物不但在酵母體內(nèi)具有ABRE結(jié)合特異性(圖3)，在體外也同樣具有ABRE結(jié)合特異性(圖4)，ABP9基因產(chǎn)物能夠特異作用于含有核心元件序列為(C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C)的ABRE順式元件。
本發(fā)明把所克隆的ABP9基因分別構(gòu)建到酵母表達(dá)載體YepGAP和植物表達(dá)載體pBI121上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ABP9基因產(chǎn)物在酵母(圖5)和玉米懸浮細(xì)胞(圖6)中均具有ABRE結(jié)合特異性和轉(zhuǎn)錄激活功能，因此，ABP9基因產(chǎn)物是具有ABRE結(jié)合特異性和轉(zhuǎn)錄激活功能的轉(zhuǎn)錄因子。且ABP9基因受到鹽、干旱、過氧化氫、ABA等逆境條件的誘導(dǎo)表達(dá)(圖7)。
綜上所述，本發(fā)明報(bào)道的ABP9基因是一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，其編碼的蛋白是一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
本發(fā)明把ABP9基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體上(圖8)，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在不同的逆境條件下進(jìn)行處理，結(jié)果證明ABP9能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱(圖9)、抗鹽(圖10)和抗寒(圖11)等非生物逆境的能力。
RNA的提取和mRNA的分離RNA的提取和mRNA的分離分別按Promega公司的RNAgents Total RNAIsolation System kit和PolyATtract mRNA Isolation System進(jìn)行。取玉米17dpp幼胚1g，提取總RNA 2.834mg，共分離出mRNA 43.7μg。取玉米21dpp幼胚1g，提取總RNA 2.427mg，共分離出mRNA 41.6μg。
玉米幼胚17dpp、21dpp cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及擴(kuò)增按GibcoBRL公司的SuperScriptTMPlasmid System for cDNASynthesis and Plasmid Cloning kit進(jìn)行，取出5μg 17dpp的mRNA用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建，反轉(zhuǎn)錄引物用Not I adapter5’-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3’，雙鏈合成后加Sal I adapter5’-TCGACCCACGCGTCCG-3’；GGGTGCGCAGGCp-5’；再用Not I酶切，構(gòu)建到經(jīng)Sal I和Not I酶切純化后的pPC86載體上(Trp+)。轉(zhuǎn)化E.coli.DH10B，得到庫(kù)容量為5.2×106cfu的cDNA文庫(kù)。
cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增配2x LB培養(yǎng)基4L(Bacto-Trypton 20g/L，Bacto-Yeast Extract10g/L，NaCl 10g/L，SeaPrep agarose 3g/L，pH7.0)，121℃30min滅菌后，37℃溫育2小時(shí)；加入氨芐青霉素至終濃度200mg/L；加入文庫(kù)至106cfu/L；混勻后，分裝20~30mL到50的培養(yǎng)管中；置于冰上1小時(shí)；30℃培養(yǎng)40小時(shí)；8000rpm，10min，離心收集菌體；棄上清，加入200mL 2x LB(含甘油12.5％)懸浮細(xì)胞，分裝成10mL一份于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 4mer ABRE誘餌載體及4mer mutant ABRE(mABRE)挽救載體的構(gòu)建合成ABRE(+)5’GAAGTCCACGTGGAGGTGG 3’和ABRE(-)5’TCCCACCTCCACGTGGACT 3’，各取20μL(1μg/μL)的ABRE(+)和ABRE(-)，混勻，加4μL 3M的NaOAc和100μL的無(wú)水乙醇，-20℃，30分鐘后離心沉淀DNA，70％乙醇洗一次，干燥，加6.5μL無(wú)菌水，1μL 10x的T4 polynucleotide kinase buffer，退火條件是88℃，2’；65℃，10’；37℃，10’；25℃；5’，加1.5μL 20mM的ATP和1μL T4polynucleotide kinase，37℃反應(yīng)2小時(shí)，加酚氯仿和氯仿各抽提一次，用無(wú)水乙醇沉淀DNA。再加2μL 10×ligase buffer，1μLligase(5units/μL)，17μL無(wú)菌水，16℃連接過夜，用2％的瓊脂糖電泳，分離大小約為80bp的DNA片段，克隆到pBSK+載體上(經(jīng)Spe I酶切，補(bǔ)平)，測(cè)序，獲得pA4質(zhì)粒。合成mABRE(+)5’GAAGTaacatgttcGGTGG3’和mABRE(-)5’TCCCACCgaacatgttACT 3’，方法同上，獲得pmA4質(zhì)粒。
pRS315His(Leu+)載體及pA4和pmA4質(zhì)粒均用BamH I、Xba I雙切后純化，把4連ABRE和4連mABRE克隆到pRS315His，得到誘餌載體pRSA4(Leu+)和挽救載體pRSmA4(Leu+)質(zhì)粒。
玉米幼胚17dpp cDNA文庫(kù)的篩選制備yWAM2感受態(tài)細(xì)胞，把pRSA4轉(zhuǎn)化到酵母菌株yWAM2(Leu-，His-，Trp-)中，轉(zhuǎn)化方法參照Two Hybrid System TRAFO Protocol進(jìn)行。獲得含有pRSA4的酵母菌株yA4(His-，Trp-)。用含有誘餌載體的yA4酵母對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化方法同上，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂到His-選擇培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3~5天。待酵母長(zhǎng)出后，提酵母質(zhì)粒，提取方法參照Method IQuickPlasmid DNA Preparations from Yeast(Christine Guthrie 1991)。將酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α，在從中提取質(zhì)粒，酶切分析，測(cè)序可知所獲得的陽(yáng)性克隆的DNA序列，再對(duì)序列進(jìn)行分析。
ABP9全長(zhǎng)cDNA序列的獲得采用5’RACE的方法得到了ABP9基因的全長(zhǎng)cDNA序列，按GibcoBRL公司5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version2.0kit操作。用于反轉(zhuǎn)錄的引物ABP9 rv25’-CCT TCA CCA GGA AGT CCT CCA-3’用于PCR的引物ABP9 rv35’-AAC CAA TCC TCC GTT CTC ACC-3’擴(kuò)增條件是PCR94℃，3min；94℃，30sec；60℃，30sec；72℃，1min；72℃，5min；35個(gè)循環(huán)。把擴(kuò)增出DNA片段從瓊脂糖膠中回收并連接到pGEM-T easy vector，轉(zhuǎn)化E.coli.JM109，酶切鑒定后測(cè)序，獲得ABP9基因的全長(zhǎng)cDNA序列(圖1)，根據(jù)cDNA序列推測(cè)出其蛋白序列(圖2)。
ABP9的ABRE體外結(jié)合特異性分析(EMSA實(shí)驗(yàn))ABP9蛋白的純化把ABP2和ABP9的全長(zhǎng)基因克隆到pGEX4T-1原核表達(dá)載體上，將克隆到pGEX4T-1載體上的ABP9轉(zhuǎn)化到BL21菌株中，用37℃，0.3mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2~3小時(shí)，SDS-PAGE電泳，有特異的ABP9表達(dá)條帶。ABP9蛋白純化的操作方法按照Pharmacia公司的MicroSpinTMGST Purification ModuLe protocol進(jìn)行，純化的蛋白用于EMSA實(shí)驗(yàn)。
同位素標(biāo)記ABRE和mABRE采用Promega公司的DNA 5’End-LabelingSystem，反應(yīng)體系是ABRE(或mABRE)1μL，T4PNK 10×buffer 5μL，γ-32P-ATP 3μL，T4PNK(10U/μL)2μL，H2O 39μL；37℃ 20分鐘；加2μL 0.5M EDTA，68℃ 10分鐘滅活；37℃ 10分鐘；4℃保存?zhèn)溆谩?br> ABP9蛋白與DNA結(jié)合反應(yīng)體系5×binding buffer(125mMHEPES-KOH ph7.6；50％甘油；250mM KCl)4μL；ABF2、ABF9和GST蛋白各約4μg(9μL)；1M DTT 1μL；上述標(biāo)記的ABRE(或mABRE)探針1μL；H2O 4μL；冰上結(jié)合30分鐘，加3μL上樣緩沖液(含0.025％溴酚藍(lán)的無(wú)菌水)，進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳分析。
非變性聚丙烯酰胺電泳配制聚丙烯酰胺膠(5.4％)30％丙烯酰胺9ml；10×電泳緩沖液5ml(甘氨酸142.7g/L，EDTA 3.92g/L，Tris30.28g/L)；50％甘油2.5ml；去離子水33ml；10％APS 400μL；TEMED 25μL。待膠凝后，用1×電泳緩沖液電泳，預(yù)電泳10分鐘(300V)；上樣，電泳1小時(shí)(300V)；用濾紙粘下膠，保鮮膜封好后，壓X光片1小時(shí)；洗片，顯影2分鐘，定影5分鐘。結(jié)果表明有明顯的被ABP9蛋白阻滯ABRE的電泳條帶(圖4)，相反，mABRE則不被阻滯，說(shuō)明ABP9基因產(chǎn)物在體外同樣具有ABRE結(jié)合特異性。
玉米細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活功能試驗(yàn)報(bào)告載體的構(gòu)建pIG46載體用Xho I酶切，T4 DNA聚合酶補(bǔ)平，pBluescript II SK+載體上的4mer ABRE用Sma I、Ecl136 II酶切，回收約80bp的DNA片段與載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，提質(zhì)粒，酶切鑒定，測(cè)序表明ABRE已連在35S mini promoter上游。ABP9瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建把ABP9(Xba I，Xho I)基因的全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建到植物瞬時(shí)表達(dá)載體pBI221上，得到pBI221-ABP9質(zhì)粒，采用基因槍的方法共轉(zhuǎn)化報(bào)告質(zhì)粒和目的基因，轉(zhuǎn)化材料為玉米懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法參照B.R.格利克和J.E.湯普森主編的《植物分子生物學(xué)及生物技術(shù)的實(shí)用方法》，結(jié)果表明單獨(dú)轉(zhuǎn)化pIG46質(zhì)粒，沒有報(bào)告基因的表達(dá)(圖6A)，把pIG46和pBI221-ABP9共轉(zhuǎn)化時(shí)，有明顯的報(bào)告基因的表達(dá)(圖6B，C)，因此ABP9在玉米細(xì)胞內(nèi)不但具有ABRE結(jié)合特異性，而且具有轉(zhuǎn)錄激活功能。
ABP9在非生物逆境條件下的表達(dá)特異性分析玉米材料的處理取玉米種子，吸脹24hr，種植于花盆中，28℃，12hr光照培養(yǎng)約20天，待長(zhǎng)出三葉一芯，進(jìn)行不同條件的處理。
1).冷害處理將玉米苗置于2℃培養(yǎng)箱，12hr光照培養(yǎng)48hr，取出并洗去根上的土，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2).鹽漬處理分別將玉米苗置于0.6％，0.8％，1％的NaCl溶液中，12hr光照培養(yǎng)3天，取出并洗去根上的土，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 3).干旱處理分別將玉米苗置于含水量為8％(混和920g干土和80mL水)，10％，13％的土壤中12hr光照培養(yǎng)3天，取出并洗去根上的土，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 4).ABA處理分別將玉米苗置于10-4M、10-5M、10-6M的ABA溶液中(取5mgABA用0.1N KOH溶解后，定容至95mL水中即為10-4M)，12hr光照培養(yǎng)24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 5).H2O2處理分別將玉米苗置于10mM H2O2(1.13mL 30％H2O2/L)，60mM H2O2(6.78mL 30％H2O2/L)，150mM H2O2(14.95mL 30％H2O2/L)的水溶液中，12hr光照培養(yǎng)24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 6).水處理將玉米苗直接置于水中12hr光照培養(yǎng)24hr，-80℃凍存。
7).對(duì)照的處理直接取未經(jīng)任何處理的苗-80℃凍存作為對(duì)照。
RNA的提取及DNA的去除1).取約200mg處理的玉米材料，液氮研磨，提取RNA的方法按照Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System kit進(jìn)行。
2).將RNA溶于85μL水中，加入10×buffer 10μL和5μL RQ1 RNAFree DNase(1U/μL)，37℃，15min，以去除DNA的污染。
3).加入100μL的酚氯仿抽提一次，取上清，用等體積的異丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μL的水中。
4).定量RNA的濃度為1μg/μL。
RT-PCR取Oligo dT181μL(0.5μg/μL)，RNA 5μL(1μg/μL)，dNTP 1μL(10mM)，水27μL；65℃，5min；0℃，2min；加入5X buffer 10μL，DTT(100mM)5μL，RNase Inhibitor 10U(40U/μL)；42℃，2~5min；加入SuperScipt II 1μL(200u/μL)；42℃，50min；70℃，15min滅活，備用。
模板cDNA的相對(duì)定量及內(nèi)標(biāo)引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上登錄的玉米肌動(dòng)蛋白基因(Maize Actinl geneAccession NO.J01238)設(shè)計(jì)如下引物mAct1 F5’-CAC CTT CTA CAA CGA GCT CCG-3’mAct1 R5’-TAA TCA AGG GCA ACG TAG GCA-3’用該引物進(jìn)行擴(kuò)增，如果是cDNA可擴(kuò)增出405bp的條帶，如果是基因組DNA可擴(kuò)增出512bp的條帶(有107bp的內(nèi)含子)。
PCR反應(yīng)體系模板1μL，2 X PCR buffer 10μL，10mM dNTP 1μL，10μM mAct1 F 1μL，10μM mAct1 R 1μL，Taq 1U，滅菌水6μL。
PCR條件94℃，2min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec；30cycle；72℃，5min。
根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果對(duì)模板DNA進(jìn)行稀釋，調(diào)整模板DNA的用量，直到用mAct1 F和mAct1 R引物擴(kuò)增出的DNA條帶的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。
ABP9基因的PCR擴(kuò)增。
2).ABP9，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的引物如下(擴(kuò)增937bp)FW1 5’-CAT GAC GCT GGA GGA CTT CCT-3’RV 5’-TTG ACG AAA ACA CAG AGC-3’
PCR體系模板1μL，2×PCR buffer 10μL，10mM dNTP 1μL，10uMmAct1 F 1μL，10uM mAct1 R 1μL，Taq 1U，滅菌水6μL。
PCR條件94℃，2min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，50sec；30cycle；72℃，5min。電泳結(jié)果表明ABP9基因受鹽漬(圖7A，B，C)、干旱(圖7J，K)、ABA(L，M，N)、過氧化氫(F，G)等逆境條件的誘導(dǎo)表達(dá)。
擬南芥轉(zhuǎn)化1).擬南芥的培養(yǎng)。擬南芥種子在4℃進(jìn)行2-3天的春化處理，每盆播種7~10粒種子(營(yíng)養(yǎng)土和蛭石按2∶1)；放于溫室中培養(yǎng)(22℃，光照16h)；待擬南芥抽出初生苔后，剪去初生苔，待其抽出更多的次生苔，且少數(shù)開始結(jié)莢時(shí)，可用于轉(zhuǎn)化。
2).農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。挑農(nóng)桿菌單菌落接種在3mlYEB(Kan50mg/L，利福平50mg/L)，28℃，250rpm培養(yǎng)30小時(shí)；按1∶400轉(zhuǎn)接入200ml新鮮的YEB(Kan50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，250rpm培養(yǎng)約14小時(shí)，測(cè)OD600≈1.5；7500rpm，4℃，10min離心收集菌體；重懸菌體于二倍體積(400mL)的滲透液(1/2MS鹽+5％蔗糖，pH5.7，121℃，15min滅菌；用之前加6-BA至終濃度為0.044uM，VB6終濃度為1mg/L，VB1終濃度為10mg/L，SILWET0.02％。
3).轉(zhuǎn)化。把擬南芥的花蕾浸入滲透液中，抽真空(25IN Hg，保持5分鐘)；轉(zhuǎn)化完畢后，花盆外套上塑料袋，水平放置，使其在低光強(qiáng)度下生長(zhǎng)24-48小時(shí)后，即可正常培養(yǎng)。
4).收集種子，進(jìn)行篩選。稱25-30mg種子放入1.5mL離心管，加1mL 75％的乙醇(含0.05％Tween 20)，于搖床上搖10分鐘(300rpm)，離心，去上清；加1ml 95％的乙醇洗一次，離心，去上清；重復(fù)一次；在超凈臺(tái)中加0.3ml的100％乙醇，移到無(wú)菌濾紙上，吹干；把吹干的種子撒到1/2MS平板(Kan50mg/L)上；4℃，放2天后，22℃，16h光照培養(yǎng)；將陽(yáng)性植株(T0代)移栽到盆中培養(yǎng)，并收集種子進(jìn)行T1代篩選。
轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA的提取1).在液氮中研磨0.1-0.2g植物葉片，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。
2).加入0.7ml CTAB(Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，CTAB 2％，巰基乙醇0.1％)，60℃，30分鐘。每隔10分鐘，顛倒一次。
3).加0.7ml酚∶氯仿(1∶1)，顛倒幾次，10000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管，加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，10000rpm離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管。
4).加等體積的異丙醇，顛倒混勻，10000rpm離心10分鐘，除去上清，70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μL的無(wú)菌水中，用于PCR檢測(cè)。
轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè)。
正向引物35S promoter5’-TCTGCCGACAGTGGTCCCAA反向引物ABP9 rv35’-CCACTCTTGCCTCCTAACCAA反應(yīng)體系(20μL)轉(zhuǎn)基因植株DNA 1μL(20ng~50ng)；10×buffer 2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；dNTP(2.5mM)2μL；引物各加10μM；加無(wú)菌水至20μL。反應(yīng)條件94℃，5分鐘；94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。篩選出PCR陽(yáng)性植株。
ABP9轉(zhuǎn)基因植株的生理分析實(shí)驗(yàn)。
1).抗寒實(shí)驗(yàn)把轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因植株置于-6℃，保持6小時(shí)；轉(zhuǎn)移到正常的生長(zhǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的存活率為80％，未轉(zhuǎn)基因的植株存活率為10％，ABP9能夠明顯提高植株的抗寒性能(圖9)。
2).抗鹽實(shí)驗(yàn)把轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因植株置于600mM的NaCl中浸泡3小時(shí)；22℃，光照培養(yǎng)24小時(shí)；轉(zhuǎn)移到擬南芥正常的生長(zhǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的存活率為80％，未轉(zhuǎn)基因的植株存活率為15％，ABP9能夠明顯提高植株的抗鹽性能(圖10)。
3).抗旱實(shí)驗(yàn)把轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)基因植株置于擬南芥正常的生長(zhǎng)條件下不給水連續(xù)培養(yǎng)15~20天。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的存活率為90％，未轉(zhuǎn)基因的植株存活率為5％，ABP9能夠明顯提高植株的抗旱性能(圖11)
序列表1ABP9 cDNA SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所趙，軍王，磊范，云六<120>一個(gè)玉米bZIP類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用<130><160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1510<212>DNA<213>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<220><221>bZIP<222>(1)..(1510)<223>transcription factor gene<400>1taaaaggagt ctttgcagtt gcaggtcgag tgtctagata tgatatggcg tcggagacga60ccaagaacgt gaaggccacc ctcgacgagc aggaggtaac ctcgcatcag cgcgaccaga 120gcgctgccga ggaggaggag gtggtggtag tggtggatcc gctggcgcgg cagtcgtccg 180tcatgtcgct tacgctggag gagctgcaga gctcgctctg cgagccgggg cgcaacttcg 240ggtccatgaa catggacgag ttcatggcca acatatggaa cgccgaggag ttccaggccg 300ccaccgccac cgccaccggc ggctgcagca agcaggaggg cacgcagcgg gagccgatga 360tgcccgtggc gaatggaaca ggtgagaacg gaggattggt tcggcaggcc aacgcggcgg 420cgcaggccgt ggtgcagccc cagatgggga gcggcggtgg cggcggcggc gtcgccgcca480gcgggcggca gcaggtgacg ctggccgaca tgacgctgga ggacttcctg gtgaaggctg540gcgtcgtgcg aggagccttc gccggccacg gccacgcggt cgtcggcatg gccccaatcc600cagccgggcg gatgggcatc cagcagcagc acgcggctcc cacgatgtcg taccaagtgg660cagcgccggc gcccaacgcc gtgtacccgg ttatgggcaa cggcacgggg taccacaacg720ggtaccccag ggccatcgcg gtggtgccgc cgtctcagtg cgtgacggcc gccgtgagcc780cggggtcgtc ggacggggtg agcgcgatga cgcaggcgga gatgatgagc tgcattggca840acgaaggggc agggacggtc cggaactacg gcggcggcgg cggcggcggc agcgcgcgga900agcgcgactc ccccgaggac gcgtgcaccg agaagaccgt ggagcgccgg cagcggcgga960tgatcaagaa ccgtgagtcc gcggcccggt cacgcgccag gaagcaggcg tatacggtgg 1020agctcgaagc tgaactgaac cacctcaaag aggagaacga tcgcctcaga gcagagcaga 1080agacgattct gctatcgaag aaaaagaagc tggtggagaa gatggtggag caggcaaggg 1140agaatgtgag cgccaagaag ggcggtcgcg ggctgcgccg ctcgggcagc gccatgtggt 1200gaactgtgac gactgacgag tgtctcgaat tgtgcagttc cagtccgctt gcttagttgc 1260ttgtatggga aaaaaaatcc tgtacctgtc ggtagcagca ccgttagtaa cagtatgcca 1320tgtggtcgac acaaacgtct gcgagggacg atatggggca tgggcgagag cttccgcgtt 1380ggcctgctgc tgttcatgag cctgggttgt acaaacaata aagcaactgt aagatagtag 1440taattaaaca caaagctctg tgttttcgtc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500aaaaaaaaaa 1510
序列表2ABP9 protein SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所趙，軍王，磊范，云六<120>一個(gè)玉米bZIP類轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用<130><160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>385<212>PRT<213>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<220><221>bZIP transcription factor<222>(1)..(385)<223>ABRE Binding Factor<400>1Met Ala Ser Glu Thr Thr Lys Asn Val Lys Ala Thr Leu Asp Glu Gln1510 15Glu Val Thr Ser His Gln Arg Asp Gln Ser Ala Ala Glu Glu Glu Glu20 25 30Val Val Val Val Val Asp Pro Leu Ala Arg Gln Ser Ser Val Met Ser35 40 45Leu Thr Leu Glu Glu Leu Gln Ser Ser Leu Cys Glu Pro Gly Arg Asn50 55 60Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Phe Met Ala Asn Ile Trp Asn Ala65 70 75 80Glu Glu Phe Gln Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ser Lys85 90 95Gln Glu Gly Thr Gln Arg Glu Pro Met Met Pro Val Ala Asn Gly Thr100 105 110Gly Glu Asn Gly Gly Leu Val Arg Gln Ala Asn Ala Ala Ala Gln Ala115 120 125Val Val Gln Pro Gln Met Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala130 135 140Ala Ser Gly Arg Gln Gln Val Thr Leu Ala Asp Met Thr Leu Glu Asp145 150 155 160Phe Leu Val Lys Ala Gly Val Val Arg Gly Ala Phe Ala Gly His Gly165 170 175His Ala Val Val Gly Met Ala Pro Ile Pro Ala Gly Arg Met Gly Ile180 185 190Gln Gln Gln His Ala Ala Pro Thr Met Ser Tyr Gln Val Ala Ala Pro195 200 205Ala Pro Asn Ala Val Tyr Pro Val Met Gly Asn Gly Thr Gly Tyr His210 215 220Asn Gly Tyr Pro Arg Ala Ile Ala Val Val Pro Pro Ser Gln Cys Val225 230 235 240Thr Ala Ala Val Ser Pro Gly Ser Ser Asp Gly Val Ser Ala Met Thr245 250 255Gln Ala Glu Met Met Ser Cys Ile Gly Asn Glu Gly Ala Gly Thr Val260 265 270Arg Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg Lys Arg Asp275 280 285Ser Pro Glu Asp Ala Cys Thr Glu Lys Thr Val Glu Arg Arg Gln Arg290 295 300Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys30 310 315 320Gln Ala Tyr Thr Val Glu Leu Glu Ala Glu Leu Asn His Leu Lys Glu325 330 335Glu Asn Asp Arg Leu Arg Ala Glu Gln Lys Thr Ile Leu Leu Ser Lys340 345 350Lys Lys Lys Leu Val Glu Lys Met Val Glu Gln Ala Arg Glu Asn Val355 360 365Ser Ala Lys Lys Gly Gly Arg Gly Leu Arg Arg Ser Gly Ser Ala Met370 375 380Trp ***38權(quán)利要求
1.玉米的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABP9，它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.玉米bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABP9的編碼基因，它的核苷酸序列與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述玉米bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABP9的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第45位到第1202位堿基。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為pBI121ABP9。
8.含有權(quán)利要求3或4所述基因的細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求3或4所述基因在培育抗非生物逆境植物品種中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述非生物逆境為寒害、旱害和鹽害。
全文摘要
本發(fā)明采用分子生物學(xué)的方法克隆了玉米bZIP類轉(zhuǎn)錄因子ABP9的基因，ABP9基因是一個(gè)新的bZIP類轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，其編碼的蛋白是一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。ABP9基因產(chǎn)物是具有ABRE結(jié)合特異性和轉(zhuǎn)錄激活功能的轉(zhuǎn)錄因子。ABP9是與植物抗非生物逆境密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，ABP9可以提高植物對(duì)低溫、干旱和鹽漬等多種非生物逆境的抵抗能力。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1472223SQ0212718
公開日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2002年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月30日
發(fā)明者趙軍, 王磊, 范云六, 趙 軍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所